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DE19848017A1 - Episomal replizierender Vektor zur Expression eines Transgens in Säugerzellen - Google Patents

Episomal replizierender Vektor zur Expression eines Transgens in Säugerzellen

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DE19848017A1
DE19848017A1 DE19848017A DE19848017A DE19848017A1 DE 19848017 A1 DE19848017 A1 DE 19848017A1 DE 19848017 A DE19848017 A DE 19848017A DE 19848017 A DE19848017 A DE 19848017A DE 19848017 A1 DE19848017 A1 DE 19848017A1
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Armin Baiker
Juergen Bode
Christian Fetzer
Christoph Piechaczek
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Abstract

Konventionelle Expressionsvektoren für eukaryotische Zellen integrieren entweder zufällig in das Wirtsgenom oder werden nur transient erhalten, was eine gezielte, sichere und effiziente genetische Manipulation erschwert. DOLLAR A In diesem Patentantrag wird ein Vektortyp beschrieben, der extrachromosomal als eigene funktionelle Einheit in höheren Zellen repliziert. Für seine Replikation sind keine viral codierten Proteine notwendig, die zur Transformation der transfizierten Zelle führen könnten. Dieser Vektortyp stellt deshalb einen Prototyp für eine sichere, reproduzierbare und effiziente Genexpression in tierischen Zellen und Organismen dar.

Description

Die Erfindung beinhaltet einen Expressionsvektor, der für Forschungszwecke, für die Expression pharmazeutisch und medizinisch relevanter Proteine, für die Herstellung transgener Tiere und allem voran als "Shuttle-Vektor" für die Gentherapie Verwendung finden und sowohl in Eschericha coli als auch in eukaryotischen Systemen propagiert werden kann.
Der aktuelle Stand der Technik ist aus mehreren Gründen unbefriedigend (1, 2, 3). Die bisher zur Verfügung stehenden Expressionsvektoren (virale, integrierende und transiente Vektoren) haben erhebliche Nachteile: virale Vektoren benötigen für ihre Stabilität und Replikation ein oder mehrere in trans wirkende Virusproteine, welche eine Immunantwort auslösen oder zellimmortalisierend wirken können (4, 5). Ansätze mit integrierenden Vektoren können zu einer zufälligen Integration in das Wirtsgenom führen und somit zu Insertionsmutagenese oder "Silencing", wodurch eine kontrollierte Expression eines Transgens erschwert wird. Auch bei transienten Expressionsvektoren sind Integration und Transformation möglich. Außerdem sind diese nicht stabil, was eine nur zeitlich begrenzte Expression des Transgens erlaubt.
Die Lösung der Aufgabe besteht in folgendem: Es sollen virale, die für in trans wirkende Faktoren codierenden Sequenzen, die für die Funktion eines viralen "origin of replication" (das sind definierte essentielle DNS-Sequenzen, an denen die Replikation der DNS startet (6)) durch S/MAR-Sequenzen (das sind definierte für die Struktur und Funktion des eukaryotischen Chomosoms essentielle DNS-Sequenzen (7)) ersetzt werden, bzw. kartierte eukaryotische "origins of replication" mit diesen Sequenzen erweitert werden. Dadurch wird ihre Funktionsfähigkeit in Plasmiden gewährleistet.
Diese Vorgehensweise bietet folgende Vorteile:
Das Expressionssystem beruht ausschließlich auf chromosomalen Elementen bzw. auf viralen "origins of replication", ohne daß deren transaktivierende Faktoren für ihre Funktion benötigt werden. Dieses System repliziert episomal in eukaryotischen Zellen. Daher findet weder Insertionsmutagenese oder Silencing noch eine Zellimmortalisation statt, und das Auslösen einer Immunantwort durch Expression von Virusproteinen unterbleibt. Desweiteren ist eine gute Handhabbarkeit durch die vergleichsweise geringe Größe des Vektors, eine gute Reproduzierbarkeit und eine permanente Genexpression gewährleistet. Eine Möglichkeit zur Regulation der Genexpression ist durch Wahl unterschiedlich starker Promotoren bzw. die Wahl zell- und gewebstypspezifischer Regulationssequenzen zu erreichen.
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Beispiel Episomal replizierender Vektor für CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) zur Expression eines bestimmten Transgens
Das eukaryotische Virus SV40 (Simian Virus) repliziert episomal in Affenzellen und in einigen Säugerzellen und Zellinien. Dazu benötigt das Virus das sogenannte "große T- Antigen" für sein Bestehen in der Wirtszelle. Die Funktionen des T-Antigens sind für die Replikation des Virus in der Zelle von entscheidender Bedeutung. Das große T-Antigen bindet an die virale DNS im Bereich des Origin of Replication, und leitet dort dessen Replikation ein. Neben diesen für das Virus wichtigen Aktivitäten beeinflusst das große T-Antigen aber auch zelluläre Funktionen. Es bindet sich unter anderem an Proteine, die an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind (Cyclin, Tubulin, cdc2). Letzteres führt zur Transformation und Immortalisation der Zelle.
Im hergestellten Vektor wurde das Gen für das große T-Antigen entfernt und durch Scaffold/Matrix Attached Regions (S/MARs) ersetzt.
Folgende Sequenzelemente sind enthalten:
  • - SV40 Origin of Replication (135 Basenpaare) für die Propagierung in Eukaryoten
  • - Kanamycin-Resistenzgen (1399 Basenpaare) für die Selektion sowohl in Eschericha coli als auch in Eukaryoten (vermittelt Resistenzen gegen Kanamycin bzw. Geneticin)
  • - pUC-Plasmid Origin of Replication (643 Basenpaare) für die Propagierung in Eschericha coli
  • - Matrix Attached Region (5'-Region des humanen Interferon β-Gens, 1984 Basenpaare (8)) für die Propagierung in Eukaryoten.
Schematische Karte des Vektors:
Der Vektor wurde mit der Methode der Elektroporation in CHO-Zellen eingebracht. Die Zellen, die das Konstrukt nicht aufgenommen hatten, wurden in einem anschließenden Selektionsverfahren mit dem Antibiotikum Geneticin abgetötet.
Die überlebenden Zellen sollten auf Grund ihrer Unempfindlichkeit gegenüber des Antibiotikums den Vektor tragen.
Vektoren, die entweder nur den SV40 Origin of Replication, oder nur eine Matrix Attached Region-Sequenzen enthalten, integrieren zufallsmäßig in das Genom (Lit!!). Dagegen führt eine Kombination dieser beiden Elemente zu einer stabilen episomalen Replikation des Konstrukts. Als experimentelle Hinweise für die episomale Natur gelten:
  • - die Restriktionsanalyse der isolierten episomalen DNS (aus einem HIRT-Extrakt (9)) zeigte dasselbe Ergebnis wie der eingesetzte Vektor.
  • - durch Transformation der isolierten episomalen DNS in Escherichia coli konnte der Vektor nachgewiesen werden.
  • - auch durch Transformation der isolierten episomalen DNS in CHO-Zellen wurde der Vektor nachgewiesen.
In CHO-Zellen, die ohne Selektionsdruck - also ohne Antibiotikum - gehalten wurden, ist der Vektor über mindestens hundert Generationen stabil.
Zusammenfassend ist zu sagen, daß mit diesem Konstrukt ein Instrument vorliegt, das die Expression eines Transgens erlaubt, ohne daß virus-codierte, in trans wirkende Faktoren, benötigt werden.
Literatur
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Claims (1)

  1. Geschützt werden sollen alle episomal replizierenden Vektoren, die aus einer Kombination von definierten eukaryotischen Origins of Replication (die aus eukaryotischen Zellen oder aus eukaryotischen Viren isoliert worden sind) und Scaffold/Matrix Attached Region-Sequenzen (S/MAR) bestehen.
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