CH633887A5

CH633887A5 - Verfahren und reagens zur bestimmung von substraten oder enzymaktivitaeten.

Info

Publication number: CH633887A5
Application number: CH571277A
Authority: CH
Inventors: Josef Danninger; Ulfert Dr Deneke; Gunter Lang; Gerhard Dr Michal; Peter Dr Roeschlau
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1976-06-09
Filing date: 1977-05-06
Publication date: 1982-12-31
Also published as: DE2625834B2; DK202677A; JPS52150692A; IE45546L; ATA234077A; HU172931B; IE45546B1; PL114343B1; PL109224B1; FR2354561A1; NL169503B; DE2625834A1; SE426601B; CS207453B2; JPS5639198B2; LU77290A1; DK144949B; CS235068B2; FI771356A; ZA772716B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Redox-Reaktion als Messreaktion sowie ein Reagenz zur Durchführung einer enzymatischen Bestimmung.

In der klinischen und pharmazeutischen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie sind Redox-Reaktionen zur Bestimmung von Enzym- bzw. Substrat-Konzentrationen von grossem Interesse. Die Auswertung dieser Reaktionen kann über photometrische Messungen erfolgen. Sind in dem Testsystem neben den interessierenden Redox-Partnern nun noch weitere reduzierende Substanzen vorhanden, so ist mit Störungen zu rechnen. Besonders häufig ist im Probenmaterial Ascorbinsäure anzutreffen. Sie gibt als starkes Reduktionsmittel zu Störungen Anlass, wenn Pharmaka oder physiologische Flüssigkeiten, wie Serum oder Urin, ascorbinhaltige Pflanzensäfte oder sonstige Lebensmittel, die Ascorbinsäure enthalten oder denen sie zugesetzt wurde, zur Untersuchung kommen. So ist z.B. bekannt, dass folgende Reaktionen durch Ascorbinsäure gestört werden:

A Reaktionen, bei denen H2O2 und ein Wasserstoffdonator mit Peroxidase (POD) umgesetzt werden, werden durch die Reaktion

Ascorbinsäure + H2O2 POD^ Dehydroascorbinsäure + H2O gestört.

B Reaktionen, bei denen Tetrazoliumsalze mit Reduktionsmitteln zu Formazanen reduziert werden, werden durch die Reaktion

Ascorbinsäure + Tetrazoliumsalz — Formazan + Dehydroascorbinsäure gestört.

C Reaktionen, bei denen Phenole mit nucleophilen Reagen-tien oxidativ gekuppelt werden, werden dadurch gestört, dass Ascorbinsäure in noch nicht geklärter Weise zu Nebenreaktionen führt, so dass uneinheitliche Kupplungsprodukte entstehen, die in ihrem Absorptionsverhalten in normalem und UV-Licht von den normalerweise gebildeten Kupplungsprodukten abweichen.

Zur Entfernung der Ascorbinsäure aus dem Probenmaterial sind die üblichen Oxidationsmethoden in der Regel ungeeignet. Oxidationsmittel greifen auch Substrate und Enzyme an und zerstören sie. Ihre Reduktionsprodukte, meist zwei- oder dreiwertige Metallionen, hemmen häufig die Enzyme, die zur Indikatorreaktion benutzt werden. Die Zerstörung der Ascorbinsäure mit Sauerstoff erfordert stark alkalisches Milieu, z.B. 25%iges NaOH. Das führt ebenfalls zur Zerstörung von Substraten und Enzymen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Redox-Reaktion als Messreaktion zu schaffen, welches durch Ascorbinsäure nicht mehr gestört wird.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass in Anwesenheit von Ascorbatoxidase gearbeitet wird. Vorzugs-

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3 633 887

weise wird die Ascorbatoxidase dem Reaktionsansatz zuge- dase anderer Herkunft kann geeignet sein.

setzt. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens nach Das Reagens zur Durchführung einer enzymatischen der Erfindung sind durch die Ansprüche 2 bis 7 umschrieben. Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten, enthält ein

Ascorbatoxidase katalysiert die Reaktion: System zur Bestimmung eines Substrats oder Enzyms mit einer

Ascorbinsäure + Vi Oi Ascorbatoxidase. Dehydroascorbin- 5 Redox-Reaktion als Messreaktion und ist dadurch gekenn-

säure + H2O. zeichnet, dass es zusätzlich Ascorbatoxidase enthält. Vorteil-

Nach den Angaben der Literatur über Ascorbinsäure-Oxi- hafte Ausführungsformen des Reagens werden durch die dase war zu erwarten, dass sich dieses Enzym nicht für den Ansprüche 9 bis 19 umschrieben.

erfindungsgemässen Zweck verwenden lässt. Alle bisher Bevorzugte Reagentien dieser Art enthalten, falls Glucose gewonnenen Enzympräparate produzieren nämlich in einer 10 das zu bestimmende Substrat ist, Peroxidase, Glucoseoxidase,

Nebenreaktion H2O2. Gleichzeitig unterliegt die Ascorbatoxi- o-Dianisidin oder Azino-di-3-äthylbenzylthiazolinsulfonat (6)

dase einer sehr raschen Inaktivierung, welche dem gleichzeitig zusammen mit Puffer oder Hexokinase, Glucose-6-phosphatde-

gebildeten H2O2 zugeschrieben wird (Biochemical Copper hydroge'nase, Diaphorase, NADP, ein Tetrazoliumsalz wie

Proceedings Symposium Harriman New York 1965, S. INT: 3-(4-Jodphenyl>2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoli-

305-337). Das gilt auch für höchstgereinigte Präparationen, die 15 umchlorid und Puffer. Bei z.B. Harnsäure aus dem zu bestim-

in der Ultrazentrifuge und bei der Elektrophorese keinerlei menden Substrat besteht das System vorzugsweise aus Peroxi-

Verunreinigungen mehr zeigen (Biochem. 4,1362-1370 [1965]). dase, Uricase, einem Phenol wie z.B. 2,4-Dichlorphenol, Amino-

Die Reaktionsinaktivierung wird auf die H202-Bildung zurück- antipyrin und Puffer. Im Falle der Glutamatbestimmung geführt (Biochem. Biophys. Acta 56,427 bis 439 [1962]). Nach besteht das System bevorzugt aus Glutamatdehydrogenase,

den Berechnungen der letzteren Autoren kann 1 U Ascorbat- 20 Diaphorase, NAD, INT und Puffer. Für z.B. Tyrosin wird Tyro-

oxidase in 1 mMol/I Ascorbinsäurelösung 0,7 10~2 mMol/1 H2O2 sinase, 3-Methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolonhydrazon(2),

produzieren. Solche Ascorbat-Konzentrationen sind in Pro- für z.B. die Brenzcatechinbestimmung Diphenoloxidase, 3-Me-

belösungen häufig vorhanden. Das gebildete H2O2 steht ohne thyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolonhydrazon(2), j eweils zusam-

weiteres für enzymatische Reaktionen zur Verfügung, wie am men mit Puffer, bevorzugt. Alle diese Systeme zur Bestimmung

Beispiel der Katalase nachgewiesen wurde. 25 von Substraten sind aber bekannt. An ihrer Stelle können

In dem System jedoch auch andere bekannte Systeme zur Bestimmung von

Wasserstoffdonator + H2O2 POD^ Farbstoff + 2 H2O Substraten oder Enzymen im Rahmen des erfindungsgemässen zum photometrischen Nachweis von H2O2 bewirkt es bei Reagens verwendet werden.

einem molaren Extinktionskoeffizienten von ca. 20 cm2/p.Mol Von besonderer Bedeutung ist die Erfindung z.B. auch für eine Extinktionsdifferenz von 0,14. Da der Messbereich norma- 30 die Anwendung auf dem Gebiet der Schnelldiagnostika. Derar-

ler photometrischer Reaktionen von ca. 0,01-1,00 reicht, wird tige Schnelldiagnostika enthalten in der Regel die verschiede-

hier ein untragbarer Fehler hervorgerufen. In gleicher Weise nen, für die Durchführung des Verfahrens benötigten Reage-

werden Reaktionen gestört, bei denen anstelle von H2O2 orga- nien z.B. entweder in einem saugfähigen Träger imprägniert nische Hydroperoxide und anstelle von POD Hämoglobin oder oder mit einem geeigneten Bindemittel auf einer Trägerfolie als andere Oxidationskatalysatoren verwendet werden. 35 Überzug aufgebracht. Die bevorzugte Ausführungsform ist

Aber abgesehen von diesem durch das H2O2 hervorgerufe- hierbei der Zusatz der Ascorbatoxidase zum Gemisch der übri-nen Fehler war aus der oben zuletzt angeführten Literaturstelle gen Reagenzien mit nachfolgender Imprägnation auf einem bekannt, dass die Umsetzung der Ascorbinsäure schon lange saugfähigen Träger. Auf diese Weise werden z.B. durch Ascor-

vor ihrer vollständigen Entfernung zum Stillstand kommt. binsäure praktisch nicht gestörte Testpapiere zum Nachweis

Besonders gravierend musste dies bei all solchen Redox- 40 von Glucose im Harn (z.B. gemäss DT-OS 23 38 932), von Blut

Reaktionen sein, bei denen H2O2 entsteht, da dieses H2O2 ja im Harn (z.B. gemäss DT-OS 2 460 903 oder DT-AS 2 235 152)

einerseits die Inaktivierung des Enzyms noch beschleunigen und von Blut im Stuhl erhalten. Dass die Ascorbatoxidase z.B.

musste und andererseits die Neubildung von H2O2 durch die in den Testpapieren für Blut im Harn funktionsfähig und lager-

Ascorbatoxidase selbst zu völlig unübersichtlichen Erscheinun- stabil bleibt, muss als höchst überraschend angesehen werden,

gen führt. Es ist daher höchst überraschend, dass es entgegen 45 Diese Testpapiere enthalten nämlich überschüssige Mengen an den Erwartungen möglich ist, die auf dem Vorhandensein von organischen Hydroperoxiden, von denen ähnlich wie von H2O2

Ascorbat beruhenden Störungen durch den Ascorbatoxidase- eine Inaktivierung der Ascorbatoxidase zu erwarten gewesen zusatz vollständig zu beseitigen, ohne dass andere Störungen wäre.

auftreten, die den Vorteil der Ascorbatbeseitigung wieder Die Ascorbatoxidase kann aber auch auf einem getrennten zunichte machen. 50 Träger aufgebracht werden, der mit dem Träger der übrigen Vorzugsweise wird das erfindungsgemässe Verfahren bei Reagentien vereinigt, beispielsweise darübergelegt, verklebt enzymatischen Reaktionen angewendet, insbesonere solchen, oder gemeinsam eingesiegelt werden kann. Besonders bevor-bei denen H2O2 gebildet wird, also bei Reaktionen, die durch zugt als Träger für die Ascorbatoxidase wird in diesem Falle Oxidasen wie Glucoseoxidase, Uricase, Cholesterinoxidase und ein sogenanntes wasserlösliches Papier (z.B. gemäss DT-OS dergleichen katalysiert werden, ferner bei Reaktionen, bei 55 24 36 598), das die Farbreaktion auf dem Trägerpapier der denen Tetrazoliumsalze reduziert werden und bei Reaktionen, anderen Reagentien besonders gut erkennen lässt. Diese Aus-bei denen Phenole mit nucleophilen Reagentien oxidativ führungsweise ist besonders dann von Vorteil, wenn in der Regekuppelt werden. Die zugesetzte Ascorbatoxidasemenge rieh- agentienkombination z.B. Substanzen vorhanden sind, die mit tet sich z.B. nach der Höhe der zu erwartenden Ascorbinsäure- der Ascorbatoxidase unverträglich sind, beispielsweise stark menge in der Probe. In der Regel werden z.B. 0,002 bis 100 60 saure Reagentien, wie sie bei den Verfahren zur Bestimmung U-Ascorbatoxidase/ml, vorzugsweise 0,01 bis 30 U/ml Testan- von Urobilinogen, Bilirubin und Nitrit verwendet werden.

satz eingesetzt. Der pH-Wert der Reaktion richtet sich z.B. in Bei den obigen Ausführungsformen werden z.B. bis zu 5000 erster Linie nach dem pH-Wert, welcher für das oder die ande- U Ascorbatoxidase pro ml Imprägnierlösung, vorzugsweise bis ren beteiligten Enzyme erforderlich ist. PH-Werte z.B. zwi- 2000 U/ml Imprägnierlösung für die Reagensherstellung eingesehen 4,0 und 8,5 können sich dabei für das Verfahren der Erfin- 65 setzt. Weniger als 1 U/ml können im allgemeinen nicht den dung als geeignet erweisen. Besonders bevorzugt wird im Rah- angestrebten Effekt sicherstellen.

men der Erfindung die Verwendung einer Ascorbatoxidase aus Weiterhin können auch getrennte Zonen des Trägermate-

Zucchini (Cucurbita pepo medullosa). Aber auch Ascorbatoxi- rials mit der Ascorbatoxidase bzw. den anderen Testreagentien

633887

4

imprägniert werden. In diesem Falle wird z.B. zweckmässig der Träger mit der zu untersuchenden Lösung derart in Berührung gebracht, dass die Lösung zuerst mit der ascorbatoxidasehalti-gen Zone in Berührung kommt und von dort aus in die Zone gesaugt wird, welche die übrigen Testreagentien enthält.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform wird die Ascorbatoxidase z.B. nach den bekannten Methoden der Enzymfixierung an unlöslichen Trägern am Trägermaterial gebunden. Geeignete Methoden sind z.B. bekannt aus DT-OS 17 68 512, 22 60 184, DT-AS 21 28 743,24 26 988,22 60 185,26 03 158, 1915 970.

Bevorzugte Methoden für das erfindungsgemässe Verfahren sind die Glucosebestimmung mit Peroxidase und Glucoseoxidase und o-Dianisidin oder 2,2'-Azino-di-3-äthylbenzthiazo-linsulfonat-{6) (ABTS), die Glucosebestimmung nach der Hexo-kinase/Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Methode, der Nachweis von Harnsäure mittels Phenol, Aminoantipyrin, Peroxidase und Uricase, die Bestimmung von Thyrosin oder Brenzca-techin mittels SMBTH (4-Methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazo-lonhydrazon(2) und Thyrosinase bzw. Diphenoloxidase.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Küvette Nr.

1

Beispiel 1

Bestimmung von Glucose mit o-Dianisidin, Peroxidase (POD) und Glucoseoxidase (GOD), gemessen im Photometer, Wellenlänge 432 nm, Messtemperatur: 25 °C.

Küvette Nr.

1

2

3

4

5

Phosphatpuf

2,5

fer pH 7,01 M

o-Dianisidin

0,1

5 mg/ml

POD 180 U/ml

0,05

Glucose-

0,03

Lösung

1 mg/ml

Ascorbinsäure-

• -

0,1

0,01

0,1

0,01

lösung 10 mM

Wasser

0,12

0,02

0,11

-

0,09

Ascorbat-Oxi-

-

0,02

2,75 2,75 2,75 2,75

10

Phosphatpuf- 2,75 fer pH 5,6 0,1 M

ABTS 50 mM 0,05 0,05 0,05

POD 250 U/ml 0,02 0,02 0,02

Glucose- 0,1 0,1 0,1 Lösung 0,1 mg/ml

Ascorbinsäure-- 0,1 0,01 Lösung 1 mM

Wasser 0,12 0,02 0,11

Ascorbat-Oxi- - - -1 dase 500 U/ml

1 Min. bei 25 °C inkubieren, Ei ablesen, starten mit

GOD 70 U/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 30 Min. bei 25 °C inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das AE berechnen

0,05 0,02 0,1

0,1

0,02

0,05 0,02 0,1

0,01

0,09 0,02

'AE

0,505 0,000 0,40 0,502 0,504

dase 500 U/ml

1 Min. bei 25 °C inkubieren, Ei ablesen, dann starten mit GOD 70 U/ml 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 30 Min. bei 25 °C inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das AE berechnen

AE 0,541 0,010 0,316 0,540 0,543

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung (keine Ascorbinsäure). Küvette 2 und 3 zeigen, dass 1 bzw. 0,1 p.Mol Ascorbat den Test praktisch vollständig bzw. zu 41,5% hemmen, Küvette 4 und 5 zeigen die vollständige Entstörung dieser Ascorbat-Konzentrationen durch Zusatz von je 10 U Ascorbat-Oxidase.

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung (kein Ascorbat). Küvette 2 und 3 zeigen, dass 0,1 bzs. 0,01 (xMol 25 Ascorbat den Test vollständig bzw. zu 21% hemmen. Küvette 4 und 5 zeigen die vollständige Entstörung dieser Ascorbat-Konzentrationen durch je 10 U Ascorbat-Oxidase.

30

Beispiel 3

Nachweis von Harnsäure mittels Phenol, Aminoantipyrin, POD und Uricase am Analysenautomaten (Autoanalyzer).

35 Testprinzip

Harnsäure + O2 + H2O Uricase^ Allantoin + H2O2 2 H2O2 + 2,4-Dichlorphenol + 4-Aminoantipyrin POD Chinoi-der Farbstoff + 2 H2O

40 Herstellung der Lösungen

1. Ascorbat-Oxidase-Reagens: In 600 ml bidest. Wasser wird der Inhalt einer Flasche 1 gelöst. Zusatz von 0,3 ml Brij -35. In dunkler Flasche bei ca. 4 °C vier Wochen, bei ca. 25 °C eine Woche haltbar.

45 2. Uricase-Reagens: In 800 ml bidest. Wasser wird der Inhalt einer Flasche 2 gelöst. Zusatz von 2,0 ml Brij -35. In dunkler Flasche bei ca. 4 °C vier Wochen, bei ca. 25 °C eine Woche haltbar.

so Konzentrationen der Lösungen

1.50 mM Phosphatpuffer, pH 5,6, Ascorbat-Oxidase > in den aus Fig. 2 der Zeichnung ersichtlichen Mengen.

2.31 mM Tris/Citronensäure, pH 8,9, Uricase > 0,08 U/ml, POD > 0,015 U/ml, 3,0 mM 2,4-Dichlorphenol, 4,0 mM 4-Amino-55 antipyrin.

Zur Durchführung der Bestimmung wird das Schlauchsystem des Automaten gemäss dem in Fig. 1 der Zeichnung dargestellten Fliessschema zusammengestellt.

Fig. 2 der Zeichnung fasst in graphischer Darstellung die 60 Ergebnisse der Versuche zusammen.

Beispiel 2 65 Beispiel 4

Nachweis von Glucose mit 2,2'-Azino-di-[3-äthyl-benzthia- Nachweis von Glucose mit HK/G6P-DH, NADP, INT und zolinsulfonat(6)] (ABTS), POD und GOD im Photometer, Wel- Diaphorase im Photometer. Messwellenlänge: 492 nm, Inkuba-

lenlänge: 432 nm, Messtemperatur: 25 °C. tionstemperatur: 25 °C.

Küvette Nr.

1

2

3

Phosphatpuffer, pH 7,5,

1,7

0,1 M

NADP/INT je 1 mg/ml

0,1"

0,1

Diaphorase 5 U/ml

0,1

Glucose-Lösung 0,05 mg/ml

0,1

Ascorbat-Lösung 10 mM

-

0,01

Ascorbat-Oxidase 35 U/ml

-

0,03

Wasser

0,04

0,03

-

3 Min. bei 25 °C inkubieren, Ei ablesen, starten mit

HK/G6P-DH-Lösung je 56 U/ml

0,05

15 Min. inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das AE berechnen

AE

0,234

0,307

0,230

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung. Küvette 2 zeigt, dass 0,01 |i.Mol Ascorbat den Test um 34% zu hoch ausfallen lässt, Küvette 3 zeigt, dass 1 U Ascorbat-Oxidase diese Störung völlig beseitigt.

633 887

Beispiel 6

Bestimmung von Tyrosin mit 3-Methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) (SMBTH) und Tyrosinase im Photometer, Messwellenlänge 492 nm, Messtemperatur 25 °C.

Küvette Nr. 1 2 3

Phosphatpuffer, pH 5,2,0,25 M

2,77

SMBTH 0,1 M

0,05

Ascorbinsäure-Lösung 10 mM

-

0,1

Wasser

0,12

0,02

-

Ascorbat-Oxidase 500 U/ml

-

0,02

Tyrosinase 60 U/ml

0,05

1 Min. bei 25 °C inkubieren, Ei ablesen, starten mit

Tyrosin 2 mM

0,05

1 Std. bei 25 °C inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das AE berechnen

AE 1,113 0,728 1,100

Beispiel 5

Bestimmung von Glutamat mittels G1DH, NAD/INT/Dia-phorase im Photometer. Messwellenlänge 492 nm, Temperatur 25 °C.

Küvette Nr. 1

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung, in Küvette 2 erniedrigt 1 p.Mol Ascorat den theoretischen Wert um 35%, in Küvette 3 ist diese Störung durch 10 U Ascorbat-25 Oxidase völlig beseitigt.

Beispiel 7

Bestimmung von Brenzcatechin mit SMBTH und Diphenol-30 Oxidase

Phosphatpuf- 1,30 1,20 1,29 1,18 1,27 fer, pH 5,5,

0,01 mM

Glutamat- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Lösung 0,2 mg/ml

Ascorbat- - 0,1 0,01 0,1 0,01 Lösung 5 mM

Ascorbat-Oxi- - - - 0,02 0,02 dase 100 U/ml

3 Min. bei 25 °C inkubieren, dann in die einzelnen Küvetten pipettieren

0,2 M TRA, 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,6 mit 1,5%

Triton-X-100

NAD-Lösung 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 5 mg/ml

Diaphorase- 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

Lösung

10 U/ml

G1DH1000 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 U/ml

Ei ablesen, Reaktion starten mit

INT-Lösung 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 2 mg/ml

15 Min. bei 25 °C inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das AE errechnen

AE 0,184 1,560 0,380 0,186 0,182

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung. Küvette 2 und 3 zeigen, dass 0,5 bzw. 0,05 |iMol Ascorbat den Test um 700 bzw. um 100% zu hoch ausfallen lassen. Küvette 4 und 5 zeigen die völlige Beseitigung dieser Störung durch 2 U Ascorbat-Oxi-dase.

Küvette Nr.

1

35 Phosphatpuffer, 0,25 M, pH 5,2 2,80 2,70 2,68

SMBTH 0,1 0,05 0,05 0,05

Brenzcatechin 0,5 M 0,10 0,10 0,10

Ascorbat-Lösung 20 mM - 0,1 0,1

Ascorbat-Oxidase 500 U/ml - - 0,02

40 1 Min. bei 25 °C inkubieren, Ei ablesen, starten mit

Diphenol-Oxidase 200 U/ml 0,05 0,05 0,05 17 Min. bei 25 °C inkubieren, E2 ablesen, aus E2-E1 das DE berechnen

AE 0,890 0,485 0,896

45

Küvette 1 entspricht einer ungestörten Messung. In Küvette 2 erniedrigen 2 p,Mol Ascorbat den theoretischen Wert um 47%, diese Störung ist in Küvette 3 durch 10 U Ascor-bat-Oxidase völlig beseitigt.

Beispiel 8

Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn

Filterpapier wird mit einer Lösung folgender Zusammen-55 setzung getränkt und bei 50° getrocknet:

1,2 m Citratpuffer pH 5 50,00 ml

Hy- 0,75 g

Dimethylaminopropyl)-6-chlor-3-aminocarbazol-dihydrochlorid 60 Glucoseoxidase (104 U/mg) 0,25 g

Peroxidase (63 U/mg) 0,05 g

Ascorbatoxidase ( 100 U/mg) 1,00 g

Wasser 100,00 ml

Das Testpapier reagiert mit glucosehaltigen Urinen mit rot-65 orangen bis schwärzlich-roten Farbtönen. Nach einer Reaktionszeit von 2 Min. geben Urine gleichen Glucosegehaltes mit Ascorbinsäuregehalten bis zu 150 mg/dl praktisch gleiche Reaktionsfarben.

633887

6

Mit Testpapieren analoger Zusammensetzung, aber ohne Ascorbatoxidase, sind je nach Glucosegehalt die Reaktionsfarben bei Ascorbinsäurekonzentrationen ab 50 mg/dl abgeschwächt oder völlig unterdrückt.

Beispiel 9

Testpapier zum Nachweis von Blut im Harn ■

Filterpapier wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40° getrocknet.

Lösung 1 35,0 ml 1,2 m Citratpuffer pH 5,25

Äthylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz 0,1 g

Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g

2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid 1,6 g (ca. 70%ig)

Phosphorsäuretrimorpholid 12,7 g

Ascorbatoxidase (100 U/mg) 0,3 g

Methanol 30,0 ml

Wasser ad 100,0 ml

Lösung 2

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin 0,3 g

Phenanthridin 0,2 g

Toluol/Petroläther (30:70) ad 100,0 ml

Testpapier B:

Wasserlösliches Papier aus Carboxymethylcellulose (Flächengewicht 60 g/m2) wird mit einer Lösung von 20% Eisessig in Methanol zwecks Neutralisation getränkt und getrocknet. Danach wird mit einer wässrigen Lösung von Ascorbatoxidase (103 U/ml) besprüht und gleich getrocknet.

Testpapier B wird auf Testpapier A gelegt und beide werden zusammen zwischen einer Polyesterfolie und einem Nylonnetz eingesiegelt. Der zu untersuchende Urin wird auf den so hergestellten Teststreifen aufgetropft.

Die Ergebnisse entsprechen denen von Beispiel 9.

Beispiel 11

'5 Testpapier zum Nachweis von Blut im Stuhl

Mit diesem Testpapier kann die Anwesenheit von 5 Erythrozyten/mm3 im Harn auch in Gegenwart von 30 bis 50 mg Ascorbinsäure/100 ml nachgewiesen werden. Mit einem Testpapier gleicher Zusammensetzung, aber ohne Ascorbatoxidase gelingt dieser Nachweis schon in Gegenwart von 10-20 mg Ascorbinsäure/100 ml nicht mehr.

Beispiel 10

Testpapier A:

Testpapier wie Beispiel 9, ohne Ascorbatoxidase.

Lösung 1 20 1,2 m Citratpuffer, pH 5,25 Ascorbatoxidase 100 U/mg Wasser ad

Lösung 2 25 Guajakharz Toluol ad

10,0 ml 0,3 g 100,0 ml

3,0 g 100,0 ml

Die Lösung wird filtriert und nur das Filtrat zur Imprägnierung verwendet.

30 Man erhält ein Testpapier, welches mit Stuhl bestrichen wird. Wird auf die Rückseite eine 3%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid getröpfelt, so erhält man eine blaue Färbung, wenn der Stuhl ca. 2% Blut enthält. Diese Färbung tritt auch bei ascorbinsäurehaltigen Stühlen (ca. 15 mg/100 g) auf, 35 während sie in diesen Fällen bei einem Testpapier ohne Ascorbatoxidase ausbleibt.

2 Blatt Zeichnungen

Claims

633887

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten unter Anwendung einer Redox-Reaktion als Messreaktion, dadurch gekennzeichnet, dass in Anwesenheit von Ascorbatoxidase gearbeitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 0,002 bis 100 U Ascorbatoxidase/ml Testansatz eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ascorbatoxidase zusammen mit einem H2O2 bildenden Enzym eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ascorbatoxidase zusammen mit einem Tetrazoli-umsalz eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ascorbatoxidase zusammen mit einem Phenol, welches mit nucleophilen Reagenzien oxidativ gekuppelt werden kann, eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es bei pH-Werten zwischen 4,0 und 8,5 durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ascorbatoxidase aus Zucchini (Cucurbita pepo medullosa) verwendet wird.
8. Reagens zur Durchführung einer enzymatischen Bestimmung von Substraten oder Enzymaktivitäten nach Anspruch 1, das ein System zur Bestimmung eines Substrats oder Enzyms mit einer Redox-Reaktion als Messreaktion enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich Ascorbatoxidase enthält.
9. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats für die Glucosebe-stimmung dient und Peroxidase, Glucoseoxidase, o-Dianisidin oder 2-Azino-di-3-äthylbenzthiazolinsulfonat (6) und Puffer enthält.
10. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats zur Harnsäurebestimmung dient und Peroxidase, Uricase, ein Phenol wie

2.4-Dichlorphenol, Aminoantipyrin und Puffer enthält.
11. Reagens nach Anpruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats zur Glucosebe-stimmung dient und Hexokinase, Glucose-6-Phosphatdehydro-genase, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (NADP) Diaphorase, Tetrazoliumsalz und Puffer enthält.
12. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats zur Glutamat-bestimmung dient und Glutamatdehydrogenase, Diaphorase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Tetrazoliumsalz und Puffer enthält.
13. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats zur Tyrosin-bestimmung dient und Tyrosinase, 3-Methyl-6-kaliumsulfonyl-benzthiazolon-hydrazon-(2) und Puffer enthält.
14. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung eines Substrats zur Brenzca-techinbestimmung dient und Diphenoloxidase, 3-Methyl-6-kali-umsulfonyl-benzthiazolon-Hydrazon-(2) und Puffer enthält.
15. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das System zur Bestimmung des Substrates und die Ascorbatoxidase auf einem saugfähigen Trägermaterial, vorzugsweise Papier, imprägniert vorliegen.
16. Reagens nach Anspruch 15, bestehend aus einem mit Glucoseoxidase, Peroxidase, Ascorbatoxidase, 9-( y-Dimethyl-amänopropyl>6-chlor-3-aminocarbazolsa]z und Puffer imprägnierten Trägerpapier.
17. Reagens nach Anspruch 15, bestehend aus mit Äthylen-diamin-tetraessigsäuresalz, Dioctylnatriumsulfosuccinat,

2.5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, Phosphorsäuretrimor-pholid, Ascorbatoxidase, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Phen-

anthridin und Puffer imprägniertem Papier.
18. Reagens nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Ascorbatoxidase auf einem wasserlöslichen blattförmigen Trägermaterial und das System zur Bestimmung des Substrats auf einem wasserunlöslichen blattförmigen, saugfähigen Trägermaterial imprägniert vorliegen und das wasserlösliche und das wasserunlösliche Trägermaterial aufeinandergeschich-tet sind.
19. Reagens nach Anspruch 15, bestehend aus mit Ascorbatoxidase, Guajakharz und Puffer imprägniertem Papier.