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CH649711A5 - Gewebeklebstoff. - Google Patents

Gewebeklebstoff. Download PDF

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CH649711A5
CH649711A5 CH1174/80A CH117480A CH649711A5 CH 649711 A5 CH649711 A5 CH 649711A5 CH 1174/80 A CH1174/80 A CH 1174/80A CH 117480 A CH117480 A CH 117480A CH 649711 A5 CH649711 A5 CH 649711A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
fibrinogen
tissue adhesive
adhesive according
lyophilized
factor xiii
Prior art date
Application number
CH1174/80A
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English (en)
Inventor
Otto Dr Schwarz
Yendra Dr Linnau
Franz Loeblich
Thomas Seelich
Original Assignee
Immuno Ag
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Publication date
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Description

Die Erfindung betrifft einen Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen und Faktor XIII.
Es ist seit langem bekannt, Blutgerinnungssubstanzen zur Stillung von Blutungen bzw. für Wundversiegelungen heranzuziehen. Nach den ersten derartigen Vorschlägen wurden Fibrintampons bzw. Fibrinplättchen verwendet. Während des Zweiten Weltkrieges wurden Gewebeklebun-gen mit Hilfe von Blutplasma vorgeschlagen.
In letzter Zeit wurde von H. Matras u.a. in der «Wiener Medizinischen Wochenschrift», 1972, Seite 517, ein Gewebeklebstoff auf Basis von Fibrinogen und Faktor XIII zur nahtlosen interfaszikulären Nerventransplantation im Tierexperiment beschrieben.
Eine weitere Studie stammt von Spängier u.a. in der «Wiener Klinischen Wochenschrift», 1973, Seiten 1 bis 7. Auch hier wurde in Tierversuchen die Möglichkeit aufgezeigt, mit Hilfe von Fibrinogen als Kryopräzipitat und Thrombin eine Gewebeklebung vorzunehmen.
Die bekannten Präparate haben sich noch nicht als zufriedenstellend erwiesen, weil sie die an einen Gewebeklebstoff zu stellenden Forderungen, welche die folgenden sind:
a) hohe Belastbarkeit der Klebungen bzw. Wundversiegelungen sowie sichere und anhaltende Blutstillung, d.h.
gute Haftfähigkeit des Klebers an den Wund- bzw. Gewebs-flächen, sowie hohe innere Festigkeit desselben,
b) regelbare Haltbarkeit der Klebungen im Körper,
c) vollkommene Resorbierbarkeit des Klebstoffes im Verlauf des Wundheilungsprozesses,
d) wundheilungsfördernde Eigenschaften,
noch nicht in ausreichendem Masse erfüllen. Dies mag teilweise darauf zurückzuführen sein, dass die für die Blutstillung notwendigen Gerinnungsfaktoren in den bekannten Präparaten nicht in einem optimalen Verhältnis zueinander vorhanden waren und auch daran, dass die fibrinolytische Aktivität im Klebebereich nur ungenügend beherrscht wurde. Es kam häufig durch enzymatische Einwirkung zu einer vorzeitigen Auflösung der Gewebeklebungen.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, einen lyophilisierten Gewebeklebstoff menschlichen oder tierischen Ursprungs zu schaffen, der die weiter oben aufgestellten Voraussetzungen erfüllt und in lyophilisierter Form vorliegt, wonach wegen der längeren Haltbarkeit und besseren Transport- bzw. Lagerfahigkeit ein Bedürfnis besteht.
Dementsprechend besteht die Erfindung in der Kombination der folgenden Merkmale:
a) dass er mindestens 33 Gew.-% Fibrinogen enthält,
b) dass das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) dass im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in einem Verhältnis von 33 bis 90: 5 bis 40 enthalten sind,
d) dass er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhi-bitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, in einer Menge von 250 bis 25 000 Kallikrein-Inaktivator-Einhei-ten (KIE) pro g Fibrinogen enthält,
e) dass das Präparat lyophilisiert ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Gewebeklebstoff zusätzlich Glycin, wodurch die Wiederauflösbarkeit des lyophilisierten Produktes verbessert wird.
Weiters kann der Gewebeklebstoff zusätzlich Glucose oder Saccharose enthalten, welche Komponenten ebenfalls die Auflösbarkeit fördern.
Der Gewebeklebstoff kann weiters 0,2 bis 200 IE Heparin pro g Fibrinogen enthalten, wodurch eine stabilisierende Wirkung erreicht wird.
Der Gewebeklebstoff gemäss der Erfindung besitzt charakteristische Vernetzbarkeitseigenschaften nach der Auflösung, welche nach der Natriumlaurylsulfat (SDS)-Polyacryl-amid-Gelelektrophorese-Methode bestimmbar sind. Der Test wird derart durchgeführt, dass nach dem Vermischen des Gewebeklebstoffes mit dem gleichen Volumen einer Lösung, enthaltend 40 (xMol CaCl2 und 15 NIH-Einheiten (US National Institute of Health-Einheiten) Thrombin pro ml, die Mischung bei 37 °C inkubiert wird. Der Vernetzungsgrad wird nach Stoppen der Reaktion und reduktiver Spaltung der in den Proteinen enthaltenen Disulfidbrücken durch Zugabe eines Gemisches von Harnstoff, Natriumdodecylsulfat und ß-Mercaoptoäthanol durch Gelelektrophorese bestimmt. Charakteristisch für den erfindungsgemässen Gewebeklebstoff ist eine vollständige Vernetzung der Fibrin-y-Ketten nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35%ige Vernetzung der Fibrin-a-Ketten nach 2 Stunden.
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Fibrinogen, Albumin und kälteunlösliches Globulin im Gesamtprotein sollen im erfindungsgemässen Gewebeklebstoff bevorzugt in einem bestimmten Verhältnis stehen; dieses Verhältnis beträgt üblicherweise 33 bis 90 : 5 bis 40 : 0,2 bis 15.
Die Erfindung umfasst des weiteren ein Verfahren zur Herstellung des beschriebenen Gewebeklebstoffes, ausgehend von Plasmakryopräzipitat, welches dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Natriumci-trat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasmino-gen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst, Humanalbumin zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
Vorteilhaft wird das Kryopräzipitat aus humanem oder tierischem Frischplasma hergestellt, welches bei —20 °C eingefroren wurde. Bei Erhöhung der Temperatur auf 0 bis 2 °C wird das Kryopräzipitat gewonnen und durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wird durch ein- oder mehrmalige Elution mit der Pufferlösung, die einen pH-Wert von 6 bis 8,0 aufweist, eluiert und bei 0 bis 4 °C zentrifugiert, um das kältelösliche Plasmaprotein zu entfernen. Die Behandlung mit der Pufferlösung wird bis zum Erreichen des gewünschten Faktor XIII-Fibrinogen-Verhältnisses durchgeführt.
Der gereinigte Niederschlag wird mit einer weiteren Pufferlösung, die Humanalbumin, Glycin und gegebenenfalls Glucose oder Saccharose, einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor sowie Heparin enthält und einen pH-Wert von 6,5 bis 9,0 aufweist, gelöst und auf eine Proteinkonzentration von 4,0 bis 9,0% verdünnt. Die Lösung wird über Membranfilter einer Porengrösse bis zu 0,2 um filtriert, in die Endbehälter abgefüllt und lyophilisiert.
Der so erhaltene lyophilisierte Gewebekleber kann bei Zimmertemperatur oder vorzugsweise bei +4 °C gelagert werden, er ist nach Rekonstitution mit Aqua ad iniectabilia, dem wahlweise ein Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor, vorzugsweise Aprotinin, beigefügt werden kann, gebrauchsfertig. Bei der Auflösung des lyophilisierten Präparates ist darauf zu achten, dass die gebrauchsfertige Lösung mindestens 70 mg Fibrinogen pro ml enthält.
Der GewebeklebstofT gemäss der Erfindung weist eine universelle Anwendbarkeit auf. Er kann zum nahtlosen Verbinden von menschlichen oder tierischen Gewebe- oder Organteilen, zur Wundversiegelung und Blutstillung sowie zur Förderung von Wundheilungen verwendet werden.
Bevorzugte Anwendungsgebiete, für welche der erfin-dungsgemässe Gewebeklebstoff erfolgreich eingesetzt werden kann, sind:
Indikationen im Bereich der Hals-, Nasen-, Ohren- und Kieferchirurgie, Zahnheilkunde, Neurochirurgie, plastischen
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Chirurgie, allgemeinen Chirurgie, Abdominalchirurgie, Tho-rax- und Gefässchirurgie, Orthopädie, Unfallchirurgie, Urologie, Ophthalmologie und Gynäkologie.
Vorteilhaft wird vor der Applikation des erfindungsgemässen Gewebeklebstoffes auf das zu verbindende Gewebe eine Mischung von Thrombin und Calciumchlorid dem Klebstoff zugefügt oder auf das Gewebe aufgebracht.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:
211 humanes, bei —20 °C eingefrorenes Frischplasma wurden auf +2 °C erwärmt. Das entstandene Kryopräzipitat (435 g) wurde bei +2 °C durch Zentrifugieren abgetrennt und bei + 2 °C mit 4,3 1 einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,5, die 6,6 g Na3-Citrat • 2H20, 3,4 g NaCl, 10,0 g Glycin, 13,0 g Glucose • 1H20, 50 000 KIE Aprotinin und 200 IE Heparin pro 1 enthielt, behandelt und nochmals bei +2 °C zentrifugiert. Der abgetrennte Niederschlag wurde in einer weiteren Pufferlösung vom pH-Wert 7,9, welche 35,0 g Humanalbumin, 20,0 g Glycin, 50 000 KIE Aprotinin und 200 IE Heparin pro 1 enthielt, gelöst und auf eine Konzentration von 70 mg Protein pro ml verdünnt.
Sodann wurde die Lösung über Membranfilter bis zu einer Porengrösse von 0,2 |xm sterilfiltriert, zu je 2,2 ml Endbehälter abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert. Nach Rekonstitution des lyophilisierten Produktes auf eine Fibrinogen-konzentration von 90 mg/ml zeigt das gebrauchsfertige Gewebeklebstoffpräparat im Vernetzungstest eine vollständige Fibrin-y-Vernetzung nach 5 Minuten und eine 66%ige Fi-brin-a-Vernetzung nach 2 Stunden bei 37 °C.
Das Verhältnis der im Gewebeklebstoff enthaltenen Proteine Fibrinogen zu Albumin zu kälteunlöslichem Globulin wurde mit 64,0: 22,3 : 7,7 festgestellt. Der Heparingehalt betrug 4,5 IE pro g Fibrinogen. Aprotinin war in einer Konzentration von 1133 KIE pro g Fibrinogen enthalten. Der Gehalt an Faktor XIII betrug 161 Einheiten pro g Fibrinogen. Der Gehalt an Gesamtprotein im lyophilisierten Präparat betrug 72,2%, der Gehalt an Fibrinogen im lyophilisierten Präparat 46,2%.
Die Bestimmungen erfolgten in folgender Weise: Die Bestimmung der Faktor XIII-Einheiten erfolgte mittels eines Vernetzungstests, bei dem Faktor XHI-freies Fibrinogen als Substrat verwendet und die durch die Zugabe der unbekannten verdünnten Probe bewirkte Fibrinvernetzung als Mass für die darin enthaltene Menge an Faktor XIII diente. Eine entsprechende Eichkurve wurde mit gepooltem humanem Citratplasma erhalten, wobei per definitionem 1 ml Plasma 1 Einheit Faktor XIII enthält. Die quantitativen Proteinbestimmungen erfolgten mittels der Methode nach Kjeldahl.
Die Bestimmung der Proteine relativ zueinander erfolgte ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, u.zw. a) mit einer nicht reduzierten und b) mit einer mit ß-Mercaptoäthanol reduzierten Probe des Gewebeklebstoffes.
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Claims (8)

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1. Gewebeklebstoff auf Basis von menschlichen oder tierischen Proteinen, enthaltend Fibrinogen und Faktor XIII, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Merkmale:
a) dass er mindestens 33 Gew.-% Fibrinogen enthält,
b) dass das Verhältnis des Faktors XIII zu Fibrinogen, ausgedrückt in Einheiten des Faktors XIII pro Gramm Fibrinogen, mindestens 80 beträgt,
c) dass im Gesamtprotein Fibrinogen und Albumin in einem Verhältnis von 33 bis 90 : 5 bis 40 enthalten sind,
d) dass er einen Gehalt an Plasminogen-Aktivator-Inhi-bitor oder Plasmin-Inhibitor, in einer Menge von 250 bis 25 000 KIE pro g Fibrinogen enthält,
e) dass das Präparat lyophilisiert ist.
2. Gewebeklebstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich Glycin enthält.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Gewebeklebstoff nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich Glucose oder Saccharose enthält.
4. Gewebeklebstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass er 0,2 bis 200 IE Heparin pro g Fibrinogen enthält.
5. Gewebeklebstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch eine vollständige Vernetzbarkeit der Fibrin-y-Ketten durch Inkubation nach 3 bis 5 Minuten und eine mindestens 35%ige Vernetzbarkeit der Fibrin-a-Ketten nach zweistündiger Inkubation, bestimmt nach der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Methode, nach Auflösung des lyophilisierten Präparates.
6. Gewebeklebstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Fibrinogen zum Albumin zu kälteunlöslichem Globulin im Gesamtpro-tein 33 bis 90 : 5 bis 40 : 0,2 bis 15 beträgt.
7. Gewebeklebstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er als Komponente (d) Apro-tinin enthält.
8. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebstoffes nach Anspruch 1 aus Plasmakryopräzipitat, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Kryopräzipitat durch ein- oder mehrfache Behandlung mit einer Pufferlösung, welche Na-triumcitrat, Natriumchlorid, Glycin, Glucose und einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor oder Plasmin-Inhibitor und Heparin enthält, kältelösliches Plasmaprotein entfernt, der gereinigte Niederschlag gelöst, Humanalbumin zugesetzt und die Lösung lyophilisiert wird.
CH1174/80A 1979-02-15 1980-02-13 Gewebeklebstoff. CH649711A5 (de)

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