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CN100398110C - 含超低剂量雌激素的制剂，贴剂及试剂盒 - Google Patents

含超低剂量雌激素的制剂，贴剂及试剂盒 Download PDF

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CN100398110C CNB988113597A CN98811359A CN100398110C CN 100398110 C CN100398110 C CN 100398110C CN B988113597 A CNB988113597 A CN B988113597A CN 98811359 A CN98811359 A CN 98811359A CN 100398110 C CN100398110 C CN 100398110C
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Abstract

本发明提供用了治疗绝经后个体中因绝经后雌激素减少所致的机体症状的方法，特别是用于降低绝经后个体中骨质疏松性骨折危险性的方法。本发明还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。

Description

含超低剂量雌激素的制剂，贴剂及试剂盒
发明背景
内源性雌激素在自然或手术绝经后急剧减少，这种衰减导致骨损失和继发性骨折明显增加。显然，内源性雌激素对于维持年轻妇女骨骼健康起重要作用。然而，内源性雌激素在老年妇女中的重要性较小。
迄今为止已发现，65岁左右的妇女中的内源性雌激素水平与继发性髋部或椎骨骨折无关。S.R.Cummings等人《骨骼矿物质研究杂志》(J.Bone Min.Res.)10(增刊I)：S174(1995)。但是，雌二醇是一种比雌酮更有效的雌激素，对其与骨折的关系的研究尚无结果。绝经前妇女中的血清雌二醇水平平均高于100pg/ml。未经激素复原疗法治疗的绝经后妇女中的血清雌二醇水平降低至20pg/ml，并且多达30-50％的绝经后妇女的血清雌二醇水平降低至用常规的灵敏检测方法都无法检测到的水平(即低于5pg/ml)。对绝经后妇女的常规治疗包括用有效剂量的雌激素复原疗法将血清雌二醇浓度维持在40-60pg/ml之上。
业已证明，常规的激素复原疗法可以有效治疗因绝经后雌激素减少所致的机体症状，包括降低骨密度损失，或甚至可以提高骨密度；减少骨折的危险。然而，现有研究表明，雌激素复原疗法可用于患乳腺癌和子宫内膜癌，以及血栓和子宫出血的危险性的增加的防治。所以，该领域仍然需要用于治疗绝经后雌激素减少或缺乏所致机体症状的方法。该技术领域还需要在治疗上述机体症状的同时减小雌激素复原疗法的副作用。
发明概述
第一方面，本发明提供一种用于绝经后个体中因雌激素减少所致机体症状的方法。该方法包括给所述个体施用一定量的雌激素以有效地使血清雌二醇水平达到约5pg/ml-约15pg/ml。
第二方面，本发明提供一种用于减小患有或易患有绝经后骨质疏松症的个体中的骨质疏松性骨折危险的方法。该方法包括给所述个体施用一定量的雌激素以有效地使血清雌二醇水平达到约5pg/ml-约15pg/ml。
第三方面，本发明提供一种适合患有或易患有因绝经后雌激素减少所致机体症状的用户使用的试剂盒。该试剂盒包括a)能够每天透皮给药少于约20μg雌激素的透皮贴剂；和b)用来描述使用该透皮贴剂来减小用户骨折危险性的方法的说明书。
第四方面，本发明提供另一种用于治疗绝经后个体中因雌激素减少所致的机体症状的方法。该方法包括在无外源性孕激素的条件下每天给药少于约20μg雌激素。
第五方面，本发明提供另一种用于减小患有或易患有绝经后骨质疏松症的个体中的骨质疏松性骨质危险的方法。该方法包括在无外源性孕激素的条件下每天给药少于约20μg雌激素。
本发明的这些方面以及其它方面将进一步在附图、优选实施方案和本发明的实施例中说明。
附图简述
图1是本发明所述方法采用的一类透皮贴剂的横截面图。
图2是本发明所述方法采用的第二类透皮贴剂的横截面图。
优选实施方案的描述
除非另外说明，在此所用的技术和科技术语均具有其在所属技术领域中的常规含义。在此，下列术语具有其所给出的含义。
“绝经后雌激素减少所致的机体症状”是指，在绝经后妇女中常见且至少部分是由体内雌激素减少导致的机体症状。这些症状包括但不限于骨质疏松症、头痛、恶心、抑郁、热潮红、骨骼矿物质密度降低，以及骨折(包括椎骨和/或髋部骨折)的危险或发病率的增加。
“绝经后个体”是指处于绝经后生命期内的妇女。患有绝经后症状的个体包括，在绝经后表现出上述任何机体症状的妇女，和特别是有骨矿物质密度在椎骨、髋部或其它部位降低表现的绝经后妇女，或曾经椎骨或髋部骨折的绝经后妇女。易患有因绝经后雌激素减少所致机体症状的个体包括：与绝经前妇女相比表现出血清雌二醇水平降低的接近绝经的妇女，以及表现出血清雌二醇水平降低但还未出现因绝经后雌激素减少所致的机体症状的绝经后妇女。表现出血清雌二醇水平降低的个体包括：血清雌二醇水平处于或低于20pg/ml的个体，包括血清雌二醇水平无法检测到的个体。鉴于本发明的目的，在提取和柱分离后采用放射免疫测定法来测量性激素水平，包括血清雌二醇水平。检测下限是5pg雌二醇/ml。
“骨质疏松性骨折”是指归因于骨质疏松症的骨折，通常为椎骨骨折或髋部骨折。
本发明所述的方法可以有效治疗绝经后个体，特别是患有或易患有上述类型的绝经后机体症状的个体。本发明的方法包括施用可以在所述个体中产生预期血清雌二醇水平的有效量的雌激素。在此所用的短语“治疗机体症状”是指消除或降低患有上述症状的个体中所述机体症状的严重程度或发病率，并且预防了易患有绝经后雌激素减少所致上述症状的个体中绝经后机体症状的发生。尽管对这些绝经后机体症状的治疗包括彻底消除患病个体中的上述症状，但对症状的彻底消除不一定符合本发明所述术语的定义。所以，本发明涉及用超低剂量雌激素来治疗雌激素减少所致机体症状并用来降低患有或易患有绝经后骨质疏松症个体中骨质疏松性骨折的危险性。
本发明的方法还可包括一个测定被治疗的绝经后个体中的血清雌二醇水平并且判断被治疗个体的血清雌二醇水平是否如相同年龄组绝经后妇女般正常的附加步骤。换言之，本发明的方法不适用于血清雌二醇水平低于相同年龄组绝经后妇女平均的正常水平的妇女。本发明的方法可以有效治疗其血清雌二醇水平对于相同年龄组妇女来说是正常的绝经后个体。在此所用的“正常”血清雌二醇水平是较接近相同年龄组妇女的平均血清雌二醇水平的血清雌二醇水平。
本发明人意外地发现，骨矿物质密度的损失在患有绝经后骨质疏松个体中不是唯一的导致骨质疏松性骨折的危险性增高的因素。低水平的血清雌二醇，即低于5pg/ml，特别是当伴随有性激素结合球蛋白(SHBG)水平等于或高于1μg/dl时，实质上增加了髋部和椎骨骨折的危险性。此外，低血清1，25(OH)2维生素D水平也会造成髋部骨折危险性的增高。评估骨质疏松性骨折危险性的方法包括利用SAS学院(位于Cary，North Carolina)开发的逻辑模型来分析预示变量和椎骨骨折之间的关系，和利用考虑到病例-人群取样设计的比例危害模型来分析预示变量和髋部骨折之间的关系。这些分析调整为基线年龄和体重，并且以相对危险性具有95％置信区间来报告结果。归因于多种激素水平的骨折比例是采用W.S.Browner在《美国流行病学杂志》123：143(1986)中公开的技术来评估，该文献在此全文引入作为参考。所谓“降低骨质疏松性骨折的危险性”是指，按照上述技术来测定，利用本发明方法治疗的个体和在用本发明方法治疗前的同一个体相比，其骨折危险性降低。所以，利用本发明方法治疗的个体和患有或易患有骨质疏松骨折的未治疗的绝经后个体相比，其骨质疏松性骨折的危险性降低。
本发明人还意外地发现，超低剂量的雌激素在不需要孕激素给药的条件下就可以影响对雌激素减少所致机体症状的治疗。本发明人现在发现，用雌激素给药但不用孕激素给药可以有效地治疗具有子宫和卵巢的绝经后妇女。现有的激素复原疗法却依赖于孕激素的联合给药才能有效治疗，特别是未实施子宫切除术卵巢切除术的妇女。
本发明方法所用的外源性雌激素来源可以包括向个体给药的任何适当形式的雌激素。适当形式的外源性雌激素包括天然或合成的具有雌激素活性的化合物。若干形式的外源性雌激素可以市购。例如，适当形式的外源性雌激素包括但不限于：雌二醇，包括α-雌二醇、17β-雌二醇、炔雌醇、雌二醇苯甲酸酯和雌二醇17β-环戊丙酸酯，雌酮，雌三醇，结合马雌激素和它们的盐。上述化合物都是具有雌激素活性甾类化合物的例子。具有雌激素活性的非甾类化合物的例子是但不限于：己烯雌酚双磷酸酯、己烯雌酚双丙酸酯和己烷雌酚。通常，本发明方法所用的优选形式的外源性雌激素是雌二醇。
外源性雌激素对所述个体的给药量应足以使血清雌二醇水平至少为约5pg/ml但不超过约20pg/ml且优选不超过15pg/ml。换言之，按照本发明所述的方法，以足够的外源性雌激素给药来达到总血清雌二醇水平至少为约5pg/ml-约20pg/ml。由于未治疗个体的血清雌二醇水平对于每个人来说是不同的，所以不同人需要给予不同的雌激素剂量以获得所需的血清雌二醇水平。相反，被治疗个体的血清雌二醇水平不一定被增加到约5pg/ml-约20pg/ml；但各被治疗个体的总血清雌二醇水平必须至少为约5pg/ml且不超过约20pg/ml。通常，外源性雌激素的给药量足以获得约5pg/ml-约10pg/ml的血清雌二醇水平。与先前理解相反的是，本发明人现发现，血清雌二醇水平处于5pg/ml-15pg/ml内有利于降低椎骨和髋部骨折的危险性。这种低于外源性雌激素常规剂量的给药还进一步有利于降低与激素复原疗法有关的不希望有的副作用的危险性。
外源性雌激素可以经任何适当途径给药。例如，用于口服和非肠道给药的外源性雌激素制剂是所属技术领域已知的，并且可以采用本发明所述方法。适于口服给药的制剂可以以独立的单位存在，例如胶囊、扁囊剂、锭剂或片剂，各单位中含义预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；或存在于水或非水液体中的溶液、分散体或悬浮剂。上述制剂可以通过任何适当的制药方法来制备，其中包括将活性化合物与适当载体(可以包括一种或多种辅助组分)组合的步骤。通常，本发明制剂的制备是通过将活性化合物与液体或微粉化固体载体或两者均匀且完全地混合，随后若需要将所得混合物成形。例如，将含有活性化合物、任选的一种或多种辅助组分的粉末或颗粒压缩或模制来制备片剂。压缩片剂可以在适当机器中压缩自由流动形式的化合物，如粉末或颗粒来制备，该化合物任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合。模制片剂可以在适当的制片机器中将用惰性液体粘合剂湿润的粉状化合物模制来制备。
外源性雌激素在口服制剂中的含量是超低剂量的雌激素，这将取决于雌激素给药的精确形式，但通常是小于0.5mg/天。优选的雌激素口服给药量是约0.1mg-约0.25mg雌激素/天。譬如，雌二醇的口服给药量是约0.1mg-约0.25mg/天。所属技术领域普通技术人员很容易判断出雌激素其它形式的等效剂量。
在本发明的优选实施方案中，雌激素是经非肠道或透皮途径给药而非口服给药。前两种给药途径优于口服给药，因为雌激素给药给药可以导致性激素结合球蛋白水平增高。性激素结合球蛋白减小了雌激素给药为绝经后个体所产生的有益功效，特别是出现骨质疏松症或骨矿物质密度损失的迹象的个体。尽管口服给药不是优选的给药途径，但是可以利用口服制剂实施本发明的方法。
本发明的制剂适用于非肠道给药，通常包括活性化合物的灭菌含水制剂，这些制剂优选与指定接受者的血液等渗。这些制剂可以通过皮下、静脉内、肌肉内、皮内注射或阴道环给药。此类制剂一般是通过将活性组分、雌激素与水或甘氨酸缓冲剂混合并将所得溶液灭菌且与血液等渗来制备。
外源性雌激素在非肠道制剂中的含量是超低剂量的雌激素，这取决于雌激素给药的精确形式，但通常是不超过20μg/天。优选的雌激素非肠道给药量是约5μg-约15μg雌激素/天，更优选约10μg雌激素/天。譬如，雌二醇的非肠道给药量是约5μg-约15μg/天。所属技术领域普通技术人员很容易判断出雌激素其它形式的等效剂量。
更优选的，本发明方法包括外源性雌激素的透皮给药。用于雌激素透皮给药的适当制剂是该技术领域中已知的，本发明的方法中可以采用。例如，适当的外源性雌激素给药的透皮贴剂公开在Campbell等人的美国专利4,460,372、kwiatek等人的美国专利4,573,996、Nuwayser的美国专利4,624,665、Eckert等人的美国专利4,722,941和Nelson等人的美国专利5,223,261中，这些文献中对透皮贴剂技术的探讨在此引入作为参考。
适用于本发明方法的一种适当类型的透皮贴剂如图1所示。通常，适当的透皮贴剂10包括非通透背层12、通透表层13、基本上连续涂敷在通透表层13上的粘合层(未显示)，以及位于或夹在背层12和通透表层13之间的储库16，以使背层12延展在储库16的周围且在通透表层13的边缘处与通透表层13相连。储库16含有雌激素，且以流体形式与通透表层13相接触。该透皮贴剂10通过通透表层13上的粘合层粘着在皮肤上，这样，当透皮贴剂10粘着在皮肤上时通透表层13基本上连续接触皮肤。当透皮贴剂10粘着在所述个体的皮肤上时，含在透皮贴剂10的储库16中的雌激素通过通透表层13从储库16经粘合层转移至并穿过所述个体的皮肤。透皮贴剂10还可以在储库16中任选地含有一种或多种渗透促进剂以提高雌激素经过皮肤的渗透作用。
透皮贴剂给药领域熟知可以构成背层的适当材料的例子，并且本发明的透皮贴剂中可以采用任何常规背层材料。适当的背层材料的特定例子包括但不限于聚酯膜，例如高密度聚乙烯、低密度聚乙烯或聚乙烯的组合物，聚丙烯，聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯，乙烯乙酸乙烯酯共聚物等等。
透皮贴剂给药领域对适当的通透表层材料的例子也很熟悉，并且本发明的透皮贴剂中可以采用任何可以通透给药活性组分，即雌激素的常规材料。适用于通透表层的材料的特定例子包括但不限于致密或微孔聚合物膜，例如那些含有聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺、改性聚丙烯共聚物、聚砜、卤代聚合物、聚氯醚、缩醛聚合物、丙烯酸树脂等的聚合物膜。这些类型的常规通透膜材料的特定例子公开在Zaffaroni的美国专利3,797,494中。
所属技术领域对于可以涂敷在背层上形成粘合层的适当胶粘剂的例子也很熟知，其中包括，例如压敏胶粘剂，例如那些含有丙烯酸和/甲基丙烯酸聚合物的胶粘剂。适当胶粘剂的特定例子包括：丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(例如其正丁醇、正戊醇、异戊醇、2-甲基丁醇、1-甲基丁醇、1-甲基戊醇、3-甲基戊醇、3-甲基戊醇、3-乙基丁醇、异辛醇、正癸醇或正十二烷醇酯)本身或与烯属不饱和单体共聚而成的聚合物，所述烯属不饱和单体例如是丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基丙烯酰胺、N-烷氧基甲基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、衣康酸、乙烯乙酸酯、N-支链C10-24烷基马来酰胺酸、乙二醇二乙酸酯，以及它们的混合物；天然或合成橡胶，例如硅橡胶、苯乙烯-丁二烯橡胶、丁基醚橡胶、氯丁橡胶、丁腈橡胶、聚异丁烯、聚丁二烯、和聚异戊二烯，聚氨酯高弹体，乙烯聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、和聚乙烯乙酸酯，脲甲醛树脂，酚醛树脂，雷琐辛醛树脂，纤维素类衍生物，例如乙基纤维素、甲基纤维素、硝基纤维素、乙酸丁酸纤维素和羧甲基纤维素，和天然树胶，例如瓜尔胶、阿拉伯树胶、果胶、淀粉、destria、明胶、酪蛋白等。对于所属领域技术人员很显然，粘合层对于活性组分雌激素应呈惰性，并且应不干扰雌激素经通透表层进行透皮给药。透皮贴剂的粘合层优选压敏胶粘剂，以便于将贴剂贴敷在个体的皮肤上。
所属领域技术人员对于适当的渗透促进剂也已熟知。常规渗透促进剂的例子包括链烷醇类，如乙醇、己醇、环己醇等，烃类，例如己烷、环己烷、异丙基苯，醛类和酮类，例如环己酮、乙酰胺，N，N-二(低级烷基)乙酰胺类，例如N，N-二乙基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-(2-羟基乙基)乙酰胺，酯类，例如N，N-二-低级烷基亚砜，挥发油类，例如丙二醇、甘油、甘油单月桂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯，水杨酸盐类，和上述物质的混合物。
图2是适用于本发明雌激素透皮给药的第二类型的透皮贴剂的例子。在该例中，活性组分混合在粘合层内而不是含在储库中。此类贴剂的例子是熟知的且包括，例如，Berlex出售的CLIMERA。透皮贴剂20包括背层22和粘合/药物层24。该粘合/药物层24兼具有将贴剂20粘着在个体皮肤上和含有给药的活性组分雌激素的作用。活性组分从粘合/药物层24浸出并透过贴剂所粘着的个体的皮肤。
本实施方案可以采用上述任何背层。此外，可以采用上述任何适当的胶粘剂。粘合/药物层包括相当均匀的选定胶粘剂和活性组分的混合物。通常，粘合/药物层包括一个基本覆盖背层的一个表面涂层。该粘合/药物层还可以含有渗透促进剂，例如上述渗透促进剂，这是通过将渗透促进剂加入到胶粘剂和活性组分基本均匀的混合物内。
对于所属领域技术人员很显然的是，根据本发明的透皮贴剂可以含有多种常规使用的便于活性药物，特别是甾类活性药物透皮给药的附加赋形剂。所述赋形剂的例子包括但不限于载体、胶凝剂、助悬剂、分散剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂等。这些赋形剂各自的特定例子为所属领域技术人员所熟知，本发明透皮贴剂可以采用任何常规赋形剂。然而，应着重注意到，本发明的透皮贴剂不含有孕激素。所以，孕激素不是一种适用于本发明透皮贴剂的适当赋形剂。
外源性雌激素在透皮贴剂中的含量为超低剂量雌激素，这取决于雌激素给药的精确形式，但应足以释放出少于20μg，通常是不超过15μg/天的雌激素。雌激素经透皮贴剂给药的优选量是约5μg-约15μg雌激素/天。更优选的雌激素给药量是约10μg/天。虽然根据本发明所述方法中雌激素的常规剂量低于20μg，但可以采用高达25μg的剂量。譬如，雌二醇的非肠道给药量是约5μg-约15μg/天。所属技术领域普通技术人员很容易判断出雌激素其它形式的等效剂量。意外地发现，本发明所述方法中所用的超低水平的雌激素从实质上降低了绝经后妇女中骨质疏松性骨折的危险性。
通常，将透皮贴剂设计为使用若干天后才需要更换。所以，储库中雌激素的含量必须足以使以低于20μg/天持续给药若干天。例如，被设计为给药10μg雌激素/天达7天的本发明透皮贴剂含有近1mg雌激素。适于给药15μg雌激素/天达7天的透皮贴剂应含有近1.4mg雌激素。基于这些具体例子，所属领域技术人员应能够确定用于获得正确雌激素日给药剂量的透皮贴剂中的雌激素的必要含量。
为了便利，本发明也提供了供患有或易患有绝经后症状的用户使用的试剂盒，该试剂盒中包括透皮贴剂和说明使用该透皮贴剂治疗用户的绝经后症状和/或减少骨质疏松性骨折危险性的方法的说明书。该说明书将指导用户利用贴剂上的胶粘剂将透皮贴剂直接粘着在皮肤表面，例如前臂上，以从该贴剂获得超低剂量雌激素的透皮给药，并由此使用户的血清雌二醇水平增加至约5pg/ml-约20pg/ml。该说明书还指导用户在需要连续雌激素给药时更换贴剂，从而利用透皮贴剂来维持必要的血清雌二醇水平。特别是，当使用试剂盒中的7天用贴剂时，该说明书可以指导用户每隔7天更换透皮贴剂以确保给药低于20μg雌激素/天，优选10μg雌激素/天。所述试剂盒可便利地以单剂量或多剂量贴剂单元包装和出售。
下列实施例用于说明本发明，并且不对本发明构成限定。
实施例1
下列实施例和数据证明了血清雌二醇水平和骨质疏松性骨折之间的关联，并且也证明了利用超低剂量外源性雌激素降低骨质疏松性骨折危险性和治疗绝经后症状的功效。
1.试验人群
骨质疏松性骨质的研究是对9704名妇女人群的前瞻性研究，这些妇女征募自美国4个社区：Baltimore、Minneapolis、Pittsburgh和Portland的全体人口名单。参见Cummings等人的N.Engl.J.Med.332：767-773(1995)。年龄在65或以上的妇女通过信访参与该研究。该试验人群包括黑人妇女，因为她们髋部骨折的危险性低，以及两侧髋部复位的妇女或需要他人帮助行走的妇女。参与者回答有关现在或近期使用的雌激素、补钙剂和含有维生素D的复合维生素。
2.临床测量
骨矿物质密度(即跟骨骨质)是利用由OsteoAnlyzer，Siemens-Osteon，Wahiawa，Hawaii获得的单光子吸光分析仪来测量。各临床中心之间对于该测量的平均变异系数是1.2％。参见Steiger等人的《骨矿物质研究杂志》7：625(1992)。
3.血清样本
所有参与者被要求坚持在试验前的前夜和早晨食用无脂肪饮食以使干扰试验的脂血最小化。在8:00AM和2:00PM之间抽取血样并将血清立刻冷冻至-20℃。所有样本装运两周运抵Rockville，Maryland的生物医学研究院，在那里它们被储存在-190℃的液氮中。
4.骨折研究
每4个月通过明信片或定期诊断访问与上述妇女联系，对生活状况和个别骨折发生的跟踪调查超过全体的99.7％。通过研究前瞻性放射照片来确定髋部骨折。在基线放射照片拍摄后平均3.3年时，7299名妇女(幸存者的79％)再次回来进行脊柱侧索照片；经判断有7238对放射照片足以作出偶发性椎骨骨折的结论。我们利用Black等人在《骨矿物质研究杂志》10：890(1995)中公开的定量形态测定法来评估放射照片是否骨折。如果基线放射照片和跟踪放射照片之间的任何椎骨高度减小≥20％和≥4mm，那么该妇女被归为具有偶发性椎骨骨折。参见“国家骨质疏松症基础研究组对于椎骨骨折的研究”(National OsteoporosisFoumdation Working Group)《骨矿物质研究杂志》10：518(1995)。这些研究者在不知道参与者血清分析结果下对放射照片作出评估。
5.对病例和人群样本(cohort sample)的选择
利用Prentice，R.L.《Biometrika》73：1(1986)中公开的病例-人群方法并将在基线时采用激素复原疗法的妇女排除，我们从133个继发有首次髋部骨折的参与者和138名具有偶发性椎骨骨折的参与者中随机选择血清样本。我们还从人群中随机选择了359名妇女的样本，其中包括12名患有继发性髋部骨折和14名患有继发性椎骨骨折的妇女。为了进行髋部骨折测定，我们排除了在基线访查前患有髋部骨折的对照者(n＝4)；为了分析椎骨骨折，我们排除了未进行跟踪放射照相的妇女或其基线或跟踪放射照片在技术上不足以进行形态测定的妇女。
6.生物化学测定
我们通过测定基线和在-190℃下储存3.5年之后时的激素水平来判断51名绝经后妇女中被选种类的激素测量结果的稳定性。两个测量之间的相关性(显著性为P＜0.001)如下：中区甲状旁腺激素(r＝0.99)、25(OH)维生素D(r＝0.88)、睾酮(r＝0.99)和雌酮(r＝0.98)。若有的话，这些物质的平均值存在很小的减少。当进行基线测量时，对甲状旁腺激素还无法进行免疫放射分析(IRMA)；通过IRMA和中区技术所测量的水平之间的相关性为0.78。
所有分析是在混合批次的病例和对照者中进行，对于参与者的骨折病史并不了解。样本由储存处直接送到分析实验室而不进行融化。初始计划是分析雌酮而不是雌二醇的水平。当完成首批分析后，我们在测量组中增加雌二醇并在89名髋部骨折病例、96名椎骨骨折病例和204名未患有上述两种骨折的妇女中进行测量。
由位于Calabasas Hills，California的内分泌科学院来分析性激素和性激素结合球蛋白(SHBG)。雌二醇和雌酮是在提取和1H2O柱分离后的通过放射免疫分析来测量。雌二醇和雌酮的测定间差异分别为8％-12.5％和6.2％-7.0％。雌二醇的检测下限为5pg/ml。在提取和Al2O3柱色谱后利用放射免疫分析法来测量总睾酮，其测定间差异为6.1％-13.4％。SHBG的结合能力直接在血清中利用置换技术来测量，其测定间差异为4.1％-14.4％。游离睾酮浓度是按照Furuyama等人在《甾类物质》16：415(1970)；和Mayes在《临床内分泌和代谢杂志》28：1169(1968)中所述的硫酸铵沉淀法来测定。其测定间差异为10.7％-15.5％。
向钙激素(calciotropic hormones)是由位于加利弗尼亚州旧金山的UCSF向钙激素参照实验室来测定。完整的甲状旁腺激素是通过放射免疫分析来测量，其测定内差异为5.2％且测定间差异为8.5％。我们利用放射免疫技术测量25(OH)维生素D和1，25(OH)2维生素D，两者的测定内差异均为6.6％，并且测定间差异分别为15％和24.4％。利用自动化学分析仪来测量肌酸酐的水平。
7.数据分析
通过近五分位(quintile)，我们分析了作为连续变量的激素和维生素水平，并且当两者有关系时，作为二分变量(高于或低于检测限)。我们利用位于Cary，North Carolina的SAS学院开发的逻辑模型来分析预示变量和椎骨骨折之间的关系，并利用考虑到病例-人群取样设计的比例危害模型(Epicure，Hirosoft International，Seattle，WA)来分析预示变量和髋部骨折之间的关系。所有分析均调节为基线年龄和体重，并且作为相对危险性(近似为优势率或危害率)来报告，其置信区间为95％。我们根据多种激素水平和Browner公开在《美国流行病学杂志》123：143(1986)中的标准技术来评估骨折比例。我们利用通用线性模型对不同组中的进行了年龄调整的骨质进行比较。
8.结果
表1给出了有关患有偶发性髋部或椎骨骨折的参与者的特征数据。
表1
患有偶发性髋部骨折、偶发性椎骨骨折的参与者和无上述
两种骨折的对照者的特征
Figure C9881135900181
*用于髋部骨折分析的对照者的数量从240变为343，因为在分析雌二醇时丢失数据。用于椎骨骨折分析的对照者的数量从193人变为264人；该变化较小，因为排除了那些技术上没有足够的基线和跟踪椎骨X射线照片对的妇女。人群样本中的偶发性骨折病例被包括在病例中。
Figure C9881135900182
与对照者比较，P＜0.1
Figure C9881135900183
与对照者比较，P＜0.5
上述数据显示，患有偶发性髋部或椎骨骨折的参与者与对照者相比年长、体重轻、很可能是吸烟者，并且骨质低。
在人群随机样本中，大约三分之一的妇女(81对247人)的雌二醇水平无法检测到(＜5pg/ml)。对体重和年龄作了调整后，有关相对危险性的数据列在表2中。
表2
年龄和体重经调整后的激素和维生素水平与髋部骨折和椎骨骨折危险性之间的关系
                                     相对危险性(95％C.I.)*
变量                  流行率(％)
Figure C9881135900191
       髋部骨折           椎骨骨折
总雌二醇＜5pg/ml      32.8            2.48(1.35-4.55)    2.46(1.43-4.22)
性激素结合球蛋白      76.4            2.04(1.06-3.85)    2.27(1.19-4.35)
＞0.9dg/dl
性激素结合球蛋白                      1.25(0.97-1.60)    1.49(1.15-1.95)
(/1.0μg/dl)
雌酮≥1.5ng/dl         77.4           1.30(0.76-2.17)    1.72(1.01-2.94)
游离睾酮≤0.7pg/ml     19.4           1.63(1.00-2.66)    1.40(0.83-2.35)
25(OH)维生素           21.5           1.16(0.70-1.92)    1.08(0.64-1.80)
D≤19ng/ml
Figure C9881135900192
1，25(OH)2维生素D≤23  15.4           2.05(1.21-3.46)    1.60(0.92-2.79)
pg/ml§
总PTH＞50pg/ml         11.2           1.05(0.52-2.12)    0.49(0.20-1.17)
*按照椎骨骨折的优势率和髋部骨折的危害率估计的相对危险性。C.I.＝置信区间
Figure C9881135900193
人群随机样本中的流行率
Figure C9881135900194
对25-羟基维生素D最高点的转化值nmoles/L，乘以2.496
§对1，25-二羟基维生素D的转化值，皮摩尔/L，乘以2.4
上述数据证实，雌二醇水平无法检测到的妇女患有髋部骨折和椎骨骨折的危险性比雌二醇水平可检测到妇女的危险性高2.5倍。我们评估出该人群中有33％的髋部骨折和32％的椎骨骨折与雌二醇水平无法检测到有关。该数据似乎反映出阈值在与雌二醇浓度有关的危险性中降低至≥5pg/ml。与雌二醇水平低于5pg/ml的妇女相比，总雌二醇水平为5-10pg/ml的妇女髋部骨折的危险性降低了62％(危害率＝0.38；0.20-0.72)，椎骨骨折的危险性降低了57％(优势率＝0.43；0.25-0.76之间的置信区间为95％)。
SHBG水平升高与个别和椎骨骨折的危险性增加有关。在调整年龄后，SHBG每升高1.0μg/dl，髋部骨折的危险性就增加1.44倍(1.16-1.80)，椎骨骨折的危险性增加1.65倍(1.30-2.10)。对于髋部骨折，该影响似乎部分是由体重介导的。
在该人群的随机样本中，26％(244人中63人)同时具有无法检测到雌二醇水平和SHBG水平≥1μg/dl；这些妇女与其它妇女相比髋部骨折的危险性和椎骨骨折的危险性分别高14倍(95％的置信区间；3.0-62)和12倍(3.3-41)。体重的变化对于髋部骨折(危害率＝6.9；1.5-32)和椎骨骨折(优势率＝7.9；2.2-28)的上述关系起些许钝化作用。在基线时患有椎骨骨折的妇女小组与基线时无椎骨骨折小组中雌二醇、SHBG和偶发性椎骨骨折之间的关系相似。对于上述同时具有无法检测到雌二醇浓度和SHBG浓度≥1μg/dl的26％的妇女来说，其髋部骨折的危险性为60％，椎骨骨折的危险性为64％。
表2中有关椎骨骨折的数据进一步扩展为表3中的数据。
表3
椎骨骨折的预示变量：多变量模型*
                             优势率(95％置信区间)
变量(单位)           调整的多变量        对于骨质的调整
雌二醇＜5pg/ml       2.65(1.50-4.68)     2.34(1.30-4.22)
SHBG(每增高1μg/dl)  1.62(1.16-2.26)     1.51(1.07-2.12)
雌酮≥1.5ng/dl       2.04(1.03-4.17)     2.33(1.12-4.76)
年龄(每增加5年)      1.17(0.89-1.54)     1.09(0.82-1.44)
体重(每增加10kg)     0.71(0.53-0.94)     0.86(0.64-1.16)
跟骨骨质(每降低1SD)                    2.27(1.52-3.33)
*表中所有结果均相对于其它变量调整。跟骨SD(标准偏差)为0.098g/cm2。
Figure C9881135900212
基线处测量的跟骨骨质
表2的数据表明，雌酮值处于最低五分位时(quintile)(≤1.4ng/dl)的妇女比高雌酮水平的妇女具有较低的椎骨骨折危险性。虽然低雌酮妇女趋于具有较低的雌二醇水平，但是雌酮和雌二醇水平之间的相关性是适当的(r＝0.57)，在调整雌二醇水平后，低水平雌酮仍然与椎骨骨折危险性降低有关，如表3所示。
1，25(OH)2维生素D水平处于最低五分位时(≤23pg/ml[≤55.2pm/L])的妇女髋部骨折的危险性明显增高(危害率＝2.1；1.2-3.5)，如表4所示。
表4
髋部骨折的预示变量：多变量模型*
                                      危害率(95％置信区间)
变量(单位)                    调整的多变量        对于骨质的调整
雌二醇＜5pg/ml                2.37(1.27-4.45)     1.92(1.01-3.64)
SHBG(每增高1μg/dl)           1.34(0.92-1.95)     1.25(0.85-1.84)
1，25(OH)2维生素D≤23pg/ml§  2.20(1.00-4.80)     2.16(0.93-5.00)
年龄(每增加5年)               2.22(1.50-3.28)     2.09(1.41-3.10)
体重(每增加10kg)              0.56(0.39-0.79)     0.67(0.46-0.98)
跟骨骨质(每降低1SD)
Figure C9881135900221
                             1.61(1.03-2.56)
*表中所有结果均相对于其它变量调整。跟骨骨质SD(标准偏差)为0.098g/cm2。
§对1，25-二羟基维生素D的转化值，皮摩尔/L，乘以2.4
在调整雌二醇和SHBG水平(危害率＝2.2；1.0-4.8)后该关系仍然很明显。进一步调整血清肌酸酐也无显著变化(危害率＝2.3；1.0-5.2)。
在将摄取维生素D补品的妇女排除之后，样本中的25(OH)维生素D的水平(平均值±SD)在1月-6月(28.4±10.2ng/ml[83.6±25.5nm/L])明显高于7月-12月的水平(25.5±10.4ng/ml[63.6±25.9nm/L]，P＜.01)。当将4-9月中的维生素D水平与10-3月间的维生素D水平进行比较时无明显差别。在低血清25(OH)维生素D水平和髋部或椎骨骨折危险性之间没有统计学意义上的显著相关性(参见表2)，甚至在调整月份、季度或诊所后，或者是排除或包括摄取维生素D补品的妇女后也是如此。
将骨质增加到激素和骨折危险性的多变量模型中仅仅略微减弱了雌激素、SHBG和髋部或椎骨骨折危险性之间的相关性的强度。参见表3和4。调整骨质对1，25(OH)2维生素D和髋部骨折之间关系或雌酮和椎骨骨折之间关系的强度无本质上的影响。
上述联合数据表明，当血清雌二醇浓度低于5pg/ml，即分析的检测限时，65岁左右妇女中的髋部和椎骨骨折的危险性大体上是增加的。约三分之一的偶发性髋部和椎骨骨折归咎于这种雌二醇水平过低。雌二醇水平略高，处于5-10pg/ml的妇女发生上述骨折的危险性很低。
雌二醇浓度无法检测到的妇女还具有较低的骨质。然而，调整跟骨骨质只能使骨折危险性的增高略微降低。这说明，极低水平的雌二醇和骨折危险性之间的关系至少部分独立于骨质。
SHBG水平也对髋部和椎骨骨折的危险性具有强有力和独立的影响。SHBG浓度≥1.0μg/dl且雌二醇水平无法检测到的妇女比SHBG水平较低但雌二醇水平较高妇女患有髋部和椎骨骨折的危险性高7倍。SHBG极易与循环中的雌二醇结合，所以SHBG水平的增高应与雌二醇生物利用度的降低有关。因此，生物可利用的雌二醇浓度可能比我们在此试验中测定的总的雌二醇水平与骨折的关联更加密切。
实施例2
本实施例表明了使用7天雌激素透皮治疗体系，雌激素的不同给药量对预防绝经后妇女中骨损失的影响的比较。
1.方法
健康、子宫切除的45-65岁且绝经后1-5年的妇女，当其通过双能X射线吸光分析法(DEXA)测定的L2-L4处的基线骨矿物质密度(BMD)处于45岁正常妇女平均值的2.5SD中的妇女可以合格入选。试验个体随机接受4个剂量的雌二醇TTS之一(6.5、12.5、15和25cm2的贴剂分别释放0.025、0.05、0.06和0.1mg/天雌二醇)或安慰剂。每周一贴粘于腹部，试验为期2年。每6个月对L2-L4处、股骨颈和前臂的BMD、血清骨钙蛋白(OST)和子宫脱氧吡啶啉交联物/肌酸酐量(DPD)进行测定。治疗18个月后得到结果。
2.结果
176名平均年龄为51.2岁的妇女登记注册。共103名个体完成了为期18个月的治疗。在所有时间点处全部剂量均可防止BMD损失。在18个月时，接受安慰剂处理的患者的腰BMD的平均百分变化率为-0.7±4.1，而对于以0.025、0.05、0.06和0.1mg/天的治疗组来说分别是3.6±4.7、3.2±3.1、3.0±3.6和4.8±5.5(相对于安慰剂来说上述差异均p＜0.05)。在12个月时，在所有的药物处理组中，OST从基线下降(百分变化率分别为-30.4±42.9，-17.9±50.7，-13.0±37.6和-26.9±29.8；相对于安慰剂的+27.6±60.4来说这些差异皆p＜0.05)。在12个月时所有药物处理组中的DPD也从基线下降(变化分别为-5.8±3.4，-6.0±8.5，-5.1±7.4和-1.8±10.8nmol/mmol)。四个药物处理组中有三组与安慰剂组明显不同。但是，在安慰剂处理个体中DPD也有所下降。
3.结论
市售常规强度的CLIMARA
Figure C9881135900241
TTS(0.05和0.1mg/天)和6.5cm2低剂量的CLIMARA
Figure C9881135900242
TTS(给药0.025mg/天)的透皮雌二醇可以预防绝经后骨损失。可以认为，用于每天释放10-15μg/天的CLIMARA贴剂将对骨骼的骨损失产生影响。
实施例3
下列实施例和数据用来证明血清雌二醇水平和骨矿物质密度损失之间的关系。这些实施例还证明了利用超低剂量的外源性雌激素具有降低骨矿物质损失的功效。
1.试验人群
试验个体是参加骨质疏松性骨折(SOF)研究的参与者，详细情况已在实施例1中描述。本试验是基于随机抽样的亚人群，即261名SOF参与者，她们被取血且具有技术上足够的在基线试验和1993-94年间的跟踪试验中检测出跟骨的BMD。其中，241名妇女具有技术上足够的在1990年的2次试验中和1993-94年间的跟踪试验中髋部骨矿物质密度测量结果。最终的结果基于231和218名妇女的亚人群，她们分别完成了一对跟骨和髋部BMD扫描照相，在基线访问时，她们称当时未采用雌激素复原疗法。个体分析的样本量随减少的值而改变。此外，雌激素样本量比其它试验少，因为我们有时在研究进行中向试验体系中增加雌二醇。
2.测量方法
在1986-1988的基线访问时，需完成详细的调查表，其中个体被询问当时或曾经使用的雌激素、钙和含有维生素D的复合维生素。还记录所述个体的身高和体重值。
利用单光子吸光分析来测量基线处以及平均5.9年后的、在1993-94年间进行的跟踪访问时的跟骨骨质。在幸存的82％的原始人群中，通过双X射线吸光分析法在1988-1990间的第二次访问中测定髋部及其亚区的骨密度。在平均3.5年后的1993-1994的跟踪访问中重复测量髋部骨密度。利用多个访问每个现场的试验成员所得的测量结果评估的跟骨颈中心和股骨颈中心之间的平均变异系数(CV)为1.2％。没有足够数量的个体供本试验进行椎骨骨密度测量。
3.血清样本
在基线检测时，在8:00AM和2.00PM之间取血并储存在-20℃。在2周内，将样本运抵生物医学研究院(Rockville，MD)并储存在-190℃的液氮中。在1994年，将入选参与者的血清融化，并分析其循环激素的水平和其它生物化学测量结果。完成分析试验的人员不了解参与者的骨折情况。
在51名妇女中，通过测定基线和在-190℃下储存3.5年后再次试验时的激素水平来测试被选激素对于时间的稳定性。测量结果对之间的相关性如下：雌酮(r＝0.98)，总睾酮(r＝0.99)，中区甲状旁腺激素(r＝0.99)和25(OH)维生素D(r＝0.88)。所有的相关性均为：p＜0.001，皆很显著。在进行基线测量时，不采用免疫放射分析法来测定PTH。PTH(IRMA)和在储存3.5年后测定的中区样本之间的相关性为0.78。两种样本之间的平均激素水平基本上没有差别。
4.生物化学分析
利用放射免疫分析法来测定雌二醇、雌酮和总睾酮的血清浓度。性激素结合球蛋白的结合能力是利用置换技术来测定。游离睾酮水平计算为总睾酮占根据硫酸铵沉淀法测定的结合了甾类物质的非SHBG的百分比的产物。通过放射免疫法来测定完整甲状旁腺激素、25(OH)D和1，25(OH)2D。所有分析的精度如表5所示，表5中还给出了平均偏差和标准偏差的描述性数据以及各激素的四分位区间(quartile)。
Figure C9881135900271
5.统计学分析
除了雌二醇的全部生物化学变量是通过四分位分析并作为连续变量。由于36％的雌二醇水平低于检测最低限(5pg/ml)，所以，将无法检测到的水平设定为最低等级，且将可检测出的水平分为三级，从而将雌二醇数据按等级分为四组。雌二醇的等级在表中简单地分为四区。对于连续模型，将无法检测的雌二醇水平规定为0。
线性回归分析法是用来分析调整年龄和体重的激素水平和BMD的年百分变化率之间的相关性。由于BMD的年绝对变化值和包括诊所位置作为协变值的结果与上面相类似，所以未列出其结果。与整个髋部比较，激素水平和骨损失之间的相关性相对于股骨颈来说较弱，转子区也如此，因此我们只给出总的髋部骨损失。年龄和体重经修正的BMD平均百分变化率和95％的置信区间是利用各激素的四分位(quartile)通过最小二乘方评估法来计算，并且利用趋交叉四分位(修正年龄和体重)的试验来评估统计显著性。连续激素水平和BMD的年百分变化率之间的相关性表示为标准化β系数，它代表了各激素水平中每增高1个标准偏差时BMD的年百分变化率的差别。
多变量模型可以用来测定生物化学变量，这些变量是在其它激素水平得到控制后骨损失的独立预示变量。由于雌二醇和雌酮的水平在此人群中适当相关(r＝0.64)，所以只在独立模型中分析这些变量。
6.结果
本研究中所采用的随机子样本的特征如上表2所示，子样本与那些抽样人群基本上没有差别。该子样本中的妇女的平均年龄为71.3岁。年均骨损失对于跟骨来说近1.5％，对于整个髋部和股骨颈来说为0.5％。
表6
跟骨骨损失人群中参与者的特征
  特征   跟骨骨损失人群生物化学样本
  数量   231
  平均年龄，岁(SD)   71.3(4.8)
  平均体重，kg(SD)   68.1(11.7)
  日常钙补品，n(％)   102(44.2)
  日常维生素补品，n(％)   100(44.1)
  平均饮食钙，mg/天，(SD)   687(390)
  平均机体活动，kcal/周(SD)   1698(1791)
  平均跟骨BMD，g/cm<sup>2</sup>(SD)   0.409(0.088)
  平均总髋部BMD，g/cm<sup>2</sup>(SD)   0.765(0.124)
  平均股骨颈BMD，g/cm<sup>2</sup>(SD)   0.658(0.108)
  平均脊椎BMD，g/cm<sup>2</sup>(SD)   0.850(0.154)
  平均跟骨骨损失，％/年，(SD)   1.48(1.80)
  平均总髋部骨损失，％/年，(SD)   0.49(1.49)
  平均股骨颈骨损失，％/年，(SD)   0.50(1.70)
激素与跟骨BMD变化之间的关系如表7所示。在年龄和体重修正了的线性回归模型中，只有SHBG是显著的跟骨骨损失预示变量。
Figure C9881135900301
与SHBG水平处于最低四分位的妇女(＜1.1μg/dL；平均变化率＝-1.2％；-1.6％，-0.7％)相比，SHBG水平处于最高四分位内(≥2.4μg/dL)的妇女每年跟骨经历两次骨损失(平均变化率＝-2.2％；95％CI＝-2.9％，-1.6％)。甚至在对血清雌二醇、雌酮和睾酮水平进行修正之后，这种相关性仍然极其显著(p＜0.002)。跟骨骨损失随激素水平降低而增加的趋势对于所有甾类性激素来说都很明显(参见表7)，但无一具有统计显著性差异。作为连续变量模型的血清雌酮浓度和跟骨骨损失之间的关系呈临界(p＜0.10)反统计学相关。
有关激素和整个髋部的BMD变化之间相关性的数据(参见表8)表明，较低水平的雌酮和雌二醇与髋部骨损失的增多明显相关。
Figure C9881135900321
例如，在修正了年龄和体重后，雌激素水平等于或高于10pg/ml的妇女在跟踪访问期间的骨损失略微增加(年均变化率＝0.1％；-0.5，-0.7)，但雌二醇水平低于5pg/ml的妇女却经历高于平均比率的髋部骨损失(年均变化率＝-0.8％；-1.2，-0.3)。
由四分位睾酮水平测定的年均髋部骨密度提供了一定的阈值：总睾酮水平等于或高于26ng/dL(最高四分位)的妇女的年均百分变化率仅为-0.1％(-0.5％，0.3％)，这是与总睾酮水平低于26ng/dL(加合1-3四分位)的妇女的-0.6％(-0.8％，-0.4％)相比而言。该差别具有统计显著性(p＜0.05)。在SHBG交叉四分位观察到髋部骨损失有所增高，虽然这种趋势在年龄和体重修正的回归模型中不具有统计显著性差异(p＝0.27)。
在包括SHBG、雌二醇和睾酮水平的多变量模型中，除了年龄和体重之外，较低的总睾酮浓度和较高的SHBG浓度独立地和髋部BMD变化有关。数据如表9所示。
表9
多变量模型：性激素、SHBG和整个髋部的骨损失
髋部BMD百分变化率的差别*
Figure C9881135900331
*所有分析只包括雌二醇测量结果具有可比性的妇女
￥第一栏代表各激素单独回归模型所得的年龄和体重经修正的结果，
Figure C9881135900332
第二栏代表包括SHBG、雌二醇、总睾酮、年龄和体重的单一回归模型的结果
Figure C9881135900341
p＜0.05
因为有许多妇女无雌二醇测量结果，所以还不清楚在其他激素水平调整后所得的SHBG与多变量模型中髋部骨损失之间是否显著相关，或SHBG是否与该妇女亚人群中的骨损失密切相关。因此，再次在具有雌二醇测量结果的妇女中，对年龄和体重修正后的SHBG与髋部骨损失之间的相关性进行测试，并且发现它们具有统计显著性差异。参见表9。
当表示为连续变量时，雌二醇与髋部BMD变化之间没有显著的相关性，无论是在睾酮和SHBG调整之前还是之后。但是，在调整SHBG和睾酮水平后，对于雌二醇的趋交叉四分位的试验仍然差异显著，而雌酮的趋交叉四分区则属于临界显著差异(p＜0.06)。
只有25(OH)D在冬季期间(1-6月)和该年的其他时间(7-12月)明显不同，其冬季平均值为24.0而其他月份的平均值为26.9(p＝0.01)。在将5-10月与11-4月间的向钙激素水平进行比较时无显著性差异。
调节年龄和体重后，向钙激素或钙水平无一明显地与跟骨BMD变化有关。参见表7。甚至在更换了季节和诊所后，以及在调整或排除了日常使用了钙或含维生素D复合维生素的用户后，该结果也仍然确实如此。
较低水平的25(OH)D与髋部骨损失增高明显相关。参见表9。25(OH)D水平处于最高四分位(≥32pg/ml)的妇女的BMD年均变化率为-0.1％(-0.5，0.3)，这是与25(OH)D水平处于最低四分位(＜21pg/ml)的妇女的BMD年均变化率-0.7(-1.1，-0.4)相比较而言。该趋势在调整了诊所、季节、钙和含维生素D复合维生素用户后仍然很显著。
甲状旁腺激素(PTH)水平与跟骨和髋部的骨损失之间没有一致的相关性。参见表7和8。对PTH的趋交叉四分位的试验揭示出不寻常的图谱，也就是，PTH水平处于中央范围(第2和第3四分位)时髋部骨损失较高，PTH水平处于极端值(最低和最高四分位)的妇女的骨损失较少。
7.结论
上述数据证实，在老年妇女中，较低水平的血清雌激素与髋部骨损失的增高明显相关，甚至在调整了年龄、体重以及SHBG和睾酮水平之后也是如此。事实上，雌二醇水平等于或高于10pg/ml的妇女在跟踪访问期间的平均骨质有较小的增加(年均变化率＝0.1％；95％CI＝-0.5，0.7)，但雌二醇水平无法检测到的妇女(＜5pg/ml)几乎以每年1％的速度失去髋部骨质(-0.8％；-1.2，-0.3)。由于骨损失对于老年妇女来说是髋部骨折的一个重要的危险因素，所以上述发现表明，适度增加循环激素的水平可以有效降低骨损失和骨折的发生率。
SHBG浓度与跟骨和髋部骨损失密切相关，这不依赖于年龄、体重和雄激素水平。SHBG以高亲和力与血清雌二醇和睾酮结合，这种相关性可以反映出骨损失的危险性随着可生物利用的性激素水平的减小而增高。然而，该相关性甚至在修正了血清雌二醇和睾酮水平后也很强，这说明SHBG对骨骼可能存在其他影响。
较低的25(OH)水平与髋部骨损失加速有关，但与跟骨的无关。将抽样研究的上述结果相结合：有两个研究试验发现，具有较低25(OH)水平的绝经后妇女具有较低的骨矿物质密度(参见Villareal，《临床内分泌和代谢杂志》72(3)：628-634(1991)；Martinez等人Calcified TissueInternational 55(4)：253-256(1994))，但至少在另一个抽样研究试验中发现，25(OH)D和挠骨远端、中挠骨和腰椎处的骨矿物质密度没有显著的相关性(参见Tsai等人Calcified Tissue International 40(5)：241-243(1987))。然而，Tsai等人的研究是在很宽的年龄范围(33-94)之间进行的，并且没有单独报导老年妇女的相关性。
在我们的研究中，PTH水平与跟骨或髋部的骨损失无关。该结果甚至在更换了季节并排除了摄取钙或维生素D补品的妇女之后也确实如此。
本研究是前瞻性研究，其中测定了骨折的变化率而不是横断面的骨质。血清样本是在测量骨质变化之前获得的。样本量明显大于其他多数有关研究中的样本量，并且试验个体样本是从美国四个分散的社区的老年人群中抽取。
所以，上述结果证实，SHBG和外源性雌激素是老年妇女中骨损失的重要决定因素。较低的25(OH)D水平与髋部骨损失加快有关，但与跟骨的无关。PTH和其他向钙激素对老年妇女中的骨损失没有显著的影响。
实施例4
下列实施例和数据用来说明血清雌二醇水平和骨密度之间的关系。
1.试验人群
本试验中所用的个体是骨质疏松性骨折(SOF)研究中的参与者，在实施例1中已经详细描述。
9704名SOF参与者在1986-1988年的基线访问期间在临床中心接受访谈和测试。在这些访谈中，收集有关主治医师诊断的病情和用药史的详细数据。我们获得了身高、体重和强壮度的标准评估数据。我们通过单光子吸光分析法测出了跟骨和邻近第三挠骨的BMD。还获得了胸廓和腰椎的侧面放射照片。收集各参与者的血清样本。
参与者每年填写调查表并且每两年一次到诊所进行跟踪访谈，共三次。在第一次跟踪访谈时(在1988-1990年间)，我们利用双能X射线吸光分析法(DXA)测量股骨远端的BMD。有关这些测量方法和对测光密度术的质量控制的详细情况公开在Steiger等人的《骨矿物质研究杂志》7：625-632(1992)中。
2.血清样本和生物化学试验
要求所有参与者坚持在试验的前夜食用无脂肪饮食以使在早晨的测试中干扰测试的脂血最小化。在上午8:00到下午2:00间抽取血样并将血清冷冻至-20℃。两周内将所有样本运抵生物医学研究院(Rockville，MD)，在那里它们被储存在液氮中(近-190℃)。这些样本的长期稳定性通过储存在-20℃两周后所得的雌二醇和储存在-190℃3.5年后所得的雌二醇相比较而测得。对于这51个样本来说，相关系数为0.94，两周后的平均值(±SD)为11.8(9.0)，3.5年后的平均值为10.9(9.0)。
在最初的人群研究中，生物化学试验使用的基线血清从400名随机抽取的参与者获得。在此次测试中，我们排除了那些检测不到血清雌二醇的妇女(n＝134)和那些声称当前正接受全身雌激素治疗的妇女(n＝39)，剩下247名妇女进入此次测试。
对每个个体进行下面的生物化学测试：向钙激素因子包括钙、25(OH)维生素D、1.25(OH)2维生素D和甲状旁腺激素；生长因子包括类胰岛素生长因子-1和类胰岛素生长因子结合蛋白3；骨形成标志物包括骨特异性碱性磷酸酶和骨钙蛋白；性激素和肾上腺激素包括雌二醇、雌酮、睾酮(总的和游离的)、SHBG、脱氢表雄甾酮硫酸酯(DHEAS)；其它内分泌试验包括甲状腺刺激(TSH)。这些生物化学测试的方法公开在Reginster等人Calcif.Tissue Intl.51：340-343(1992)中。对于雌二醇的免疫分析法是由内分泌科学实验室(Tarzana，CA)完成的，他们采用高灵敏分析法，其检测下限为5pg/ml。
为了验证我们在独立人群中的发现，我们测定了第二随机样本，即222名满足与初始分析样本相同的入选和排除标准的参与者的基线血清雌二醇。对第二人群血清雌二醇的测定是由Corning NicholsInstitute(San Juan Capistrano，CA)来完成，他们采用了高灵敏度分析法，其灵敏度下限为2pg/ml。22份一分为二的血清样本在两个参照实验室中的测定结果相同(相关系数＝0.9，斜率1.3)。
3.椎骨畸形的调查
放射照片的形态分析用于诊断基线的流行性椎骨畸形；流行性畸形的标准是在至少1个椎骨的前、中或后椎骨的高度各降低了3SD以上。参见Black等人的《骨矿物质研究杂志》10：890-902(1995)。
4.统计学分析
分析是在旧金山的加州大学的SOF协作中心中完成。
在第一样本(n＝27)中，基于其血清雌二醇水平将妇女分为4组；在1等级中，包括了所有雌二醇无法检测到(＜5pg/ml，n＝81，32.8％)的妇女；其余的妇女是基于5-6pg/ml、7-9pg/ml和10-25pg/ml的雌二醇水平大致相等地分为三组；这些等级中的试验个体数量为55(22.3％)、63(25.5％)和48(19.4％)。在第二检验样本(n＝222)中，采用相同的血清雌二醇截点；个体在这些组中的比例是25.2％、27.5％、24.8％和22.5％。
在就个体的体重和年龄进行修正后对结果进行测定。这是因为体重和BMI极其相关，同时体重与BMD的相关性更强。参见Bauer等人的《内科纪事》118：657-665(1993)。我们对入选后续模型中的体重进行筛选。随后，我们利用第一试验变量评估了协变量的可能性作用，我们认为这些第一试验变量是骨密度或骨质疏松性骨折的有效预示变量。如果任何有效的混杂者在不同的雌二醇等级中显示出一致的趋势(在分析变量时测试线性趋势)，我们将进一步评价其在多变量模型中的作用，所得结果是第四骨骼位点处的骨密度。这些模型包括年龄、诊所位置和血清雌二醇以及入选者的预示变量。如果入选者的变量能够在上述模型中保持，那么她被认为是混杂者(confounder)。我们还在模型中增加了握力强度和日常吸烟行为作为变量，因为这些变量在先于我们的研究中被证实是BMD(参见Bauer等人的《内科纪事》118：657-665(1993))和骨折(参见Cummings等人的《新英格兰医学杂志》332：767-773(1995))的预示变量。
利用对变量的分析，可以计算出各等级雌二醇的经修正的平均BMD。利用Dunnett氏试验来测定修正后的最低等级的BMD(雌二醇无法检测到)相对于3个较高等级的BMD之间的差别的统计显著性。用逻辑回归模型来计算多变量修正的优势率(OF)，以及3个相对于最低等级来说较高的雌二醇等级的流行性椎骨畸形的危险性的95％置信区间。所述分析采用SAS(SAS Institute，Cary，NC)完成。
5.试验个体雌二醇水平的特征
在本试验中妇女的临床测量结果如表10所示：
表10
在按照血清雌二醇水平分组的247名老年妇女中测定的临床值和实验值
Figure C9881135900401
一般地，本研究中的妇女的年龄约为72岁(表10)。平均雌二醇水平随年龄而改变；那些年龄在65-74岁的妇女的平均(SD)雌二醇水平为5.8(5.1)pg/ml，那些年龄大于或等于80岁的妇女的平均雌二醇水平为6.3(4.9)。不同雌二醇等级间的身高无差别。在最高雌二醇等级的妇女中，体重在统计学意义上较高。生物化学试验包括向钙因子、生长因子、骨特异性碱性磷酸酶和DHEAS(未给出结果)的分析。该生物化学试验未显示出不同雌二醇等级之间存在较大或一致性差异。雌二醇水平处于最高等级的妇女中的雌酮和总睾酮约是雌二醇水平无法检测到妇女中的2倍。数个变量包括那些与体重有关的变量，那些不同雌二醇等级之间的明显且一致的差异。雌二醇水平较高时骨钙蛋白趋于降低；雌二醇处于最高等级时要比处于最低等级(无法检测到)雌二醇时的骨钙蛋白低10.9％。因为不同雌二醇等级间存在差别，并且与4个BMD的结果相当一致，所以模型中包括体重和SHBG以及年龄、握力强度和日常吸烟。
四个骨骼位点都同样表现出，年龄和体重修正的基线BMD随雌二醇水平增高而趋于增高。和血清雌二醇水平＜5pg/ml的妇女比较，那些雌二醇水平10-25pg/ml的妇女所有骨骼位点的平均BMD在统计学意义上较高；对于整个髋部、跟骨、挠骨远端和椎骨，差别分别是4.6％，6.1％，5.8％和7.1％(相对于各对照P＜0.05)。在将多变量修正后，有关整个髋部、跟骨、挠骨远端和椎骨的差别仍然具有统计学上的显著性：5.7％，6.35％，6.5％和6.9％。
检验试验中的妇女具有与在我们的初始试验中的妇女相同的特征，其中包括血清雌二醇水平。由检验试验的人群中发现，血清雌二醇水平和BMD之间具有类似的相关性。在全部四个骨骼位点处，修正了年龄和体重的BMD表现出与初始人群相似的趋势。与血清雌二醇＜5pg/ml的妇女相比，那些雌二醇水平10-25pg/ml的妇女在整个髋部、跟骨、挠骨远端和椎骨处的BMD分别增高4.9％，9.6％，7.3％和6.8％。在对多变量进行修正后，差别仍然具有统计显著性：整个髋部、跟骨、远挠骨和椎骨处的BMD增高3.8％，7.0％，5.4％和6.9％。
在最低雌二醇等级(＜5pg/ml)的妇女中，有30％的妇女呈≥1的流行性椎骨畸形，而在其他雌二醇水平为7-19％的三个等级中，该流行性较低。在对年龄和体重进行修正后，雌二醇水平介于5-25pg/ml内的妇女的流行性椎骨畸形似乎比雌二醇水平无法检测到的妇女的低60％(OR＝0.4，95％置信区间(CI)0.2-0.8)；多变量修正对该比率的影响很小(OR＝0.4，CI 0.2-0.7)。在检验试验的人群中，我们未发现存在任何雌二醇水平和椎骨畸形流行性相关的趋势；在所有雌二醇的等级中，该流行性相似且介于15％-19％。
6.结论
上述数据证实，血清雌二醇水平低于5pg/ml被认为有害于老年妇女的骨骼健康。在对年龄和体重进行修正后，数据显示雌二醇水平低于5pg/ml的妇女在全部骨骼位点具有实质上减少的BMD。此外，数据还显示，作为骨更新的标识物的骨钙蛋白在血清雌二醇水平较低的妇女中趋于增高。因此，在临床上，低浓度的雌二醇对老年妇女产生重要的影响。对此的可能解释是，当雌二醇以低浓度存在时，可以减少骨骼畸形，有利于骨骼的质量，并且由此降低骨折率。
我们发现BMD的差别很大，甚至在对多因子修正后仍然对应约0.4的标准偏差(SD)。该差别被推测可以使髋部骨折危险性减小30％(假定1.0SD＝0.11g/cm2和1.0SD差别＝RR2.8)。利用相同的计算方法，我们认为脊椎密度正相关于血清雌二醇10-25pg/ml，等效于约0.4SD，由此推测出可以使脊椎骨折的危险性降低23％(假定1.0SD＝0.17g/cm2和1.0SD差别＝RR2.1)。
雌酮作为骨骼健康的一个预示变量在绝经后妇女中被广泛测定。已发现BMD在白人和黑人妇女中都与血清雌酮水平典型相关(参见Cauley等人《美国流行病学杂志》(Am.J.Epid.)139：1035-1046(1994))。然而，本研究也有局限性，因为半数以上妇女的雌二醇水平低于检测限。雌酮不能预示偶然性髋部骨折。在绝经后妇女中，雌酮是数量上占优势的雌激素，并且主要由肾上腺雄甾烯二酮转化生成。雌二醇是通过还原雌酮且通过芳构化卵巢和肾上腺的睾酮来生成，其衍生自转化的雄甾烯二酮和DHEA。(参见，Cauley等人，《美国流行病学杂志》139：1035-1046(1994))。数据显示，在初始样本(r＝0.65)和验证样本(r＝0.78)中，血清雌酮水平和雌二醇之间具有高相关性。雌二醇而不是雌酮被认为是核受体的效应激素。(参见Grodin等人的《临床内分泌和代谢杂志》36：207-214(1973))。雌二醇的效能是雌酮的4-10倍。所以，雌二醇是主要的甾类性激素，因此可以预测出它对骨骼结果具有强有力的、持续的和正性关系。
雌二醇可以通过若干可能性机制对骨骼产生有益作用：降低骨代谢单位的活化；拮抗甲状旁腺激素对骨吸收的刺激作用；通过局部细胞因子或其他生长因子来提高成骨细胞的存活；增强胃肠道对钙的吸收和肾钙保存的功效。上述作用中的一些或全部可以对极低水平的雌二醇产生反应。我们的数据也支持了雌二醇对减轻骨代谢的影响。雌二醇通过体重间接地影响骨骼，但我们的数据对体重进行了修正，但发现它们仍然具有密切的关系。
过去，非灵敏的测试阻碍了雌二醇作用的研究。只有极其灵敏和精确的方法才可以区分开低水平(＜30pg/ml)和极低水平(＜5pg/ml)雌二醇。一些商用实验室所提供的雌二醇分析法的检测下限小于20pg/ml。缺乏上述灵敏分析方法将妨碍其他人发现上述相关性。与极低水平相比，低的内源性雌二醇水平产生的结果很细小并且需要许多年才能显示出BMD的变化。我们的抽样数据显示出雌二醇水平在65岁以后不再随着年龄的增加而降低。
我们的结果表明，低水平的雌二醇具有对抗骨质降低和骨折的保护作用；该作用是肯定的，因为可以对若干骨骼位点处的骨密度，髋部和跟骨的骨损失，以及椎骨骨折的危险性进行观察。这些发现由不同实验室的高灵敏雌二醇分析法来重现。雌二醇在老年妇女中对骨骼的有益作用在预先确定无生理损伤的妇女中产生。
上述对优选实施方案和实施例的描述是举例说明本发明，并不对本发明构成限定。本发明由下列权利要求限定，其中包括等效力的权利要求。

Claims (19)

1.含有对于口服给药而言小于0.5mg/天的超低剂量雌激素、用于治疗绝经后个体的机体症状的口服制剂，所述雌激素能在所述个体中有效产生相当于5pg/ml-15pg/ml血清雌二醇水平的所述雌激素血清水平，以及所述机体症状选自骨质疏松症、头痛、恶心、抑郁、热潮红、骨骼矿物质密度降低和骨折的危险或发病率的增加。
2.含有对于透皮给药而言小于25μg/天的超低剂量雌激素、用于治疗绝经后个体的机体症状的透皮制剂，所述雌激素能在所述个体中有效产生相当于5pg/ml-15pg/ml血清雌二醇水平的所述雌激素血清水平，以及所述机体症状选自骨质疏松症、头痛、恶心、抑郁、热潮红、骨骼矿物质密度降低和骨折的危险或发病率的增加。
3.含有对于非肠道给药而言小于20μg/天的超低剂量雌激素、用于治疗绝经后个体的机体症状的非肠道制剂，所述雌激素能在所述个体中有效产生相当于5pg/ml-15pg/ml血清雌二醇水平的所述雌激素血清水平，以及所述机体症状选自骨质疏松症、头痛、恶心、抑郁、热潮红、骨骼矿物质密度降低和骨折的危险或发病率的增加，条件是非肠道制剂为通过皮下，静脉内，肌肉内或皮内注射的制剂，非肠道给药为通过皮下，静脉内，肌肉内或皮内注射给药。
4.权利要求1，2或3所述的制剂，其中所施用的所述雌激素的量为能在所述个体中有效产生相当于5pg/ml-10pg/ml血清雌二醇水平的所述雌激素血清水平。
5.权利要求1，2或3所述的制剂，其中所述的雌激素是雌二醇。
6.权利要求5所述的制剂，其中口服施用的所述雌激素的量为少于0.5mg/天。
7.权利要求6所述的制剂，其中所述雌激素的量为0.1-0.25mg/天。
8.权利要求5所述的制剂，其中胃肠外施用的所述雌激素的量为少于20μg/天。
9.权利要求5所述的制剂，其中胃肠外施用的所述雌激素的量为5-15μg/天。
10.权利要求5所述的制剂，其中胃肠外施用的所述雌激素的量为10μg/天。
11.权利要求5所述的制剂，其中透皮施用的所述雌激素的量为不多于15μg/天。
12.权利要求5所述的制剂，其中透皮施用的所述雌激素的量为5μg/天-15μg/天。
13.一种供患有或易患有因绝经后雌激素减少所致机体症状的用户使用的试剂盒，该试剂盒包括：
a)含有20μg/天的超低剂量雌激素的透皮贴剂，其以有效产生相当于5-15pg/ml血清雌二醇的血清雌激素的量透皮施用雌激素；和
b)描述用该透皮贴剂来治疗所述用户由绝经后雌激素减少所致的机体症状的方法的说明书。
14.含有超低剂量雌激素、用于治疗绝经后个体的机体症状的透皮贴剂，在无外源孕酮的存在下给所述个体透皮施用少于20μg/天量的雌二醇。
15.权利要求14所述的透皮贴剂，其中所述机体症状选自绝经后雌激素下降、由于绝经后骨质疏松导致的骨质疏松性骨折的危险性增高和骨矿物质密度损失。
16.权利要求14所述的透皮贴剂，其中所述施用是在所述个体实施子宫切除术之前。
17.权利要求14所述的透皮贴剂，其中所述的雌激素是雌二醇。
18.权利要求17所述的透皮贴剂，其中所施用的所述雌激素的量为5-15μg/天。
19.权利要求17所述的透皮贴剂，其中所施用的所述雌激素的量为10μg/天。
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