BRPI0721630A2 - Plasmídeo de dna tendo expressão e estabilidade aperfeiçoadas - Google Patents

Abstract

PLASMÍDEO DE DNA TENDO EXPRESSÃO E ESTABILIDADE APERFEIÇOADAS. A presente invenção é relacionada a composições e métodos para aumentar a expressão de polipeptídios exógenos, como um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse. Mais particularmente, a presente invenção trata de plasmídeos de DNA com expressão e estabilidade aperfeiçoadas em composições e métodos úteis para vacinas de DNA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: vx PLASMÍDEOS DE DNA TENDO EXPRESSÃO E ESTABILIDADE APERFEIÇOADAS"

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido faz referência ao Pedido Provisório Americano 60/795.324, depositado no dia 27 de abril de 2006. Todos os documentos aqui citados ou referenciados ("documentos aqui citados") e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e encartes de produtos do fabricante para quaisquer produtos aqui mencionados ou em qualquer documento aqui incorporado por referência são por meio deste aqui incorporados por referência e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere de modo geral às vacinas de DNA e aos métodos de uso da mesma. Mais particularmente, a presente invenção se refere aos plasmideos de DNA com expressão e estabilidade melhoradas úteis para as vacinas de DNA.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vacinas de DNA, também referidas como vacinas genéticas, de plasmideo ou de polinucleotideo, representam um método relativamente simples e econômico para explorar a transferência genética para a imunização contra antigenos. A baixa toxicidade associada com as vacinas de DNA favorece o seu desenvolvimento adicional, porém estratégias adicionais para melhorar a potência dessa abordagem são necessárias se ele tiver que ser integrada com sucesso no ambiente clinico (revisto por Shaw & Strong, Front Biosci. Io de janeiro de 2006;11:1189-98). A vacinação de DNA pode superar a maior parte das desvantagens das estratégias de vacinação convencionais e tem potencial para as vacinas do futuro. Entretanto, um produto comercial ainda não alcançou o mercado. Uma explicação possível poderia ser a falha técnica para induzir uma resposta imune eficiente em humanos, porém a segurança também pode ser uma questão fundamental (revisto por Glenting & Wessels, Microb Cell Fact. 6 de setembro de 2005; 4:26).

0 plasmídeo pVR1020 ou 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.846.946; 6.451.769; 6.586.409 e 6.875.748) é um vetor de plasmídeo de DNA utilizado para a inserção de uma seqüência polinucleotídica. 0 plasmídeo pVR1020 é derivado do pVR1012 e contem a seqüência de sinalização tPA humana. Plasmídeos de DNA adicionais são encontrados, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 6.852.705; 6.818.628; 6.586.412; 6.576.243; 6.558.674; 6.464.984; 6.451.770; 6.376.473 e 6.221.362. Entretanto, há desvantagens com os plasmideos à base de pVR1012 para a vacinação de DNA, TAM como a instabilidade do plasmídeo e a heterogeneidade do número de cópias.

Em conformidade, existe uma necessidade por uma vacina de DNA eficaz, especialmente em relação à expressão de um antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio alvo de interesse em uma quantidade suficiente para eliciar uma resposta protetora.

A citação ou identificação de qualquer documento nesse pedido não é uma admissão de que tal documento é disponível como técnica anterior da presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO

A invenção é baseada, em parte, em uma observação experimental de que a inserção de um elemento de transposição entre um promotor do gene de resistência à canamicina e um iniciador de tradução aboliu a resistência à canamicina, conforme esperado, e surpreendentemente permitiu altas taxas de replicação de plasmídeo. Em outras palavras, os rendimentos de plasmídeo da forma modificada (contendo o elemento de transposição) foram três vezes mais altos do que os rendimentos do plasmídeo de origem. Deste modo, foi levantada a hipótese de que a eficiência da expressão do gene de resistência à canamicina ("KanaR") tem um impacto na replicação do plasmideo em bactérias, isto é, a menor resistência à canamicina levou a taxas de replicação de plasmideo aumentadas. Especificamente, a alta taxa de expressão de KanaR pode representar uma forte carga metabólica, o que interfere com a taxa de replicação de plasmideo ótima e/ou a transcrição do gene KanaR interfere com a origem de replicação (ORI).

A presente invenção se refere a um plasmideo de DNA o qual pode compreender um gene de resistência à canamicina ("KanaR") em que o gene de resistência à canamicina compreende um promotor menos eficaz para a expressão de KanaR e/ou um códon de iniciação menos eficiente. Em uma modalidade vantajosa, o promotor KanaR é o promotor PI. 0 plasmideo de DNA resultante gera rendimentos de plasmideo mais altos e estabilidade de plasmideo mais alta presumivelmente devido à expressão de KanaR reduzida. Vantajosamente, o plasmideo de DNA pode ser PLLlO OU PLL14.

A presente invenção também se refere a um plasmideo de DNA o qual pode compreender um gene de resistência à canamicina, em que um elemento de transposição é inserido entre o promotor KanaR e a iniciação da tradução, resultando deste modo em uma expressão de KanaR reduzida. 0 plasmídeo de DNA resultante gera rendimentos de plasmídeo mais altos e maior estabilidade do plasmídeo presumivelmente devido à expressão de KanaR diminuída.

A presente invenção engloba formulações para a

distribuição e expressão de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse, em que a formulação pode compreender qualquer um dos plasmídeos de DNA revelados aqui e um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma modalidade vantajosa, o carreador, veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a conservação do vetor ou proteína. Vantajosamente, o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse pode ser derivado de um vírus ou patógeno aviário, bovino, canino, eqüino, felino ou suíno.

A invenção ainda fornece métodos de estímulo de uma resposta imune em um animal os quais podem compreender uma quantidade eficaz das formulações aqui reveladas para células do animal e expressando o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse nas células. A invenção também fornece métodos de eliciar uma resposta imune em um animal, os quais podem compreender a administração de uma quantidade eficaz das formulações aqui β reveladas para as células do animal e expressando o antigeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse nas células. Vantajosamente, o animal pode ser uma ave, um bovino, um canino, um eqüino, um felino ou um suino.

A invenção também engloba kits para efetuar qualquer um dos métodos descritos acima, os quais podem compreender o plasmideo ou formulações de DNA aqui revelados mais instruções para efetuar os métodos de estimulo ou indução de uma resposta imune em um animal.

É verificado que nesta descoberta e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos tais como "compreende", "compreendido" e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na lei de Patentes Americana; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e semelhantes; e aqueles termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" tem o significado atribuído a eles na lei de patentes Americana, por exemplo, eles permitem elementos não citados explicitamente, porém exclui elemento que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Esses e outras modalidades são reveladas ou são óbvias de e englobadas pela seguinte Descrição Detalhada. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada a seguir, dada a titulo de exemplo, porém não tencionada a limitar a invenção somente às modalidades especificas descritas, pode ser melhor entendida juntamente com os desenhos associados, nos quais:

FIG. 1 demonstra os três promotores potenciais do cassete de expressão KanaR conforme identificado no Exemplo 1: Pl (SEQ ID NO: 1), P2 (SEQ ID NO: 2) e P3 (SEQ ID NO: 3). P2 e P3 se sobrepõem parcialmente; FIG. 2 demonstra um esquema do pVR1012,ilustrando a

direção da transcrição de KanaR e a posição da origem de replicação, ORI;

FIG. 3 ilustra como o cassete KanaR do plasmideo pVR1012 no Exemplo 1 foi clonado no vetor de mutagênese pALTER-1;

FIG. 4 demonstra como um sitio de restrição PacI no Exemplo 1 foi introduzido à jusante da ORF KanaR, produzindo o plasmideo pLL2, um sitio e restrição SwaI foi introduzido à montante, um sitio de restrição RsrII foi introduzido à jusante, produzindo pLL4, e finalmente o códon iniciador de tradução ATG foi modificado para TTG, produzindo pLL6; FIG. 5 demonstra como o cassete KanaR modificado de ppl4 no Exemplo 1 foi clonado no plasmideo pVR1012, produzindo pLL7;

FIG. 6 demonstra como a seqüência terminadora rrnB identificada no Exemplo 1 foi clonada no plasmideo pLL7 por PCR de pSB062 e a subsequente digestão de PacIO RsrII para formar pLL9;

FIG. 7 demonstra a clonagem da seqüência terminadora speA, identificada no Exemplo 1, no plasmideo pLL7 pelo anelamento dos olgonucleotideos sintéticos e a digestão PacI RsrII para formar pLLll;

FIG. 8 demonstra como a seqüência de iniciação de tradução modificada do plasmideo pLL6 foi clonada em pLL9 pela digestão de MscI PacI para formar pLLlO; FIG. 9 ilustra como as seqüências promotoras P2/P3

(SEQ ID Nos: 2-3) com Pl (SEQ ID NO: 1), Pl (SEQ ID NO: 1) e P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3), as quais foram identificadas no Exemplo 1, foram clonadas por URS11-URS12 PCR, URS13- URS12 PCR e URS11-URS14 PCR, respectivamente; FIG. 10 demonstra como a seqüência promotora P2/P3

(SEQ ID NOS: 2-3) com Pl (SEQ ID NO: 1) foi clonada no plasmideo pLL9 para formar pLL14; FIG. 12 demonstra como a seqüência promotora P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) foi clonada no plasmídeo pLL9 para formar pLL15;

FIG. 13 demonstra como a seqüência promotora Pl (SEQ ID NO: 1) foi clonado no plasmídeo pLL7 para formar pLL16;

FIG. 14 demonstra vários derivados pVR1012 gerados com os vários promotores e terminadores adequados identificado no Exemplo 1. Os constructos pLL13, pLL14, pLL15 e pLL16 têm uma eliminação de 192 pares de base entre o promotor CMV e o promotor KanaPl (SEQ ID NO: 1);

FIG. 15 demonstra um esquema dos derivados pVR1012, ilustrando a região com 192 pares de base eliminada nos constructo pLL13 a pLL16 do Exemplo 1;

FIG. 16 demonstra dois gráficos da capacidade das colônias bacterianas em resistir às concentrações crescentes de canamicina, de acordo com o Exemplo 1, a 50 μία e 100 ^iL de diluições de suspensões bacterianas, respectivamente ;

FIG. 17 demonstra gráficos dos rendimentos de plasmídeo obtidos sob condições de crescimento laboratorial. As colônias de bactérias do Exemplo 1 cresceram em meio LB líquido com Kana 100 μg/mL; FIG. 18 demonstra rendimentos de plasmídeo expresso como a proporção do rendimento de plasmídeo pLL14 (linha de base = 100) . O Experimento 1 demonstra de 8 a 15 colônias por constructo, o Experimento 2 demonstra 6 colônias para pVRl012, para pLL14, para pLL16 e o Experimento 3 (25 colônias para pVR1012, pPB662 e pLL14, e 20 para pLL19) ;

FIG. 19 demonstra gráficos dos rendimentos de plasmídeo obtidos sob condições de crescimento laborator iais. As colônias de bactérias cresceram em meio EGLI. Os rendiment os de plasmídeo são expressos como uma proporção em relação ao rendimento de plasmídeo de origem PVR1012 (linha de base = 100);

FIG. 20 demonstra o rendimento de plasmídeo individual (indexado na média do constructo pVR1012) apresentando heterogeneidade do clone. (*: plasmídeo modificado) e demonst ra gráficos dos rendimentos do plasmídeo em três clones EGLI-adaptados de constructos diferentes de acordo com o Exemplo 1. A variabilidade é expressa como um índice, onde o primeiro clone é considerado a referência de 100%. DESCRIÇÃO DETALHADA:

A invenção é baseada em parte em uma observação experimental de que a inserção de um elemento de transposição entre um promotor do gene de resistência à canamicina e a iniciação de tradução aboliu a resistência à canamicina, conforme esperado, e surpreendentemente, permitiu altas taxas de replicação do plasmideo. Em outras palavras, o rendimentos de plasmideo da forma modificada (contendo o elemento de transposição) foram três vezes mais altos do que os rendimentos do plasmideo de origem. Foi deste modo formada a hipótese de replicação do plasmideo na bactéria, isto é, a expressão de resistência à canamicina reduzida levou a taxas de replicação de plasmideo aumentadas. Especificamente, no contexto da limitação de nutriente, a alta taxa de expressão KanaR pode representar uma forte carga metabólica, a qual interfere com a taxa de replicação de plasmideo ótima e/ou a transcrição do gene KanaR interfere com a origem de replicação (ORI).

A invenção engloba qualquer plasmideo de DNA contemplado em que a expressão de KanaR é reduzida, resultando dessa forma em rendimentos de plasmideo aumentados e em uma estabilidade de plasmideo maior em comparação, por exemplo, com o plasmideo pVR1012 ou um derivado seu, sem a expressão de KanaR reduzida. A presente invenção se refere a um plasmideo de DNA o

qual pode compreender KanaR, em que o gene de resistência à canamicina compreende um promotor menos eficaz para a expressão de KanaR e/ou um códon de iniciação menos eficiente. Em uma modalidade vantajosa, o promotor KanaR é o promotor Pl e ο códon de iniciação é ATG. 0 plasmideo de DNA resultante resulta em rendimentos de plasmideo mais elevados e em uma maio estabilidade do plasmideo, presumivelmente devido à expressão de KanaR reduzida.

Vantajosamente, o plasmideo de DNA pode ser pLLlO ou pLL14.

A presente invenção também se refere a um plasmideo de DNA o qual pode compreender um gene de resistência à canamicina, em que um elemento de transposição é inserido entre o promotor KanaR e o inicio da tradução, resultando deste modo em uma expressão de KanaR reduzida. O plasmideo de DNA resulta em rendimentos de plasmideos superiores e em uma estabilidade de plasmideo mais alta presumivelmente devido à expressão reduzida de KanaR.

0 vetor de expressão é um vetor de plasmideo ou um vetor de plasmideo de DNA, particularmente um vetor de expressão in vivo. Em um exemplo especifico não-limitativo, o vetor de plasmideo de DNA contém elementos do plasmideo PVR1020 ou 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al. , Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.846.946; 6.451.769; 6.586.409 e 6.875.748). 0 plasmideo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a seqüência de sinal tPA humana. Em uma modalidade, o sinal tPa compreende do aminoácido M(I) até o aminoácido S(23) no Genbank sob o número de acesso HUMTPA14. em outro exemplo não-limitativo especifico, o plasmideo utilizado como vetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotideo pode conter a seqüência de peptideo de sinal da IGFl eqüina do aminoácido M(24) até o aminoácido A(48) no Genbank sob o número de acesso U28070. Informações adicionais nos plasmideos de DNA as quais podem ser consultadas ou utilizadas na prática são encontradas, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 6.852.705; 6.818.628; 6.58 6.412; 6.57 6.24 3; 6.558.67 4; 6.4 64.984; 6.4 51.7 70; 6.376.473 e 6.221.362.

Em outra modalidade, o plasmideo pode ser qualquer plasmideo com um gene de resistência à canamicina incluindo, porém sem se limitar, aos vetores Clontech Living Colors pAcGFPl, Living Colors pAcGFPl-Cl, Living Colors pAcGFPl-Nl, pAmCyanl-Cl, pAmCyanl-Nl, pAsRed2-Cl, pAsRed2-Nl, pCMV-DsRed-Express, pDsRed2-l, pDsRed2-Cl, pDsRed2-Nl, pDsRed-Express-1, pDsRed-Express-Cl, pDsRed- Express-Nl, pDsRed-Monomer-Cl, pDsRed-Monomer-Nl, pHcRedl- 1, pHcRedl-Cl, pHcRedl-Nl/1, pIRES2-DsRed2, pIRES2-DsRed- Express, Aceptor pLPS-AcGFPl-N, Sensor de Proteassoma, pTimer, pZsGreenl-1, pZsGreenl-Cl, pZsGreenl-Nl,

pZsYellowl-Cl e pZsYellowl-Nl; Vetores da Invitrogen pCR3, pCR3.I-Uni, pCRIOOO e pZErO-2.1 e Stratagene pCMV-3Tag, pBK-CMV Phagemid, ZAP Express, pCMV-Script, pCMV-Tag, PCR- Script pMClneo e vetores pMClneo Poly A. É também feita referência ' às Patentes Americanas Nos. 6.942.975, 6.887.702, 6.849.442, 6.846.970, 6.825.012, 6.806.399, 6.803.230, 6.790.607, 6.696.278, 6.667.150, 6.624.344, 6.620.990, 6.610.909, 6.585.976, 6.573.437, 6.570.067, 6.562.584, 6.528.703, 6.503.748, 6.475.731, 6.410.317, 6.410.314, 6.387.654, 6.376.744, 6.350.934, 6.303.383, 6.297.054, 6.284.541, 6.258.999, 6.255.560, 6.248.937, 6.235.518, 6.174.708, 6.127.171, 6.121.511, 6.117.651, 6.054.635, 6.037.524, 6.018.103, 5.994.625, 5.981.191, 5.981.182, 5.977.439, 5.925.544, 5.910.488, 5.866.404, 5.851.808, 5.851.804, 5.830.727, 5.824.877, 5.792.935, 5.783.394, 5.750.871, 5.733.753, 5.733.744, 5.731.179, 5.723.746, 5.716.803, 5.712.112, 5.705.361, 5.654.180, 5.599.670, 5.591.577, 5.589.623, 5.569.834, 5.567.599, 5.565.347, 5.504.005, 5.463.174, 5.460.952, 5.436.138, 5.416.250, 5.416.011, 5.378.618, 5.256.568, 5.169.755, 5.137.829, 5.053.335, 5.004.863, 4.935.340, 4.920.054, 4.795.855, 4.782.022, 4.771.002, 4.626.510 e 4.567.146.

A presente invenção também engloba plasmideos com outros genes de resistência a antibiótico além da resistência à canamicina, tais como, porém sem se limitar, ao da resistência à ampicilina, cloranfenicol, neomicina e tetraciclina.

Em uma modalidade, o plasmideo pode ser qualquer plasmideo com um gene de resistência à ampicilina incluindo, porém sem se limitar, aos vetores Clontech Living Colors pAcGFPl, pAmCyan, pAsRed2, pbetagal-básico, pbetagal-controle, pBI Tet, pBI-G Tet, pBI-L Tet, pCMVbeta, pCMV-Myc & pCMV-HA, pDsRed2, pDsRed-Express, vetor pDsRed- monômero, pGFP, pGFPuv , pHcRedl, pIRES, pIRESbleo3, pIRESneo3, pIRESpuro3, aceptor pLP-IRESneo, aceptor pLP- LNCX, aceptor pLP-TRE2, pPUR, pRevTet-Off, pRevTet-Off-IN, pRevTet-On, pSEAP2-básico, pSEAP2-controle, pTet-Off, pTet- On, pTet-tTS, pTimer, pTimer-1, pTK-Hyg, pTRE2, pTRE2hyg, pTRE2hyg2-6xHN, pTRE2hyg2-HA, pTRE2hyg2-Myc, pTRE2pur, pTRE2pur-6xHN, pTRE2pur-HA, pTRE2pur-Myc, pTRE-6xHN, pTRE- HA, pTRE-Myc, pTRE-Tight, pTRE-Tight-DsRed2, pZsGreen e pZsYellow; Vetores da Invitrogen p2Bac, p2Bac/CAT/CAT, pAc5.1/V5-His, pAc5.1/V5-His/LacZ, pBAD-TOPO, pBlueBac, pBlueBac/His, pBlueBac/His/CAT, pBlueBac2, pBlueBac3, pBlueBac4, pBlueBac4/CAT, pcDNAl/Amp, pcDNA3/CAT, pcDNAII, pCMVSport1, pCMVSport2, pCMVSport2.2, pCMVSport4, pCR3, pCR3.I-Uni, pCRBac, pCRT7/CT-LacZ, pCRT7/CT-TOPO, pCRT7/NT- E3, pCRT7/NT-TOPO, pDW232, pFastBacl, pMEP4, pMT/LacZ, pMT/V5-His-T0P0, pPIC3, pPIC3K, pRBK, pSL301, pSPORTl-CAT, ρYesTrp2-RalGDS e ρYesTrp2-RaIGDS e Stratagene PCR-Script, fagemideo pBC, pMClneo e pMClneo Poli A, pBlueScript II fagemídeo e SuperCos I. É também feita referência às

patentes Nos. 6.987.006 r 6.972.322, 6 . 916 . 611, 6. 887. 702 6. 803. 230, 6. 790.607, 6 .706. 524, 6. 696. 278, 6. 667 . 150 6. 569. 678, 6. 562.584, 6 . 544 . 782, 6. 521. 449, 6. 503. 748 6. 486. 134, 6. 410.317, 6 .410. 314, 6. 387 . 654, 6. 376. 192 6. 291. 238, 6. 255.071, 6 .221. 630, 6. 140. 087, 6. 127. 171 6. 025. 193, 6. 025.192, 6 . 010. 875, 5. 981. 279, 5. 981. 182 5. 955. 363, 5. 925.544, 5 . 919. 676, 5. 912. 153, 5. 894 . 060 5. 877 . 400, 5. 866.404, 5 . 851. 808, 5. 834 . 191, 5. 830. 727 5. 830. 690, 5. 786.162, 5 . 776. 773, 5. 773 . 697, 5. 766. 940 5. 733. 753, 5. 731.193, 5 .716. 803, 5. 705. 361, 5. 691. 155 5. 602 . 300, 5. 527.691, 5 . 504. 005, 5. 470. 729, 5. 436. 138 5. 434 . 065, 5. 432.082, 5 . 378 . 618, 5. 290. 691, 5. 264 . 354 5. 256. 568, 5. 256.546, 5 . 160. 489, 5. 151. 364, 5. 147 . 789 5. 143. 836, 5. 126.252, 5 . 093. 251, 5. 081. 022, 4 . 997 . 767 4 . 988 . 622, 4 . 935.364, 4 . 920. 054, 4 . 889. 806, 4 . 879. 230 4 . 876. 202, 4 . 845.031, 4 .808. 519, 4 . 766. 072, 4 . 752. 574 4 . 703. 012, 4.634.678, 48 7 . 835, 4 . 349 . 629 e 4.340 . 674 .

Em outra modalidade, o plasmideo pode ser qualquer plasmideo com um gene de resistência ao cloranfenicol incluindo, porém sem se limitar, aos vetores da Clontech Repórter Doador pDNR-LacZ, Repórter Doador pDNR-SEAP, Aceptor pLP-AcGFPl-C, Aceptor pLP-BacPAK9, Aceptor pLP- BacPAK9-6xHN, Aeeptor pLP-CMV-HA, Aeeptor pLP-CMV-Myc, Aeeptor pLP-CMVneo, Aeeptor pLP-GADT7 AD, DNA-Aeeptor pLP- GBKT7, Aeeptor pLP-IRESneo, Aeeptor pLP-LNCX, Aeeptor pLP- PROTet-6xHN, Aeeptor pLP-RevTRE, Aeeptor pLPS-AeGFPl-N e Aeeptor pLP-TRE2; Vetores da Invitrogen pLysS e pSPORTl-CAT e Fagemideo pBC e vetores PCR-Seript da Stratagene. É

também feita referência às Patentes Nos. 6. 916. 611 6. 900. 010, 6. 887 . 702, 6. 884 . 576, 6. 846 . 671, 6. 803. 230 6. 696. 278, 6. 673. 537, 6. 667. 150, 6. 562 . 584, 6. 548 . 246 6. 503. 748, 6. 436. 694, 6. 420. 110, 6. 410 . 317, 6. 410. 314 6. 391. 640, 6. 387. 654, 6. 376. 192, 6. 331 .527, 6. 309. 883 6. 309. 830, 6. 291. 211, 6. 255. 071, 6. 252 . 140, 6. 221. 630 6. 146 . 871, 6. 127 . 171, 6. 107. 093, 6. 083 .750, 6. 031. 151 6. 025. 192, 6. 001. 564, 5. 994 . 132, 5. 994 . 066, 5. 981. 182 5. 955. 363, 5. 932 . 479, 5. 928 . 891, 5. 925 .544, 5. 925. 523 5. 908 . 747, 5. 866. 404, 5. 851. 808, 5. 821 . 093, 5. 766. 940 5. 733. 753, 5. 728 . 571, 5. 716. 803, 5. 707 .830, 5. 639. 644 5. 591. 577, 5. 470. 729, 5. 437 . 988, 5. 434 .065, 5. 256. 568 5. 256. 546, 5. 053. 335, 5. 004 . 863, 4 . 868 .111, 4 . 839. 284 4 . 752. 574 e 4 . 711. 849.

Em outra modalidade, o plasmideo pode ser qualquer plasmideo com um gene de resistência à neomicina incluindo, porém sem se limitar, aos vetores da Clontech Vetor pRevTet-Off, Vetor pRevTet-Off-IN, Vetor pIRES, Vetor pIRESbleo3, Vetor pIREShyg3, Vetor pIRESneo3, Vetor pIRESpuro3, Vetor Aceptor pLP-IRESneo, Vetor pTet-Off, Vetor pTet-On, Vetor pIRES2-DsRed-Express, Vetor Retroviral pLXIN, Vetor pIRES2-DsRed2, Vetor Sensor de Proteassoma, Vetor Retroviral pLXSN, Vetor pCMV-DsRed-Express, Vetor Living Colors pAcGFPl-Cl, Vetor pAmCyanl-Cl, Vetor pAsRed2- Cl, Vetor pDsRed2-Cl, .Vetor pDsRed-Express-Cl, Vetor pDsRed-Monômero-Cl, Vetor pHcRedl-Cl, Vetor pZsGreenl-Cl, Vetor pZsYellowl-Cl, Vetor Living Colors pAcGFPl, Vetor pDsRed2-l, Vetor pDsRed-Express-1, Vetor pHcRedl-1, Vetor pTimer, Vetor pZsGreenl-1, Vetor Retroviral pQCXIX, Grupo de Vetores Retrovirais LRCX, Vetor Retroviral pLNCX2, Vetor Aceptor pLP-LNCX, Vetor Retroviral pQCXIN, Vetor Living Colors pAcGFPl-Nl, Vetor pAmCyanl-Nl, Vetor pAsRed2-Nl, Vetor pDsRed2-Nl, Vetor pDsRed-Express-Nl, Vetor pDsRed- Monomer-Nl, Vetor pHcRedl-Nl/1, Vetor Aceptor pLPS-AcGFPl- N, Vetor pZsGreenl-Nl, Vetor pZsYellowl-Nl e Grupo de Vetores de Domínio Mínimo VP16; Vetores Invitrogen pcDNAl/Neo, pcDNA3/CAT (substituído com pcDNA3.1/CAT), pCR3 (substituído com pCR3.1), pCR3.I-Uni e pRc/CMV e Vetores pCMV-3Tag, Vetor pCMV-Script, Vetor SuperCos If Vetor ZAP Express, Vetores pCMV-Tag, Vetores pMClneo e pMClneo Poly A da Stratagene, Kits de clonagem PCR-Script, Vetores de Expressão de Mamífero Vitality hrGFP, Vetor de Fagemídeo pBK-CMV e Vetor Lambda ZAP-CMV. É também feita referência

às Patentes Americanas Nos. 7 . 026. 525, 6. 942. 995 6. 905 . 818, 6. 815.185, 6. 806.399, 6 . 787 . 687, 6. 747 . 189 6. 673 . 602, 6. 673.537, 6. 667.150, 6 . 624 . 344, 6. 620. 990 6. 440 .444, 6. 429.357, 6. 391.633, 6 . 376 .192, 6. 316. 253 6. 294 . 187, 6. 291.211, 6. 255.560, 6 .252 . 140, 6. 248. 937 6. 232 . 526, 6. 221.630, 6. 210.930, 6 .207 . 879, 6. 194 . 636 6. 114 . 146, 6. 096.717, 6. 071.512, 5 . 998 .144, 5. 985. 560 5. 969 .211, 5. 955.363, 5. 955.319, 5 . 939 .288, 5. 902. 577 5. 894 .060, 5. 891.634, 5. 830.698, 5 .807 .742, 5. 750. 871 5. 733 .779, 5. 665.565, 5. 639.663, 5 . 614 . 381, 5. 583. 278 5. 470 . 726, 5. 463.174, 5. 416.011, 5 .352 . 605, 5. 278. 056 5. 256 . 568, 5. 149.636, 5. 017.478, 4 . 957 .865, 4 . 935. 340 4 . 839 .284, 4 . 792.520, 4 . 766.066, 4 .752 . 574, 4 . 740. 463 4 . 663 . 285, 4 . 536.475, 4 . 513.086, 4 . 513 . 085, 4 . 503. 155 4 . 468 .462, 4.460.688, 4 .430.434 e 4. 416.994.

Em outra modalidade, o plasmídeo pode ser qualquer plasmídeo com um gene de resistência à tetraciclina incluindo, põem sem se limitar, aos vetores da Clontech Vetor pRevTet-Off, Vetor pRevTet-On, Vetor pRevTet-Off-IN, Sistema de Expressão Bacteriano Creator-Compativel, PROTet 6xHN, Sistema de Expressão Bacteriano PROTet 6xHN, Vetor pTRE-Tight, Vetor pTet-Off, Vetor pTet-On, Sistema de Expressão de Gene Tet-Off, Sistema de Expressão de Gene Tet-On, Sistema de Expressão Adeno-X Tet-Off 1, Sistema de Expressão Adeno-X Tet-On 1, DNA viral Adeno-X (PI-Sce I/I- Ceu I digerido), Sistema de Expressão de Gene Retroviral Creator-Compatible RevTet-Off, Sistema de Expressão de Gene Retroviral Creator-Compatible RevTet-On, Vetor Aceptor pLP- RevTRE, Vetor pRevTRE, Sistema RevTet-Off, Sistema RevTet- On, Vetor pBI Tet, Vetor pBI-G Tet, Vetor pBI-L Tet, Vetor pTet-tTS, Vetor Aceptor pLP-TRE2, Vetor pTRE2, Vetor pTRE2hyg, Vetor pTRE2pur, FBS aprovado pelo sistema Tet, US-Sourced (Gama irradiado), Vetor pTRE-Tight-DsRed2 e Grupo de Vetores de Domínio Mínimo VP16 e vetores da Invitrogen pTet-tTak e pTet-Splice. É também feita referência às Patentes Americanas de Nos. 6.924.101, 6.905.836, 6.777.229, 6.759.236, 6.699.702, 6.699.692, 6.696.278, 6.680.301,6.673.537,6.667.150, 6.642.052,

6.620.618, 6.613.528, 6.544.782,

6.541.003,6.503.748,6.482.636, 6.440.741, 6.436.694, 6.410.317, 6.392.121, 6.376.192,6.309.883,6.303.383,

6.265.562, 6.261.807, 6.221.630, 6.218.181,

6.136.536,6.127.171,6.080.575, 6.033.856, 6.022.731, 6.010.875, 5.958.680, 5.955.363,5.891.718,5.869.035, 5.866.410, 5.858.762, 5.851.796, 5.849.576,

5.840.521,5.830.727,5.830.690, 5.786.162, 5.766.940, 5.637.503, 5.593.860, 5.585.254,5.527.691,5.516.669, 5.508.176, 5.384.259, 5.378.618, 5.348.886,

5.290.691,5.256.568,5.256.546, 5.166.070, 5.158.891, 5.151.364, 5.147.789, 5.053.335,4.983.522,4.879.230, 4.876.202, 4.874.703, 4.778.761, 4.752.574,

4.703.012,4.680.260,4.663.285, 4.634.677, 4.631.259, 4.581.335, 4.374.200 e 4.349.629.

O termo plasmídeo engloba qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob esse aspecto, é verificado que um plasmideo circular superenovelado ou não-superenovelado, assim como uma forma linear, são tencionados a estarem dentro do escopo da invenção.

Cada plasmideo compreende ou contém ou consiste essencialmente em, além do polinucleotideo codificando um antigeno, epitopo ou imunógeno, opcionalmente fundido com uma seqüência de peptideo heteróloga, variante, análogo ou fragmento, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor. Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte funcional em células eucarióticas. 0 promotor forte preferido é o promotor de citomegalovírus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou de murino, ou opcionalmente com outra oigem, tal como de rato ou de porquinho-da-india. 0 promotor CMV-IE pode compreender a parte efetivamente promotora, a qual pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Também pode ser feita referência ao EP-A- 260 148, EP-A-323 597, Patentes Americanas Nos. 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, assim como ao Pedido PCT No W087/03905. 0 promotor CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) ou um CMV-IE de murino.

Em termos mais gerais o promotor tem origem ou viral ou celular. Um promotor viral forte diferente do CMV-IE que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor inicial/tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do virus de sarcoma de Rous. Um promotor forte celular que pode ser empregado de modo útil na prática da invenção é um promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor de desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), ou o promotor da actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277).

Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é,porções desses fragmentos que mantêm uma atividade promotora adequada, estão incluídos na presente invenção, por exemplo, promotores de CMV-IE de acordo com o Pedido PCT No. W098/00166 ou a Patente Americana No. 6.156.567 podem ser usados na prática da invenção. Um promotor na prática da invenção consequentemente inclui derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantém uma atividade promotora adequada e deste modo funciona como um promotor, preferivelmente promovendo a atividade substancialmente similar Àquela do promotor efetivo ou de comprimento total do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhantemente com a atividade dos promotores CMV-IE da Patente Americana No. 6.156.567 em relação à atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente de ou consistir da porção promotora do promotor de comprimento total e/ou da porção intensificadora do promotor de comprimento total, assim como derivados e subfragmentos.

Preferivelmente, os plasmideos compreendem ou consistem essencialmente de outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar seqüências estabilizantes, por exemplo, seqüência(s) de íntron(s), preferivelmente o primeiro intron de hCMV-IE (Pedido PCT No. W089/01036) , o intron II do gene da β- globina de coelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344) .

Também para o sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmideos e vetores virais diferentes de poxvirus, o uso pode ser mais feito do sinal poli (A) do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver a Patente Americana No. 5.122.458), ou o sinal poli (A) do gene da β-globina de coelho ou o sinal poli (A) do virus SV40.

A invenção fornece a expressão de qualquer peptideo ou polipeptidio alvo, vantajosamente um antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse pelos plasmideos de DNA da presente invenção. A invenção contempla a expressão de qualquer antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse nos plasmideos de DNA aqui revelados. Os plasmideos de DNA podem expressar um ou mais antigenos, epitopos ou imunógenos de interesse.

Em uma modalidade vantajosa, o antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio é derivado de um virus ou patógeno de ave, de um animal bovino, canino, eqüino, felino ou suino. Em outra modalidade, o antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio pode ser derivado do virus do Oeste do Nilo. Em outra modalidade, o antigeno, epitopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptidio pode ser derivado de um vírus ou patógeno humano.

Antigenos, epítopos ou imunógenos de ave de acordo com a invenção podem ser derivados do vírus da doença de Marek (MDV) (por exemplo, sorotipos 1 e 2, pref erivelmente 1), vírus da doença de Newcastle (NDV) , vírus da doença de Gumboro ou vírus da doença da cavidade infecciosa (IBDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da anemia infecciosa ou vírus da anemia de galinha (CAV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da

encefalomielite ou vírus da encefalomielite aviária (AEV ou vírus da leucose aviária ALV), vírus da enterite hemorrágica de pru (HEV), vírus da pneumovirose (TRTV), vírus da praga de galinha (influenza aviária), vírus da hidropericardite de galinha, reovírus aviário, Escherichia coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida e suas misturas. Preferivelmente, para MDV, o imunógeno é vantajosamente Gb e/ou gD, por exemplo, Gb e gD, para NDV o imunógeno é vantajosamente HN e/ou F, por exemplo, HN e F; para IBDV o imunógeno vantajosamente é VP2; para IBV o imunógeno é vantajosamente S (mais vantajosamente SI), e/ou M e/ou N, por exemplo, S (ou SI) e M e/ou N; para CAV o imunógeno é vantajosamente VPl e/ou Antigenos, epítopos ou imunógenos bovinos de acordo com a invenção podem ser derivados do virus BHV-I, BRV, bPI-3 e/ ou BCV ou um patógeno bovino selecionado do grupo incluindo, porém sem se limitar, ao virus sincicial respiratório bovino e o virus da diarréia viral bovino. Imunógenos BRSV podem ser BRSV F ou G ou N, tal como BRSV F e/ou G ou N e/ou G. Imunógenos BHV-I podem ser Gb e/ou gC e/ou gD. Imunógenos BVDV podem ser EO a proteína (gp48) e/ou a proteína E2 (gp53) . 0 BVDV pode ser do tipo 1 e/ou 0 do tipo 2. Os imunógenos bPI-3 podem ser bPI-3 F e/ou HN.Ver também as patentes americanas Nos. 6.451.770, 6.376.473, 6.224.878, em relação aos imunógenos dos patógenos bovinos e moléculas de ácido nucléico codificando isso e constructos que expressam o mesmo. Antigenos, epítopos ou imunógenos caninos de acordo

com a invenção podem ser derivados do vírus da doença do sarampo, vírus da indisposição canina (CDV), vírus do parainfluenza canino tipo 2 (CPI-2), herpesvírus canino tipo 1 (CHV-I), vírus da raiva (rabdovírus), parvovírus 0 canino (CPV), coronavírus canino (CCV), adenovírus canino, Borrelia burgdorferi, Leptospira e suas misturas. Preferivelmente, para CDV, o imunógeno é vantajosamente F e/ou HA (ver também as Patentes Americanas Nos. 6.309.647, 5.756.102, em relação ao imunógenos e constructos de CDV); para o CPV, o imunógeno é vantajosamente VP2; para CCV, o imunógeno é vantajosamente S e/ou M; para CHV-I, o imunógeno é vantajosamente Gb e/ou gC e/ou gD (ver também a Patente Americana No. 5.688.920, 5.529.780, em relação aos constructos e imunógenos CHV); para o virus da raiva, o imunógeno é vantajosamente G (ver também a Patente Americana No. 5.843.456, em relação às combinações de combinação de raivas); para Borrelia burgdorferi, o imunógeno é vantajosamente OspA (ver também a Patente Americana No. 6.368.603, em relação às composições de combinação de OspA).

Antigenos, epitopos ou imunógenos de eqüinos de acordo com a invenção podem ser derivados de um virus EHV-I e/ou EHV-4 ou outro patógeno eqüino selecionado do grupo incluindo, porém sem se limitar, ao virus da influenza eqüino (EIV), virus da encefalomielite oriental (EEV), virus da encefalomielite ocidental (WEV), virus da encefalomielite venezuelano (VEV), agente da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, Clostridium tetani, virus equine arteritis (EAV) e virus da raiva. Antigenos, epitopos ou imunógenos podem ser as glicoproteinas EHV tais como gB, gD, gB+gD, gC e gE, para EIV o imunógeno é vantajosamente HA, NP e/ou N; para o vírus da encefalite, o imunógeno é vantajosamente C e/ou El e/ou E2; e para Clostridium tetani o imunógeno é toda ou parte da subunidade C da toxina tetânica.

É feita referência às Patentes Americanas Nos. 6.395.283, 6.248.333, 5.338.683, 6.183.750 para os imunógenos de patógenos eqüinos e moléculas de ácido nucleico que os codificam e constructos que os expressam.

Antigenos, epitopos ou imunógenos felinos de acordo com a invenção podem ser derivados do herpesvirus felino tipo 1 (FHV-I), calicivirus felino (FCV), virus da raiva (rabdovirus), parvovirus felino (FPV), virus da peritonite infecciosa felina (FIPV), virus da leucemia felina (FeLV), virus da imunodeficiência felina (FIV), Chlamydia e suas misturas. Preferivelmente, para FeLV o imunógeno é vantajosamente env e/ou gag e/ou pol, por exemplo, gag/pol; para FPV, o imunógeno é vantajosamente VP2; para FIPV o imunógeno é vantajosamente S e/ou M e/ou N, por exemplo, S e M e/ou N (ver também as Patentes Americanas Nos. 6.348.196 e 5.858.373 e os seus imunógenos e constructos); para FHV, o imunógeno é vantajosamente gB e/ou gC e/ou gD, por exemplo, gB e gC e/ou gD (ver também as Patentes Americanas Nos. 5.338.683, 6.183.750; para os imunógenos de herpesvirus e os constructos expressando o mesmo); para FCV, o imunógeno é vantajosamente C; para FIV, o imunógeno é vantajosamente env e/ou gag e/ou pro, por exemplo, gag/p ro, env ou eny e gag/pro (ver também os imunógenos e constructos discutidos em Tartaglia et al., Pedido Americano No. De Série 08/746.668, depositado no dia 14 de novembro de 1996); para o virus da raiva, o imunógeno é vantajosamente G.

Antigenos, epitopos ou imunógenos suinos de acordo com a invenção podem ser derivados o virus PRRS e/ou um patógeno suino pode ser selecionado do grupo incluindo, porém sem se limitar, ao virus da pseudorraiva, virus influenza suino, parvovirus suino, virus da gastroenterite transmissível (coronavírus), circovírus suíno, tal como o circovírus suíno tipo 2, rotavírus, adenovírus suíno tipo 3, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Clostridium spp., Salmonella spp., Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Myeoplasma hyopneumoníae e Aetinobaeillus pleuropneumoniae. Antígenos,epítopo ou imunógenos de patógenos suínos podem incluir vírus da pseudorraiva gB, vírus da pseudorraiva gC, vírus da pseudorraiva gD, influenza suína HA, influenza suína NA, influenza suína NP, ORF4 de suíno reprodutora e vírus da síndrome respiratória, ORF7 de suíno reprodutora e vírus da síndrome respiratória, ORF5 das estruturas de leitura abertas PRRSV, PRRSV 0RF3, PRRSV 0RF6, PRRSV 5 (0RF5) e 6 (ORF6) , virus do cólera Hog El, vírus do cólera Hog E2, parvovírus VP2, ORFl do circovírus suíno tipo 2 ou 0RF2 do circovírus suíno tipo 2. É feita referência às Patentes Americanas Nos. 6.517.843, 6.497.883, 6.391.314, 6.379.676, 6.217.883, 6.207.165 e à publicação de patente americana No. 2003003112 e WO99/53047, W099/08706, WOOl/83737, e WOOO/47756 para imunógenos de patógenos suínos, moléculas de ácido nucleico os codificando e constructos expressando os mesmos.

Os plasmídios de DNA da presente invenção podem expressar um ou mais dentre os polinucleotídeos do Vírus do Oeste do Nilo ("WNV") codificando E, prM, M ou combinações de suas poliproteínas (por exemplo, E, ou E e prM, ou E e M, ou E e prM e M, ou poliproteína E-prM-M, ou poliproteína prM-E ou poliproteína M-E, ou pelo menos um epítopo seu. De acordo com uma modalidade da invenção, o outro vetor ou vetores na preparação compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polinucleotídeo que codifica, e sob circunstâncias apropriadas o vetor expressa uma ou mais outras proteínas do vírus WN, por exemplo, prM, M, prM-M, ou um epítopo seu.

Conforme aqui utilizado, o termo "antígeno" ou "imunógeno" significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. 0 antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; uma peça ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune na apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídio, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação desses. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

0 0 termo "proteína ou peptídeo imunogênico", conforme

aqui utilizado, também se refere e inclui peptídeos e polipeptídios que são imunologicamente ativos no sentido de que uma vez administrados ao hospedeiro, é capaz de suscitar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular direcionada contra a proteína. Preferivelmente, o fragmento de proteína é tal que ele tem substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total. Deste modo, um fragmento de proteína de acordo com a invenção compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos um O epítopo ou determinante antigênico. O termo epítopo se refere a um sítio proteico capaz de induzir uma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou do tipo celular (células T). O termo "proteína ou peptideo imunogênico" ainda contempla eliminações, adições e substituições à seqüência, contanto que as funções polipeptidicas produzam uma resposta imunológica conforme aqui definido. Sob esse aspecto, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativa na natureza, isto é, aquelas substituições que ocorrem em uma família de aminoácidos. Por exemplo, aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácida - aspartato e glutamato; (2) básica - lisina, arginina, histidina; (3) não-polar - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar descarregado - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. FEnilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificadas como aminoácidos aromáticos. É razoavelmente previsível que uma substituição isolada de leucina com isleucina ou valina, ou vice-versa; um aspartato com um glutamato o vice-versa; uma treonina com uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativa semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito grande na atividade biológica. Proteínas com substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos como a molécula de referência porém possuindo substituições de aminoácidos menores que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, deste modo, dentro da definição de polipeptidio de referência.

0 termo "epítopo" se refere ao sítio ou a um antígeno ou hapteno ao qual as células B específicas e/ou células T respondem. O termo também é utilizado intercambiavelmente com "determinante antigênico" o "sítio determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificado em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo de bloquear a ligação do outro anticorpo a um antígeno alvo.

Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo a uma composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, porém não está limitada, a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos, células B, células T helper e/ou células T citotóxicas, direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro irá exibir uma resposta imunológica ou terapêutica ou protetora de modo que a resistência a novas infecções será intensificada e/ou a severidade clínica da doença reduzida. Tal proteção será demonstrada o pela redução da falta de sintomas normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um titulo viral reduzido no hospedeiro infectado.

Os termos proteína ou polipeptídio "imunogênico", conforme aqui utilizados, se referem a uma seqüência de aminoácidos a qual elicia uma resposta imunológica conforme descrito acima. Uma proteína ou polipeptídio "imunogênico", conforme aqui utilizado, inclui a seqüência de comprimento total da proteína, seus análogos ou fragmentos imunogênicos seus. Por "fragmento imunogênico se entende um fragmento de uma proteína a qual inclui um ou mais epítopos e, deste modo, ajuda a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer quantidade de técnicas de mapeamento de epítopo bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Hethods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando ao mesmo tempo grandes quantidades de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo às porções da molécula de proteína, e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos estão ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, na Patente Americana No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998- 4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, todos aqui incorporados por referência nas suas totalidades. Semelhantemente, epitopos conformacionais são prontamente identificados pela determinação da conformação espacial dos aminoácidos tal como, por exemplo, por cristalografia de raio-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Métodos especialmente aplicáveis às proteínas de T. parva são completamente descritos no Pedido PCT No. De Série PCT/US2004/022605, aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Antigenos sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, de poliepítopos, epitopos flanqueadores e outros antígenos recombinantes. Ver, por exemplo, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777- 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. e Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th Conferência Mundial sobre a AIDS, Geneva, Suíça, 28 de junho a 3 de julho de 1998. Fragmentos imunogênicos, para os propósitos da presente invenção, irão geralmente incluir pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 a aminoácidos, e mais pref erivelmente 25 ou mais aminoácidos da molécula. Não há limite superior critico para o comprimento do fragmento, o qual poderia compreender aproximadamente o comprimento total da seqüência proteica, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epítopo da proteína.

Concordantemente, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo expressando um epítopo é que ele compreende ou consiste essencialmente em ou consiste dos nucleotídeo O para codificar um epítopo ou determinante antigênico da proteína ou poliproteína de interesse. Um polinucleotídeo codificando um fragmento da proteína ou poliproteína total, mais vantajosamente, compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em um mínimo de 21 nucleot ídeos, vantajosamente de pelo menos 42 nucleotídeos, e pref erivelmente de pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da seqüência codificando a proteína ou poliproteína total. Procedimentos de determinação de epítopo, tais como a geração de bibliotecas 0 de peptídeo sobreponíveis (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4), 163-168), Pepscan (Geysen et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 81, 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82, 178-182; Van der Zee R. et al., (1989) Eur. J. Immunol., 19, 43-47; Geysen Η.M., (1990) Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 21, 523-533; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) e de algoritmos (De Groot A. et al., (1999) Nature Biotechnology, 17, 533-561), e no Pedido PCT No. De Série PCT/US2 004/022605, todos os quais sendo aqui incorporados por referência nas suas totalidades, podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação demasiada. Outros document os citados e incorporados aqui podem também ser consultados para os métodos para a determinação dos epitopos de um imunógeno o antigeno, e deste modo moléculas de ácido nucleico que codificam trais epitopos.

Um "polinucleotídeo" é uma forma polimérica de nucleotideos de qualquer comprimento, os quais contêm desxirribonucleotideos, ribonucleotideos e análogo em qualquer combinação. Polinucleotideos podem ter estrutura tridimensional, e podem efetuar qualquer função, conhecida ou desconhecida. 0 termo "polinucleotideo" inclui moléculas de fita dupla, simples e de hélice tripla. A não ser que seja especificado o solicitado de oura forma, qualquer modalidade da invenção aqui descrita que seja um polinucleotideo engloba tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas complementares conhecidas ou previstas para compor a forma de fita dupla do DNA, RNA ou molécula hibrida. Os seguintes são exemplos não-limitativos dos polinucleotideos: um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNAm, RNAt, RNAr, ribozimas, DNAc,

polinucleotideos recombinantes, polinucleotideos

ramificados, plasmidios, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas e iniciadores de ácidos nucleicos. Um polinucleotideo pode compreender nucleotideos modificados, tais como nucleotideos metilados e análogos de nucleotideos, uracil, outros açúcares e grupos ligantes tais como fluorribose e tiolato, e ramificações de nucleotideos. A seqüência dos nucleotideos pode ser ainda modificada após a polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nessa definição são capas, substituição de um ou mais dos nucleotideos de ocorrência natural com um análogo e introdução de meios para ligar o polinucleotideo às proteínas, íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotideos ou suporte sólido. Os polinucleotideos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um microorganismo.

A invenção compreende ainda uma fita complementar a um polinucleotideo codificando um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse. A fita complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento, e pode conter desoxirribonucleotideos, ribonucleotídeos e análogos em qualquer combinação.

Os termos "proteína", "peptídeo", "polipeptídio" e "fragmento de polipeptídio" são usados intercambiavelmente aqui para se referir aos polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modif içados ou análogos de aminoácidos, e ele pode ser interrompido por porções químicas diferentes dos aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação ou bioativo.

Um polinucleotídeo ou polipeptídio "isolado" é um que é substancialmente livre dos materiais com os quais ele está associado no seu ambiente natural. Por substancialmetne livre se entende pelo menos 50%, vantajosamente pelo menos 70%, mais vantajosamente pelo menos 80%, e ainda mais vantajosamente pelo menos 90% desses materiais. Reações de hibridização podem ser efetuadas sob condições de diferentes xvestringências". Condições que aumentam a estringência de uma reação de hibridização são bem conhecidas. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et ai. 1989) . Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de estringência crescente): temperaturas de incubação de 25 °C, 37 °C, 50 0C e 68 0C; concentrações de tampão de 10 χ SSC, 6 χ SSC, 1 χ SSC, 0,1 χ SSC (onde SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato 15 mM) e seus equivalentes usando outros sistemas tampões; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais passos de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6 χ SSC, 1 χ SSC, 0,1 χ SSC, ou água deionizada.

A invenção ainda engloba polinucleotideos codificando variantes e derivados funcionalmente equivalentes dos polipeptidios de interesse e fragmentos funcionalmente equivalentes seus os quais podem intensificar, reduzir ou não afetar significativamente as propriedades dos polipept idios codificados por isso. Essas variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes apresentam a capacidade de reter a atividade biológica. Por exemplo, alterações em uma seqüência de DNA que não alteram a seqüência de aminoácidos modificada, assim como aquelas que resultam em substituições conservativas dos resíduos de aminoácidos, uma ou algumas eliminações ou adições de aminoácidos, e substituição dos resíduos de aminoácidos por análogos de aminoácidos são aquelas as quais não irão significativamente afetar as propriedades do polipeptídio codificado. Substituições de aminoácidos conservativas são glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina;

asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; e

fenilalanina/tirosina/triptofano. Em uma modalidade, as variantes têm pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com o polinucleotídeo ou polipeptídio de interesse. Para os propósitos da presente invenção, a identidade

ou homologia de seqüência é determinada pela comparação das seqüências quando alinhadas de modo a maximizar a sobreposição e identidade, enquanto minimiza os intervalo de seqüência. Particularmente, a identidade de seqüência pode ser determinada usando qualquer um de uma variedade de algoritmos matemáticos. Um exemplo não-limitativo de um algoritmo matemático usado para comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 1990; 87: 2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993;90: 5873-5877.

Outro exemplo de um algoritmo matemático usado para comparação de seqüências é o algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), o qual é parte do pacote de software de alinhamento de seqüência GCG. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de residuo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usadas. Ainda outro algoritmo útil para identificar regiões de similaridade de seqüência local e alinhamento é o algoritmo FASTA conforme descrito em Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1988; 85: 2444-2448.

E vantajoso para uso de acordo com a presente invenção o software WU-BLAST (Washington University BLAST) versão 2.0. Os programas executáveis WU-BLAST versão 2.0 para várias plataformas UNIX podem ser descarregados de ftp ://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa é baseado em WU-BLAST versão 1.4, o qual por sua vez é baseado no domínio público NCBI-BLAST versão 1.4 (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993;Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993;Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877; todos os quais sendo aqui incorporados por referência). e^ geral, comparação das seqüências de aminoácidos é

efetuada pelo alinhamento de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptidio de uma estrutura conhecida com a seqüência de aminoácidos de um polipeptidio de uma estrutura desconhecida. Amionoácidos nas seqüências são a seguir comparados e grupo de aminoácidos que são homólogos são agrupados juntos. Esse método detecta regiões conservadas dos polipeptídios e responde por inserções e eliminações de aminoácidos. A homologia entre as seqüências de aminoácidos pode ser determinada pelo uso de algoritmos comercialmente disponíveis (ver também a descrição da homologia acima). Além daqueles mencionados aqui de outro modo, é também feita menção aos programas BLAST, BLAST intervalado, BLASTN, BLASTP e PSI-BLAST, fornecidos pelo Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (VNational Center for Biotechnology Information' Equivalent in English). Esses programas são amplamente usados na técnica para este propósito e podem alinhar regiões homólogas de duas seqüências de aminoácidos.

Em todo os programas de busca no conjunto, as rotinas

de alinhamento intervalado são parte da própria busca do banco de dados em si. O intervalamento pode ser desligado, caso seja desejável. A penalidade predefinida (Q) para um intervalo e comprimento um é Q = 9 para proteínas e BLASTP, e Q = 10 para BLASTN, porém pode ser alterada para qualquer número inteiro. A penalidade por resíduo predefinida para estender um intervalo (R) é R = 2 para as proteínas e BLASTP, e R = 10 para BLASTN, porém pode ser alterada para qualquer número inteiro. Qualquer combinação de valores para QeR pode ser usada para alinhar seqüências de modo a maximizar a sobreposição e identidade, ao mesmo tempo em que se minimiza os intervalos da seqüência. A matriz de comparação de aminoácidos padrão é BLOSUM62, porém outras matrizes de comparação de aminoácidos, tal como PAM, podem ser utilizadas.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo "homologia" ou "identidade", por exemplo, em relação a um nucleotídeo ou seqüência de aminoácidos, pode indicar uma medição quantitativa da homologia entre duas seqüências. A homologia seqüencial porcentual pode ser calculada como (Nreí ~ Ndif) *100/Nre^ , em que Ndif é a quantidade total de resíduos não-idênticos nas duas seqüências quando alinhadas e em que Nref é a quantidade de resíduos em uma das seqüências. Deste modo, a seqüência de DNA AGTCAGTC irá ter uma identidade de seqüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2).

Alternativamente ou adicionalmente, "homologia" ou "identidade" em relação às seqüências pode se referir à quantidade de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pela quantidade de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas seqüências em que o alinhament o das duas seqüências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80:726, aqui incorporado por referência), por exemplo, usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos e uma penalidade de intervalo de 4, e análise assistida por computador e interpretação dos dados da seqüência incluindo o alinhamento pode ser convenientemente efetuada usando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics ™ Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Quando as seqüências de DNA são ditas como sendo similares, ou tendo um grau de identidade ou homologia de seqüência com seqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracil (U) na seqüência de RNA. Deste modo, seqüências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas das seqüências de DNA, por timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual à uracil (U) nas seqüências de RNA.

E, sem experimentação demasiada, o técnico habilitado pode consultar com muitos outros programas ou referências para determinar a homologia porcentual.

A invenção ainda engloba os polinucleotideos de interesse contidos em uma molécula de vetor ou em um vetor de expressão e operativamente ligados a um elemento promotor e opcionalmente a um intensificador. Um "vetor" se refere a um plasmidio ou virus de RNA ou

DNA recombinante que compreende um polinucleotideo heterólogo a ser distribuído a uma célula alvo, in vitro ou in vivo. O polinucleotídeo heterólogo pode compreender uma seqüência de interesse para fins de terapia, e pode estar opcionalmente na forma de um cassete de expressão. Conforme aqui utilizado, um vetor não precisa ser capaz de replicar na célula alvo ou indivíduo final. 0 termo inclui os vetores de clonagem; os vetores virais também estão incluídos. Al O termo "recombinante" significa um polinucleotideo semi-sintético, ou de origem sintética, o qual ou não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotideo em uma disposição não encontrada na natureza.

"Heterólogo" significa derivado de uma entidade

geneticamente distinta do resto da entidade à qual ela está sendo comparada. Por exemplo, um polinucleotideo pode ser colocado por técnicas de engenharia genética em um plasmidio ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é um pol inucleotideo heterólogo. Um promotor removido de sua seqüência codificadora natural e operativamente ligado a uma seqüência codificadora diferente da seqüência natural é um promotor heterólogo.

Os polinucleotideos da invenção podem compreender seqüências adicionais, tais como seqüências codificadoras adicionais na mesma unidade de transcrição, elementos de controle tais como promotores, sitios de ligação a ribossomo, sitios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle do mesmo ou de um promotor diferente, seqüências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira, e qualquer tal constructo conforme possa ser desejável para fornecer modalidades dessa invenção. Elementos para a expressão de um antígeno, epitopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptidio de interesse estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção. De modo minimo, isto compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor, e opcionalmente também uma seqüência de poliadenilação para certos vetores, tais como certos vetores virais e plasmídios, por exemplo, vetores virais diferentes do poxvírus. Quando o polinucleotideo codifica um fragmento de poliproteina, por exemplo, um peptídeo, vantajosamente, no vetor, um ATG é colocado em 5' da estrutura de leitura e um códon de parada é colocado em 3' . Outros elementos para controlar a expressão podem estar presentes, tais como seqüências intensificadoras, seqüências estabilizantes, tais como seqüências de íntron e sinal permitindo a secreção da proteína.

Métodos para fazer e/ou administrar um vetor ou recombinantes ou plasmídio para a expressão dos produtos de gene dos genes da invenção ou in vitro ou in vivo pode ser qualquer método desejado, por exemplo, um método o qual é por ou análogos aos métodos aqui revelados em, ou relevados nos documentos citados, por exemplo, nas: Patentes Americanas Nos: 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807; 5.514.375; 5. 744 . 140; 5.744. 141; 5.756.103 r 5. 762. 938; 5. 766. 599; 5. 990. 091; 5.174. 993; 5.505.941 r 5. 338. 683; 5. 494 . 807; 5. 591. 639; 5.589. 466; 5.677.178 r 5. 591. 4 39; 5. 552 . 14 3; 5. 580. 859; 6.130. 066; 6.004.777 r 6. 130. 066; 6. 497 . 883; 6. 464 . 98 4; 6.451. 770; 6.391.314 r 6. 387 . 37 6; 6. 376. 473; 6. 368 . 603; 6.348. 196; 6.306.400 r 6. 228. 846; 6. 221. 3 62; 6. 217. 883; 6.207. 166; 6.207.165 f 6. 159. 477; 6. 153. 199; 6. 090. 3 93; 6.074 . 64 9; 6.045.803 r 6. 033. 67 0; 6. 485. 72 9; 6. 103. 52 6; 6.224 . I 3 82; 6.312.682; 6 .348.450 e 6. 312. 68 3; Pedido de Patente Americana No. De Série 920. 197 .

depositado em 16 de outubro de 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 19 9 6;9 3: 11313-11318; Ballay et al.. EMBO J. 19 9 3; 4: 3861-65; Felgner et al.. J. Biol. Chem. 1994;269:2550-2561; Frolov et al. . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996;93:11371-11377; Graham. Tibtech 1990;8:85-87; Grunhaus et al.. Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju et al.. Diabetologia 1998;41:736-739; Kitson et al.. J. Virol. 1991;65:3068-3075; McClements et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996;93:11414-11420; Moss. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996;93:11341-11348; Paoletti. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11349-11353; Pennock et al.. Mol. Cell. Biol. 1984;4:399-406; Richardson (Ed) . Methods in Molecular Biology 1995;39. "Baculovirus Expression Protocols." Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983;3:2156-2165; Robertson et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996;93:11334-11340; Robinson et al.. Sem. Immunol.

1997;9:271; e Roizman. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996;93:11307-11312. Os documentos aqui citados e aqui incorporados por referência, além do fornecimento dos exemplos de vetores usados na prática da invenção também podem fornecer fontes de peptideos ou fragmentos seus para serem expressos por vetor ou vetores em, ou incluídos nas composições da invenção.

A presente invenção também se refere às preparações compreendendo vetores, tais com vetores de expressão, por exemplo, composições terapêuticas. As preparações podem compreender, consistir essencialmente de ou consistir de um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão in vivo compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo de (e vantajosamente expressando) um ou mais dos antigenos, epitopos ou imunógenos de interesse. Vantajosamente, o vetor contém e expressa um polinucleotideo que inclui, consiste essencialmente em ou consiste em um polinucleotideo codificando (e vantajosamente expressando) um antigeno, epitopo, imunógeno peptideo ou polipeptidio de ■ interesse, em um carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Deste modo, de acordo com uma modalidade da invenção, o outro vetor ou vetores na preparação compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polinucleotideo que codifica, e sob condições apropriadas o vetor expressa uma ou mais outras proteínas de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse ou um fragmento seu.

De acordo com outra modalidade, o vetor ou vetores na

preparação compreendem, ou consistem essencialmente do(s) polinucleotideo(s) codificando uma ou mais proteínas ou fragmento (s) seu(s) de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse do vetor ou vetores expressando o(s) polinucleotideo(s). A preparação da invenção vantajosamente compreende, consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos dois vetores compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo de, e vantajosamente também expressando, vantajosamente in vivo sob condições apropriadas ou condições adequadas ou em uma célula hospedeira adequada, polinucleotídeos de diferentes isolados codificando as mesmas proteínas e/ou diferentes proteínas, porém vantajosamente as mesmas proteínas Preparações contendo um ou mais vetores contendo, consistindo essencialmente em ou consistindo de polinucleotideos codificando, e vantajosamente expressando, vantajosamente in vivo, um antigeno ou proteína de fusão de interesse ou um epítopo seu. A invenção é também direcionada às misturas de vetores que contêm, consistem essencialmente de ou consistem da codificação para, e expressam diferentes antígenos, epítopos ou imunógenos, por exemplo, um antigeno, epítopo, imunógeno peptídeo ou polipeptídio de diferentes espécies tais como, porém sem se limitar, a pássaros, cachorros, gatos,vacas, cavalos, humanos e porcos.

De acordo com outra modalidade da invenção, os vetores de expressão são vetores de expressão usados para a expressão in vitro de proteínas em um sistema celular apropriado. As proteínas expressas podem ser coletadas em ou do sobrenadante da cultura depois ou não após a secreção (se não houver secreção a Iise celular ocorre ou é efetuada), opcionalmente concentradas por métodos de concentração tais como ultrafiltração e/ou purificadas por meios de purificação, tais como afinidade, troca iônica ou métodos de cromatografia tipo filtração em gel.

Uma "célula hospedeira" denota uma célula procariótica ou eucariótica que tenha sido geneticamente alterada, ou que seja capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotideo exógeno, tal como um plasmidio ou vetor recombinante. Ao se referir a células geneticamente alteradas, o termo se refere tanto à célula originalmente alterada quanto à sua progenia. Células hospedeiras vantajosas incluem, porém não estão limitadas, às células de rim de hamster jovem (BHK), células de carcinoma de cólon (Caco-2), células C0S7, células MCF-7, células MCF-IOa, células de rim canino Madin-Darby (MDCK), células de rim bovino Madin-Darby (MDBK), células de pulmão de marta (MvlLu), células MRC-5, células U937 e células VERO, células Kl de hamster de ovário chinês (CHO). Polinucleotideos compreendendo uma seqüência desejada podem ser inseridos em um vetor de clonagem ou expressão adequado, e o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Polinucleotideos podem ser introduzidos em células hospedeiras através de quaisquer meios conhecidos na técnica. Os vetores contendo os polinucleotideos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer uma de uma variedade de meios apropriados, incluindo absorção direta, endocitose, transfecção, nucleofecção, f-emparelhamento, eletroforação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubidio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrana ou outras substâncias; bombardeamento por microprojétil; lipofecção; e infecção (onde o vetor é infeccioso, por exemplo, um vetor retroviral) . A escolha da introdução de vetores ou polinucleotideos . irá geralmente depender das

características da célula hospedeira.

Em uma modalidade vantajosa, a invenção fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para a distribuição e expressão de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é experimentação de rotina para uma pessoa normalmente versada na técnica. Em uma modalidade, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que expressa um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse e um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma modalidade vantajosa, o carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfecção e/ou melhora a conservação do vetor ou proteína.

Os carreadores, veículos ou excipientes

farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl 0,9% (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outros carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis que podem ser usados para os métodos dessa invenção incluem, porém não estão limitados, a poli(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. Os carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilitem a administração do vetor (ou proteína expressa de um vetor da invenção in vitro); vantajosamente, o carreador, veículo ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a conservação do vetor (ou proteína) . Doses e volumes de doses são aqui discutidos na descrição geral e podem também ser determinados pela pessoa versada na técnica a partir dessa descoberta lida juntamente com o conhecimento da técnica, sem qualquer experimentação demasiada.

Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário os quais são vantajosamente, porém não exclusivamente adequados para os plasmídios, são vantajosamente aqueles com a seguinte fórmula:

CH3

I +

R-O-CH.-CH-CHr-N-R-X

2I 2I

OR CH,

1 Λ Na qual R1 é um radical alifático de cadeia linear saturado ou insaturado com de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é ouro radical alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Em outra modalidade, o lipideo catiônico pode ser associado com um lipideo neutro, por exemplo, DOPE.

Dentre esses lipideo catiônicos, é dada preferência ao DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-

bis(tetradecilóxi)-1-propano amônio; W096/34109);

vantajosamente associado com um lipideo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura de plasmidio com o adjuvante é formada extemporaneamente e vantajosamente

contemporaneamente com a administração da preparação ou logo antes da administração da preparação; por exemplo, logo antes ou após a administração, a mistura plasmídio- adjuvante é formada, vantajosamente de modo a fornecer tempo suficiente antes da administração para a mistura para formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como aproximadamente 30 minutos antes da administração. Quando DOPE está presente, a proporção molar DMRIE- DOPE é vantajosamente de cerca de 95: cerca de 5 até cerca de 5:cerca de 95, mais vantajosamente de cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A proporção em peso de adjuvante DMRIE ou DMRIE-

DOPE:plasmídio pode estar entre cerca de 50:cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 10, tal como cerca de 10: cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 5, e vantajosamente cerca de 1:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2. As composições imunogênicas e vacinas de acordo com a

invenção podem compreender ou consistir essencialmente de um ou mais adjuvantes. Adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, polímeros derivado de alquinil e anidrido maleico, (2) seqüências de imunoestimulação (ISS), tais como seqüências de oligodesoxirribonucleotídeo com uma ou mais unidades CpG não-metiladas (Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; W098/16247), (3) uma emulsão óleo em água, tal como a emulsão SPT descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo trabalho, (4) lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, por exemplo, (5) citocinas DDA, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência no presente pedido, ou (9) quaisquer combinações ou misturas suas.

A emulsão óleo em água (3), a qual é especialmente

apropriada para vetores virais, pode ser baseada em : óleo de parafina líquida leve (tipo farmacopéia Européia), óleo de isoprenóide tal como esqualano, esqualeno, óleo resultante da oligomerização de alquenos, por exemplo, isobuteno ou deceno, ésteres dos ácidos ou alcoóis com um grupo alquil de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etila, propilenoglicol, di(caprilato/caprato), glicerol tri(caprilato/caprato) e dioleato de

propilenoglicol, ou ésteres de alcoóis ou ácidos graxos ramificados, especialmente ésteres do ácido isoesteárico.

0 óleo é usado juntamente com emulsificantes para formar uma emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos não-iônicos, tais como: ésteres de por um lado sobitan, mannide (por exemplo, oleato de anidromanitol) glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiestárico, os referidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados ou copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno, tais como Pluronic, por exemplo, L121. Dentre os polímeros adjuvantes tipo (1), é dada preferência aos polímeros do ácido acrílico ou metacrílico reticulados, especialmente reticulado por polialquenil éteres de açúcares ou polialcoóis. Esses compostos são conhecidos pelo nome carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junho de 1996) . Uma pessoa versada na técnica também pode se referir à Patente Americana No. 2.909.462, a qual fornece tais polímero acrílicos reticulados por um composto poliidroxila com pelo menos três grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que oito tais grupos, os átomos de hidrogênio de pelo menos três grupos hidroxila sendo substituídos por radicais insaturados alifáticos com pelo menos dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, grupos vinil, alil e outros etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem também conter outros substituintes, tais como metil. Produtos vendidos com o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) são especialmente adequados. Eles são reticulados por alil sacarose ou por alil pentaeritritol. Dentre estes, é feita referência ao Carbopol 974P, 934P e 971P.

Como para os copolímeros derivado de anidrido maleico- alquenil, é dada preferência ao EMA (Mosanto), os quais são copolímeros de cadeia linear ou reticulados de etileno- anidrido maleico e eles são, por exemplo, reticulado por éter diviníIico. É também feita referência a J. Fields et al·., Nature 186: 778-780, 4 de junho de 1960.

Em relação à estrutura, os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e EMA são preferivelmente formados por unidades básicas com a fórmula a seguir:

R ι R2

COOH COOH

Na qual:

- Ri e R2, os quais podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3;

- χ = 0 ou 1, preferivelmente χ = 1

- y = 1 ou 2, com χ + y = 2.

Para EMA, x = 0ey = 2e para os carbômeros χ = y = 1.

Esses polímeros são solúveis em água ou em solução salina fisiológica (20 g/L de NaCl) e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo, com soda (NaOH), para fornecer a solução adjuvante na qual o(s) vetor(es) de expressão pode(m) ser incorporado(s). A concentração de polímero na composição de vacina final pode variar entre 0,01 e 1,5% p/v, vantajosamente 0,05 a 1% p/v e preferivelmente 0,1 a 0,4% p/v. Δ citocina ou citocina(s) pode estar na forma de proteína na composição imunogênica ou de vacina, ou pode ser coexpressa no hospedeiro com o imunógeno ou imunógenos ou epítopo(s) seu(s). É dada preferência à co-expressão da citocina ou citocinas, seja pelo mesmo vetor que aquele expressando o imunógeno ou imunógenos ou epítopo(s) seu(s), ou por um vetor separado dele.

A invenção compreende o preparo de tais composições de combinação; por exemplo, pela mistura dos componentes ativos, vantajosamente juntamente e com um adjuvante, veículo, citocina e/ou diluente.

Citocinas que podem ser usadas na presente invenção incluem, porém não estão limitadas, ao fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito/macróago (GM-CSF), interferon α (IFN a), interferon β (IFN β), interferon γ (IFN γ), interleucina-la (IL-Ia), interleucina-ΐβ (IL-Ιβ), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina- 4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina- 9 (IL-9), interleucina-10 (IL-IO), interleucina-11 (IL-Il), interleucina-12 (IL-12), fator de necrose tumorala (TNF a) , fator de necrose tumoral β (TNFP) e fator de crescimento transformador β (TGF β) . É entendido que as citocinas podem ser co-administradas e/ou seqüencialmente admi nistradas com a composição imunogênica ou da vacina da presente invenção. Deste modo, por exemplo, a vacina da presente invenção pode também conter uma molécula de ácido nucleico exógena que expressa in vivo uma citocina adequada, por exemplo, uma citocina emparelhada ao seu hospedeiro a ser vacinado ou no qual uma resposta imunológica está para ser suscitada (por exemplo, uma citocina canina para as preparações a serem administradas aos cachorros).

Vantajosamente, as composições farmacêuticas e/ou terapêuticas e/ou formulações de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente de ou consistem de uma quantidade eficaz para eliciar uma resposta terapêutica de um ou mais vetores de expressão e/ou polipeptidios conforme aqui discutido; e uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir dessa descoberta, incluindo os documentos aqui incorporados, e o conhecimento na técnica, sem experimentação demasiada.

No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em um vetor de plasmidio, uma dose pode compreender, consistir essencialmente de ou consistir, em termos gerais, de cerca de 1 μς até cerca de 2000 μq, vantajosamente de cerca de 50 μς a cerca de 1000 μς e mais vantajosamente de cerca de 100 μg a cerca de 800 μς de plasmidio expressando o antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse. Quando as composições terapêuticas ou farmacêuticas à base de vetor de plasmidio são administradas com eletroforação, a dose do plasmidio é geralmente entre cerca de 0,1 μg e 1 mg, vantajosamente entre cerca de 1 μς e 100 μς, vantajosamente entre cerca de 2 μς e 50 \iq. Os volumes de dose podem estar entre cerca de 0,1 e cerca de 2 mL, vantajosamente entre cerca de 0,2 e cerca de 1 mL. Essas doses e volumes de dose são adequados para o tratamento de espécies alvo de mamíferos.

Em uma modalidade vantajosa, um animal é vacinado com

duas doses de vacina inativada com intervalos de cerca de 3 a 4 semanas através da via subcutânea, embora a via intramuscular também seja contemplada. Amostras de sangue podem ser coletadas no dia da primeira e/ou segunda vacinação e cerca de 2 a 4 dias depois da segunda vacinação para determinar os níveis de anticorpos específicos pelos métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, neutralização de vírus inibição de hemaglutinação, ELISA ou testes de hemólise radial individuais (SRH).

Deve ser entendido por uma pessoa versada na técnica que a descoberta aqui é fornecida a título de exemplo e a presente invenção não está limitada a isso. A partir dessa descoberta e do conhecimento da técnica, a pessoa habilitada pode determinar a quantidade de administrações, a via de administração e as doses a serem usadas para cada protocolo de injeção, sem qualquer experimentação demasiada.

A presente invenção contempla pelo menos uma admi nistração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita de acordo com a invenção. 0 animal pode ser um macho, fêmea, fêmea grávida e recém- nascido. Essa administração pode ser através de várias vias incluindo, porém sem se limitar, à injeção intramuscular (IM) , intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) ou através da administração intranasal ou oral. A composição terapêutica de acordo com a invenção também pode ser administrada por um aparelho sem agulha (por exemplo, como com um aparelho Pigjet, Biojector ou Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)). Outra abordagem para administrar composições de plasmídio é usar 'a eletroforação (ver, por exemplo, S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; Pedido PCT No. W099/01158) . Em outra modalidade, a composição terapêutica é distribuída ao animal por uma arma de gene ou bombardeamento com partículas de ouro. Em uma modalidade vantajosa, o animal é um vertebrado.

Uma modalidade da invenção é um método para suscitar uma resposta imune contra o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse em um animal, compreendendo a administração de uma formulação para distribuição e expressão de uma vacina recombinante em uma quantidade eficaz para suscitar uma resposta imune. Ainda outra modalidade da invenção é um método de indução de uma resposta imune ou protetora em um animal, compreendendo a administração ao animal de uma quantidade eficaz de uma formulação para distribuição e expressão de um antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse, em que a formulação compreende uma vacina recombinante e um carreador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

A invenção se refere a um método para suscitar, induzir ou estimular a resposta imune de um animal, vantajosamente um mamífero ou um vertebrado. Outra modalidade da invenção é um kit para efetuar um método de indução de uma resposta imunológica ou protetora contra um antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse em um animal compreendendo uma vacina recombinante e instruções para efetuar o método de distribuição em uma quantidade eficaz para suscitar uma resposta imune no animal.

A invenção será agora descrita a titulo dos seguintes exemplos não-limitativos . EXEMPLO 1: Impacto da eficiência de expressão do gene

de resistência à canamicina ("KanaR") na eficiência de replicação de plasmidio em bactérias.

O exemplo a seguir ilustra o impacto da eficiência de expressão do gene de resistência à canamicina ("KanaR") na eficiência de replicação de plasmidio em bactérias.

Primeiramente, os elementos do cassete de expressão KanaR foram analisados, especificamente o(s) promotore (s), iniciação de tradução e término de transcrição. Na análise desses elementos de expressão, esses elementos são modificados e o impacto dos elementos modificados nos rendimentos da produção de plasmidio são analisados. Quatro promotores potenciais foram identificados. P3 (SEQ ID NO: 3) fo i identificado a partir de buscas na literatura e em bancos de dados, a estrutura sendo descrita no GenBank AN# Χ00928 (SEQ ID NO: 4), porém não detectado pelos softwares atuais. P2 (SEQ ID NO: 2) foi determinado por análise de bioinformática e também foi encontrado no GenBank AN# V00359 (SEQ ID NO: 5) publicado. Pl (SEQ ID NO: 1) foi um promotor potencial adicional pertencendo à estrutura pVR1012. PO foi outro promotor potencial pertencendo à estrutura pVR1012. FIGl. 1 mostra como P2 (SEQ ID NO: 2) e P3 se sobrepõem parcialmente.

Não há seqüência de sinal de terminação de transcrição para KanaR em pVR1012. Isto poderia ter muitas conseqüências em potencial. Muitos transcritos KanaR poderiam ser anormalmente longos e degradados, uma vez que poderia haver uma queima metabólica inútil. Além disso, a expressão de KanaR poderia ser sub-ótima em pVR1012. A transcrição de KanaR pode continuar pela origem de replicação, ORI, e consequentemente com a iniciação da replicação conforme demonstrado esquematicamente na FIG. 2. Consequentemente, dois terminadores de transcrição apropriados foram identificados: rrnBTl+T2, o qual pode ser encontrado em GenBank AN# U13872 (SEQ ID NO: 6) e é usado em muitos vetores de expressão comerciais, e speA, o qual tem o Número Acc. M31770 (SEQ ID NO: 7) . Além disso, o códon iniciador ATG de pVR1012 foi substituído por TTG para reduzir a eficácia de iniciação de tradução. Deste modo, o objetivo foi determinar o efeito de cada cassete de expressão modificado na capacidade de resistência à canamicina e nos rendimentos de produção de plasmidio.

Deste modo, os derivados PVR1012 foram gerados com o promotor Pl (SEQ ID NO: 1), P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) ou Pl (SEQ ID NO: 1) com P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3), terminadores de transcrição rrnBTl+T2 ou speA e o códon iniciador TTG. Para introduzir tais seqüências de DNA à montante ou à jusante da ORF KanaR, sítios de restrição individuais foram necessários. Tais sítios não foram encontrados em pVR1012, de modo que eles foram introduzidos por mutagênese direcionada a sítio.

Primeiramente, o cassete KanaR foi clonado no vetor de mutagênese pALTER-1, conforme mostrado na FIG. 3. FIG. 4 mostra como um sítio de restrição PacI foi introduzido à jusante da ORF KanaR, produzindo dessa forma pLL2, um sítio de restrição SwaI foi introduzido à montante e um sítio de restrição RrsII foi introduzido à jusante, deste modo produzindo pLL4, e finalmente o códon iniciador de tradução ATG foi modificado para TTG, produzindo pLL6. 0 cassete KanaR modificado de pLL4 foi a seguir clonado em pVR1012 para formar pLL7, conforme mostrado na FIG. 5. A seqüência terminadora rrnB foi a seguir clonada em pLL7 por PCR a partir de pSB062 e subseqüentemente foi feita a digestão de PacI RsrII para formar pLL9, conforme mostrado na FIG. 6. A FIG. 7 mostra a clonagem da seqüência terminadora speA em pLL7 pelo anelamento de oligonucleotideo sintéticos e a digestão de PacI RsrII para formar pLLll. Posteriormente, a seqüência de iniciação traduzida modificada de pLL6 foi clonada em pLL9 por digestão e MscI PacI para formar pLLlO, mostrado na FIG. 8. Finalmente, a FIG. 9 ilustra como as seqüências promotoras P2/P3 (SEQ ID Nos: 2-3) com Pl (SEQ ID NO: 1), Pl (SEQ ID NO: 1), e P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) foram clonadas por URS11-URS12 PCR, URS13-URS12 PCR e URS11-URS14 PCR, respectivamente. As FIGS. 10, 11 e 12 mostram como essas foram a seguir incorporadas em pLL9 para formar pLL13, 14 e 15, respectivamente.

Semelhantemente, a FIG. 13 mostra como a Pl (SEQ ID NO: 1) foi incorporada em pLL7 para formar pLL16. FIG. 14 mostra vários dos constructos resultantes. Os constructos pLLl3, pLL14, pLL15 e pLL16 tinham uma eliminação de 192 pares de base entre o promotor CMV e o promotor Kana Pl (SEQ ID NO: 1), conforme ilustrado pela FIG. 15. A Tabela 1 resume esses constructos.

Tabela 1

Gene KanaR Inserção Tamanho PLASMIDI O Promotor(es ) Códon iniciado r Terminado r o do plasmidi o (pb) pVR1012 p0, P2/3 pi, ATG Não Não 4911 pLL7 p0, P2/3 pi, ATG Não Não 4911 pLL9 P0, P2/3 pi, ATG rrnB Tl - T2 Não 5011 pLLlO P0, P2/3 pi, TTG rrnB Tl - T2 Não 5011 pLLll P0, P2/3 pi, ATG speA Não 4846 pLL13* PI, P2/3 ATG rrnB Tl - T2 Não 4811 pLLl4 * Pl ATG rrnB Tl - T2 Não 4655 pLL15* P2/3 ATG rrnB Tl - T2 Não 4661 pLL16* Pl ATG Não Não 4555 pPB662 P0, P2/3 pi, ATG Não FIV env 7456 pLLl9* Pl ATG rrnB Tl - FIV env 7204 PLASMÍDI O Gene KanaR Inserção o Tamanho do plasmídi o (pb) Promotor(es ) Códon iniciado r Terminado r T2

*Constructos com uma eliminação de 192 pb entre o promotor CMV e o promotor Kana Pl

0 efeito das modificações no tamanho do transcrito do gene KanaR foi confirmado por experimentos de Northern blot. Esses confirmaram a heterogeneidade dos transcritos Pvrl012 KanaR conforme mostrado pela mancha. Eles também confirmaram a presença de três promotores ativos em pLL9, pLLlO e pllll; um transcrito curto principal de P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) e dois transcritos mais fracos de PO e Pl (SEQ ID NO: 1) . Conforme esperado, pLL13 gerou dois transcritos e pLLl4 e pLL15 somente um.

Vários parâmetros foram a seguir testados nos derivados pVR1012 para avaliar as suas novas características. A capacidade de resistir ao aumento às concentrações de canamicina foi testada primeiramente pela inoculação de uma colônia bacteriana contendo cada constructo, pVR1012 a pLL15, em meio LB e crescimento de um dia para o outro a 37 0C e 200 RPM. As bactérias em cada suspensão foram quantificadas por espectrofotometria (OD60O nm). Diluições apropriadas de suspensões bacterianas, de 50 ou 100 pL, foram plaqueadas em meio LB contendo o aumento as concentrações de canamicina. Finalmente, as colônias fo ram contadas, os resultado das quais sendo mostrados na FIG. 16. Esses resultados mostraram que as bactérias contendo a maior parte dos derivados pVR1012 tinham a mesma capacidade de resistir ao aumento da concentração de Kana sem adaptação, uma vez que o crescimento não foi afetado ente 0 e 800 μς/τη!, e foi inibido a 3200 μς/ιιΛ. As bactérias contendo pLLlO e PLL14 tinham urna capacidade significativamente menor de resistir à canamicina, uma vez que o crescimento foi inibido de 90% a 100% a 800 μς/mL, porém não em 200 μς/ιηΐ,. Deste modo, foi concluído que a ausência dos promotores P2/P3 (SEQ ID Nos: 2-3) o de eficiências de tradução reduzidas tem um impacto significativo na produção da enzima KanaR, indicando que os promotores P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3) são mais eficientes para a expressão de KanaR e o inibidor TTG reduz a expressão de KanaR. Entretanto, essas mutações ainda permitem a resistência bacteriana e o crescimento na presença das concentrações de Kana clássicas A capacidade de adaptação ao meio EGLI foi testada primeiramente pelo crescimento das suspensões de células bacterianas contendo cada constructo bacteriano e IO4 UFC em LB, e a seguir plaqueando em placas EGLI. De 25 a 50 colônias isoladas contendo cada constructo foram subseqüentemente plaqueadas em uma nova placa. EGLI. As colônias em crescimento foram contadas, os resultados das quais sendo mostrados na Tabela 2. As estruturas dos plasmidios pLLlO, pLL14 e pLL16 conferem uma clara vantagem de crescimento em meio com nutriente limitado para as bactérias que os contêm. Além disso, a menor capacidade de produção de canamicina está associada com a melhor capacidade de adaptação em meio com pouco nutriente na presença de 100 μg/mL de canamicina. CM

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Os rendimentos de plasmidio obtidos sob condições de crescimento laboratoriais foram testados primeiramente pela adaptação de EGLI em meio sólido. De 15 a 25 colônias, Experimento AeB, respectivamente, contendo cada constructo cresceram de um dia para o outro em meio EGLI a 37 0C e 200 RPM. A quantidade de bactéria em cada suspensão foi avaliada por espectrofotometria, OD60O. 0 DNA de cada suspensão foi purificado usando colunas Qiagen e quantificado por espectrofotometria, OD26O- A quantidade de cópias de plasmidio em cada suspensão foi a seguir deduzida, os resultados podendo ser observados na FIG. 19.

Os resultados mostram que os constructos pLL14 e pLL16 são os melhores candidatos em relação aos rendimentos de plasmidio sob condições laboratoriais em meio EGLI. Além disso, os rendimentos de plasmidio foram significativamente menores quando o constructos continham um terminador de transcrição e iniciação de tradução eficiente (ATG). Concomitantemente, os rendimentos de plasmidio foram mais altos quando os constructos não continham um terminador de tradução ou não continham o promotor Pl (SEQ ID NO: 1) subótimo ou a iniciação e tradução subótima (TTG). Os rendimentos dos plasmidios forma comparáveis nos constructos pVR1012 e pLLlO, indicando que uma baixa eficiência de tradução compensou o efeito negativo da terminação de transcrição. Esses resultados sugerem que quanto mais baixa é a capacidade de expressar KanaR, mais altos são os rendimentos dos plasmidios. Em uma extensão do teste, a estabilidade do plasmidio foi ainda avaliada submetendo-se cada preparação de plasmidio derivado de cada constructo à análise de restrição. A Tabela 2 mostra os resultados dessa análise. Nenhuma mutação foi detectada depois da adaptação de EGLI para pLLlO, pLL14, pLLl6 e pLL19, enquanto que foi de mais de 9% para os outros constructos. Também foi descoberto que houve uma maior homogeneidade dos rendimentos de plasmidio nos clones pLL14, pLLl6 e pLL19 de EGLI adaptados. FIG. 20 ilustra a diferença entre a alta heterogeneidade do rendimento de plasmidio com os constructos pVR1012 e uma menor heterogeneidade com o constructo pLL14 ou pLL19. Os rendimentos do plasmidio obtido por fermentação

foram testado primeiramente pela seleção arbitrária de um clone de SCSl/pLL14 EGLI-adaptado para fermentação. Depois da fermentação, as bactérias foram centrifugadas e o plasmidio foi extraído de uma alíquota e quantificado duas vezes de acordo com os método desenvolvidos por PGEA. Os resultados mostraram que a taxa de crescimento de SCSl/pLL14 foi significativamente mais baixo do que o geralmente observado para os derivados pVR1012, tais como pPB266 e pPB662. Além disso, o rendimento de plasmído específico de PLL14 foi de 3,1 mg de plasmídio/g de pélete bacteriano. Este resultado corresponde aos melhores resultados já obtidos com os derivados pVR1012 depois da adaptação de Kana e seleção do clone, tal como pPB266. A estabilidade do plasmidio foi a seguir avaliada submetendo- se as preparações de plasmidio de cada clone fermentado à análise de restrição com três diferentes padrões de digestão de restrição diferentes. A Tabela 4 fornece um resumo dos resultados de análise de plasmidio globais. Os resultados mostram que o nivel de expressão de KanaR teve um impacto na eficiência de replicação de plasmidio. Quanto menor a expressão, maiores foram as taxas de replicação em meio com pouco nutriente e Kana 100 μg/mL. A redução da expressão de KanaR pôde ser obtida pela eliminação do promotor natural (P2/P3 (SEQ ID NOS: 2-3)), assegurando a ausência de um sinal de terminação de transcrição e modificação da iniciação de tradução. A expressão de KanaR reduzida levou a rendimentos de plasmidio aumentado em até 50% em comparação com a estrutura de plasmidio de origem pVR1012. Isto também levou a uma estabilidade e homogeneidade de plasmidio aumentada nos rendimentos da produção de plasmidio. Isto, deste modo, provavelmente permitiu uma seleção de clone limitada. (d H

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** Resultados obtidos em um segundo teste de quantificação de rendimento de plasmidio.

*** Resultados obtidos em um terceiro teste de quantificação de rendimento de plasmidio.

O plasmidio pLL16 é submetido a análises posteriores, tais como resistência ao aumento das concentrações de Kana e rendimentos de plasmidio após a fermentação. Δ construção de pLL17 e pLL18 também é completada, em que pLL17 tem o promotor PI, um códon de iniciação TTG e o terminador mB Tl/2 e pLL18 tem o promotor pl, um códon de iniciação TTG e nenhum terminador. Entretanto, esses constructos podem ser difíceis de obter devido à baixa capacidade de KanaR. Essas construções são analisadas usando o testes anteriormente descritos. Os testes de rendimento de plasmidio depois da adaptação de Kana em constructos selecionados (por exemplo, pLL14 a -18) são efetuados. Δ análise de transcrito de RNA do gene KanaR de todas as construções é efetuada para confirmar o modelo deduzido. Pelo movimento do cassete KanaR em pVR1012, pode-se confirmar que o cassete KanaR não tem impacto na origem de replicação.

EXEMPLO 2: Seqüências 10

15

20

DEFINIÇÃO Região 5' do gene Tn2350 Km(r) de elemento de transposição do plasmidio RI. ACESSO X00928 (SEQ ID NO: 4)

1 gaattcccgc agattaacgc gcataacaag cggtttactc

gttttggcct gcaatgtaac

61 ataatataca ttatgcgcac taaggtagag tatgcggttt tgatcagaac

121 tcagttaacc atcccgggat tctgctctgg gcagtttttt actttggatg

181 aagttaaccc atgttatatt gcacaagata atcatgaaca ataaaactgt

241 ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg tattcaacgg gaaacgtctt

301 gctcgaggga attc DEFINIÇÃO Elemento de transposição Tn903. ACESSO V00359 J01839 (SEQ ID NO: 5)

gcagcaagat

cccattcagc

aaaatatatc

ttatgagcca

1 ggctttgttg gtagcgggtt gtgttttcag 61 gcaatacgca tgttcagcgc tcgtaccagg 121 gccatagcct tcagtgaacc cccgaacagc 181 tgttttaccc ggttgtaatc tgttgtccat

aataaatcag atttcgggta agtctccccc

cgctttcagg catacctgct ttcgtcattt

ccgcaacctg accatcgtag tcacgcagcg

ggtacatcgc cgtttccgct atcgagcgac 15

20

241 ctgcacggtt

301 taagcgcgct

361 cgtctgccga

421 ctgagtcggt

481 caacggcgag

541 tccattcgcc 601 caccccgggt 661 tgtaatccgg 721

ttccaccgcg acggtctgca tattcaccgg gattttctta cgccgcagtt tgctgccctg atttttctgt cacattgttc agcgacaggt atgcagctta cgccagatac ttcaccaaag accttcagcc gaacgttttg aaactgatat gcagcgcaac ggaacattca

gcgcagcgcg cagggtcagc 781 ctgaatacgc ggtcagaata gcgctgaggt 841 ctgcctcgtg gaatcgcccc atcatccagc 901 cagaaagtga aggtggacca gttggtgatt

cattactccc ggtcattcgc tgattagcca

gccagtaacc cgcacctttt cggggaggga

catcgtgaca gagccgggtg tcgtaagcgc

gagtctgccg gataagaccc gggaaggctt

cagcgcagat gatttcatgt gttttactgt

ggcggcgttc ctggccatgc tttttgactt

cggtggaatc aatcaccaga tgcgcgattt

taaccgactt tgcccgcctg ctgacacagc

tcagtgtaaa aatggaatca ataaagccct

gtttaatgac cagcacagtc gtgatggcaa

aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct

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1141 aaacgtcttg 1201 aatgggctcg 1261 ccgatgcgcc

1321 atgagatggt 1381

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1441 tccaggtatt 1501 tcctgcgccg 1561 ttcgtctcgc 1621 atgacgagcg

ttgaactttt gatctgatcc ttcaactcag aaatctctga tgttacattg tgcttacata aacagtaata ctcgaggccg cgattaaatt cgataatgtc gggcaatcag agagttgttt ctgaaacatg cagactaaac tggctgacgg tcctgatgat gcatggttac agaagaatat cctgattcag gttgcattcg attcctgttt tcaggcgcaa tcacgaatga taatggctgg

gctttgccac ggaacggtct gcgttgtcgg

caaaagttcg atttattcaa caaagccacg

cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa

caaggggtgt tatgagccat attcaacggg

ccaacatgga tgctgattta tatgggtata

gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc

gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag

aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt

tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat

gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt

gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat

ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg 1681 cattctcacc

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1921 tcgatgagtt

1981 tgacttgacg

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cctgttgaac ggattcagtc gtcactcatg attaataggt tgtattgatg catcctatgg aactgcctcg atatggtatt gataatcctg tttctaatca gaattggtta ggacggcggc tttgttgaat cttcccgaca acgcagaccg acctacaaca aagctctcat attcaggcct ggtatgagtc gaccttgcca tcacgactgt

cctgcgcgct gcgcagggct 2341 ttattgattc ctgcccggat tacagctgtg

aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc

gtgatttctc acttgataac cttatttttg

ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc

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2521 aaaagcatgg ccaggaacgc cgccgtatct gcatctcgcc gttgacagta

2581 aaacacatga aatcatctgc gctgacctgt tgtgaccgac tcagaagcct

2641 tcccgggtct tatccggcag actcacagaa agcatcggca gacggcgctt

2701 acgacacccg gctctgtcac gatgaactgc aatcagcgcg cttatccctc

2761 cccgaaaagg tgcgggttac tggcccggtg ccgtaaccgt gcagtggcta

2821 atcagcgaat gaccgggagt aatgcgcggt aacagattac aaccgtcgct

aggtctttgg

ggcgtaagct

cgctgaacaa

aaatcagggc

ggcgtaagaa

aatatgcaga

ggaaatggac

2881 cgatagcgga aacggcgatg taccgggtaa aacagctgtt cgggggttca ctgacgctgc

2941 gtgactacga tggtcaggtt gcggaggcta tggccctggt acgagcgctg aacaaaatga

3001 cgaaagcagg tatgcctgaa agcgtgcgta acacaacccg ctacggggga

3061 gacttacccg aaatctgatt tattcaacaa agcc

ttgcctgaaa 10

15

20

DEFINIÇÃO Vetor de clonagem pTrc99a, seqüência completa.

ACESSO U13872 (SEQ ID NO: 6)

1 gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc

61 ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc

121 gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc

181 tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 241 taacaatttc

cggtacccgg

301 atgagagaag

361 acagaatttg

421 agtgaaacgc

481 ccaggcatca

541 gtttgtcggt

ggatcctcta gagtcgacct attttcagcc tgatacagat cctggcggca gtagcgcggt cgtagcgccg atggtagtgt aataaaacga aaggctcagt gaacgctctc

acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct

gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg

taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa

ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga

ggggtctccc catgcgagag tagggaactg

cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 601 ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg

cgaagcaacg gcccggaggg 661 tggcgggcag ttaagcagaa ggccatcctg 721 acggatggcc atttttctaa atacattcaa

781 tcaataatat 841

cttttttgcg 901 agatgctgaa

961 taagatcctt 1021

tctgctatgt 1081 catacactat 1141 ggatggcatg 1201 ggccaactta 1261 catgggggat

atatgtatcc tgaaaaagga agagtatgag gcattttgcc ttcctgtttt gatcagttgg gtgcacgagt gagagttttc gccccgaaga ggcgcggtat tatcccgtgt tctcagaatg acttggttga acagtaagag aattatgcag cttctgacaa cgatcggagg catgtaactc

gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa

tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt

gctcatgaga caataaccct gataaatgct

tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc

tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa

gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg

acgttttcca atgatgagca cttttaaagt

tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg

gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac

tgctgccata accatgagtg ataacactgc

accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1321 aaacgacgag

1381 aactggcgaa 1441

taaagttgca

1501 atctggagcc 1561 gccctcccgt 1621 tagacagatc 1681 ttactcatat 1741

gaagatcctt 1801 agcgtcagac 1861 aatctgctgc 1921

gccttgatcg cgtgacacca cgatgcctac ctacttactc tagcttcccg ggaccacttc tgcgctcggc ggtgagcgtg ggtctcgcgg atcgtagtta tctacacgac gctgagatag gtgcctcact atactttaga ttgatttaaa tttgataatc tcatgaccaa cccgtagaaa agatcaaagg ttgcaaacaa aaaaaccacc

agagctacca actctttttc 1981 cgaaggtaac tgtccttcta gtgtagccgt

ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc

agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt

gcaacaatta atagactgga tggaggcgga

ccttccggct ggctggttta ttgctgataa

tatcattgca gcactggggc cagatggtaa

ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa

gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt

acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt

aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg

atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2041 atacctcgct 2101 taccgggttg 2161

gggttcgtgc 2221 gcgtgagcta 2281 aagcggcagg 2341 tctttatagt

2401 gtcagggggg 2461

cttttgctgg

2521 ccgtattacc 2581 cgagtcagtg 2641 gtgcggtatt 2701

agttaggcca ctgctaatcc tgttaccagt gactcaagac gatagttacc acacagccca gcttggagcg tgagaaagcg ccacgcttcc gtcggaacag gagagcgcac cctgtcgggt ttcgccacct cggagcctat ggaaaaacgc ccttttgctc acatgttctt gcctttgagt gagctgatac agcgaggaag cggaagagcg tcacaccgca tatggtgcac

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg

aacgacctac accgaactga gatacctaca

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc

cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc

tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa

cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct

tctcagtaca atctgctctg atgccgcata

gttaagccag tatacactcc 10

15

20

2761 ccgccaacac 2821 caagctgtga 2881 cgcgcgaggc

2941 ccatcgaatg

3001 tcagggtggt

3061 cttatcagac

3121 aaaaagtgga

3181 tggcgggcaa

3241 cgtcgcaaat 3301

gctatcgcta ccgctgacgc gccctgacgg ccgtctccgg gagctgcatg agcagatcaa ttcgcgcgcg gtgcaaaacc tttcgcggta gaatgtgaaa ccagtaacgt cgtttcccgc gtggtgaacc agcggcgatg gcggagctga acagtcgttg ctgattggcg tgtcgcggcg attaaatctc

tgtcgatggt agaacgaagc 3361 ggcgtcgaag cgcaacgcgt cagtgggctg 3421 atcattaact

cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa

aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca

tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat

tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct

aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg

attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac

ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc

gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg

cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg

atccgctgga tgaccaggat gccattgctg

tggaagctgc ctgcact aat

Claims (14)

1. Plasmideo de DNA compreendendo um gene de resistência à canamicina caracterizado pelo fato de que: a. o gene de resistência à canamicina compreende a seqüência promotora SEQ ID NO: 1 e/ou um códon de iniciação TTG, b. o gene de resistência à canamicina não compreende o promotor da SEQ ID NO: 2, o promotor da SEQ ID NO: 3 e/ou um sinalizador terminal de transcrição, cuja expressão do gene de resistência à canamicina é reduzida quando comparada a um gene de resistência compreendendo o promotor de SEQ ID NO: 2, o promotor de SEQ ID NO: 3 e/ ou um sinalizador terminal de transcrição.

2. Plasmideo de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão reduzida do gene de resistência à canamicina resulta em maior rendimento do plasmideo e maior estabilidade do plasmídeo quando comparado ao plasmideo de DNA compreendendo o gene de resistência à canamicina compreendendo o promotor de SEQ ID NO: 2, o promotor de SQ ID NO: 3 e/ou um sinalizador de terminal de transcrição.

3. Plasmideo de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene de resistência à canamicina compreende um promotor de SEQ ID NO: 1.

4. Plasmídeo de DNA, de acordo co qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 3, caracterizado pelo fato de que o gene de resistência à canamicina compreende o códon de iniciação TTG.

5. Plasmideo de DNA, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o plasmideo de DNA é pLLlO, pLL14, pLL16 ou PLL18.

6. Plasmideo de DNA compreendendo gene de resistência à canamicina caracterizado pelo fato de que um elemento de transposição é inserido entre o gene promotor de resistência à canamicina e a iniciação da tradução, por isso resultando em expressão reduzida do gene de resistência à canamicina.

7. Plasmideo de DNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão reduzida do gene de resistência à canamicina resulta em maior rendimento de plasmideo e maior estabilidade de plasmideo quando comparado com plasmideo de DNA compreendendo gene de resistência à canamicina não tendo um elemento de transposição inserido entre o gene promotor de resistência à canamicina e a iniciação da tradução.

8. Formulação para distribuição e expressão de um antigeno, epitopo, imunógeno, peptideo ou polipeptidio de interesse caracterizada pelo fato de compreender o plasmídeo de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6 e 7 e um carreador, veiculo ou excipiente veterinária ou farmaceuticamente aceitável.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o carreador, veiculo ou excipiente facilita a transfecção e/ou melhora a preservação do vetor ou proteína.

10. Formulação, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse é derivado de vírus ou patógeno aviário, bovino, canino, eqüino, felino ou suíno.

11. Método de estimulação de resposta imune em animal caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma dose efetiva da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10 a células do animal e a expressão do antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse nas células.

12. Método para desencadear uma resposta imune em um animal caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma dose efetiva da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10 a células do animal e a expressão do antígeno, epítopo, imunógeno, peptídeo ou polipeptídio de interesse nas células.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 13, caracterizado pelo fato de que o animal é uma ave, um canino, eqüino, felino ou suino.

14. Kit para execução de qualquer um dos métodos de acordo com as reivindicações 11, 12 ou 13 caracterizado pelo fato de compreender o plasmideo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 e instruções para execução do método e qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13.