CH646607A5

CH646607A5 - Haemostatisches mittel und verfahren zu seiner herstellung.

Info

Publication number: CH646607A5
Application number: CH467879A
Authority: CH
Inventors: Philip Nicholas Sawyer
Original assignee: Interface Biomedical Lab Corp
Priority date: 1978-05-19
Filing date: 1979-05-21
Publication date: 1984-12-14
Also published as: FR2425860A1; CA1124177A; GB2051074A; DE2918098A1; SE7903617L; US4238480A; IT1115218B; GB2051074B; IT7922635A0; FR2425860B1

Description

Die Erfindung betrifft ein hämostatisches Mittel und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Sie betrifft insbesondere ein Hämostatikum, das durch Behandeln von Kollagen oder einer kollagenartigen Substanz hergestellt wird. Die erfin-dungsgemässen Mittel können zur Kontrolle bzw. Bekämpfung oder zum Stillen einer Blutung verwendet werden.

In verschiedenen Patentschriften wird die Modifizierung der Oberflächenladung von Gefässsystemen oder von Substanzen, die in Verbindung damit verwendet werden sollen, diskutiert. Generell wurde vorgeschlagen, solche Systeme zu behandeln, um ihre Oberflächenladung negativer zu machen, um das Auftreten einer Thrombose und dgl. zu vermeiden.

Es sind bereits die verschiedensten hämostatischen Mittel (Hämostatika) bekannt, wie z. B. Gelfoam™, hergestellt von der Firma Up-John und beschrieben in der US-Patentschrift 2 465 351, Avitene™, hergestellt von der Firma Acecon und beschrieben in der US-Patentschrift 3 742 955, und Surgi-cell™, hergestellt von der Firma Johnson und Johnson und beschrieben in der US-Patentschrift 3 364 200.

In der US-Patentschrift 3 742 955 ist angegeben, dass Kollagen in verschiedenen behandelten oder präparierten Formen in der Chirurgie und für die Versorgung von Wunden verwendet werden kann und aus «Ann. Surg.», 161, 238-247, Febr. 1965, ist zu entnehmen, dass Kollagen hämo-statische Eigenschaften besitzt, wenn es als Wundverbandmaterial verwendet wird. In der US-Patentschrift 3 742 955 ist ferner angegeben, dass faserförmiges Kollagen und aus

Kollagen hergestellte Faserprodukte, wenn sie in geeigneter Weise hergestellt werden und mit Blut benetzt werden, nicht nur eine hämostatische Wirkung besitzen, sondern auch eine unerwartete Haftung an durch Einschnitt voneinander getrennten biologischen Oberflächen bei Warmblütern besitzen. Darin ist auch ein Verfahren zur Herstellung von fein-teiligem faserförmigem Kollagen und von Kollagen abgeleiteten Faserprodukten beschrieben, die wertvolle hämostatische Mittel (Hämostatika) darstellen und einzigartige Haftungseigenschaften im Kontakt mit einer eingeschnittenen oder eingerissenen biologischen Oberfläche bei einem Warmblüter besitzen, wenn sie mit Blut benetzt sind.

In der US-Patentschrift 3 364 200 ist angegeben, dass seit vielen Jahren zum Stillen von Blutungen chirurgische Hämostatika verwendet werden, die aus konventionellen Gaze-Kompressen oder ähnlichen Artikeln bestehen, die mit einem hämostatischen Material, wie Eisen(III)chlorid, Thrombin oder dgl. imprägniert worden sind. Diese bekannten Hämostatika haben jedoch den Nachteil, dass sie in einer geschlossenen Wunde nicht in situ verbleiben dürfen, da dies eine Fremdkörper-Gewebereaktion zur Folge hätte, was ein schwerwiegender Nachteil insofern ist, als bei der Entfernung des Hämostatikums von der blutenden Stelle ein Blutgerinnsel, das sich gebildet hat, wieder aufgerissen wird und das Bluten erneut beginnt. In der oben genannten Patentschrift wird daraufhingewiesen, dass deshalb ein vitales Bedürfnis nach einem hämostatischen Material besteht, das in einer geschlossenen Wunde an Ort und Stelle belassen werden kann, ohne dass eine ernste lokale Gewebereaktion dadurch hervorgerufen wird. Darin ist auch angegeben, dass eine Verbesserung dadurch erzielt werden konnte, dass gefunden wurde, dass oxydierte Cellulose nicht nur hämostatische Eigenschaften besitzt, sondern auch von tierischem Gewebe absorbiert werden kann. In dieser Patentschrift sind absorbierbare hämostatische oxydierte Cellulose-Mittel beschrieben, die eine verbesserte Beständigkeit gegen Beeinträchtigung bzw. Verschlechterung (Abbau) bei der Lagerung aufweisen. Die oxydierte Cellulose stammt aus Holzpulpe, Baumwolle, Baumwoll-Lintern, Ramie, Jute, Papier und ähnlichen Materialien und aus Regeneratcellulose oder Rayon, hergestellt nach dem Viskose- oder Bemberg-Verfah-ren. Die US-Patentschrift 2 465 357 bezieht sich auf einen für Flüssigkeiten durchlässigen, in Wasser unlöslichen Gelatineschwamm, der die allgemeinen physikalischen Eigenschaften eines Schwammes besitzt, jedoch von Tierkörpern absorbierbar ist. Bei dem Schwamm handelt es sich um eine poröse Substanz, die nach den Angaben in dieser Patentschrift genügend weich sein sollte, wenn sie feucht ist, und die viele feine Zwischenräume aufweist, um eine bestimmte Menge eines therapeutischen Mittels zurückzuhalten und dieses langsam abzugeben oder als wirksames Absorptionsmaterial für freifliessende Flüssigkeiten in einer Wundfläche, wie z.B. Blut und Exsudate, zu fungieren. Darin ist auch die Herstellung einer Gelatine enthaltenden wässrigen Lösung und die Zugabe einer geringen Menge Formalin und das anschliessende Erhitzen des Materials für einen längeren Zeitraum zur Herstellung eines festen Schaums mit einem wesentlich grösseren Volumen als die ursprüngliche Lösung beschrieben.

Die in den vorgenannten Patentschriften beschriebenen Erfindungen beziehen sich alle auf das Gebiet der Hämosta-se, keine betrifft jedoch die Kontrolle bzw. Steuerung der Elektronen- oder elektrostatischen Oberflächenladung der beteiligten Materialien und keine dieser Erfindungen geht dem Hämostase-Problem auf den Grund wie die vorliegende Erfindung.

Eine Diskussion über einen Kollagenschwamm ist ferner zu finden in «Collagen Sponge: Theory and Practice of Me-

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dical Applications» im «J. Biomedicai Materials Research», John Wiley & Sons, New York, Band 11, Nr. 5, Sept. 1977. In diesem Artikel sind die Anwendungen von Kollagen als biologisch abbaubares Material einschliesslich der Résorptions- und Antigenbildungsrate zusammenfassend dargestellt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein verbessertes hämostatisches Mittel (Hämostatikum) und ein Verfahren zur Herstellung dieses hämostatischen Mittels sowie dessen Anwendungsmöglichkeiten aufzuzeigen. Das Hämostatikum soll mit handelsüblichen Produkten konkurrenzfähig und diesen in bestimmten Belangen überlegen sein.

Das erfindungsgemässe hämostatische Mittel ist dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenladung der Kollagensubstanz oder kollagenartigen Substanz positiver ist als im Normalzustand. Das Herstellungsverfahren besteht darin, dass man der Kollagensubstanz oder kollagenartigen Substanz Zusätze beigibt, die deren Oberflächenladung erhöhen. Mit anderen Worten wird die Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz mit positiven Resten modifiziert, wobei die Erhöhung der Oberflächenladung entweder auf kovalen-ter oder auf nicht-kovalenter Modifizierung beruht. Die erfindungsgemässe Substanz kann klinisch verwendet werden zur Kontrolle bzw. Bekämpfung und Stillung von Blutungen, insbesondere in nicht näh- bzw. klebbaren Bereichen. Bei dieser Substanz handelt es sich um ein Hilfsmittel für chirurgische Verfahren, nicht um einen Ersatz der konventionellen chirurgischen Verfahren.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Kollagensubstanz oder kollagenartigen Substanz um Gelatine, die mit Salzsäure (HCl) behandelt wird. Gemäss einer anderen Ausführung wird die Gelatine mit Äthylendiamin behandelt. Die modifizierte Substanz wird in einer bevorzugten Ausführungsform lyophilisiert.

Diese und weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen hervor.

Dabei zeigen:

Fig. 1 bis 3 Diagramme, welche die Ultraviolettabsorptionsspektren von verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung darstellen;

Fig. 4 ein Diagramm, welches den pH-Wert von Lösungen für die erfindungsgemässen Verbindungen bzw. Mischungen angibt; und

Fig. 5 und 6 Diagramme der Infrarotspektren von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.

Viele Faktoren tragen zu dem Gerinnungsmechanismus der hämostatischen Mittel (Hämostatika) bei. Einige davon sind folgende: (1) die Oberflächenchemie (einschliesslich der biochemischen Wechselwirkungen), (2) die elektrischen oder elektrostatischen Ladungseigenschaften und (3) die Mikrostruktur. In den Vorstufen der Synthese und Bewertung (Beurteilung) von hämostatischen Mitteln wurde bereits versucht, die Bedeutung jedes der oben genannten Kriterien zu erkennen.

Die verschiedenen Formen des erfindungsgemässen hämostatischen Mittels sind Modifikationen von Kollagen oder einer kollagenartigen Verbindung. Kollagen selbst weist hämostatische Eigenschaften auf. Die Modifikationen, die durchgeführt worden sind, haben das Ziel, diese Phänomene sowohl durch Manipulieren der Oberflächenladung als auch der Mikrostruktur zu verstärken.

Die Modifizierung der Ladungsdichte einer Verbindung kann nach zwei verschiedenen Verfahren erzielt werden: (1) durch nicht-kovalente Modifizierung von gelöster Knochengelatine (Baker U.S.P.) unter Verwendung von positi646607

ven Gruppen, beispielsweise durch HCl, und (2) die kovalen-te Bindung der verschiedensten Liganden an die Peptidkette von Gelatine.

Multiple Formen eines positiv geladenen hämostatischen Mittels werden wie nachfolgend angegeben hergestellt, beispielsweise aus dem nachfolgend angegebenen Ausgangspräparat einer Kollagen- oder kollagenartigen Substanz oder Verbindung:

11 einer l%igen (oder 10 Gramm pro Liter) Ausgangslösung von Gelatine (Baker U.S.P., Rohmaterial) wird beispielsweise in destilliertem und entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren gelöst. Aus dieser Ausgangslösung werden 200 ml-Portionen (aliquote Anteile) entnommen und in den nachfolgend angegebenen verschiedenen Verfahren verwendet.

A) Nicht-kovalente Modifizierung

Die 200 ml-Portion der Proteinlösung wird mit einer HCl-Lösung auf den gewünschten pH-Wert (beispielsweise pH 2,5) eingestellt. Dies wird durchgeführt unter konstantem Rühren, um die Homogenität zu gewährleisten und jede Denaturierung minimal zu halten.

Die Gelatine-HCl-Lösung wird dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, durch ein Whatman-Filter Nr. 4 in einen 600 ml-Virtus-Kolben filtriert. Der Kolben wird dann in ein Trockeneis/Aceton-Bad (—40 °C) eingetaucht und unter konstantem Schütteln des Kolbens gefriert die Proteinlösung im Innern desselben aus. Dieses Material wird dann auf eine Virtus-Lyophilisier-Einrichtung (Research Equipment, N.Y., USA) aufgebracht und getrocknet, bis die Lösung einen schaumartigen Charakter hat. Das Material wird dann aus dem Virtus-Kolben entnommen und in Glasoder Kunststoff-Trockenflaschen eingeführt. Es können auch Shelf-Gefriermethoden angewendet werden, d.h. Gefriermethoden, bei welchen die Gelatine vorerst auf einem Tablett (Shelf) in ein Gefrierfach gegeben und tiefgefroren wird; daraufhin wird im Gefrierfach ein Vakuum erzeugt und das gebildete Eis wird als Dampf wegsublimiert, so dass die gefriergetrocknete Gelatine zurückbleibt.

Eine zweite Modifikation ist die Zugabe von CaCl2 • 2H20 (von Fisher-Reagensqualität) zu der gereinigten Gelatine in Ca++-Endkonzentrationen von 0,001 M, 0,01 M, 0,10 M oder 0,25 M (vgl. die weiter unten folgende Tabelle

I).

B) Kovalente Modifizierung

Die kovalente Bindung wurde erhalten unter Verwendung der Struktur von Kollagen oder Gelatine als Trägermedium (wobei berücksichtigt wurde, dass diese beispielsweise einer Sephrose®-Matrix ähnelt mit ihren freien Carbonsäureendgruppen) und durch Binden des Liganden an diese Matrix über eine Peptid-Bindung, die zwischen den-COOH-Endgruppen der Gelatine und den freien Aminogruppen der verschiedenen Liganden erzeugt wird. Diese Peptidbin-dungsbildung tritt leicht bei einem pH-Wert von 4,75 auf bei Verwendung des Kondensationsmittels l-Äthyl-3-(3-dime-thylaminopropyl)carbodiimid-HCl (E.D.C., vertrieben von der Firma Sigma Corp.).

Die Bildung dieser Bindung ist erklärlich, da die verwendete Knochengelatine, wie angenommen wird, in ihrer Aminosäurezusammensetzung dem Rinderknochenkollagen ähnelt. Rinderknochenkollagen weist 44 Asparaginsäuregrup-pen und 77 Glutaminsäuregruppen oder mit anderen Worten 121 COOH-Gruppen pro 1000 Resten auf. Bezogen auf die obige Analyse kann angenommen werden, dass die Gelatine in diesem Experiment 100/1000 freie Carbonsäuregruppen enthält. Daraus ergibt sich, dass 100 mg/1 g Gelatine modifiziert werden sollten, wenn der Modifizierungsligand

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in grossem Überschuss vorliegt. Alle anderen Modifizierungen wurden auf analoge Weise durchgeführt.

Beispiel

Zu einer 200 ml-Portion der Proteinlösung wurde genügend Ligand (1-molar) zugegeben, so dass er im 5-fachen Überschuss gegenüber den möglichen Bindungszentren vorlag. Die Lösung wurde unter Verwendung einer geeigneten Säure (HCl) oder Base (NaOH) auf einen pH-Wert von 4,75 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 5 g festes EDC (die minimale Carbodiimid-Menge, die zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,1 M erforderlich war) zugegeben. Die Lösung wurde dann 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Messungen mit einem Leeds-Northrop-pH-Meter verfolgt. Es trat eine Änderung des pH-Wertes (d.h. auf pH 3) auf, die durch Zugabe von Base kompensiert wurde. Die Probe wurde dann 24 Stunden lang gerührt, um eine vollständige Reaktion aller möglichen Bindungszentren sicherzustellen.

Das Protein wurde dann unter Verwendung von fliessen-dem Wasser 6 Stunden lang und erneut gegen 41 destilliertes Wasser und 2 Stunden lang gegen entionisiertes Wasser, 4 mal wiederholt, dialysiert. Dies wurde durchgeführt, um eine Entfernung des nicht-umgesetzten Liganden und Kondensationsmittels sicherzustellen. Das Material wurde dann filtriert und auf identische Weise behandelt wie das nicht-kovalent modifizierte Material (schalenförmig gefroren und lyophilisiert).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiele

Code-Nr.

Gelatine

Ligand

EDC

Bindung

1.

1%

_

2.

1%

HCl

-

nicht-kovalent

3.

1%

NH4C1

5g kovalent

4.

1%

-

5g intern

5.

1%

Äthylendiamin

5g kovalent1

6.

1%

A1C13

-

kovalent

8.

5% 2

—

kovalent1

9.

5%2

HCl

nicht-kovalent

10.

1%

AICI3+Harnstoff 5 g kovalent

1 die kovalente Natur dieser Bindung muss noch quantitativ bestimmt werden;

2 die Änderung zu 5% (hohe Dichte) war indiziert bei der Beurteilung der 1 %-Schäume, da diese Beispiele extrem hygroskopisch waren und sich beim starken Bluten schnell auflösten.

In dem Bestreben, quantitativ zu bestimmen, welche chemischen Modifikationen des Kollagens tatsächlich auftraten, wurden die folgenden analytischen Verfahren angewendet:

1.) Polyacrylamid-Scheiben-Elektrophorese (P.A.G.E.)

2.) Bindungsuntersuchungen

3.) Circulardichroismus-U ntersuchungen

Bei der P.A.G.E. handelt es sich um eine häufig angewendete Technik zur Sichtbarmachung der Reinheit, der Masse und der Ladung eines Proteins. Proteine wandern durch ein Medium auf der Basis der Verhältnisse Ladung/ Masse (e/m). Da die Wanderung des Proteins auf dieses Verhältnis zurückzuführen ist, ist es möglich, diese Methode zur Bewertung der Kriterien anzuwenden.

Das nach dieser Methode bewertete Kriterium ist üblicherweise die Masse (S.D.S. Denaturierung-Gelelektropho-rese), obgleich mit einigen geringfügigen Modifikationen auch das Bandenmuster eines Proteins zur Unterscheidung zwischen Proteinen mit identischer Masse mit modifizierten Ladungseigenschaften verwendet werden kann. Diese Methode kann auch zum Nachweis der Menge irgendeiner Ladungsänderung durch Modifizierung des Kollagens angewendet werden, ohne dass man auf die schwierigere, teurere durchweg konventionelle isoelektrische Fokussierung zurückgreifen muss.

Bezüglich der Bindungsuntersuchungen ist klar, dass Bindungsuntersuchungen angewendet werden müssen zur Bestimmung des Typs und der Menge der durchgeführten Modifikationen. Die in diesem Verfahren angewendete kovalente Modifizierung erzeugt im Prinzip Pseudolysinreste. Jede Methode, die freie NH2-Gruppen an einem intakten Protein differenzieren kann, kann zur Bestimmung der Menge der Bindung durch Vergleich der Anzahl der NH2-Grup-pen vor und nach der Behandlung angewendet werden. Solche Methoden umfassen den Ninhydrin-Test und/oder den Fluorescamin-Test {Purcell et al.).

Schliesslich bestimmt die Konformation eines Proteins bis zu einem gewissen Grade seine chemischen Eigenschaften. Es ist daher hilfreich, jede Änderung der chemischen Konformation, die durch eine Modifizierung hervorgerufen worden ist, durch Zirculardichroismus-Untersuchungen sowohl vor als auch nach der Behandlung zu überwachen. Schliesslich sollte eine Korrelation zwischen den Konformationsänderungen und den Gerinnungseigenschaften bestimmt werden.

Zur Beurteilung der synthetisierten Materialien wurden akute in vivo-Tierexperimente (Hund) und eine in vitro-TRT (Thrombinrecalcifizierungszeit)-Analyse angewendet. Die Beurteilung der erfindungsgemässen hämostatischen Mittel und ihr Vergleich bestanden aus:

1.) einer subkutanen Implantation der verschiedensten Agentien in ein bestimmtes Tier für eine Zeitspanne innerhalb des Bereiches von 1 Tag, 2 Tage, 7 Tagen und 2 Wochen,

2.) in der Blutungszeit und der halbquantitativen Analyse des Gewichtes des Blutverlustes an zwei getrennten anatomischen Orten (Haut und Milz); aus diesen Tests wurden Informationen bezüglich (1) des relativen Gerinnungsvermögens (Wirkungsgrades) jedes der Agentien, (2) Informationen über die physikalische Strukturintegrität dieser Materialien sowohl vor als auch nach dem Kontakt mit dem Blut,

(3) starke Anzeichen für eine Toxizität und die Histologie,

(4) verschiedene Typen von gebildetem Fibrin bei der Einwirkung von Blut aus verschiedenen Bereichen, was sowohl von den Eigenschaften des Agens als auch von den Eigenschaften des beteiligten Blutes abhängt, (5) über die Handhabungseigenschaften jedes Agens unter Raum-Arbeitsbedingungen und (6) klinische subjektive Meinungen über jedes Agens bezüglich seiner Handhabung, seines Gerinnungs-vermögens und seiner Wechselwirkung mit dem umgebenden Gewebe erhalten.

Es wurden Implantationsuntersuchungen durchgeführt durch Herstellung einer Tasche in dem Brustmuskel (Hund) und Einführen jedes Agens in einzelne Taschen und Zunähen derselben mit Seide. Die Proben wurden vor der Tötung des Versuchstieres herausgeschnitten, in Formalin-Glutaral-dehyd fixiert und für die histologische und mikroskopische Untersuchung markiert. Dabei erhielt man die folgenden Proben:

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50

55

«0

65

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Datum Anzahl der Hunde Reihenfolge

2/1/77 D6:45

2/1/77 D6:53

2/1/77 45:131

2/23/78 C6:18

Bemerkungen

Nr. 5 = feucht und glitschig Nr. 4 = kristallin Nr. 3 = feucht und kristallin Nr. 4 führte zu einem Abszess Nr. 6 = wurde braun wie Blut Nr. 10 = auf der rechten Seite

Nr. 0,1, III, II, 1,2, 3, 5,4 Nr. 6,1, III, II, 1,2, 3, 5,4

Nr. 4,0,1, III, II, 1, 2, 3, 5, 10,9 Nr. 8,11,12,13,14

Erläuterungen:

0

= Kontrolle, kein Agens

I

= Gelfoam

II

= Surgicell

III

Avitene

1

= Gelatineschaum 1%

2

= Gelatineschaum 1% + HCl

3

= Gelatineschaum 1 % + NH4C1

+ EDC

4

= Gelatineschaum 1 %

+ EDC

5

= Gelatineschaum 1 % + EDA

+ EDC

6

= Gelatineschaum 1% + A1C1,

7»

= Gelatineschaum 1 % (2 Wochen-Implantation im Nacken)

8

= Gelatineschaum 5%

9

= Gelatineschaum 5% + HCl

10

= Gelatineschaum 1 % + A1C13 + Harnstoff

+ EDC

11

= Gelatineschaum 5% + 0,001M CaCl2

12

= Gelatineschaum 5% + 0,010M CaCl2

13

= Gelatineschaum 5% + 0,10M CaCl2

14

= Gelatineschaum 5% + 0,25M CaCl2

1 Nr. 7 und Nr. 1 stellen identische Verbindungen dar.

Ausserdem wurden photographische Bewertungen aller Stellen in einem Zeitintervall von 1,2 und 7 Tagen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Implantationsuntersuchungen und Strukturuntersuchungen sind in den folgenden Tabellen 40 I und II zusammengefasst.

Hautschnitt-Heilungszeit Links oder rechts im Rumpf des Hundes wurde ein 3 cm-Einschnitt vorgenommen, der in den Muskel eindrang. 45

Dann wurde das thermostatische Mittel zugegeben und der Einschnitt wurde gerinnen gelassen. Es wurde kein Druck auf eines der Agentien ausgeübt. Die Gerinnungszeit wurde mittels einer Stoppuhr ermittelt.

Bei einer Versuchsreihe wurde in jeden Einschnitt eine 50 vorher gewogene 4 x 4-Bandage oder ein Schwamm eingelegt und das Blut wurde gesammelt und gewogen. Das Gewicht des Blutes wurde erhalten durch Subtrahieren des Gewichtes des sauberen trockenen 4 x 4-Schwammes von dem Gewicht des Blutes, das von der 4 x 4-Bandage oder dem Schwamm 55 aufgesaugt worden war. Die Ergebnisse sind in der weiter unten folgenden Tabelle II angegeben.

Organblutungszeit Um Informationen über das relative hämostatische Ver- 6o mögen jedes der Agentien auf einem nicht-nähbaren Organ, wie z. B. der Milz oder der Leber, zu erhalten, wurden auf der Milz Einschnitte durchgeführt und die Blutungszeiten wurden bestimmt. Das Verfahren war im wesentlichen analog zu dem oben genannten Hauttest. In den seitlichen 6S Aspekt der Milz wurden 3 cm-Einschnitte durchgeführt, die hämostatischen Mittel wurden auf die Verletzung aufgelegt und die Blutungszeit und das Gewicht des Blutes wurden bestimmt. Bei der Beurteilung dieser Daten trat eine gewisse Schwierigkeit auf, da mit verschiedenen Verletzungsgraden (d.h. eingeschnittenen Arterien und dgl.) verschiedene Blutungsraten auftraten. Dies ist erforderlichenfalls bei den Ergebnissen angegeben. Die Milz wurde dann herausgenommen, fixiert und für die histologische Untersuchung markiert.

In vitro-Analyse Es wurde eine in vitro-Analyse durchgeführt, die aus der Standard-TRT (Thrombinrecalcifizierungszeit) bestand, bei der eine normale Kochsalzlösung durch gelöste hämostatische Mittel in der gleichen Konzentration ersetzt wurde.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Reihe von Variationen des erfindungsgemässen hämostatischen Mittels brauchbare Alternativen zu den handelsüblichen thermostatischen Mitteln (Avitene, Surgicell und Gelfoam) sowohl in bezug auf ihre hämostatischen Eigenschaften als auch in bezug auf ihre histologische Beurteilung darstellen. Dabei handelt es sich um H.D.-HC1 (hohe Dichte, mit 5% HCl behandelt), L.D.-HC1 (niedrige Dichte, mit 1 % HCl behandelt) und LDO (niedrige Dichte, 1% Gelatine). Ausserdem wurde von den Experimentatoren und Klinikärzten, die diese vorläufige Untersuchung durchführten, die Reihenfolge der Bevorzugung von hämostatischen Mitteln als H.D.-HC1, L.D.-HC1, Avitene, L.D.O., Surgicell und Gelfoam angegeben. Die oben genannten Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen I und II zusammengefasst.

Tabelle I

Produkt- Modifikation Struk- physikalische Ultra- anatomischer Blutverlust Haftung an Hand- Gewebe- Gerinnsel- Histologische Daten

Code-Nr. tur struktur bei d. Ein- Testort der Wunde habungs- heilung bildung 1 Tag 2 Tage 7 Tage 2 Wochen

Wirkung v. Blut Sp (Milz) eigen- Sk (Haut) ^ schaften

I

Gelfoam

3

Sp-Sk

2

3

2

3

2

II

Surgicell

4

Sp-Sk

2

3

4

2

3

1

2

III

Avitene

1

2

Sp-Sk

3

2

1

2

1

2

1

1% FG

2

1

Sp-Sk

2

1

4

2

4

2

1% FG+HC1

2

3

Sp-Sk

1

2

3

1

2

3

1% FG+NH4C1+EDC

3

2

Sp-Sk

2

3

2

3

1

2

4

1% FG+EDC

2

Sp-Sk

3

2

3

2

3

2

3

5

1% FG+EDA+EDC

2

3

Sp-Sk

2

3

2

6

1% FG+A1C13

3

2

Sp-Sk

3

2

3

1

3

2

3

8

5% FG

3

4

Sp-Sk

1

4

3

4

3

2

3

4

9

5% FG+HC1

3

4

Sp-Sk

1

4

3

2

3

10

1 % FG+A1C13+Harnstoff

+ EDC

3

4

Sk

3

2

4

1

-

3

11

5% Gelatineschaum

+0,001 M CaCl2

4

Sp-Sk

1

4

12

5% Gelatineschaum

+0,01 MCaCl2

4

Sp-Sk

1

4

3

13

5% Gelatineschaum

+0,1 MCaCl2

2

3

Sp-Sk

2

4

3

2

3

2

14

5% Gelatineschaum

+ 0,23 M CaCl2

2

3

Sp-Sk

2

3

2

1

3

1

FG = geschäumte Gelatine; 0 = nichts/nichts; 1 = schlecht/minimal; 2 = gut/mittel; 3 = sehr gut/stark; 4 = ausgezeichnet/maximal.

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Tabelle II

Blutungsdauer und Blutverlust bei Haut- und Milzeinschnitten

% Änderung d. Blutungsdauer gegenüber Kontrolle1

% Änderung d. Gesamtblutverlustes gegenüber Kontrolle (g)1

% Änderung d. Blutungsdauer gegenüber Kontrolle2

% Änderung d. Gesamtblutverlustes gegenüber Kontrolle (g)2

Kontrolle

0

Gelfoam

-24,8

-73,0

-65,9

-70,0

Surgicell

-26,0

-78,8

-78,5

-68,7

Avitene

-21,7

+ 15,3

-79,5

-48,7

Gelatineschaum 1 %

-42,6

-80,3

-87,7

-62,5

Gelatineschaum 1 %+HCl

-61,5

-86,5

-85,7

-67,5

Gelatineschaum 1 %+NH4C1+EDC +01,0

-85,3

-78,2

-68,0

Gelatineschaum 1%+EDC

-03,0

-82,3

-61,9

-64,0

Gelatineschaum 1%+EDA+EDC

-16,6

-78,0

-72,1

-60,7

Gelatineschaum 1%+A1C13

+ 73,0

+93,8

-42,1

-35,5

Gelatineschaum 5%

-39,1

-75,0

-90,4

-65,5

Gelatineschaum 5% +HC1

-56,4

-81,0

-91,1

-69,5

Gelatineschaum 1 % + A1C13+Harnstoff + EDC

+98,7

-56,9

_

Gelatineschaum 5% +0,00 IM CaCl2

-50,0

-88,5

-91,1

-90,7

Gelatineschaum 5%+0,010M CaCl2

-56,2

-94,6

-93,8

-12,5

Gelatineschaum 5% + 0,10M CaCl2

-57,5

-72,3

-93,8

-0,4

Gelatineschaum 5% +0,25M CaCl2

-56,2

-92,1

-94,5

-0,1

— = Abnahme + = Zunahme

1 Haut

2 Milz

Die Fig. 1 bis 3 der beiliegenden Zeichnungen zeigen UV-Absorptionsspektren von verschiedenen erfindungsgemässen Formulierungen. Die Grundverbindung (Grundmischung) allein oder mit zugesetztem CaCl2 absorbiert bei 280 m|i nicht, was anzeigt, dass keine Proteinverunreinigung vorliegt. Die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) führt jedoch zu einem Absorptionsmaximum bei 280 m^. Die Abnahme der Absorption mit zunehmenden Mengenanteilen CaCl2, bezogen auf das Protein, geht aus der Fig. 3 hervor, wahrscheinlich als Folge der Verdünnung des Proteins. Alle Proben wurden hergestellt aus l%igen Lösungen, die dann vor der Messung auf das 10-fache verdünnt wurden. Die in den Fig. 1 bis 3 angegebenen Prozentsätze beziehen sich auf die Konzentrationen vor der Lyophilisierung.

Die Fig. 4 zeigt den pH-Wert von 10 ml 0,1 %igen Super Stat-Lösungen bei Zugabe von 100 jj.1 0,01 n NaOH oder 0,01 n HCl. Die pH-Wertkurve für destilliertes Wasser, das fast keine Pufferkapazität besitzt, ist ebenfalls angegeben. Mit zunehmendem Mengenanteil an CaCl2, bezogen auf das Protein, tritt eine Abnahme der Pufferkapazität auf, wahrscheinlich als Folge der Verdünnung des Proteins. Auch die Zugabe einer Base führt zu einer grösseren Änderung des pH-Wertes als die Zugabe einer Säure. Dieser Unterschied war zu erwarten, da:

1.) der pH-Wert der neuen Verbindung in destilliertem Wasser (pH = 5,5) sauer ist, etwa 5,9, und (2) die negative Gesamtladung an den Gelmolekülen dahingehend wirkt,

dass sie H+ wirksamer neutralisiert als OH".

Die Fig. 5 und 6 zeigen die Infrarotspektren der neuen Verbindungen (Mischungen). Es sind Absorptionsmaxima für N-H und C = O angegeben. Die Erhöhung des Mengenanteils an CaCl2, bezogen auf das Protein, führt zu einer Ab-45 nähme der beiden Absorptions-Maxima, was zu erwarten , war, dadurch wird jedoch die Gestalt der Maxima nicht be-einflusst.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, dass durch die vorliegende Erfindung ein verbessertes hämostati-50 sches Mittel (Hämostatikum) sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung geschaffen werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein verbessertes Verfahren zur Kontrolle bzw. Bekämpfung bzw. Stillung des Blutens zur Verfügung.

Obgleich Lyophilisierungsverfahren bekannt sind, kön-55 nen die nachfolgend angegebenen Stufen, bezogen auf die obigen Angaben, angewendet werden:

1.) 50 ml-Mengen werden in 100 mm-Petrischalen verteilt,

60 2.) in einer Lyophilisiereinrichtung (z. B. einem Virtus-Modell 100 SRC-7) wird bei - 30 bis - 50 °C 3 bis 5 Stunden lang oder bis zum Erreichen des eutektischen Punktes in einem Schrank eingefroren,

3.) der Kondensator wird eine bis zwei Stunden lang auf-65 gesetzt und es wird mit dem Vakuum begonnen ohne Anwendung von Wärme für einen Zeitraum von 3 Stunden,

4.) die Schrankwärme wird auf + 30 °C festgesetzt und 48 Stunden lang beibehalten.

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Die nachfolgend angegebenen Stufen können für die Sterilisierung angewendet werden:

1. Man führt in ein Gassterilisierungsgefäss ein und ver-schliesst es mit einem Indikator darin,

2. es wird eine Gassterilisierung mit Äthylenoxid über ei- 5 nen normalen Cyclus durchgeführt,

3. nach der Einwirkung von Äthylenoxid wird gründlich belüftet.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, dass die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist, sondern dass diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne dass dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

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s

6 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Hämostatisches Mittel, bestehend aus einer Kollagensubstanz oder kollagenartigen Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass deren Oberflächenladung durch entsprechende Modifizierung positiver ist als im Normalzustand.

2. Hämostatisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die positive Oberflächenladung auf einer nicht kovalenten Modifizierung beruht.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Hämostatisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die positive Oberflächenladung auf einer kovalenten Modifizierung beruht.

4. Verfahren zur Herstellung eines hämostatischen Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man der Kollagensubstanz oder kollagenartigen Substanz Zusätze beigibt, die deren Oberflächenladung im positiven Sinne erhöhen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz eine Gelatine verwendet und sie mit Salzsäure behandelt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz eine Gelatine verwendet und sie mit Äthylendiamin behandelt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz eine Gelatine verwendet und sie mit NH4C1 behandelt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz eine Gelatine verwendet und sie mit einer Calcium-Verbin-dung behandelt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gelatine mit Calciumchlorid behandelt.

10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,. dass man die Kollagensubstanz oder kollagenartige Substanz lyophilisiert.