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CN101220090B - 明胶多重改性衍生物及其交联材料 - Google Patents

明胶多重改性衍生物及其交联材料 Download PDF

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CN101220090B CN2007100362765A CN200710036276A CN101220090B CN 101220090 B CN101220090 B CN 101220090B CN 2007100362765 A CN2007100362765 A CN 2007100362765A CN 200710036276 A CN200710036276 A CN 200710036276A CN 101220090 B CN101220090 B CN 101220090B
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Abstract

本发明公开了一类明胶多重改性衍生物，不仅具有通式(I)结构，至少还同时具有通式(II)、(III)和(IV)中的一种结构，其中G是明胶残基，包括A型明胶残基、B型明胶残基、基因重组明胶残基；R1是亚烷基或含有一个酰氨键的连接基团；R2是烷基或芳香基；R3是亚烷基；R4是羧基或羧基盐。明胶的多重改性包括明胶侧链氨基的酰氨键疏水化改性、明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性、明胶侧链羧基的巯基化改性及明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性后的巯基化改性。此外，本发明还公开了该明胶多重改性衍生物的交联材料。本发明明胶多重改性衍生物具有灵活多变的化学结构和多种性能，其交联材料可用作细胞生长基质等。
Figure 200710036276.5_AB_0

Description

明胶多重改性衍生物及其交联材料
技术领域
本发明涉及化合物明胶，尤其涉及明胶多重改性衍生物；此外，本发明还涉及该明胶多重改性衍生物的交联材料。
背景技术
明胶是胶原的变性衍生物，是一种含有18种人体不可缺少的氨基酸的蛋白质。天然明胶通常通过酸法或碱法对动物皮、骨、腱与韧带等结缔组织中的胶原进行水解后分离提取制备。通常它可以分为A型和B型两种：通过酸法水解制备的明胶被称为A型，具有较少的侧链羧酸残基和较高的等电点；通过碱法水解制备的明胶被称为B型，侧链的大部分谷氨酰胺和天冬酰胺残基都转化为谷氨酸和天冬氨酸，因而侧链具有较多的羧酸残基，等电点较低。无论是酸法或碱法制备的天然明胶，通常都是一个复杂的混合物，含有多种不同分子量的多肽，其性质因生产批次的不同而有一定的差异。明胶还可以通过基因重组工程来制备。基因重组明胶具有精确的分子量、等电点、以及可以根据特定的应用来设计明胶的分子结构(Olsen等，Advanced Drug DeliveryReviews，55，1547，2003)。
明胶具有生物相容、生物降解、低免疫原性等许多优异性能，因而在生物医药领域具有广泛的用途：如明胶止血海绵、药用明胶胶囊、明胶海绵伤口敷料以及新型药物缓释制剂和组织再生修复支架等等。然而明胶在体温条件下可溶于水，因而对明胶进行物理交联和化学交联以提高明胶的热和机械稳定性对于明胶的绝大多数生物医学应用是必不可少的。脱氢热处理和紫外线辐射是明胶物理交联的常用方式，但是交联效率较低且不可控。化学交联具有相对较高的效率。常见的明胶化学交联剂包括甲醛、戊二醛、多官能团环氧交联剂、多官能团异氰酸酯交联剂、酰基叠氮化合物、碳化二亚胺等等(Kui jpers等，Journal of Biomaterials Science：Polymer Edition，11，225，2000)。但是这些化学交联剂通常具有较强的毒副作用，即使微量的化学交联剂和交联官能团的残留也可能导致严重的炎性反应。因此当前可供选择的化学交联方式在很大程度上制约了明胶在生物医药领域的应用。
明胶的化学改性是提高明胶在生物医药领域应用的一个重要途径。这种途径不仅可以使明胶具有一些重要的物理化学性能，同时还可能减少或者不使用有毒副作用的化学交联剂制备明胶交联材料。例如，Ma等人在Journal of Biomaterials Science：Polymer Edition，13，67，2002中公开了具有两亲性能的聚乳酸疏水改性明胶衍生物；Van Den Bulcke等人在Biomacromolecules，1，31，2000中公开了甲基丙烯酰氨改性明胶衍生物，这些衍生物可以通过相对温和的光引发自由基聚合制备出明胶交联材料；Morikawa和Matsuda等人在Journal of Biomaterials Science：PolymerEdition，13，167，2002中公开的N-异丙基丙烯酰氨接枝明胶衍生物具有温度响应凝胶化性能；Shu等人在Biomaterials，24，3825，2003公开的巯基化改性明胶衍生物可以通过温和的二硫键方式或亲核加成方式制备原位交联材料。到目前为止，这些方法在制备明胶交联材料时仍具有很多局限性。其中一个重要原因是明胶可供化学改性和交联的主要官能团(侧链氨基或羧基)数量相当有限。例如B型明胶的侧链氨基和羧基分别约为28和118个/1000氨基酸残基；A型明胶具有与B型明胶相近的侧链氨基含量，但侧链羧基的含量则要低得多(54个/1000氨基酸残基)。因此很有必要进一步开发新型化学改性和交联的方法以进一步扩展明胶在生物医药领域的多种应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一类新颖的明胶多重改性衍生物。
本发明要解决的技术问题之二是提供一类新颖的明胶多重改性衍生物的交联材料。
本发明以明胶为原料，通过对明胶侧链氨基的酰氨键疏水化改性、氨基的酰氨键羧基化改性以及羧基的巯基化改性制备了新颖的明胶多重改性衍生物。与明胶单一改性衍生物相比，本发明明胶多重改性衍生物具有许多优异的性能，如可调节的侧链分子结构和化学性能等等，将在生物医药领域具有许多重要的应用。
本发明明胶多重改性衍生物同时具有下述通式(I)结构和至少下述通式(II)、(III)和(IV)中的一种结构。
Figure G200710036276520070126D000021
其中G是指明胶残基，包括A型明胶残基、B型明胶残基、基因重组明胶残基等；R1是亚烷基或含有一个酰氨键的连接基团；R2是指烷基或芳香基；R3是亚烷基或取代亚烷基；R4是羧基或羧基盐。
上述含有一个酰氨键的连接基团是指或
Figure G200710036276520070126D000032
其中R′和R″是亚烷基、取代亚烷基、芳香基或聚醚基；
上述的亚烷基是指-(CH2)n-(n是1～15的整数)。优选n是1～8的整数。
上述取代亚烷基是指至少一个氢原子被烷基、羟基、氨基、烷氧基、苯基、酯基等基团取代的亚烷基。
上述芳香基是指芳香族的苯基、萘基等。优选苯基。
上述聚醚基是指-[(CHR)nO]m-，其中R是烷基，n是1～10的整数，m是1～500的整数。优选R为氢原子，n分别等于2、3和4。
上述烷基是指具有1～15个碳原子的直链或支链的烷基。例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等等。优选具有1～10个碳原子的直链或支链的烷基，特别优选甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基。
上述烷氧基是指具有1～6个碳原子的直链或支链的烷氧基。例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基等。优选具有1～4个碳原子的支链或直链的烷氧基，特别优选甲氧基和乙氧基。
上述酯基是指-C(O)OR，其中R是上述低级烷基。优选甲酯基、乙酯基、丙酯基和丁酯基。
上述羧基是指-COOH；羧基盐是指上述羧基被碱中和后的基团，即-COO-A+，其中A+包括钠离子、钾离子、锂离子、氨根离子等。优选羧基、羧基钠盐或羧基钾盐。
本发明明胶多重改性衍生物具有下列几种代表性化学结构通式：
Figure G200710036276520070126D000033
Figure G200710036276520070126D000041
其中G、R1、R2、R3和R4的定义同前述。
本发明明胶多重改性衍生物中R1、R2、R3和R4的优选化学结构如下：
R1＝-(CH2)n-  n＝1～15  R2＝-(CH2)nCH3  n＝1～15
在上述通式(V)到(XI)的明胶多重改性衍生物都含有至少一个巯基。通式(V)、(VI)和(VII)为本发明明胶双重改性衍生物的化学结构式；通式(VIII)、(IX)和(X)为本发明明胶三重改性衍生物的化学结构式；通式(XI)为本发明明胶四重改性衍生物的化学结构式。
本发明明胶多重改性衍生物的化学改性包括以下四种方式：(A)明胶侧链氨基的酰氨键疏水化改性；(B)明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性；(C)明胶侧链羧基的巯基化改性；(D)明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性后的巯基化改性。
化学改性方式(A)，明胶侧链氨基的酰氨键疏水化改性常用的方法如下所示：
Figure G200710036276520070126D000051
其中G和R2的定义同上述。具体的常用制备过程是将明胶溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，然后调节溶液的pH值为弱碱性(通常为8～10)；此后加入酸酐，搅拌反应一定时间，同时不断加入适量的碱溶液(如氢氧化钠)以保持反应溶液为弱碱性；最后反应溶液透析纯化、冷冻干燥即可得到产物。所采用的酸酐包括醋酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐、庚酸酸酐、辛酸酐等等。
化学改性方式(B)，明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性常用的方法如下所示：
其中G和R3的定义同上述。具体的常用制备过程是将明胶溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，然后调节溶液的pH值为弱碱性(通常为8～10)；此后加入二酸酸酐，搅拌反应一定时间，同时不断加入适量的碱溶液(如氢氧化钠)以保持反应溶液为弱碱性；最后反应溶液透析纯化、冷冻干燥即可得到产物。所采用的二酸酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、马来酸酐、庚二酸酐、辛二酸酐等等。
化学改性方式(C)和(D)，对明胶侧链羧基的巯基化改性(包括明胶侧链氨基的酰氨键羧基化引入的羧基巯基化改性)采用酰肼/碳二亚胺的偶合化学方法(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002)。其基本原理是明胶的侧链羧基(或明胶侧链氨基的酰氨键羧基化引入的羧基)在碳二亚胺的活化下生成活性中间体，然后二硫代二酰肼的酰肼氨基亲核进攻活性中间体生成加成物，最后加成物的二硫键被还原成自由巯基，纯化即可得到产物。其常用的方法如下所示：
Figure G200710036276520070126D000053
其中G和R1的定义同上述。具体的常用制备过程是将明胶或明胶酰氨键羧基化改性衍生物溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，然后调节溶液的pH值为弱酸性(通常为4.75)；此后加入定量的二硫代二酰肼，搅拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，同时不断加入适量的酸溶液(如盐酸)以保持反应溶液pH值为4.75；最后在弱碱性条件下(通常pH值为8～10)加入羟基硫醇、二硫苏糖醇或硼氢化钠等还原剂将二硫键还原成自由巯基，在酸性条件下透析纯化除去杂质、冷冻干燥即可得到产物。
化学改性方式(C)和(D)，对明胶侧链羧基(或明胶侧链氨基的酰氨键羧基化引入的羧基)的巯基化改性，所采用的常见代表性二硫代二酰肼包括Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的二硫代二丙酸二酰肼(简称DTPDH)和二硫代二丁酸二酰肼(简称DTBDH)，以及本申请人在发明专利申请(申请号：200610118715.2，发明名称：二酰肼化合物及其制备方法和用途)中公开的新型二酰肼化合物：包括二硫代二丙酸双酰甘氨酸二酰肼(简称DGDTPDH)、二硫代二丙酸双酰丙氨酸二酰肼(简称DADTPDH)、二硫代二丙酸双酰(羟基)氨基乙酸二酰肼(简称DHADTPDH)、二硫代二丙酸双酰氨基丙酸二酰肼(简称DPDTPDH)、二硫代二丙酸双酰氨基丁酸二酰肼(简称DBDTPDH)、双丙二酸双酰胱胺二酰肼(简称DPCDH)、双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(简称DSCDH)、双(甲基)丁二酸双酰胱胺二酰肼(简称DMPCDH)、双戊二酸双酰胱胺二酰肼(简称DGCDH)、双己二酸双酰胱胺二酰肼(简称DACDH)等等。这些代表性二硫代二酰肼的化学结构式如下所示：
Figure G200710036276520070126D000061
Figure G200710036276520070126D000071
前述通式(V)代表的明胶多重改性衍生物包括化学改性方式(A)明胶侧链氨基的酰氨键疏水化改性和化学改性方式(C)明胶侧链羧基的巯基化改性两个过程。所采用的一般制备方法分为两个步骤：(1)将明胶溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，然后调节溶液的pH值为弱碱性(通常为8～10)；此后加入酸酐，搅拌反应一定时间，同时不断加入适量的碱溶液(如氢氧化钠)以保持反应溶液为弱碱性；最后反应溶液透析纯化、冷冻干燥即可得到中间产物；(2)将中间产物溶于温水配成水溶液或直接采用未纯化的中间产物溶液(通常约为30摄氏度)，调节溶液的pH值为弱酸性(通常为4.75)；此后加入定量的二硫代二酰肼，搅拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，同时不断加入适量的酸溶液(如盐酸)以保持反应溶液pH值为4.75；最后在弱碱性条件下(通常pH值为8～10)加入羟基硫醇、二硫苏糖醇或硼氢化钠等还原剂将二硫键还原成自由巯基，在酸性条件下透析纯化除去杂质、冷冻干燥即可得到本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物。所采用的酸酐包括醋酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、己酸酐、庚酸酐、辛酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。
前述通式(VI)代表的明胶多重改性衍生物包括化学改性方式(B)明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性和化学改性方式(C)明胶侧链羧基的巯基化改性两个过程。所采用的一般制备方法分为两个步骤：(1)将明胶溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，调节溶液的pH值为弱酸性(通常为4.75)；此后加入定量的二硫代二酰肼，搅拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，同时不断加入适量的酸溶液(如盐酸)以保持反应溶液pH值为4.75；最后在弱碱性条件下(通常pH值为8～10)加入羟基硫醇、二硫苏糖醇或硼氢化钠等还原剂将二硫键还原成自由巯基，在酸性条件下透析纯化除去杂质、冷冻干燥即可得到中间产物；(2)在惰性气体(如氮气等)保护下将中间产物溶于温水配成水溶液然(通常约为30摄氏度)，调节溶液的pH值为弱碱性(通常为8～10)；此后加入二酸酸酐，搅拌反应一定时间，同时不断加入适量的碱溶液(如氢氧化钠)以保持反应溶液为弱碱性；最后反应溶液在酸性条件下透析纯化、冷冻干燥即可得到本发明通式(VI)代表的明胶多重改性衍生物中间产物。所采用的二酸酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。
前述通式(VII)和(X)代表的明胶多重改性衍生物包括化学改性方式(B)明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性、化学改性方式(C)明胶侧链羧基的巯基化改性和化学改性方式(D)明胶侧链氨基的酰氨键羧基化改性后的巯基化改性三个过程。所采用的一般制备方法基本相同，可分为两个步骤：(1)将明胶溶于温水配成水溶液(通常约为30摄氏度)，调节溶液的pH值为弱碱性(通常为8～10)；此后加入二酸酸酐，搅拌反应一定时间，同时不断加入适量的碱溶液(如氢氧化钠)以保持反应溶液为弱碱性；最后反应溶液透析纯化、冷冻干燥即可得到中间产物；(2)将中间产物溶于温水配成水溶液或直接采用未纯化的中间产物溶液(通常约为30摄氏度)，调节溶液的pH值为弱酸性(通常为4.75)；此后加入定量的二硫代二酰肼，搅拌溶解后再加入定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐，同时不断加入适量的酸溶液(如盐酸)以保持反应溶液pH值为4.75；最后在弱碱性条件下(通常pH值为8～10)加入羟基硫醇、二硫苏糖醇或硼氢化钠等还原剂将二硫键还原成自由巯基，在酸性条件下透析纯化除去杂质、冷冻干燥即可得到产物。如果反应中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐过量，全部羧基都被改性为巯基，产物即为本发明通式(VII)代表的明胶多重改性衍生物；如果反应中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的使用量较少，部分羧基被改性为巯基，产物即为本发明通式(X)代表的明胶多重改性衍生物。所采用的二酸酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐等等，所采用的二硫代二酰肼如前所述。
前述通式(VIII)代表的明胶多重改性衍生物的制备方法与上述通式(VI)代表的明胶多重改性衍生物的制备方法基本相同，只要在上述通式(VI)代表的明胶多重改性衍生物的制备步骤(2)中同时加入酸酐和二酸酸酐即可。
前述通式(IX)和(XI)代表的明胶多重改性衍生物的制备方法与上述通式(VII)和(X)代表的明胶多重改性衍生物的制备方法基本相同，只要在上述通式(VII)和(X)代表的明胶多重改性衍生物的制备步骤(2)中同时加入酸酐和二酸酸酐即可。如果反应中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐过量，全部羧基都被改性为巯基，产物即为本发明通式(IX)代表的明胶多重改性衍生物；如果反应中1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的使用量较少，部分羧基被改性为巯基，产物即为本发明通式(XI)代表的明胶多重改性衍生物。
本发明的有益效果是本发明公开的明胶多重改性衍生物具有灵活多变的化学结构和多种性能。在本发明通式(V)、(VIII)、(IX)和(XI)代表的明胶多重改性衍生物中通过对明胶侧链氨基的改性，引入了疏水基团，提高了本发明明胶多重改性衍生物的疏水性能，改变了水溶液的性质、促进了疏水胶束的形成，提高了对疏水物质(如药物等)的增溶作用；同时通过对明胶侧链羧基的巯基化改性，提供了活性的巯基，可以作为进一步化学改性的具有高度反应活性的活性点(如可以和高度生物相容的交联剂制备交联材料等)。在本发明通式(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)和(XI)代表的明胶多重改性衍生物中通过对明胶侧链氨基的改性引入了额外的羧基，改变了水溶液的性质、提高了本发明明胶多重改性衍生物的亲水性能；同时更为重要的是通过把氨基转化为羧基，大大提高了可供进一步化学改性的羧基的含量(例如B型明胶的侧链羧基含量可以增加多达24％，而A型明胶的侧链羧基含量可以增加多达50％)；此外这些羧基和明胶本身具有的羧基都可以进行巯基化改性，提供了活性的巯基，可以作为进一步化学改性的具有高度反应活性的活性点(如可以和高度生物相容的交联剂制备交联材料等)。
本发明的新颖明胶多重改性衍生物至少具有一个侧链自由巯基，可以在合适的条件下重新氧化形成二硫键。氧气、低浓度过氧化氢、碘、铁三价离子等中强度氧化剂均可使自由巯基形成二硫键，从而制备出明胶交联材料。其一般制备方法是将本发明的明胶多重改性衍生物的水溶液在中性或弱碱性条件下用空气氧化制备二硫键交联材料；或者在弱酸性或酸性条件下，用低浓度过氧化氢、铁三价离子等更强的氧化剂氧化制备二硫键交联材料。
本发明明胶多重改性衍生物的交联材料还可以通过本发明的明胶多重改性衍生物和巯基反应活性交联剂交联制备。本发明采用的巯基反应活性官能团包括马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯、卤代丙酸酯、卤代丙酰胺、二硫代吡啶、N-羟基丁二酰亚胺活化酯等等。其中马来酰亚胺、乙烯砜、碘代丙酸酯、碘代丙酰胺、二硫代吡啶等官能团具有很高巯基反应活性。这些反应可以分为三类：(1)巯基和活化不饱和双键的加成反应，属于这类反应的官能团包括马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯等；(2)巯基和活化卤代烷的取代反应，属于这类反应的官能团包括碘代丙酸酯、溴代丙酸酯、氯代丙酸酯、碘代丙酰胺、溴代丙酰胺、氯代丙酰胺、二硫代吡啶等；(3)最后一类是硫酯化反应，这类反应的官能团包括各种羧酸的活化酯，如N-羟基丁二酰亚胺活化酯等等。以本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物为例，巯基和这些官能团的反应方程式如下：
Figure G200710036276520070126D000101
本发明采用的巯基反应活性交联剂至少含有两个上述反应官能团的聚乙二醇(简称PEG)的衍生物，如双臂、三臂、四臂、八臂或更多臂的聚乙二醇衍生物，它们具有如下典型的化学结构：
F1——PEG——F2
双臂聚乙二醇交联剂
Figure G200710036276520070126D000111
其中F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7和F8为前述巯基反应活性官能团如马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯、卤代丙酸酯、卤代丙酰胺、二硫代吡啶或N-羟基丁二酰亚胺等等，它们可以具有全部相同、部分相同或全部不相同的化学结构；PEG是指分子量为100到1000000的具有CH2CH2O重复单元的链段。
以双臂的聚乙二醇为例，本发明采用的常见交联剂包括聚乙二醇二马来酰亚胺、聚乙二醇二乙烯砜、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二卤代丙酸酯、聚乙二醇二卤代丙酰胺、聚乙二醇二二硫代吡啶、聚乙二醇二N-羟基丁二酰亚胺等。化学结构式如下所示：
Figure G200710036276520070126D000112
本发明采用巯基反应活性交联剂交联的新颖明胶多重改性衍生物的交联材料的一般制备方法是将本发明的明胶多重改性衍生物制成水溶液或混合水溶液，调节溶液的pH值为中性，然后加入上述巯基反应活性交联剂的水溶液，混合均匀后室温静置片刻即形成凝胶，得到交联材料。以上述双臂聚乙二醇衍生物交联剂和本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物为例，所制备的交联材料具有如下化学结构：
Figure G200710036276520070126D000121
与本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物相似，本发明通式(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)和(XI)代表的明胶多重改性衍生物也至少含有一个巯基，也可以采用上述相同的交联方式制备交联材料。此外也可采用一种多臂聚乙二醇衍生物交联剂共同交联制备本发明明胶多重改性衍生物的交联材料。另外也可以采用两种或两种以上聚乙二醇衍生物交联剂(如双臂聚乙二醇衍生物、三臂聚乙二醇衍生物交联剂、四臂聚乙二醇衍生物交联剂、八臂聚乙二醇衍生物交联剂等等)来制备本发明明胶多重改性衍生物的交联材料。也可以采用上述制备方法，同时采用两种或两种以上本发明明胶多重改性衍生物来制备明胶交联材料
本发明的有益效果是可以方便地制备出具有高度生物相容的明胶交联材料，这些明胶交联材料可以制成薄膜、海绵、凝胶等各种形态，可以用作细胞生长基质等等。
附图说明
附图是本发明实施例1中乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的氢原子核磁共振谱图和重要化学位移峰的归属(D2O为溶剂)。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R2＝-CH3)的合成和表征
(1)明胶的乙酰化改性
明胶(B型，来自牛皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.05克醋酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(乙酰化明胶)约0.8克。
(2)乙酰化明胶的巯基化改性
取上述乙酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入2.5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.35克。
(3)乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000131
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定乙酰化明胶的侧链氨基，约37％的氨基被甲酰化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.5毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)：见图1。
实施例2己酰化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R2＝-CH2CH2CH2CH2CH3)的合成和表征
(1)明胶的己酰化改性
明胶(A型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.1克戊酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(己酰化明胶)约0.8克。
(2)己酰化明胶的巯基化改性
取上述己酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入2.5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.37克。
(3)己酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
己酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure DEST_PATH_GSB00000100773100011
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的己酰化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定己酰化明胶的侧链氨基，约33％的氨基被己酰化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测甲酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.24毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)结果如下：
Figure DEST_PATH_GSB00000100773100012
实施例3丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物，其中
Figure DEST_PATH_GSB00000100773100013
R2＝-CH2CH2CH3)的合成和表征
(1)明胶的丁酰化改性
明胶(B型，来自牛皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.08克丁酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁酰化明胶)约0.75克。
(2)丁酰化明胶的巯基化改性
取上述丁酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.4克双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(按照本申请人申请的发明专利(二酰肼化合物及其制备方法和用途，申请号200610118715.2)中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入3.0克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.31克。
(3)丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000161
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定丁酰化明胶的侧链氨基，约36％的氨基被己酰化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.47毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure 836773DEST_PATH_GSB00000100773100021
实施例4乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(V)代表的明胶多重改性衍生物，其中
Figure 753914DEST_PATH_GSB00000100773100022
R2＝-CH3)的合成和表征
(1)明胶的乙酰化改性
明胶(A型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.08克醋酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(乙酰化明胶)约0.8克。
(2)乙酰化明胶的巯基化改性
取上述乙酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.5克二硫代二丙酸双酰甘氨酸二酰肼(按照本申请人申请的发明专利(二酰肼化合物及其制备方法和用途，申请号200610118715.2)中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.3克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入3.0克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.3克。
(3)乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000181
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定乙酰化明胶的侧链氨基，约52％的氨基被乙酰化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测甲酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.32毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure G200710036276520070126D000182
实施例5丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(VI)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R3＝-CH2CH2-，R4＝-COOH)的合成和表征
(1)明胶的巯基化改性
明胶(B型，来自牛皮，Sigma，美国)2克溶解于200毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.5克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入6克二硫苏糖醇(DiagnosticChemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体(巯基化改性明胶)约1.3克。
(2)巯基化改性明胶的丁二酰羧基化改性
上述巯基化改性明胶在惰性气体(氮气)保护下1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.0，然后在电磁搅拌下加入0.5克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应20分钟。加入6摩尔/升的盐酸，调节上述溶液的pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体(丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物)约0.7克。
(3)丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.31毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure G200710036276520070126D000192
实施例6丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(VII)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R3＝-CH2CH2-)的合成和表
(1)明胶的丁二酰羧基化改性
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.05克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁二酰羧基化明胶)约0.7克。
(2)丁二酰羧基化明胶的巯基化改性
取上述丁二酰羧基化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.75克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.33克。
(3)丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000201
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定丁二酰羧基化明胶的侧链氨基，约45％的氨基被丁二酰羧基化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.87毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure G200710036276520070126D000211
实施例7乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(VIII)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R2＝-CH3，R3＝-CH2CH2-，R4＝-COOH)的合成和表征
(1)明胶的巯基化改性
明胶(B型，来自牛皮，Sigma，美国)2克溶解于200毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.5克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入6克二硫苏糖醇(DiagnosticChemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体(巯基化改性明胶)约1.3克。
(2)巯基化改性明胶的乙酰化和丁二酰羧基化改性
上述巯基化改性明胶在惰性气体(氮气)保护下1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.0，然后在电磁搅拌下加入0.5克丁二酸酐和0.15克醋酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应20分钟。加入6摩尔/升的盐酸，调节上述溶液的pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体(乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物)约0.7克。
(3)乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000221
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.47毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure G200710036276520070126D000222
实施例8乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(IX)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R2＝-CH3，R3＝-CH2CH2-)的合成和表征
(1)明胶的乙酰化改性
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)2克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.02克醋酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(乙酰化明胶)约1.6克。
(2)乙酰化明胶的丁二酰羧基化改性
取上述乙酰化明胶1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.02克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁二酰羧基化乙酰化明胶)约0.7克。
(3)丁二酰羧基化和乙酰化明胶的巯基化改性
取上述丁二酰羧基化和乙酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入1.2克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.75克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.33克。
(4)乙酰化、丁二酰羧基化、和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000241
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定明胶的侧链氨基约21％乙酰化、28％丁二酰羧基化。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.64毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
实施例9丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(X)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R3＝-CH2CH2-)的合成和表征
(1)明胶的丁二酰羧基化改性
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.05克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁二酰羧基化明胶)约0.7克。
(2)丁二酰羧基化明胶的巯基化改性
取上述丁二酰羧基化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入2.5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.33克。
(3)丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000251
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定丁二酰羧基化明胶的侧链氨基，约45％的氨基被丁二酰羧基化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.64毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure DEST_PATH_GSB00000100773100031
实施例10丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(X)代表的明胶多重改性衍生物，其中
Figure DEST_PATH_GSB00000100773100032
R3＝-CH2CH2-)的合成和表征
(1)明胶的丁二酰羧基化改性
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.05克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁二酰羧基化明胶)约0.7克。
(2)丁二酰羧基化明胶的巯基化改性
取上述丁二酰羧基化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.5克双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(按照本申请人申请的发明专利：二酰肼化合物及其制备方法和用途(申请号200610118715.2)中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入3.0克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.33克。
(3)丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征
丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000271
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定丁二酰羧基化明胶的侧链氨基，约45％的氨基被丁二酰羧基化改性。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.61毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
Figure G200710036276520070126D000272
实施例11丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物(本发明通式(XI)代表的明胶多重改性衍生物，其中R1＝-CH2CH2-，R2＝-CH3，R3＝-CH2CH2-)的合成和表征
(1)明胶的乙酰化改性
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)2克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.02克醋酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(乙酰化明胶)约1.6克。
(2)乙酰化明胶的丁二酰羧基化改性
取上述乙酰化明胶1克溶解于100毫升蒸馏水中(约30摄氏度)，得到澄清透明溶液。用1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液调节溶液的pH值为约9.5，然后在电磁搅拌下加入0.02克丁二酸酐(分析纯)，不断加入适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，保持溶液的pH值在弱碱性(通常8.0～9.5)。在约30摄氏度下搅拌反应1小时。此后上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Fisher，美国)，用蒸馏水透析，每8小时换一次透析液；直至凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体(丁二酰羧基化乙酰化明胶)约0.7克。
(3)丁二酰羧基化和乙酰化明胶的巯基化改性
上述丁二酰羧基化和乙酰化明胶0.5克溶解于50毫升蒸馏水中(约30摄氏度)。在上述溶液中加入0.3克二硫代二丙酰肼(按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.25克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。电磁搅拌反应2小时后，加入2.5克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌，调节溶液的pH值为8.5。此后室温电磁搅拌反应24小时后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至pH值为约3.0。将上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液，直至GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到百色絮状固体约0.33克。
(4)丁二酰羧基化、乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的表征丁二酰羧基化、乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物的化学结构如下所示：
Figure G200710036276520070126D000291
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)试剂测定明胶的侧链氨基约21％乙酰化、28％丁二酰羧基化。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物的活性巯基含量：0.54毫摩尔巯基/克。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)的结果如下：
实施例12明胶多重改性衍生物交联水凝胶的制备
1、聚乙二醇二乙烯砜交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例1制备的乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeuties，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
2、聚乙二醇二丙烯酸酯交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例3制备的丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物0.25克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁酰化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
3、聚乙二醇二乙烯砜交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例5制备的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物0.2克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeuties，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
4、聚乙二醇二乙烯砜交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例6制备的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
5、聚乙二醇二乙烯砜交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例8制备的乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，NektarTherapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升乙酰化、丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
6、聚乙二醇二乙烯砜交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例9制备的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
7、聚乙二醇二乙烯砜和聚乙二醇二丙烯酸酯交联本发明明胶多重改性衍生物水凝胶的制备：实施例1制备的乙酰化和巯基化明胶多重改性衍生物0.15克和实施例9制备的丁二酰羧基化和巯基化明胶多重改性衍生物0.15克同时溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH为7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，NektarTherapeutics，美国)0.05克和聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量3400，NektarTherapeutics，美国)0.05克同时溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液。然后将上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜/聚乙二醇二丙烯酸酯溶液加入到10毫升明胶多重改性衍生物溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
实施例13明胶多重改性衍生物交联水凝胶作为细胞粘附生长的基质
按照实施例12在24孔标准细胞培养板内制备6种明胶多重改性衍生物交联水凝胶，每孔为0.4毫升。12小时后整块细胞培养板浸泡在75％的酒精溶液消毒2小时。此后细胞培养板用无菌生理盐水浸洗三次。每孔加入1毫升细胞培养液(DMEM，10％牛血清)和2万个NIH3T3成纤细胞。37摄氏度、二氧化碳细胞培养箱培养24小时。显微镜观察发现细胞在聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶表面的黏附铺展与空白细胞培养板相似，细胞呈纺锤形。这个结果表明二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶是细胞粘附生长的良好基质。

Claims (2)

1.由下述通式(I)结构和至少下述通式(II)、(III)和(IV)中一种结构组成的明胶多重改性衍生物：
Figure FSB00000100773000011
其中G是明胶残基，包括A型明胶残基、B型明胶残基、基因重组明胶残基；R1是亚乙基或
Figure FSB00000100773000012
R2是含有1-5个碳原子的烷基；R3是亚乙基；R4是羧基或羧基盐。
2.一种或一种以上如权利要求1所述的明胶多重改性衍生物通过与至少含有两个相同或不相同的巯基反应活性官能团交联剂交联生成的明胶交联材料，所述的巯基反应活性官能团交联剂为聚乙二醇二乙烯砜和/或聚乙二醇二丙烯酸酯。
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