CN105273105B - 改性海藻酸钠及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改性海藻酸钠及其用途。所述改性海藻酸钠是通过现有海藻酸钠接枝10％～40％的含巯基的基团得到。本发明所述改性海藻酸钠具有①形成水凝胶所需时间短(1秒至5分钟内)，②具有良好的生物相容性和生物降解性和③在生理盐水中不溶胀等优点。本发明提供的改性海藻酸钠可作为止血剂。

Description

改性海藻酸钠及其用途

技术领域

本发明涉及一种改性海藻酸钠及其用途。

背景技术

海藻酸钠是从海洋褐藻中提取的一种天然海洋生物多糖。其结构中含有α-L-古罗糖醛酸(guluronate，G)和β-D-甘露糖醛酸(mannuronate，M)两种结构单元。海藻酸钠的结构示意式如式A所示。目前，海藻酸钠海藻酸钠主要应用于微胶囊、药物缓释或纳米胶束制备等生物材料领域。

人体出血后的止血方式主要有生理性止血以及辅助止血两种途径。生理性止血指的是依靠血液中血小板、凝血因子等物质，使得出血处形成血块，从而达到止血目的；辅助止血指的是依靠各种形式的止血剂，通过覆盖粘合伤口、增强生理性止血效果等方式进行止血，通常应用于外伤或手术过程中的大面积出血。

根据材料的不同，止血剂可以分为天然材料类止血剂和合成材料类止血剂两大类。其中，已经市场化的天然材料类止血剂有胶原类、凝血酶类、壳聚糖类和纤维素类。胶原类和凝血酶类止血剂是从人体或动物体内提取的物质，作用机理是增强生理性止血作用，从而缩短凝血时间，其止血效果优异，但它价格昂贵，显著增加了手术费用；壳聚糖类和纤维素类止血剂作为天然多糖止血剂的代表，主要的产品是各类可降解止血纱布，但是由于纱布不能与伤口完全贴合，所以其止血效果不及胶原类和凝血酶类止血剂。已经市场化的合成类止血剂主要是α-氰基丙烯酸酯类，它能迅速粘合人体组织，达到止血目的。其优点在于止血能力极强，但缺点在于生物相容性差，不能降解。

虽然现有海藻酸钠遇钙离子(Ca²⁺)等二价阳离子水溶液会形成水凝胶，但是所形成的水凝胶在生理盐水中的溶胀率非常高。如将现有海藻酸钠作为止血剂应用，显然存在问题。因此，对现有海藻酸钠改性，势在必行。

发明内容

本发明的发明人经研究发现：如能在现有海藻酸钠接枝一定数量的巯基(-SH)，其与水混合后同样在短时间内形成水凝胶，且所形成的水凝胶在生理盐水中无溶胀现象。

据此，本发明一个目的在于，提供一种结构新颖的改性海藻酸钠。

本发明所述的改性海藻酸钠，通过现有海藻酸钠(下文简记为SA)接枝10％～40％的含巯基(-SH)的基团得到。

本发明另一个目的在于，揭示上述改性海藻酸钠一种用途。即所述改性海藻酸钠在制备止血剂中的应用。

本发明提供的改性海藻酸钠具有如下优点：

(1)所述改性海藻酸钠遇水或生理盐水在短时间(1s～5min)内形成水凝胶，且无溶胀现象；

(2)所述改性海藻酸钠有很好的生物相容性和生物降解性，且价格低廉。

附图说明

图1实施例1制备的改性海藻酸钠及其水凝胶的拉曼光谱图；

其中，(a)为实施例1制备的改性海藻酸钠的拉曼光谱图，

(b)实施例1制备的改性海藻酸钠形成水凝胶的拉曼光谱图。

图2实施例1制备的改性海藻酸钠形成水凝胶的储能模量、损耗模量及粘度曲线；

其中，G’代表储能模量，G”代表损耗模量，|f|代表粘度。

图3不同浓度的改性海藻酸钠形成水凝胶对人正常肝细胞(QSG-7701)毒性柱状图。

具体实施方式

在本发明一个优选的技术方案中，本发明所述的改性海藻酸钠是通过由SA与含有巯基(-SH)的、且能与SA所含羧酸钠(-COONa)官能团反应的化合物反应，制得的。

进一步优选的技术方案是：由SA与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐反应，得到目标物(本发明所述的改性海藻酸钠)。

在本发明另一个优选技术方案中，所述改性海藻酸钠由主要步骤如下的制备方法制得：

将SA配成水溶液，得到SA水溶液，并使其pH值为3～7；

另将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物置于水中，得到EDC、NHS和水的混合物，将所得EDC、NHS和水的混合物加入上述pH值为3～7的SA水溶液中，在20℃～60℃状态保持1小时至4小时，再在此体系中加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(CME)，同样在20℃～60℃状态保持1小时至60小时，加入乙醇，有沉淀物产生，过滤，滤饼依次经乙醇和乙醚洗涤，及干燥即可得目标物(本发明所述的改性海藻酸钠，下文简记为“SA-SH”)。

其中：SA中的羧酸钠基团-COONa与EDC和NHS的摩尔比为1∶(0.5～5)∶(0.5～5)；SA中的羧酸钠基团-COONa与CME的摩尔比为1∶(0.5～5)。

SA的羧酸钠基团摩尔数量计算方法为，SA质量除以结构单元摩尔质量，即得到SA结构单元的摩尔数量，由于SA每个结构单元都有羧酸钠基，所以结构单元的摩尔数量就是SA羧酸钠基的摩尔数量。(M与G两种结构单元摩尔质量相同)。

在本发明又一个优选技术方案中，SA分子量优选50kDa～500kDa，所用SA中M单元(β-D-甘露糖醛酸)与G单元(α-L-古罗糖醛酸)的摩尔比为1:(0.5～2)。

本发明所述含巯基(-SH)的基团的接枝率，由式(1)计算得到：

式(1)中，S％为由元素分析测试SA-SH样品中的硫含量，m为SA-SH样品的质量。

将上述SA-SH置于水、生理盐水或含有钙离子(Ca²⁺)等二价阳离子水溶液中均会在1秒至5分钟内形成水凝胶。

本发明提供的SA-SH具有如下优点：

①形成水凝胶所需时间短(1秒至5分钟内)，②具有良好的生物相容性和生物降解性，和③在生理盐水中不溶胀。

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，期目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。

实施例1

称取分子量为50kDa，M/G＝1：1的海藻酸钠10g，溶解于200mL pH＝3的水溶液中，配制成50g/L的海藻酸钠水溶液。将EDC(1g)与NHS(1g)溶解于5mL水中，配制成催化剂溶液，将所配置的催化剂溶液加入上述浓度为50g/L的海藻酸钠水溶液中，在室温(20℃)条件下搅拌1小时，再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(2g)，升温至60℃，继续搅拌反应2h，停止搅拌，用400mL乙醇进行沉降，抽滤收集沉淀物，分别使用50ml乙醇洗涤沉淀物三次，最后分别使用50mL乙醚洗涤沉淀物三次，真空干燥4h获得巯基化改性的海藻酸钠(简记为“SA-SH-1”)，SA-SH-1的巯基接枝率为10％。

将SA-SH-1置于球磨机内粉碎，称取0.1g粉末状SA-SH-1于样品瓶中，加入5mL水，体系在10秒以内生成水凝胶(简记为“水凝胶-1”)。

SA-SH-1和水凝胶-1的拉曼光谱图见图1。

由SA-SH-1的拉曼光谱(图1(a))和水凝胶-1的拉曼光谱(图1(b))可知，SA-SH-1的拉曼光谱中在波数524cm处(二硫键的吸收峰)无吸收峰；水凝胶-1的拉曼光谱在波数524cm处出现了二硫键的吸收峰，说明了凝胶网络之间是通过二硫键连接而成的。

水凝胶-1的的储能模量、损耗模量及粘度曲线见图2。由图2可知，水凝胶-1储能模量维持在1000Pa-10000Pa之间，损耗模量维持在100Pa-10000Pa之间，且储能模量一直比损耗模量数值高，说明了凝胶网络结构具有一定的强度。

从粘度变化趋势上可以看出，随着频率的上升，水凝胶-1的粘度逐渐下降，最后小幅上升。

实施实例2

称取分子量为150kDa，M/G＝1：0.5的海藻酸钠10g，溶解于200mL pH＝5的水溶液中，配制成15g/L的海藻酸钠水溶液。将EDC(2g)与NHS(2g)溶解于10mL水中，配制成催化剂溶液，将所配置的催化剂溶液加入上述浓度为15g/L的海藻酸钠水溶液中，在室温(20℃)条件下搅拌1小时，再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(4g)，升温至50℃，继续搅拌反应2h，停止搅拌，用800mL乙醇进行沉降，抽滤收集沉淀物，分别使用100ml乙醇洗涤沉淀物五次，最后分别使用100mL乙醚洗涤沉淀物五次，真空干燥12h获得巯基化改性的海藻酸钠(简记为“SA-SH-2”)，SA-SH-2的巯基接枝率为15％。

将SA-SH-2置于球磨机内粉碎，称取0.1g粉末状SA-SH-2于样品瓶中，加入5mL的0.9％生理盐水溶液，体系在10秒以内生成水凝胶(简记为“水凝胶-2”)。

SA-SH-2和水凝胶-2与SA-SH-1和水凝胶-1有着极为相似的拉曼光谱图，在此不再赘述。

实施例3

称取分子量为300kDa，M/G＝1：1的海藻酸钠10g，溶解于200mL pH＝6的水溶液中，配制成50g/L的海藻酸钠水溶液。将EDC(3g)与NHS(3g)溶解于20mL水中，配制成催化剂溶液，将所配置的催化剂溶液加入上述浓度为15g/L的海藻酸钠水溶液中，在室温(20℃)条件下搅拌3小时，再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(5g)，升温至40℃，继续搅拌反应24h，停止搅拌，用1L乙醇进行沉降，抽滤收集沉淀物，分别使用200ml乙醇洗涤沉淀物三次，最后分别使用200mL乙醚洗涤沉淀物三次，真空干燥16h获得巯基化改性的海藻酸钠(简记为“SA-SH-3”)，SA-SH-3的巯基接枝率为25％。

将SA-SH-3置于球磨机内粉碎，称取5g粉末状SA-SH-3置于带有高压氮气的喷射装置中，将其喷射在大鼠腹部0.5cm×0.5cm的创口处，在1min内吸收创口渗出的血液并形成了水凝胶。

实施例4

称取分子量为500kDa，M/G＝1：2的海藻酸钠1g，溶解于200mL pH＝7的水溶液中，配制成5g/L的海藻酸钠水溶液。将EDC(5g)与NHS(5g)溶解于40mL水中，配制成催化剂溶液，将所配置的催化剂溶液加入上述浓度为15g/L的海藻酸钠水溶液中，在室温(20℃)条件下搅拌4小时，再加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(10g)，升温至30℃，继续搅拌反应60h，停止搅拌，用2L乙醇进行沉降，抽滤收集沉淀物，分别使用2L乙醇洗涤沉淀物六次，最后分别使用2L乙醚洗涤沉淀物六次，真空干燥24h获得巯基化改性的海藻酸钠(简记为“SA-SH-4”)，SA-SH-4的巯基接枝率为20％。

取5g条状SA-SH-4，将其剪裁成1cm×1cm的形状，将其覆盖在大鼠腹部0.5cm×0.5cm的创口处，在1min内吸收渗出的血液并形成了水凝胶。

实施例5

选取的研究对象细胞是QSG-7701人正常肝细胞，在培养基内加入不同浓度的SA-SH-1，并原位固化交联后进行细胞培养，在1/2/3/4/5天时取样并使用噻唑蓝(MTT)处理，利用酶标仪检测实验组492nm下的吸光度A_sample，并测试空白对照组的吸光度A_control，利用公式得到细胞相对增值率数据，RGR(relative growth rate)，即相对增值率。具体结果见图3。

由图3中可以看出，不同水凝胶浓度下细胞相对增值率均大于85％，表明凝胶样品对细胞无明显的抑制作用，细胞毒性保持在1级(医用材料的细胞毒性分级标准参考GB/T14233.2-2005)。

由上述相同的毒性试验可知：SA-SH-2，SA-SH-3和SA-SH-4的凝胶样品对细胞无明显的抑制作用，细胞毒性保持在1级(具体实验步骤及结果不再赘述)。

Claims (4)

1.一种改性海藻酸钠，其特征在于，所述改性海藻酸钠由现有海藻酸钠接枝10％～40％的含巯基的基团得到；

其中，所述现有海藻酸钠分子量为50kDa～500kDa、且其中β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗糖醛酸的摩尔比为1:(0.5～2.0)，所述含巯基的基团来源于L-半胱氨酸甲酯盐酸盐。

2.如权利要求1所述的改性海藻酸钠，其特征在于，其中，所述改性海藻酸钠由主要步骤如下的制备方法制得：

将现有海藻酸钠配成pH值为3～7的水溶液；

另将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺的混合物置于水中，得到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺和水的混合物，将所得1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺和水的混合物加入上述pH值为3～7的水溶液中，在20℃～60℃状态保持1小时至4小时，再在此体系中加入L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，同样在20℃～60℃状态保持1小时至60小时，加入乙醇，有沉淀物产生，过滤，滤饼依次经乙醇和乙醚洗涤，及干燥即可得目标物。

3.如权利要求2所述的改性海藻酸钠，其特征在于，其中，现有海藻酸钠中的羧酸钠基团与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶(0.5～5)∶(0.5～5)；现有海藻酸钠中的羧酸钠基团与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐摩尔比为1∶(0.5～5)。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的改性海藻酸钠在制备止血剂中的应用。