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CN100471861C - 从细胞和组织中快速提取rna - Google Patents

从细胞和组织中快速提取rna Download PDF

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CN100471861C
CN100471861C CNB2004100595259A CN200410059525A CN100471861C CN 100471861 C CN100471861 C CN 100471861C CN B2004100595259 A CNB2004100595259 A CN B2004100595259A CN 200410059525 A CN200410059525 A CN 200410059525A CN 100471861 C CN100471861 C CN 100471861C
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Abstract

提供一种从生物系统(细胞、细胞碎片、细胞器、组织、器官或有机体)中提取RNA的方法，其中将含有RNA的溶液与能结合RNA的基质接触。通过应用负压从基质回收RNA。所有的离心步骤都不超过30秒钟。优选地，在过滤前稀释RNA，并且采用一个或多个洗涤步骤来去除干扰物。在一种这样的方法中，除了DNA剪切和干燥步骤，在提取步骤中不进行离心。

Description

从细胞和组织中快速提取RNA
背景技术
本发明涉及用于体外诊断的RNA的提取。
由于基因组技术和生物信息学的新进展，用于指示癌症和其它疾病的诊断、预测和治疗的新的基因表达标记正迅速地被发现。为了在体外检测中评价和使用这些标记，需要一种快速、灵敏和易操作地从细胞、组织和其他生物学成分中提取RNA的方法。
在肿瘤学中，快速的手术中分子检测用于更加灵敏地探测出手术范围(surgical margin)、淋巴结或者其他转移位点，确定组织中是否存在癌症。为了加强手术护理，实施手术的外科医生必须能够在通常约45分钟的患者进行手术期间获得用于手术安排的诊断结果。为了酌留用于反转录、连续扩增和分子标记检测的时间，必须在几分钟内提取和纯化细胞和组织中的可扩增RNA。
已经开发了几种用于从细胞和组织中分离和纯化RNA的不同方法。这些方法包括基于膜的方法、基于溶液的方法和基于磁场的方法。实施基于溶液的方法一般需要至少90分钟，并且包括使用有毒溶剂。已经开发了磁性颗粒方法，但是需要至少45分钟。
用于实施基于膜的RNA纯化的试剂盒可以从一些销售商购买得到，一般地，这些试剂盒被开发成适合于小规模(30mg或更少)制备RNA(如QIAGENRNeasy Mini Kit)、中等规模(250mg组织)(如QIAGEN RNeasy Mini Kit)和大规模(最多1g)(QIAGEN RNeasy Mini Kit)地从细胞和组织中制备RNA。不幸的是，目前可获得的基于膜的RNA提取和纯化系统需要多个操作步骤，这对于手术中的诊断应用来说过于缓慢。
因此，特别是对于在手术中的诊断应用来说，需要更加快捷的基于膜的RNA提取方法。
发明概述
本发明是一种从生物系统(细胞、细胞碎片、细胞器、组织、器官和有机体)中提取RNA的方法，其中含有RNA的溶液与RNA能与之结合的基质接触。通过应用负压从基质上回收RNA。离心步骤都不超过30秒钟。优选地，在过滤前稀释RNA，并采用一个或多个洗涤步骤去除干扰物。在另一个实施方案中，除了DNA剪切和干燥步骤，在提取步骤中不进行离心。
本发明的另一方面，从含有目标RNA的细胞中去除不具有目标RNA的细胞。然后溶解含有目标RNA的细胞，将溶解产物与含有RNA粘着或结合于其上的物质的基质接触。不用离心，优选对基质施加少于15秒钟的负压从基质上去除干扰物。在本发明的一个方面，对底物施加的负压为11.6-13.1psi。
本发明还有一个方面，从生物系统中提取RNA的方法具有如下步骤：
(a)从生物系统中获得含有细胞的样品，
(b)任选地，从该样品中去除没有目标RNA的细胞来产生一个工作样品，
(c)溶解含有目标RNA的细胞，制备其匀浆，
(d)稀释匀浆，
(e)将湿润、均化的工作样品与含有RNA粘着或结合于其上的物质的基质接触，
(f)使样品结合到基质上，
(g)去除杂质和干扰物，
(h)干燥基质，和
(i)从基质上洗脱RNA；
本方法在8分钟中内实施。
发明详述
本发明的生物系统是细胞器、细胞、细胞碎片、组织、器官或者有机体。含有目标RNA的溶液可以得自任何存在于生物系统中或者从中制备的流体。
成功分离完整RNA一般包括至少4个步骤：有效地裂解细胞或组织、使核蛋白复合物变性、灭活内源性核糖核酸酶(RNA酶)和去除杂质DNA和蛋白质。
根据含有目标RNA(即其标记将被分析的RNA)的样品，要求去除不含目标RNA的细胞。去除不含目标RNA的细胞优选是通过溶解它们，并从溶液中去除溶解产物。当用全血进行试验时，由于血红细胞大量存在并且无核，构成了其中无目标RNA的细胞的主体。血红细胞对低渗休克非常敏感，因而可以使其在低渗缓冲液中胀裂。溶解剂是本领域熟知的，其中包括含有氯化钾铵或者草酸铵的溶液。
对于组织来说，可以使用如Qiagen提供的商品RNA提取试剂盒、溶解缓冲液。优选地，这些试剂含有硫氰酸胍盐(GTC)溶液，和一种或多种表面活性剂如十二烷基硫酸钠，以及用于抑制或灭活核糖核酸酶(RNA酶)的强还原剂如2-巯基乙醇。GTC具有特别有用的破坏作用和RNA保护功能。GTC/表面活性剂组合用于破坏核蛋白复合物，使RNA释放到溶液中并分离去除蛋白质。存在高浓度GTC时，稀释细胞提取物会导致发生细胞蛋白选择性沉淀，而RNA仍保留在溶液中。更优选地，使用RLT缓冲液(有时称作为溶解或者均化缓冲液)，该缓冲液可以从Qiagen购买到，是Qiagen公司的RNA提取试剂盒的一部分。细胞和不需要的细胞成分的溶解和去除可以借助使用匀浆机、玻珠混合机、电动机和研杵、手磨等类似设备进行机械破坏。
组织中转移灶和微转移灶在各个结节或其它组织中的分布是不一致的。因此，必须获得足够多样品以至于不会遗漏转移灶。本方法的一种解决样品问题的方法是均化大组织样品，接着稀释充分混合的均化样品，用于后续的分子检测。
在匀化之后和将匀浆加入到结合RNA的步骤之前进行稀释(如下文所述)是极其有益的。稀释步骤包括加入稀释液，该稀释液是一种稀释组织匀浆而不会使RNA不稳定的试剂。优选地，稀释液是如上述的RLT缓冲液试剂。优选地，匀浆稀释为每毫升稀释液2-8mg匀浆。更优选地，匀浆稀释为约2-4mg/ml之间。更优选地，匀浆稀释为约4mg/ml。
这种稀释步骤可以进行快速过滤，例如通过旋转柱。这可避免或者极大降低堵塞旋转柱，不需要后来的大量匀化缓冲液，不需要紧接的离心步骤和不需要将样品通过切碎柱或切碎设备。结果，该稀释步骤使得RNA提取更容易并得到一个更加标准化的方法。
一般经过一个或多个洗涤步骤除去细胞、碎片或者非RNA物质，然后通过如从装有基质的柱中洗脱提取该纯化的RNA。
用乙醇将RNA从溶液中选择性地沉淀出，结合到膜/基质上，如玻璃纤维的硅表面。由于离液盐破坏水分子，RNA快速地结合到基质上，从而促使核苷酸吸附到硅胶上。通过简单的洗涤步骤进一步纯化结合的总RNA，除去杂质盐、蛋白质和细胞杂质。最后，通过加入去核酸酶水从膜上洗脱总RNA。
几种基于“旋转柱”纯化的、用于从组织中提取RNA的试剂盒已经被商品化。所有试剂盒都适合于本发明的方法。这些试剂盒包括Invitrogen公司(Carlsbad，CA)、Stratagene(La Jolla，CA)、BDBiosciences Clontech(Palo Alto，CA)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Ambion公司(Austin，TX)、Promega公司(Madison，WI)销售的产品。典型地，这些试剂盒含有缓冲液形式具有胍盐(4.0M或更多)的溶解结合缓冲液、缓冲液形式的含有或不含有离液盐如胍盐的不同稀释度的乙醇洗涤溶液、和洗脱缓冲液，通常含有去核酸酶蒸馏水。典型地，这些试剂盒含有试剂如：
溶解/结合缓冲液(4.5M胍盐-盐酸，100mM磷酸钠)，
洗涤缓冲液I(5M胍盐-盐酸中的37％乙醇，20mM Tris-HCl)，
洗涤缓冲液II(20mM NaCl中的80％乙醇，2mM Tris-HCl)，
洗脱缓冲液，和
去核酸酶灭菌双蒸水。
使用RNA能与之结合的基质或者结合了RNA能与之结合的物质的基质，是本方法与基于膜的RNA提取方法的区别之处。RNA通过任何化学或物理方法方式到这种物质上，只要RNA容易从该物质上释放，例如用适当试剂稀释。现在许多基质常用于基于膜的方法。在EP0496822中描述的Macherey-Nagel硅胶膜技术是这类方法，在此引入作为参考。实质上，RNA被吸附到硅胶膜上。在溶液中去除水合分子上的水分的试剂包括高浓度胍盐；多糖和蛋白质不吸附而被除去。在洗脱步骤之后，在低盐条件下洗脱纯的RNA。
在基于膜的系统中，离子交换树脂也常常用作RNA提取的基质。例如，Qigen具有商用阴离子交换树脂，其中当工作样品加到该基质(结合)时采用低盐浓度，在洗涤RNA过程中使用高盐浓度，并通过乙醇沉淀。这种树脂以硅胶为基础，并具有高密度二乙基氨基乙基基团(DEAE)。使用该基质时，通过缓冲液的加入和使用控制盐浓度和pH。一种可购自Qiagen的这类离子交换树脂如下：
Figure C200410059525D00081
最优选的基质是如下的单硅胶：
Figure C200410059525D00082
当存在结合缓冲液时，核苷酸被吸附到硅胶上。在本发明的优选实施例中，该基质装在容器如柱中。最优选地，这些柱可以购买得到，如从Qiagen，GbH购买到的“RNeasy”柱。
从少于30mg组织样品中提取和纯化RNA的优选方法是将可从QIAGEN，GbH购买的RNeasy Mini Kit中含有的试剂应用于本文描述的方法。由下面描述的方法，普通技术人员采用从QIAGEN，GbH购买的QIAGEN RNeasy MIDI或QIAGEN RNeasy MAXI Kit很容易地进行调整，特别是试剂配置，用于从较大组织样品中提取更大量RNA。
当采用这种试剂盒时，本发明的优选方法如下：
对于少于20mg起始组织，往组织中加入350-600μl均化缓冲液(优选得自Qiagen试剂盒中的RLT缓冲液)，对于20-30mg组织，优选加入600μl缓冲液。根据组织样品来调整均化缓冲液的用量。然后用下面的方法之一来破坏组织或细胞，包括但不限于转子定子匀浆机、玻珠混合机、电动机和研杵、和通过人工研磨。当进行人工破坏细胞和组织时，常常使用一次性组织研磨机(VWR科学，产品目录号15704-126或15704-124)进行匀化。更优选地，可以采用用于该目的的机械设备进行匀化，如得自Omni International(Warrenton，VA)的PCR组织匀化试剂盒。
匀化时间一般约为1分钟，优选为当组织显然被匀化时。
对于致密的组织样品，降低样品的粘性是需要的。更优选地，通过往匀浆中加入匀化缓冲液来实现(2-8mg匀浆/ml缓冲液)。也可以一次或多次经过装在去RNA酶的注射器上的针头(优选为20线规)或者采用设备如与离心一起使用的QIA切碎柱来实现。
优选将1倍体积70％乙醇加到清洗过的溶解产物，吹打混合。
将约700μl已制备的样品加到装有RNA结合基质的容器中(优选为Qiagen试剂盒中的RNeasy硅胶小型柱)和/或通过过滤弃去(与离心并用)和优选应用真空。优选应用约11-13pis(在所有应用真空的步骤中)的真空约15-60秒。本文中在所有应用真空的步骤中，只要应用的真空没有超出基质耐受该压力的极限，可以提高压力来缩短应用真空的时间。
将洗涤缓冲液(优选约700μl Qiagen试剂盒中的RW1缓冲液)加到装有RNA结合基质的容器中(优选RNeasy柱)和优选通过过滤和优选施用真空，过滤去除和/或弃去流通液，然后除去和/或弃去收集管(collection tube)。
第二洗涤缓冲液(优选约500μl Qiagen试剂盒中的RPE缓冲液)被滴加到柱上。轻轻地封好小管，通过过滤和优选地应用真空去除和/或弃去流通液。
任选地，往容器(优选RNeasy柱)中再加入洗涤缓冲液(优选约500μl RPE缓冲液)。轻轻地封好小管并干燥基质/膜。优选地将容器放到新的2ml收集管中并离心(优选为约8000g 1分钟)。
对于洗脱，优选将容器转移到新的1.5ml收集管中，并将30-50μl去RNA酶水直接滴加到基质/膜上。轻轻地封好小管并离心(优选为10,000RPM约30秒钟)来洗脱RNA。如果期望RNA产量超过30μg，优选地在洗脱中重复该操作。
用于从动物组织中分离总RNA的RNAeasy方法(QIAGEN RNAeasy手册，2001年6月)需要至少6分钟45秒的总离心时间，当包括离心的加速和减速时间在内时，至少需要8分钟45秒。与此相比，在本发明的快速方法中，全部过滤和离心步骤的总时间是2分钟15秒，当包括离心的加速和减速时为3分钟。对于本发明的方法和现有技术的方法来说，45秒到1分钟的样品操作(包括稀释和混合步骤)时间是常见的。
因此，本发明的总时间少于8分钟，优选为少于6分钟。当样品是单个淋巴结时，5分钟的总提取时间是特别期望和可达的。
真空歧管如QIA vac24真空歧管优选地用于便利地真空处理并联的旋转柱。用真空替代离心使样品和洗涤溶液通过柱膜，产生更高的速度，减少从细胞和组织中提取和纯化RNA的处理(hands-on)时间。
该方法与适当破坏方法一起用于从动植物细胞以及细菌、酵母、植物和丝状真菌中提取RNA。
实施例
实时PCR
本发明的实施例基于实时PCR的使用。在实时PCR中，在PCR反应的指数阶段实时监控聚合酶链式反应的产物，而不是在终点测定。因此，DNA和RNA的量化更加精确和可重复。在每个循环中记录荧光值，表示在扩增反应中该点扩增产物的产量。在反应开始加入越多模板，达到首次记录的荧光信号显著地高于背景的点的循环次数越少，这是(Ct)值的定义。阈循环的概念允许采用荧光RT-PCR精确和可重复地量化。可以采用多种不同检测方法进行PCR产物的同源检测，包括双链DNA结合染色(如SYBR绿色)、荧光探针(如TaqMan探针、分子信标)和直接标记引物(如Amplifuor引物)的方法。
实施例1：缩短离心时间
在本实施例中，两个乳腺淋巴结购自Asterand公司(DetroitMI)
一个淋巴结通过病理学被确定为癌症阳性(ALNC1)，另一个为癌症阴性(ALNN1).
作为对照，如上所述采用生产商建议的QIAGEN RNeasy Mini程序提取和纯化各个淋巴结的30mg组织。对于每个样品，对单种匀浆进行三次提取。以相同的方式，采用QIAGEN RNeasy Mini程序处理三份30mg切片，除了在最后加入RPE洗涤缓冲液后之外，所有离心步骤减少为30秒钟。所有的离心步骤在Eppendorf型5415C微型离心机(Brinkman，Instruments公司，Westbury，纽约)中进行。
在260nm和280nm下，在Hewlitt-Packard HP8453UV-可视分光系统(Waldbronn，德国)中分光光度分析从各个淋巴结中提取的RNA，在260nm下确定总RNA产量，根据260nm/280nm的比值确定各个样品的RNA质量。
除非下文注明，所有包括引物的试剂购自Invitrogen公司，Carlsbad CA。
如下转录得到的RNA来制备cDNA拷贝。制备含有5μL锚定的寡dT23、5μL的10mM各种dNTP和RNA酶处理水(Sigma化学公司，St.Louis，Mo)的50μL母液，并加入2.5μg RNA，将溶液加热到70℃ 5分钟，然后放置在冰上。然后加入38μL具有20μL 5X上标第一链缓冲液溶液、10μL的0.1M二硫苏糖醇、3μL 40U/μL的Rnasin(Promega公司，Madison威斯康星州)和5μL的200U/μL上标II反转录酶和去RNA酶水(Sigma化学公司，路易斯大街，密苏里州)的溶液。试管在42℃下温育50分钟，然后加入40μL的0.5M NaOH，试管在70℃下温育5分钟。加入20μL pH 7.0的1M的Tris-HCl缓冲液，接着加入90μL去RNA酶水去RNA酶水。假定RNA完全转化成cDNA以及1μg转化倍数为100,000个细胞当量(CE)，那么80mM Tris缓冲液浓度为1000CE/μl被用于在所有后面的实时PCR分析。
下面在实时PCR程序中的基于SYBR绿色检测的方法被用于定量检测看家基因胆色素原脱氨酶(PBGD，Seq.ID No.20)，以及乳腺癌特异性基因乳腺球蛋白(SeqID No.17)和促乳素诱导蛋白(PIP，Seq IDNo.18)。储存的主要混合液含有10μL 10XPCR缓冲液#1(Applied Biosystem公司，Foster City，CA)、0.1μL 10M氯化镁、2μL 10mM dTNP’s、1μL 100X SYBER绿溶液(Sigma化学公司，St.Louis，Mo.)、2μL得自5uM母液的各种引物的TE缓冲液、和0.75μL Taq/抗Taq抗体混合物，和加入去RNA酶水去RNA酶水到94μL。混合Taq DNA聚合酶和抗Taq抗体，并且在加入其他反应成分之前先温育10-15分钟。往各个孔中加入1μL cDNA(1,000CE)以及49μL上述主要混合液。
使用下列引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2用于PBGD；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4用于乳腺球蛋白；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6用于PIP。
SEQ ID NO.1ATGACTGCCT TGCCTCCTCA GTA(PBGD)
SEQ ID NO.2GGCTGTTGCT TGGACTTCTC TAAAGA(PBGD)
SEQ ID NO.3CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA(乳腺球蛋白)
SEQ ID NO.4TCTGTGAGCC AAAGGTCTTG CAGA(乳腺球蛋白)
SEQ ID NO.5GGCCAACAAA GCTCAGGACA ACA(PIP)
SEQ ID NO.6GCAGTGACTT CGTCATTTGG ACGTA(PIP)
在Applied Biosystem7900(Foster City，CA)中进行实时PCR测定。采用94℃2分钟，接着50个循环94℃15秒、62℃15秒和72℃45秒的热反应模式和阈值275。
这些试验的结果总结在表1中，表明与标准QIAGEN操作相比，用缩短离心步骤提取的样品的持家基因PBDGGD、癌基因乳腺球蛋白和PIP的RNA产量和扩增效率没有大的差异。这些结果表明快速离心方法不会抑制反转录或者PCR步骤。
表1.缩短离心时间对乳乳淋巴结的RNA产量和实时PCR的影响
Figure C200410059525D00121
作为快速操作中的高RNA质量的额外证明，还通过Agilent 2100生物分析仪用6000毫微芯片试剂盒(Agilent Technologies，Wilmington，德国)评价上述所有样品的RNA质量。基于存在明确的18s和28s核糖体峰和最小RNA降解，电泳图结果表明了类似高质量的RNA。根据Agilent生物分析仪的数据，所有样品具有接近1.6或更高的核糖体最高比例，这也证实从缩短离心操作中得到高质量RNA。提取RNA的总时间为5分钟15秒。
实施例2.RNA产量、反转录和实时PCR扩增
在本实施例中，使用具有导管癌的乳腋结节。所有试剂来自QIAGENRNeasy试剂盒(产品目录号74181，QIAGEN公司，Valencia公司)。下列供应品和仪器也是购自QIAGEN公司：QIA vac 24过滤器(产品目录号19403)、QIA切碎机(产品目录号79656)、QIA vac连接器(产品目录号19409)和Vac连接器(产品目录号19407)。所有其他试剂从实施例1所描述的来源获得。
用于本试验组织匀浆，将540mg乳结节组织悬浮在10.8ml的悬浮液RLT，使用前匀化。以多种不同方式处理得到的匀浆。
第I部分.评价真空歧管。本试验采用QIA vac24过滤器并应用真空来实施。
1.将700μL匀浆加入QIA切碎柱中，并于14,000RPM离心2分钟。
2.将等体积70％乙醇加到溶解产物中，吹打混合。紧接着继续后面的步骤
3.将700μL样品加到与真空歧管连接的RNEasy小型柱中。应用12psi真空处理10秒。
4.将700μL缓冲液RWI加到柱中，以同样的真空压强应用相同时间。
5.将500μL缓冲液RPE滴加到柱中，以同样的真空压强应用相同时间。将另一500μL缓冲液RPE加到柱中，以同样的真空压强应用相同时间。
6.将该柱放入收集管中，并于14,000rpm离心1分钟来干燥。
7.将柱转移到新的1.5ml管中。将25μL去RNA酶的水直接滴加到膜上。
8.离心该膜60秒来洗脱。
第II部分被实施来确定减少离心时间为30秒以及应用真空歧管的作用
1.将700μL匀浆加入QIA切碎柱中，并于14,000RPM离心30秒。
2.将等体积70％乙醇加到溶解产物中，吹打混合。紧接着继续后面的步骤
3.将700μL样品加到与真空歧管连接的RNEasy的小型柱中。应用12psi真空10秒。
4.将700μL缓冲液RWI加到柱中，并如上应用真空。
5.将500μL缓冲液RPE滴加到柱中，并如上应用真空。将另一500μL缓冲液RPE加到柱中，并如上应用真空。
6.将该柱放入收集管中，并于14,000rpm离心30秒来干燥该柱。
7.将柱转移到新的1.5ml管中。将25μL去RNA酶水直接滴加到膜上。
8.离心该膜30秒来洗脱。
第III部分.采用低速离心
在本实施例中，在上述第II部分的步骤1、6和7中以10,000rpm使用购自VWR科学，West Chester，PA的10MVSS型离心机。
第IV部分.去除干燥柱的步骤
作为阴性对照，包括一个去除第II部分所述操作中的步骤6(第II部分)的试验。
下述表2给出具有3’和5’引物的持家基因PBGD的这些各个部分中的RNA产量、RNA的260/280nm比值(评估RNA纯度)和基于SYBR绿色的实时PCR分析。操作和试剂与实施例1中描述的相同。
表2.从乳结节中提取RNA。
Figure C200410059525D00141
这些试验结果表明提高速度和降低仪器费用的方案导致RNA产量的部分损失。但是，通过改进的方案获得的RNA的产量已经大大超过反转录反应所需的量(2-2.5μg)。实时PCR的结果说明这些快速方法获得可以被实时PCR转录和量化的RNA。
实施例3.比较快速方法与现有方法(通过基于实时PCR的Taqman分析R)
总共16个H&E阳性结节和15个H&E阴性乳结节购自GenomicsCollaborative。从每个结节上切下两个30mg组织片。
第I部分.如下处理一个30mg组织片：加入600μl的RLT缓冲液，用任意一个组织研磨机(产品目录号15704-126，VWR科学，West Chester，PA)人工匀化组织样品20-40秒。在Eppendorf型5415C微型离心机中以最大速度离心3分钟。将上清液转移到新的试管中，加入1体积70％乙醇。
将样品(700μL)加入到放置在QIA vac24真空歧管上的RNeasy小型柱中，并应用真空。使RWI缓冲液(700μL)滤过该柱。将RPR缓冲液(500μL)滴加到该柱上并过滤。将另一RPR缓冲液(500μL)加到该柱上并过滤。将RNeasy柱放入一个2ml收集管中，在微型超速离心机中以最大速度离心1分钟。然后通过将RNeasy柱转移到新的1.5ml的收集管中，加入50ul去RNA酶水，并于8000Xg离心1分钟来从该柱中洗脱RNA。
第II部分.如下用快速方法处理第二个30mg乳结节组织片：(1)将组织片加入600μl的RLT缓冲液，用任意一个组织研磨机人工匀化组织样品20-40秒。(2)通过QIA切碎柱以最大速度离心匀浆30秒钟。(3)将1体积70％乙醇加入溶解产物中，吹打混合。(4)然后将样品加入到放置在QIA vac24真空歧管上的RNeasy小型柱中，并应用真空。(5)往柱中加入700μL RWI缓冲液并滤过该柱。(6)将500μLRPR缓冲液加到该柱上并过滤。(7)将柱放入一个2ml收集管中，以10,000rpm离心30秒钟。(8)然后将25ul去RNA酶水加到膜上，以10,000rpm离心该柱30秒钟来洗脱RNA。快速方法的所有离心步骤都在10MVSS VWR型离心机中进行。
反转录所提取的RNA，如先前在实施例1中所描述量化RNA和cDNA。
对于Taqman分析，Taqman核心试剂试剂盒、基因Amp 10X PCR缓冲液1、Amp消除尿嘧啶N-糖苷酶和AmpliTaq金DNA聚合酶都购自AppliedBiosystem，Foster，CA。其他所有试剂得自如实施例1所描述的商业性来源。甘油购自Sigma化学公司(St.Louis，Mo.)，而土温20(tween 20)购自EastmanOrganic化学(Rochester，NY)。
乳腺球蛋白引物(SEQ ID NO.3和SEQ IDN O.4)由Invitrogen公司合成(Calsbad，CA)，乳腺球蛋白Taqman探针(SEQ ID NO.7)得自EpochBiosciences(San Diego，CA)。PBGD引物(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)由QIAGEN Operon(Alamenda，CA)合成，而探针(SEQ ID NO.23)由SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)。B305D的引物(SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12)由Invitrogen公司合成和探针(SEQ ID NO.13)由Applied Biosystem公司合成。对于所有的Taqman探针，羧基荧光素(FAM)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)作为染料和猝灭配对。
SEQ ID NO.3.CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA
SEQ ID NO.4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG CAGA
SEQ ID NO.7 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC
TTTGTG-TAMRA
SEQ ID NO.8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGG
SEQ ID NO.9 CATCTTCATG CTGGGCAGGGSEQ ID NO.23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAGTGT-
TAMRA
SEQ ID NO.11.TCTGATAAAG GCCGTACAAT G
SEQ ID NO.12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC
SEQ ID NO.13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA
对于Taqman分析，通过加入10μL 10X PCR缓冲液#1、14μL的25mM氯化镁、8μL的10mM dTNP’s、1μL的AmpErase UNG(1U/μL)、16μL甘油、1μL的1％土温20、0.75μL AmpliTaq金(5U/μL)、6μL得自5μM母液的各种引物、0.4μL的10μM的探针母液、和加水到最终体积94μL，来制备主要混合液。将主混合液(48μL)和2μL来自各个结节样品的cDNA加到光学反应微量滴定板的各个孔中。在盖上光学盖子后，在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystem，Inc.，Foster City，CA)中处理该板。商品试剂包括Taqman PCR核心试剂盒、Taqman DNA模板试剂和Taqman B-肌动蛋白检测试剂都是购自Applied Biosystem(Foster City，CA)，并按照生产商推荐的方法进行分析。阈值0.02被用于乳腺球蛋白分析，0.03用于B305D分析，0.08用于B-肌动蛋白分析，而0.1用于PBGD分析。表3和4中给出Taqman分析三次测定的平均值。
在表3中的15个H&E阴性结节样品以及16个阳性结节样品给出看家基因B-肌动蛋白(SEQ ID NO.19)和PBGD之间的实时测定的比较，表3还给出了2个对照cDNA样品。这些试验结果表明本发明的快速方法获得的Ct值与现有技术方法获得的Ct值十分吻合，证明通过快速RNA提取方法提取的RNA可以达到与现有技术方法提取的RNA相似的反转录和PCR扩增的程度。
表4对基于乳癌标记乳腺球蛋白和B305D(异构体C，SEQ ID NO.14)Ct值的基因表达结果与在表3中评价的相同乳结节样品进行比较。为了确定是否可以根据实时PCR结果在H&E阳性和H&E阴性乳腺结节样品之间产生相关，确定乳腺球蛋白和B305D在H&E阴性结节样品中的各个标记的最低Ct值。在H&E阳性样品中粗略但是谨慎地应用在H&E阴性样品中低于最低值2.5Ct值的关闭。表4阴影部分的样品具有较高的这两个乳腺标记的表达，其中Ct值至少比H&E阴性样品中所观察的Ct值低2.5。采用本发明的快速方法和由试剂盒生产商QIAGEN推荐的现有技术方法，这些标记的表达之间都具有极好相关性。
在15个H&E阴性结节样品中用乳腺球蛋白作为标记，GCLNC-24具有不同的Ct值0.4，其在试验误差内。第二个样品的Ct具有较大不同。乳腺球蛋白和B305D的Ct值的较大不同可能是由于难以光谱量化这些样品中的RNA，以及已充分地建立了结节中的转移的不均匀分布(Cserni，1999，通过彻底的组织病理学分析确定乳腺癌在腋窝岗哨淋巴结节中转移.临床病理学杂志，52：0922-924)。
表3.比较快速方法和现有技术方法提取的RNA，通过Taqman分析看家基因B-肌动蛋白和PBGD来测定。
Figure C200410059525D00181
Figure C200410059525D00182
表4.比较快速方法和现有技术方法提取的RNA，通过Taqman分析癌基因乳腺球蛋白和B305D来测定。
Figure C200410059525D0019155927QIETU
Figure C200410059525D0019160025QIETU
  Cut off值＝             33.7    37.5    36.1      36.1
实施例4.QIA切碎柱的评价
本实施例的目的在于证实在匀化淋巴结组织后可以使用QIA切碎柱，并且离心匀浆仅仅30秒钟就得到可行的RNA提取物。
H&E阴性的乳腋窝结节得自Genomics Collaborative(Cambridge，MA)。将490mg组织切片与5.5ml RLT缓冲液混合，匀化结节。取出600微升匀浆，用如实施例2所描述的所有缩短方案提取RNA。作为对照，另一个600微升匀浆用如实施例2所描述的所有缩短方案改进来处理，除了采用3分钟离心替代QIA切碎柱。如实施例1所述得自各个反应的RNA被反转录和量化。如先前实施例3所描述，用Taqman探针进行实时PCR。
这些试验的结果表明与在离心方法中的0.34μg/μL的产量相比，含有QIA切碎操作的方法具有相似的0.31μg/μL的RNA产量。两个样品都得到表示高质量的RNA的相同的260/280nm比率2.1。实时PCR分析也表明，与离心方法相比，QIA切碎柱提取的RNA具有相似的乳腺球蛋白的Ct值(22.5比22.0)、以及相似B305D的Ct值(26.7比26.6)以及相似持家基因PBGD的Ct值(29.1比29.0)和相似B-肌动蛋白的Ct值(18.5比18.2)。
总之，本实施例具有与包括在匀化后用QIA切碎柱代替3分钟离心步骤的方法相似的RNA产量、质量和实时PCR扩增结果。这种改进使进行提取RNA所需时间减少2.5分钟，这对于开发适合于需要快速结果来加强患者护理的手术间或者其他应用的方法是十分重要的。
实施例5.快速RNA提取方法和标准(现有技术)QIAGEN方法用于结肠组织的比较
下面的实施例对用本发明方法和现有技术从结肠组织中提取RNA进行比较。将20mg结肠组织加到600ul RLT缓冲液，并如实施例3所述匀化。匀化的结肠癌组织的一个样品用按照实施例3A所述快速方法处理，一个样品用按照实施例3部分B所述QIAGEN方法处理。从两个处理中得到的RNA在Agilent生物分析仪上检验。
用快速方法和现有技术提取的RNA的电泳图表明，用QIAGEN方法处理的样品的RNA比率为1.54，用快速方法处理的样品为1.37。一般地，任何具有RNA比率超过1.1的样品是可行的。如Agilent生物分析仪所确定，用快速方法处理的样品具有136μg/μL的RNA产量，而用QIAGEN方法处理的样品的RNA产量为280μg/μL。通过这两种方法获得的产量都大大超过反转录反应所需的RNA量(2-2.5ug)。
实施例6.溶解产物的稀释对RNA产量和精确度的影响
下面的实施例说明溶解产物的稀释对RNA产量和RNA回收精确度的影响。在本实施例中，剪切20mg、10mg或5mg的冷冻猪结节组织。用50ml任意的组织磨研磨组织30秒，并搅拌样品。重复称重每个结节三次。
将1ml各个溶解产物转移到一个1.7ml微型离心机的离心管中，然后在Eppendorf微型超速离心机中以最大速度(14,000RPM)离心30秒钟。700μL样品通过QIA切碎柱离心，以最大速度离心30秒钟。然后如先前在实施例2的第I部分步骤4-8所述，洗涤、干燥该柱和洗脱RNA。通过Gene Spec II量化RNA。这些试验的结果显示于表5中，说明与含有10mg和20mg的重量较大的样品相比，在600ml匀化缓冲液中匀化重2.5mg的初始结节组织具有优良的精确度。这些结果表明结节重量较低时提高RNA回收精确度。同时，可以预期较稀的匀浆可以更快地滤过柱，并且将更少存在堵塞过滤器的问题。
实施例7.进行下面的实施例来说明如果稀释了匀浆，在匀化后不需要离心步骤，以及不需要通过设备如QIA切碎机处理来快速提取RNA。
在本实施例中，各个200mg的猪淋巴结节组织片被悬浮在4ml匀化缓冲液RLT中，并在任意的50ml组织磨中匀化30秒。额外加入20ml缓冲液RLT，使得最终浓度为5mg/600ml缓冲液。搅拌样品15秒钟，将组织的浓度稀释到每600ml缓冲液RLT中2.5mg、1.25mg或0.625mg。如以下方式进行三次测定。
(I)匀化和QIA切碎步骤后的离心，(II)离心，无QIA切碎步骤，(III)QIA切碎，无离心步骤，和(IV)在组织匀化后，无QIA切碎和离心匀浆的步骤。各个样品用等体积70％乙醇稀释并混合。将样品(700μL)加到RNEasy小型柱上，放在QIAGEN真空歧管上。真空过滤样品，用700μL缓冲液RWI洗涤该柱，接着用500μL缓冲液RPE洗涤。将该柱放到新的收集管中，以最大速度(14,000RPM)离心30秒钟来干燥该柱。然后将每个柱都转移到新的收集管中，往膜上滴加50μL去RNA酶水，以14,000xg速度离心收集管30秒钟来洗脱RNA。分光光度量化RNA产量。这些试验的结果被总结于表5中，表明在匀化后进行QIA切碎或者离心或者包括这两个步骤的分析中，重量小的组织样品(2.5mg、1.25mg和0.625mg)的RNA产量没有提高。
序列表
<110>Johnson & Johnson
     Belly，Robert
     Toner，Jacqueline
     Backus，John
<120>从细胞和组织中快速提取RNA
<130>CDS5008
<140>10/427,217
<141>2003-05-01
<160>35
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>1
Figure C200410059525D00221
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>2
Figure C200410059525D00222
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>3
Figure C200410059525D00231
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>4
Figure C200410059525D00232
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>5
Figure C200410059525D00233
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>6
Figure C200410059525D00234
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00241
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00242
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00243
<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00251
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00252
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00253
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是探针
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Figure C200410059525D00254
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<211>1155
<212>DNA
<213>人类
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<212>DNA
<213>人类
<400>15
Figure C200410059525D00271
Figure C200410059525D00281
Figure C200410059525D00301
<210>16
<211>3282
<212>DNA
<213>人类
<400>16
Figure C200410059525D00302
Figure C200410059525D00311
<210>17
<211>503
<212>DNA
<213>人类
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Figure C200410059525D00331
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<211>503
<212>DNA
<213>人类
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Figure C200410059525D00332
<210>19
<211>1793
<212>DNA
<213>人类
<400>19
Figure C200410059525D00351
<210>20
<211>1377
<212>DNA
<213>人类
<400>20
Figure C200410059525D00352
Figure C200410059525D00361
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<212>DNA
<213>人类
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Figure C200410059525D00362
Figure C200410059525D00371
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<211>2384
<212>DNA
<213>人类
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Figure C200410059525D00381
Figure C200410059525D00391
<210>23
<211>30
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是探针
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Figure C200410059525D00401
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<213>人工序列
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<223>人工序列是探针
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Figure C200410059525D00402
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<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00403
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<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00411
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
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Figure C200410059525D00412
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是探针
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Figure C200410059525D00413
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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<221>misc_特征
<222>(213)..(213)
<223>misc_特征为引物
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Figure C200410059525D00421
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<213>人工序列
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<223>人工序列是引物
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<213>人工序列
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<223>人工序列是探针
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>33
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是引物
<400>34
Figure C200410059525D00432
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列是探针
<400>35
Figure C200410059525D00433

Claims (20)

1.从生物系统中提取RNA的方法，包括将取自该系统的含有RNA的溶液与基质接触，该基质含有或粘附有通过化学或物理方法方式结合RNA的物质，并通过应用负压来回收RNA，其中所述方法中包含的离心步骤都不超过30秒，其中RNA容易从所述物质上释放。
2.权利要求1的方法，其中生物系统通过组织研磨机匀化。
3.权利要求1的方法，其中生物系统是一种组织，并且在将该含有RNA的溶液与基质接触前降低该溶液的粘度。
4.权利要求1的方法，其中负压为11.6-13.1psi。
5.从生物系统中提取RNA的方法，包括稀释RNA匀浆，并将含有所述被稀释的RNA匀浆的溶液与基质接触，该基质含有或粘附有通过化学或物理方法方式与RNA结合的物质，并通过应用负压来回收RNA，
6.权利要求5的方法，其中所述RNA匀浆被稀释为2-8mg/ml匀浆/稀释液。
7.权利要求5的方法，其中所述方法包含的的离心步骤都不超过30秒。
8.从生物系统中提取RNA的方法，包括从该系统的样品中去除无目标RNA的细胞，溶解含有RNA的细胞，将溶解产物与含有或粘附有通过化学或物理方法方式结合RNA的的物质的基质接触，不离心而应用负压，转移被结合到基质的RNA；其中所述方法在少于6分钟内完成。
9.权利要求8的方法，其中细胞用硫氰酸胍盐溶液溶解，而基质是硅胶膜。
10.权利要求8的方法，还包括洗涤溶解产物的步骤。
11.权利要求8的方法，还包括在与基质接触之前或者之后离心溶解产物的步骤。
12.从生物系统中提取RNA的方法，包括
(a)从生物系统中获得含有细胞的样品，
(b)从该样品中去除没有目标RNA的细胞来产生工作样品，
(c)溶解含有目标RNA的细胞
(d)匀化工作样品，
(e)湿润均化的工作样品，
(f)将湿润、均化的工作样品与含有RNA或粘附有通过化学或物理方法方式结合RNA的物质的基质接触来形成基质-RNA复合物，
(g)对基质应用负压来提取RNA，
(h)洗涤被提取的RNA，
(i)从基质-RNA复合物上去除水分，和
(j)洗脱RNA
其中所述方法在少于6分钟内实施。
13.权利要求12的方法，其中无目标RNA的细胞在去除前被溶解。
14.权利要求12的方法，还包括稀释被匀化的工作样品的步骤。
15.权利要求14的方法，其中工作样品被稀释为2-8mg匀浆/ml稀释液。
16.权利要求15的方法，其中工作样品被稀释为4mg匀浆/ml稀释液。
17.权利要求14的方法，其中稀释液含有保护RNA的物质。
18.权利要求17的方法，其中该物质为硫氰酸胍。
19.权利要求12的方法，还包括在步骤g、h、i或j之后的离心步骤，其中这种离心步骤不超过30秒钟。
20.权利要求12的方法，其中该基质是硅胶膜。
CNB2004100595259A 2003-05-01 2004-04-30 从细胞和组织中快速提取rna Expired - Fee Related CN100471861C (zh)

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