BRPI0620316A2

BRPI0620316A2 - formulações de proteìnas com viscosidades reduzida e seus usos

Info

Publication number: BRPI0620316A2
Application number: BRPI0620316-7A
Authority: BR
Inventors: Nicholas W Warne; Pilarin E Nichols; Paulo J Loureiro
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2011-11-08
Also published as: US7390786B2; AU2006330858A1; JP5405122B2; CA2634131C; CA2634131A1; US7758860B2; CN101378782A; US20070172479A1; US20110027292A1; WO2007076062A3; EP1962907A2; JP2009521482A; WO2007076062A2; US20080160014A1

Abstract

FORMULAçõES DE PROTEìNAS COM VISCOSIDADE REDUZIDA E SEUS USOS. A invenção fornece formulações de proteínas e métodos para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína. O método para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína compreende adicionar um a- gente redutor de viscosidade, tal como cloreto de cálcio ou cloreto de mag- nésio à formulação de proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- ÇÕES DE PROTEÍNAS COM VISCOSIDADE REDUZIDA E SEUS USOS".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

O campo técnico da invenção refere-se a formulações de proteí- nas, e mais particularmente, formulações de proteínas com viscosidade re- duzida.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de pa- tente provisório n2 de série 60/752660, depositado em 21 de dezembro de 2005, que é aqui incorporado como referência em sua totalidade. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Estima-se que mais de 371 novos medicamentos baseados em biotecnologia estão em desenvolvimento na indústria. Tais medicamentos baseados em biotecnologia incluem proteínas terapêuticas tais como enzi- mas, receptores solúveis, ligantes, proteínas do sangue, e anticorpos mono- clonais. A terapia baseada em proteínas, especialmente a terapia baseada em anticorpos monoclonais, tornou-se um método importante para tratar do- enças tais como câncer, doenças alérgicas, asma, e transplante de órgãos. No final de 2003, quatorze terapias baseadas em anticorpos tinham sido a- provadas pela Food and Drug Administration para tratar diferentes doenças humanas.

A terapia baseada em anticorpos é usualmente administrada em uma base regular e requer dosagens de vários mg/kg por injeção. A injeção subcutânea é uma via de administração típica destas terapias. Por causa dos pequenos volumes usados para injeção subcutânea (usualmente 1,0 mL-1,2 mL), para terapias com anticorpos em altas doses, esta via de admi- nistração requer formulações de proteínas com altas concentrações (por e- xemplo, 50 mg/mL-300 mg/mL).

As altas concentrações de proteínas apresentam desafios refe- rentes à estabilidade física e química da proteína, e dificuldade com fabrica- ção, estocagem, e distribuição da formulação de proteína. Um problema é a tendência de as proteínas formarem pârticulados durante o processamento e/ou estocagem, o que torna difícil a manipulação durante o processamento adicional. Para tentar obviar este problema, tensoativos e/ou açúcares têm sido adicionados às formulações de proteínas. Embora os tensoativos e a- çúcares possam reduzir o grau de formação de particulados de proteínas, eles não tratam de outro problema associado à manipulação e administração de formulações concentradas de proteínas, isto é, visçosidade aumentada. De fato, os açúcares podem intensificar as interações intermoleculares den- tro de uma protein ou entre proteínas e aumentar a visçosidade da formula- ção de proteína.

A visçosidade aumentada de formulações de proteínas tem rami- ficações negativas desde o processamento até a distribuição do fármaco para o paciente. Conseqüentemente, há uma necessidade nessas técnicas de desenvolver formulações de proteínas com concentrações relativamente altas, com viscosidades adequadamente baixas, que sejam apropriadas para fabricação, estocagem e administração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O presente pedido de patente refere-se a formulações de proteí- nas que têm visçosidade reduzida em comparação com uma formulação de proteína correspondente que não inclui um agente redutor de visçosidade em uma concentração apropriada, e métodos para fabricar tais formulações de proteínas que têm visçosidade reduzida (formulações com visçosidade reduzida).

Em um aspecto, a invenção refere-se a métodos para reduzir a visçosidade de uma formulação de proteína, adicionando um agente redutor de visçosidade a uma formulação de proteína, reduzindo desta forma a vis- çosidade da formulação de protein em comparação com uma formulação de proteína que carece do agente redutor de visçosidade. Em uma modalidade, o método envolve determinar a visçosidade de de uma formulação de prote- ína antes da adição de um agente redutor de visçosidade. Em outra modali- dade, o método envolve determinar a visçosidade de uma formulação de proteína depois da adição de um agente redutor de visçosidade. Em ainda outra modalidade, o método envolve determinar a visçosidade de uma for- mulação de proteína antes e depois da adição de um agente redutor de vis- cosidade. Em certas modalidades, o agente redutor de viscosidade reduz a viscosidade da formulação de proteína em pelo menos 5% em comparação com a viscosidade da formulação formulada sem o agente redutor de visco- sidáde.

Em algumas modalidades, o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. O agente redutor de viscosidade é adicionado em concentrações baixas de modo a não afetar negativamente a formulação de proteína. O agente redutor de viscosidade é adicionado ge- ralmente a uma formulação de proteína até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente redu- tor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína até uma con- centração final entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM. Em certas modalida- des, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de pro- teína até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 20 mM. Em certas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína até uma concentração final entre 0,5 mM e 14 mM. Em outra modalidade, a proteína é uma anticorpo, uma protein de fusão de Ig, um receptor, um ligante, um fator de transcrição, uma enzima, ou um fragmento biologicamente ativo deles. Em algumas modalidades, a proteína é um anticorpo antimiostatina, um anticorpo anti-IL-12, ou um anticorpo anti- IL-13.

Em outro, aspecto, a invenção refere-se a uma formulação de proteína com viscosidade reduzida. A formulação de proteína com viscosi- dade reduzida inclui uma proteína, um agente redutor de viscosidade, e um tampão. Em algumas modalidades, o agente redutor de viscosidade é clore- to de cálcio ou cloreto de magnésio. O agente redutor de viscosidade é adi- cionado geralmente a uma formulação de proteína até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína até uma concentração final entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM. Em cer- tas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formu- lação de proteína até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 15 mM. Em certas outras modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína até uma concentração final entre 0,5 mM e 14 mM. Quando o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína até uma concentração entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM, cloreto de sódio e bifosfato de de sódio não são usados como agentes redutores de viscosidade. O pH da formulação de proteína é geralmente entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em certas modalidades, a pro- teína é um anticorpo, uma proteína de fusção de Ig, um receptor, um ligante, um fator de transcrição, uma enzima, ou um fragmento biologicamente ativo deles. Em certas modalidades, as formulaçãoes de proteínas são fornecidas como kits. Tais kits podem incluir instruções para o uso da formulação de proteína.

Em certas modalidades, a formulação de proteína com viscosi- dade reduzida é uma formulação de anticorpo antimiostatina com viscosida- de reduzida. Em uma modalidade, o anticorpo antimiostatina é um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, o anticorpo antimiostatina é um anticorpo monoclonal humanizado (por exemplo, um anticorpo monoclonal parcialmen- te humanizado ou completamente humanizado). Em certas modalidades, o anticorpo antimiostatina é MYO-022, MYO-028 ou MYO-029. Os anticorpos antimiostatina são usados geralmente em uma concentração entre cerca de 25 mg/mL e cerca de 400 mg/ml_. O agente redutor de viscosidade é adicio- nado geralmente a uma formulação de anticorpo antimiostatina com viscosi- dade reduzida até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicio- nado a um anticorpo antimiostatina até uma concentração final entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM. Em certas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de anticorpo antimiostatina até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 15 mM. Em certas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formula- ção de anticorpo antimiostatina até uma concentração final entre 0,5 mM e 14 mM. Quando o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formu- lação de anticorpo antimiostatina até uma concentração entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM, cloreto de sódio e bifosfato de sódio não são usados com agentes redutores de viscosidade. As formulações de anticorpo antimi- ostatina com víscosidade reduzida têm geralmente um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em uma modalidade, histidina é usada para tamponar uma formulação de anticorpo antimiostatina com viscosidade reduzida. Uma for- mulação de antimiostatina com viscosidade reduzida pode incluir também um ou mais crioprotetores, um ou mais tensoativos, um ou mais antioxidan- tes, ou uma combinação deles. Em algumas modalidades, a formulação an- timiostatina com viscosidade reduzida é uma formulação reconstituída. Os anticorpos antimiostatina podem ser formulados como aqui descrito, como composições farmacêuticas, e usados para tratar distúrbios tais como, po- rém sem limitações, distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, e diabetes Ti- po II. Em certas modalidades, uma formulação de anticorpo antimiostatina com viscosidade reduzida é fornecida como um kit. Tais kits podem incluir instruções para o uso da formulação de anticorpo.

Em certas modalidades, a formulação de proteína com viscosi- dade reduzida é uma formulação de anticorpo anti-IL-12 com viscosidade reduzida. Em uma modalidade, o anticorpo anti-IL-12 é um anticorpo mono- clonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-IL-12 é um anticorpo monoclo- nal humanizado (por exemplo, um anticorpo monoclonal parcialmente huma- nizado ou completamente humanizado). Em certas modalidades, o anticorpo anti-IL-12 é J695. Os.anticorpos anti-IL-12 são usados geralmente em uma formulação em uma concentração entre cerca de 25 mg/mL e cerca de 400 mg/mL. Um agente redutor de viscosidade é adicionado geralmente a uma formulação de anticorpo anti-IL-12 até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente redutor de vis- cosidade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-12 a concen- tração final dentre cerca de 5 mM and cerca de 25 mM. Em certas modalida- des, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de an- ticorpo anti-IL-12 até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 15 mM. Em certas outras modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-12 até uma concentração final entre 0,5 mM e cerca de 14 mM. Quando o agente redutor de viscosi- dade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-12 até uma con- centração entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM, cloreto de sódio e bifos- fato de sódio não são usados como agentes redutores de viscosidade. As formulações de anticorpo anti-IL-12 com viscosidade reduzida têm geralmen- te um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em certas modalidades, histidina é usada como um tampão em uma formulação de anticorpo anti-IL-12 com viscosidade reduzida. As formulações de anticorpo anti-IL-12 com viscosida- de reduzida podem incluir também um ou mais crioprotetores, um ou mais tensoativos, um ou mais antioxidantes, ou combinações deles. Em algumas modalidades, a formulação anti-IL-12 com viscosidade reduzida é uma for- mulação reconstituída. Os anticorpos anti-IL-12 podem ser formulados como aqui descrito para uso como composições farmacêuticas e usadas para tra- tar distúrbios tais como, porém sem limitações, artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase, e artrite psoriática. Em certas modalidades, uma formula- ção de anticorpo anti-IL-12 com viscosidade reduzida é fornecida como parte de um kit. Tais kits podem incluir instruções para uso da formulação de anti- corpo anti-IL-12.

Em certas modalidades, a formulação de proteína com viscosi- dade reduzida é uma formulação de anticorpo anti-IL-13. Em uma modalida- de, o anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, o anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo monoclonal humanizado (por exemplo, parcialmente humanizado ou completamente humanizado). Em certas moda- lidades, o anticorpo anti-IL-13 é IMA-638. Os anticorpos anti-IL-13 são usa- dos geralmente em uma formulação em uma concentração entre cerca de 25 mg/mL e cerca de 400 mg/mL. Um agente redutor de viscosidade é adicio- nado geralmente para fabricar uma formulação de anticorpo anti-IL-13 com viscosidade reduzida até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cer- ca de 50 mM. Em algumas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-13 até uma cocentração final entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM. Em certas modalidades, o a- gente redutor de viscosidade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-13 até uma concentração final entre cerca de 1 mM e cerca de 15 mM. Em certas outras modalidades, o agente redutor de viscosidade é adi- cionado a umá formulação de anticorpo anti-IL-13 até uma concentração final entre 0,5 mM e cerca de 14 mM. Quando o agente redutor de viscosi- dade é adicionado a uma formulação de anticorpo anti-IL-13 até uma con- centração entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM, cloreto de sódio e bifos- fato de sódio não são usados como agentes redutores de viscosidade. As formulações de anticorpo anti-IL-13 com viscosidade reduzida têm geralmen- te um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em uma modalidade, histidina é usada como um tampão em uma formulação de anticorpo anti-IL-13 com viscosidade reduzida. Uma formulação de anticorpo anti-IL-13 com viscosi- dade reduzida pode incluir também um ou mais crioprotetores, um ou mais tensoativos, um ou mais antioxidantes, ou combinações deles. Em algumas modalidades, a formulação anti-IL-13 com viscosidade reduzida é uma for- mulação reconstituída. Os anticorpos anti-IL-13 podem ser formulados em uma formulação com viscosidade reduzida como uma composição farma- cêutica e usado para tratar distúrbios tais como, porém sem limitações, dis- túrbios respiratórios (por exemplo, asma); distúrbios atópicos (por exemplo, rinite alérgica); condições inflamatórias e/ou auto-imunes da pele (por exem- pio, dermatite atópica), distúrbios gastrointestinais (por exemplo, doença in- flamatória do intestino (IBD)), bem como distúrbios fibróticos e cancerosos. Em certas modalidades, uma formulação de anticorpo anti-IL-13 com visco- sidade reduzida é fornecida como um kit. Tais kits podem incluir instruções para uso da formulação de anticorpo anti-IL-13 com viscosidade reduzida.

A menos que diferentemente definido, todos termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que aqueles entendi- dos comumente pelos versados nas técnicas às quais esta invenção perten- ce. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui des- critos possam ser usados na prática ou nos testes da presente invenção, os métodos e materiais apropriados estão descritos abaixo. Todas publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas como referência em sua totalidade. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são meramente ilustrativos e não se intenciona que sejam limitativos.

Outras características e vantagens da invenção ficarão eviden- tes a partir da descrição detalhada, dos desenhos e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico que representa os resultados de experi- mentos conduzidos para determinar o efeito de aumentar as concentrações de vários sais sobre a viscosidade de uma formulação de anticorpo antimios- tatina (MYO-029).

A Figura 2 é um gráfico de barras que representa os resultados de experimentos conduzidos para determinar o efeito de aumentar as con- centrações de cloreto de cálcio sobre a viscosidade de uma formulação de anticorpo antimiostatina (MYO-028).

A Figura 3 é um gráfico que representa os resultados de experi- mentos conduzidos para determinar o efeito de aumentar as concentrações de cloreto de cálcio sobre a viscosidade de uma formulação de anticorpo anti-IL-13 (IMA-638).

A Figura 4A é um gráfico de barras que representa os resultados de experimentos conduzidos para testar o efeito da degradação induzida por congelamento/descongelamento do anticorpo antimiostatina (MYO-029) na presença ou ausência de cloreto de cálcio. A degradação foi avaliada pela recuperação de proteína, determinada medindo a absorvância a 280 nm.

A Figura 4B é um gráfico de barras que representa os resultados de experimentos conduzidos para testar o efeito da degradação induzida por congelamento/descongelamento do anticorpo antimiostatina (MYO-029) na presença ou ausência de cloreto de cálcio. A degradação foi avaliada pela porcentagem de formação de espécies de alto peso molecular (% de HMW), determinada por cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SEC-HPLC).

A Figura 5A é um gráfico de barras que representa os resultados de experimentos conduzidos para testar o efeito da presença ou ausência (controle) de cloreto de cálcio sobre a estabilidade do líquido do anticorpo antimiostatina (MYO-029) submetido à estocagem a 40 °C por até sete dias. A estabilidade do líquido do anticorpo MYO-029 foi determinada medindo a absorvância a 280 nm.

A Figura 5B é um gráfico de barras que representa os resultados de experimentos conduzidos para testar o efeito da presença ou ausência (controle) de cloreto de cálcio sobre a estabilidade do líquido de um anticor- po antimiostatina (MYO-029) sbmetido à estocagem a 40 °C por até sete dias. A estabilidade do líquido do anticorpo MYO-029 foi determinada me- dindo a formação de espécies de alto peso molecular (HMW), determinada por SEC-HPLC.

A Figura 6 é uma representação da seqüência de aminoácidos da cadeia pesada (SEQ ID NO:1) e da cadeia leve (SEQ ID NO:2) do anti- corpo MYO-028.

A Figura 7 é uma representação da seqüência de amino ácidos da cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 4) do anti- corpo MYO-029.

A Figura 8 é uma representação da seqüência de aminoácidos da cadeia pesasda (SEQ ID NO: 5) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 6) do anti- corpo J695.

A Figura 9 é uma representação da seqüência de aminoácidos cada cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e da cadeia leve (SEQ ID NO: 8) do anticorpo IMA-638. O.último resíduo de aminoácido codificado pela seqüên- cia de DNA da cadeia pesada, Lys448, é observado na forma madura secre- tada de IMA-638 apenas em pequenas quantidades e é presumivelmente removido da massa total do anticorpo monoclonal durante o processamento intracelular por proteases celulares de CHO. Portanto, o terminal carbóxi da cadeia pesada de IMA-638 é Gly447. O processamento da lisina do terminal carbóxi foi observado em anticorpos recombinantes e derivados do plasma e não parece influenciar sua função.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A viscosidade de uma formulação de proteína tem implicações para a estabilidade, processamento, estocagem, e, no caso daquelas usa- das como fármacos, a distribuição do fármaco da formulação de proteína

para um paciente. Tais implicações incluem, porém sem limitações, a con- centração e troca de tampão por intermédio de ultrafiltração e diafiltração (o fluxo através da membrana pode diminuir com a viscosidade crescente, re- sultando desta forma em tempos de processamento mais longos), filtração estéril (leva mais tempo para filtrar soluções viscosas, e em alguns casos, uma solução muito viscosa não passará através das membranas com poros muito pequenos, por exemplo, membranas de 0,22 pm), manuseio de amos- tras (por exemplo, dificuldade para pipetar e encher uma seringa), recupera- ção a partir do frasco de estocagem depois da reconstituição, estabilidade, e passagem através de agulhas para administração subcutânea ou intramus- cular.

São fornecidos aqui métodos para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína, que foram identificados. Os métodos são apropria- dos para preparar formulações de proteínas que têm viscosidade reduzida ("formulações com viscosidade reduzida" ou "formulações de proteínas com viscosidade reduzida"). Estas formulações de proteínas com viscosidade reduzida incluem uma proteína de interesse e um agente redutor de viscosi- dade.

Métodos para Reduzir a Viscosidade de uma Formulação de Proteína

O termo "viscosidade", como aqui utilizado, pode ser "viscosida- de cinemática" ou "viscosidade absoluta". A "viscosidade cinemática" é uma medida do fluxo resistivo de um fluido sob a influência da gravidade. Quando dois fluidos de igual volume são colocados em viscosímetros capilares idên- ticos e deixados escoar por gravidade, um fluido viscoso leva mais tempo do que um fluido menos viscoso para escoar através do capilar. Caso um fluido leve 100 segundos para completar seu escoamento e outro fluido leve 200 segundos, o segundo fluido é duas vezes mais viscoso que o primeiro em uma escala de viscosidade cinemática. A "viscosidade absoluta", algumas vezes denominada "dinâmica" ou "viscosidade simples", é o produto da vis- cosidade cinemática e da densidade do fluido. A dimensão da viscosidade cinemática é L2/T, onde L é um comprimento e T é um tempo. Comumente, a viscosidade cinemática é expressa em centistokes (cSt). A unidade do Sis- tema Internacional de Unidades (SI) de viscosidade cinemática é mm2/s, o que corresponde a 1 cSt. A viscosidade absoluta é expressa em unidades de centipoise (cP). A unidade do Sl de viscosidade absoluta é milipascal- segundo (mPa-s), onde 1 cP=1 mPa-s.

A viscosidade de uma formulação de proteína pode ser reduzida pela adição de um agente redutor de viscosidade à formulação. Em alguns casos, o agente redutor de viscosidade é adicionado em uma concentração relativamente baixa. A viscosidade de uma formulação que compreende um agente redutor de viscosidade é reduzida em comparação com a viscosida- de de uma formulação que carece do agente redutor de viscosidade. Quan- do a adição do agente redutor de viscosidade resulta em um abaixamento da viscosidade da formulação em comparação com uma formulação correspon- dente que não inclui o agente redutor de viscosidade ou comparado com uma formulação que não inclui o agente redutor de viscosidade em uma con- centração selecionada, a formulação que contém o agente redutor de visco- sidade (por exemplo, em uma concentração selecionada), a formulação é uma formulação com viscosidade reduzida. Em certas formulações com vis- cosidade reduzida, o agente redutor de viscosidade reduz geralmente a vis- cosidade de uma formulação de proteína em cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, e cerca de 90%, em comparação com uma formulação de proteína sem o a- gente redutor de viscosidade ou que contém quantidades inferiores dele. Em alguns casos, o agente redutor de viscosidade reduz a viscosidade de uma formulação de proteína em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, e pelo menos 90%, em compara- ção com a viscosidade de uma formulação de protein sem o agente redutor de viscosidade ou que contém quantidades inferiores dele. Em certas moda- lidades, a viscosidade de uma formulação de proteína é medida antes da adição do agente redutor de viscosidade. Em outras modalidades, a viscosi- dade de uma formulação de proteína é medida depois da adição do agente redutor de viscosidade. Tais medições podem ser feitas horas (por exemplo, 1-23 horas), dias (por exemplo, 1-10 dias), semanas (por exemplo, 1-5 se- manas), ou meses (por exemplo, 1-12 meses), ou anos (por exemplo, 1-2 anos, 1-3 anos) depois da adição de um agente redutor de viscosidade a uma formulação de proteína. Em ainda outras modalidades, a viscosidade da formulação de proteína é medida antes e depois da adição do agente re- dutor de viscosidade. Os métodos para medir a viscosidade são bem conhe- cidos nessas técnicas e incluem, por exemplo, usar um viscosímetro capilar ou um reômetro de placa e cone.

Em uma modalidade, o agente redutor de viscosidade é um sal tal como cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, fosfato de sódio, ou cloridra- to de arginina. No método aqui descrito, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteína até uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e cerca de 100 mM. Em uma modalidade, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteína até uma concentração final concentration entre cerca de 5 mM e cerca de 20 mM. Em outra modali- dade, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteí- na até uma concentração final entre 0,5 mM e 14 mM. Em certas modalida- des, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteína até uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e não maior do que 20 mM, ou 19 mM, ou 18 mM, ou 17 mM, ou 16 mM, ou 15 mM, ou 14 mM, ou 13 mM, ou 12 mM, ou 11 mM, ou 10 mM. Geralmente, quando o agente re- dutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteína até uma concen- tração final entre cerca de 0,5 mM e cerca de 25 mM, o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, mas não cloreto de sódio ou bifosfato de sódio. Em certas modalidades, o agente redutor de vis- cosidade é adicionado em concentrações baixas de modo a não afetar nega- tivamente a formulação de proteína. Por exemplo, em concentrações de clo- reto de cálcio ou cloreto de magnésio 20 mM ou maiores, as proteínas po- dem formar um gel em temperaturas baixas de estocagem (por exemplo, 2-8 °C). Conseqüentemente, uma concentração de um agente redutor de visco- sidade é selecionada geralmente para que nela a viscosidade seja reduzida na temperatura de estocagem selecionada da formulação com viscosidade reduzida. Formulações

A composição de uma formulação de proteína com viscosidade reduzida é determinada considerando vários fatores. Estes fatores incluem, porém sem limitações, a natureza da proteína (por exemplo, receptor, anti- corpo, proteínas de fusão de Ig, enzima); a concentração da proteína; a faixa desejada do pH; como a formulação de proteína vai ser estocada (por e- xemplo, a temperatura); o período de tempo durante o qual a formulação de proteína vai ser estocada; e como a formulação vai ser administrada a um paciente. A seleção de um agente redutor de viscosidade apropriado é feita baseando-se, em parte, nesses requisitos para a proteína na formulação. Proteínas

A proteína de interesse a ser formulada inclui, porém sem Iimita- ções, proteínas tais como miostatina/GDF-8; interleucinas (ILs), por exem- pio, IL-1 a IL-15; hormônios do crescimento tais como o hormônio do cresci- mento humano e o hormônio do crescimento bovino; fator Iiberador do hor- mônio de crescimento; hormônio paratireóideo; hormônio estimulador da ti- reóide; uricase; bicunina; bilirrubina oxidase; subtilisina; lipoproteínas; a-1- antitripsina; cadeia de insulina A; cadeia de insulina B; pró-insulina; hormô- nio estimulador de folículos; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; Fator Vila; Fator VIII, Fator VIIIC; Fator IX; fator tecidual; fator de von Wille- brand; fatores anticoagulantes tais como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou ativador de plasminogênio do teipo tecidual (t-PA); bombazina; trombina; plasmina; miniplasmina; microplasmina; fator de necrose tumoral α e β; en- cefalinase; RANTES (Regulada por Ativação Expressada e Secretada Nor- malmente por Células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1- a); albumina de soro, tal como albumina de soro humano; substância inibidora mulleriana; cadeia de relaxina A; cadeia de relaxina B; pró-relaxina; peptídeo associado à gonadotropina do camundongo; DNase; inibina; activi- na; fator do crescimento endotelial vascular (VEGF); fator de crescimento placentário (PIGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; uma integrina; proteína A ou proteína D; fatores reumatóides; um fator neu- rotrófico tal como o fator neurotrófico derivado de ossos (BDNF), neurotrofi- na-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento nervoso tal como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastos, tais como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformador (TGF), tal como TGF-α e TGF-β, incluindo TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, TGF- β 4, ou TGF-β 5; fator de crescimento semelhante à insulina-i e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral); proteínas Iigantes do fator de cresci- mento semelhante à insulina; proteínas CD, tais como: CD2, CD3, CD4, CD8, CD9, CD19, CD20, CD22, CD28, CD34, e CD45; eritropoietina (EPO); trombopoietina (TPO); fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon tal como interferon-α, -β, e -γ; um fator estimulador de colônias (CSF), por exemplo, M-CSF1 GM-CSF1 e G- CSF; superóxido dismutase; receptores de células T; membros da família de receptores HER, tal como o receptor de EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular, tais como LFA-1, VLA-4, ICAM-1, e VCAM; IgE; antígenos de grupo sangüíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); fator acelerador de decaimento (DAF); um antígeno viral, tais como proteínas HIV gag, env, pol, tat, ou rev; receptores de homing·, a- dressinas; imunoadesinas; e fragmentos biologicamente ativos, ou variantes de qualquer um dos polipeptídeos listados acima. Em algumas formulações, mais do que um tipo de proteína ou fragmento é incluído na formulação.

O termo "fragmento biologicamente ativo" significa um fragmento de uma proteína, que retém pelo menos uma das funções da proteína a par- tir da qual ele é derivado. Um fragmento biologicamente ativo de um anticor- po inclui um fragmento Iigante de antígeno do anticorpo; um fragmento bio- Iogicamente ativo de um receptor inclui um fragmento do receptor que ainda pode se ligar a seu ligante; um fragmento biologicamente ativo de um Iigante inclui a parte de um ligante que ainda pode se ligar a seu receptor; e um fragmento biologicamente ativo de uma enzima inclui a parte da enzima que ainda pode catalisar uma reação catalisada pela enzima de comprimento inteiro. Em uma modalidade, um fragmento biologicamente ativo retém pelo menos cerca de 5% da função da proteína a partir da qual ele é derivado. A função de uma proteína pode ser testada por métodos conhecidos nessas técnicas (por exemplo, testando interações anticorpo/antígeno, testando inte- rações ligante/receptor, testando atividade enzimática, testando atividade transcricional, ou testando interações DNA/proteína). Em alguns casos, o fragmento é um fragmento terapeuticamente útil, que pode, por exemplo, reter certas características da proteína a partir da qual ele é derivado (por exemplo, ligando a um ligante específico), mas não causa resposta celular eliciada pela proteína a partir da qual ele é derivado.

Em certas modalidades, a proteína a ser formulada é um anti- corpo. O anticorpo pode ser um que pode se ligar a uma das proteínas su- pramencionadas. O termo "anticorpo", como aqui utilizado, inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, composições de anticorpos com especi- 1 ficidades de poliepítopos, anticorpos biespecíficos, diacorpos, ou outras pre- parações purificadas de anticorpos e anticorpos recombinantes. Os anticor- pos podem ser anticorpos integrais, por exemplo, de qualquer isótipo (IgG, IgA, IgE, IgM, etc.), ou fragmentos deles, que se ligam ao antígeno de inte- resse. Em um exemplo específico de um anticorpo usado na presente inven- ção, o anticorpo a ser formulado é um anticorpo que tem o isótipo de IgG. Os anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas concencionais ou ou- tras técnicas e os fragmentos podem ser triados quanto à ligação a um antí- geno de interesse. Geralmente, um fragmento de anticorpo compreende a região ligante de antígeno e/ou variável de um anticorpo intacto. Assim sen- do, o termo fragmento de anticorpo inclui segmentos partes clivadas de for- ma proteolítica ou recombinante de uma molécula de anticorpo, que podem se ligar seletivamente a uma proteína selecionada. Os exemplos não- Iimitativos de tais fragmentos proteolíticos e/ou recombinantes incluem Fab, F(ab')2, Fab1, Fv1 e anticorpos de cadeia única (scFv) que contêm um domí- nio V[L] e/ou V[H] unido por um Iigante peptídico. Os scFvs podem ser Iiga- dos de forma covalente ou não-covalente para formar anticorpos que têm dois ou mais sítios de ligação.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclo- nal humanizado. O termo "anticorpo monoclonal humanizado", como aqui utilizado, é um anticorpo monoclonal de uma origem não-humana (recebe- dor) que foi alterado para conter pelo menos um ou mais dos resíduos de aminoácidos encontrados no anticorpo monoclonal humano equivalente (do- ador). Um "anticorpo monoclonal completamente humanizado" é um anticor- po monoclonal de uma origem não-humana que foi alterado para conter to- dos os resíduos de aminoácidos encontrados na região Iigante de antígeno do anticorpo monoclonal humano equivalente. Os anticorpos humanizados podem compreender também resíduos que não são encontrados no anticor- po do recebedor ou no anticorpo do doador. Estas modificações podem ser feitas para refinar e otimizar ainda mais a funcionalidade do anticorpo. Um anticorpo humanizado podem compreender também opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobilina humana (Fc).

Em certas modalidades, um anticorpo usado em uma formulação com viscosidade reduzida é um anticorpo antimiostatina (por exemplo, MYO- 022, MYO-028 (Figura 6), MYO-029 (Figura 7)). Os anticorpos MYO-022, MYO-028, e MYO-029 estão descritos no pedido de Patente n- US 10/688.925 (publicação n- 2004/0142382), que é aqui incorporado como re- ferência. Em ainda outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-IL-12 (por exemplo, J695 (Figura 8)). O anticorpo J695 está descrito na Patente n- US 6.914.128, que é aqui incorporada como referência. Em ainda outra mo- dalidade, o anticorpo é um anticorpo anti-IL-13 (por exemplo, IMA-638 (Figu- ra 9), CAT-354). Os anticorpos anti-IL-13 estão descritos no pedido de Pa- tente n2 US 11/149.309, que é aqui incorporado como referência.

Em algumas modalidades, a proteína a ser formulada é uma pro- teína de fusão. Em uma modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão de imunoglobulina (lg). Em uma modalidade específica, a proteína de fusão compreende a região constante da cadeia pesada de IgG. Em outra modalidade, a proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoáci- dos correspondente às regiões de articulação, CH2 e CH3, da imunoglobuli- na humana, Cy1. Os exemplos de proteínas de fusção de Ig incluem CTLA4 Ig e VCAM2D-lgG. Os métodos para fabricar proteínas de fusão são conhe- cidos nessas técnicas (vide, por exemplo, Patentes n° US 6.887.471 e 6.482.409).

Em certas modalidades, a proteína a ser formulada é uma prote- ína que não inclui um polipeptídeo Fator VII, ou um anticorpo anti-lgE.

Uma formulação com viscosidade reduzida pode conter mais do que uma proteína, conforme necessário, para o tratamento de um distúrbio específico. A proteína ou proteínas adicionais têm tipicamente atividades complementares à(s) outra(s) proteína(s) na formulação, e não afetam ad- versamente a(s) outra(s) proteína(s) na formulação. Por exemplo, pode ser desejável fornecer uma única formulação que contém dois ou mais anticor- pos que se ligam à miostatina; dois ou mais anticorpos que se ligam a IL-12; ou dois ou mais anticorpos que se ligam a IL-13. Além disso, uma formula- ção de proteína pode conter também substâncias não-protéicas que são de uso na utilidade final da formulação de proteína com viscosidade reduzida. Por exemplo, sacarose pode ser adicionada para aumentar a estabilidade e a solubilidade da proteína em solução; e histidina pode ser adicionada para proporcionar capacidade apropriada do tampão. Tais substâncias adicionais podem ser parte de uma formulação de proteína antes da adição de um a- gente redutor de viscosidade ou adicionadas no processo para fabricar uma formulação com viscosidade reduzida.

Em certas modalidades, a proteína a ser formulada é essencial- mente pura e/ou essencialmente homogênea (isto é, substancialmente isen- ta de proteínas contaminantes, etc.) antes do seu uso na formulação. O ter- mo "proteína essencialmente pura" significa uma composição que compre- ende pelo menos cerca de 90% em peso de uma fração da proteína selecio- nada, por exemplo, pelo menos cerca de 95% em peso da fração da proteí- na selecionada. O termo "proteína essencialmente homogênea" significa uma composição que compreende pelo menos cerca de 99% em peso de uma fração da proteína selecionada, excluindo a massa de vários estabiliza- dores e água em solução.

Concentração da Proteína ém uma Formulação de Baixa Viscosidade

A concentração da proteína em uma formulação com viscosida- de reduzida é dependente do uso final da formulação. As concentrações de proteína nas formulações aqui descritas são geralmente entre cerca de 10 mg/mL e cerca de 300 mg/mL, por exemplo, entre cerca de 10 mg/mL e cer- ca de 100 mg/mL, cerca de 25 mg/mL e cerca de 100 mg/mL, cerca de 50 mg/mL e cerca de 100 mg/mL, cerca de 75 mg/mL e cerca de 100 mg/mL, cerca de 100 mg/mL e cerca de 200 mg/mL, cerca de 125 mg/mL e cerca de 200mg/mL, cerca de 150 mg/mL e cerca de 200 mg/mL, cerca de 200 mg/mL e cerca de 300 mg/mL, e cerca de 250 mg/mL e cerca de 300 mg/mL. Por exemplo, as concentrações de proteína nas formulações aqui descritas podem ser entre 10 mg/mL e 300 mg/mL, por exemplo, entre 10 mg/mL e 100 mg/mL, entre 25 mg/mL e 100 mg/mL, entre 50 mg/mL e 100 mg/mL, entre 75 mg/mL e 100 mg/mL, entre 100 mg/mL e 200 mg/mL, entre 125 mg/mL e 200mg/mL, entre 150 mg/mL e 200 mg/mL, entre 200 mg/mL e 300 mg/mL, e entre 250 mg/mL e 300 mg/mL. O termo "entre" pre- tende ser inclusivo das concentrações mínimas e máximas.

As formulações de proteínas com viscosidade reduzida podem ser usadas com propósitos terapêuticos. Conseqüentemente, a concentra- ção da proteína em uma formulação usada para uma aplicação terapêutica é determinada baseado no fornecimento da proteína em uma dosagem e vo- lume tolerado e de valor terapêutico para o paciente. Caso uma formulação com viscosidade reduzida vá ser administrada por injeção, a concentração de proteína dependerá do volume da injeção (usualmente, 1,0 mL-1,2 mL). As terapias baseadas em proteínas podem requerer vários mg/kg de dosa- gem por semana, por mês, ou por vários meses. Conseqüentemente, caso uma proteína vá ser fornecida a 2-3 mg/kg de peso corporal do paciente, e um paciente mediano pese 75 kg, 150 mg-225 mg da proteína precisarão ser distribuídos em um volume de injeção de 1,0 mL-1,2 mL. Alternativamente, a formulação é fornecida em uma concentração apropriada para distribuição em mais do què um local de injeção por tratamento.

À medida que a concentração da proteína em uma formulação aumenta, a viscosidade da formulação de proteína possivelmente também aumenta. A viscosidade aumentada da formulação torna a formulação mais difícil de administrar. Conseqüentemente, há uma necessidade de diminuir a viscosidade de formulações de proteína quando a viscosidade aumentada dificulta sua utilização.

Agentes Redutores de Viscosidade

Descobriu-se que adicionar concentrações relativamente baixas de certos agentes redutores de viscosidade a uma formulação de proteína reduz a viscosidade da formulação de proteína. O termo "agente redutor de viscosidade", como aqui utilizado, inclui qualquer agente que reduz a visco- sidade de uma formulação de proteína em comparação com uma formulação de proteína que não contém, ou contém uma quantidade menor do agente redutor de viscosidade. Por exemplo, um agente redutor de viscosidade re- duz geralmente a viscosidade de uma formulação de proteína em cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 90%, ou cerca de 95% em comparação com a viscosidade da formulação de proteína sem, ou que con- tém quantidades inferiores de um agente redutor de viscosidade. Por exem- plo, um agente redutor de viscosidade reduz geralmente a viscosidade da formulação de protein em 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, ou 95% em comparação com a viscosidade de uma formulação de proteína sem o agente redutor de viscosidade ou que contém quantidades inferiores dele. Os exemplos não-limitativos de agentes redutores de viscosidade in- cluem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, cloridrato de arginina, cloreto de sódio, tiocianato de sódio, tiocianato de amônio, sulfato de amônio, fosfa- to de sódio, e cloreto de amônio.

Em uma modalidade, o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio. Em outra modalidade, o agente redutor de viscosidade é cloreto de magnésio. Um uma modalidade alternativa, mais do que um agente redu- tor de viscosidade é adicionado a uma formulação de proteína.

Um agente redutor de viscosidade é adicionado geralmente a uma formulação de proteína até uma concentração final entre 1 mM e cerca de 150 mM, por exemplo, entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, entre cer- ca de 2 mM e cerca de 40 mM, entre cerca de 3 mM e cerca de 30 mM, en- tre cerca de 4 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 20 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 30 mM, entre cerca de 5 mM e cerca de 40 mM, e entre cerca de 5 mM e cerca de 50 mM. Em certas modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de proteína até uma concentração final menor do que 14 mM, menor do que 13 mM, menor do que 12 mM, menor do que 11 mM, menor do que 10 mM, menor do que 9 mM, menor do que 8 mM, menor do que 7 mM, menor do que 6 mM, menor do que 5 mM, menor do que 4 mM, menor do que 3 mM, ou menor do que 2 mM. Em outras modalidades, o agente redutor de viscosidade é adicionado à formulação de protein até uma concentração final entre 0,5 mM e 14 mM, entre 0,5 mM e 13 mM, entre 0,5 mM e 12 mM, entre 0,5 mM e 11 mM, entre 0,5 mM e 10 mM, entre 0,5 mM e 9 mM, entre 0,5 mM e 8 mM, entre 0,5 mM e 7 mM, entre 0,5 mM e 6 mM, or entre 0,5 mM e 5 mM. Em uma modalidade, o agente redutor de viscosi- dade é cloreto de cálcio em uma concentração final entre cerca de 5 mM e cerca de 20 mM na formulação. Em outra modalidade, o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio em uma concentração final entre 5 mM e cer- ca de 14 mM na formulação. Em outras modalidades, o agente redutor de viscosidade é cloreto de magnésio em uma concentração final entre cerca de 5mM e cerca de 20 mM na formulação. Em outra modalidade, o agente redutor de viscosidade é cloreto de magnésio em uma concentração final entre 5 mM e cerca de 14 mM na formulação.

A viscosidade de uma formulação de proteína pode ser medida por qualquer método apropriado conhecido nessas técnicas, incluindo, por exemplo, o uso de um viscosímetro capilar ou um reômetro de cone e placa. Tampões

O termo "tampão", como aqui utilizado, inclui os agentes que mantêm o pH de uma solução, por exemplo, uma formulação, em uma faixa desejada. O pH de uma formulação como aqui descrita é geralmente entre cerca de pH 5,0 e cerca de 9,0, por exemplo, cerca de pH 5,5 a cerca de 6,5, cerca de pH 5,5 a cerca de 6,0, cerca de pH 6,0 a cerca de 6,5, pH 5,5, pH 6,0, ou pH 6,5. Geralmente, usa-se um tampão que pode manter uma solu- ção em pH 5,5 a 6,5. Os exemplos não-limitativos de tampões que podem ser usados em uma formulação aqui descrita incluem histidina, succinato, gliconato, Tris (trometamol), fosfato, citrato, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato de sódio, acetato de sódio, e cacodilato.

A histidina é um tampão que está tipicamente em formulações com viscosidade reduzida que vão ser administradas por injeção subcutâ- nea, intramuscular, ou peritoneal. A concentração do tampão é entre cerca de 5 mM e 30 mM. Em uma modalidade, o tampão de uma formulação é his- tidina em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM.

Excipientes

Além da proteína, um agente redutor de viscosidade, e tampão, uma formulação com viscosidade reduzida aqui descrita pode conter tam- bém outras substâncias. Tais substâncias incluem, porém sem limitações, crioprotetores, lioprotetores, tensoativos, agentes de massa, antioxidantes, e agentes estabilizadores. Em uma modalidade, uma formulação de proteína com viscosidade reduzida aqui descrita inclui um excipiente selecionado no grupo que cosiste em um crioprotetor, um lioprotetor, um tensoativo, um a- gente de massa, um antioxidante, um agente estabilizador, e combinações deles.

O termo "crioprotetor", como aqui utilizado, inclui agentes que proporcionam estabilidade para a proteína em uma formulação contra as tensões induzidas por congelamento, por exemplo, sendo de preferência excluído da superfície da proteína. Os crioprotetores podem oferecer tam- bém proteção durante a secagem primária e secundária e na estocagem do produto a longo prazo. Os exemplos não-limitativos de crioprotetores inclu- em açúcares, tais como sacarose, glicose, trealose, manitol, manose, e Iac- tose; polímeros, tais como dextrario, hidróxi-etil-amido, e polietilenoglicol; tensoativos, tais como Polissorbatos (por exemplo, PS-20 ou PS-80); e ami- noácidos, tais como glicina, arginina, leucina, e serina. Usa-se geralmente um crioprotetor que apresenta baixa toxicidade em sistemas biológicos. O crioprotetor, caso inluído na formulação, é adicionado geralmente até uma concentração final entre cerca de 0,1% e cerca de 10% (peso/volume), por exemplo, entre cerca de 0,5% e cerca de 10%, entre cerca de 0,5% e cerca de 5%, entre cerca de 0,5% e cerca de 2%, entre cerca de 1% e cerca de 5%, ou entre cerca de 5% e cerca de 10%. Em uma modalidade, o crioprote- tor é sacarose em uma concentração entre cerca de 0,5% e cerca de 10% (peso/volume).

Em uma modalidade, um Iioprotetor é adicionado a uma formu- lação aqui descrita. O termo "Noprotetor", como aqui utilizado, inclui agentes que proporcionam estabilidade para a proteína durante o proceso de seca- gem por congelamento ou desidratação (ciclos de secagem por congelamen- to primária e secundária), por exemplo, disponibilizando uma matriz vítrea amorfa e pela ligação à proteína através de ligação hidrogênio, substituindo as moléculas de água que são removidas durante o processo de secagem. Isto ajuda a manter a conformação da proteína, minimizar a degradação da proteína durante o ciclo de liofilização, e melhorar a estabilidade do produto a longo prazo. Os exemplos não-limitativos de Iioprotetores incluem açúca- res, tais como sacarose ou trealose; um aminoácido, tal como glutamato monossódico, glicina ou histidina não-cristalina; uma metal-amina, tal como betaína; um sal liotrópico, tal como sulfato de magnésio; um poliol, tal como álcoois de açúcares triidroxilados ou mais, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Pluronics; e combinações deles. A quantidade de Iioprotetor adicionada a uma formulação é geralmente uma quantidade que não leva a uma quanti- dade inaceitável de degradação/agregação da proteína quando a formulação de proteína é liofilizada. Quando o Iioprotetor é um açúcar (tal como sacaro- se ou trealose) e a proteína é um anticorpo, os exemplos não-limitativos de concentrações de lioprotetor em uma formulação de proteína com viscosida- de reduzida são entre cerca de 10 mM e cerca de 400 mM, entre cerca de 30 mM e cerca de 300 mM, e entre cerca de 50 mM e cerca de 100 mM.

Em certas modalidades, um tensoativo é incluído em uma formu- lação aqui descrita. O termo "tensoativo", como aqui utilizado, incluí agentes que reduzem a tensão superficial de um líquido por adsorção na interface ar- líquido. Os exemplos de tensoativos incluem, sem limitações, tensoativos não-iônicos, tais como Polissorbatos (por exemplo, Polissorbato 80 ou Polis- sorbato 20); Poloxâmeros (por exemplo, Poloxamer 188); Triton® (por exem- plo, Triton®X-100); dodecil-sulfato de sódio (SDS); octal-glicosídeo de sódio; lauril-sulfobetaína; miristil-sulfobetaína; linoleil-sulfobetaína; estearil- sulfobetaína; lauril-sarcosina; miristil-sarcosina; linoleil-sarcosina; estearil- sarcosina; linoleil-betaína; miristil- betaína; cetil-betaína; lauroamidopropil- betaína; cocamidopropil-betaína; linoleamidopropil-betaína; miristamidopro- pil-betaína, palmidopropil-betaína; isoestearamidopropil-betaína (por exem- plo, lauroamidopropila); miristarnidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearami- dopropil-dimetil-amina; metil-cocoil-taurato de sódio, ou metil-oleil-taurato dissódico; e a série Monaquat® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J., EUA); polietilglicol; polipropilglicol; e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Pluronics, PF68). A quantidade de tensoativo adicionada é tal que ele mantenha a agregação da proteína reconstituída em um nível aceitável, como testado usando, por exemplo, SEC-HPLC, para determinar a porcen- tagem de espécies de alto eso molecular (HMW) ou espécies de baixo pelo molecular (LMW), e minimize a formação de particulados depois da reconsti- tuição de um Iiofilizado de uma formulação de proteína aqui descrita. Por exemplo, o tensoativo pode estar presente em uma formulação (líquida ou antes da liofilização) em uma quantidade entre cerca de 0,001 e 0,5%, por exemplo, entre cerca de 0,05 e 0,3%.

Em algumas modalidades, um agente de massa é incluído em uma formulação com viscosidade reduzida. O termo "agente de massa", co- mo aqui utilizado, inclui agentes que proporcionam a estrutura do produto secado por congelamento sem interagir diretamente com o produto farma- cêutico. Além de proporcionar um torta farmaceuticamente atraente, os a- gentes de massa podem conferir também qualidades referentes à modifica- ção da temperatura de colapso, proporcionando proteção no congelamen- to/descongelamento, e aumentando a estabilidade da proteína durante a estocagem a longo prazo. Os exemplos não-llimitativos de agents encorpan- tes incluem manitol, glicina, lactose, e sacarose. Os agentes de massa po- dem ser cristalinos (tais como glicina, manitol, ou cloreto de sódio) ou amor- fos (tais como dextrano ou hidróxi-etil-amido) e são usados geralmente em formulações de proteínas em uma quantidade entre 0,5% e 10%.

Outros veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceutica- mente aceitáveis, tais como aqueles descritos em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 20a edição, Editora Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins (2000) também podem ser incluídos em uma formulação de prote- ína aqui descrita, desde que eles não afetem adversamente as característi- cas desejadas da formulação. Os veículos, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são atóxicos para os recebedores (por exemplo, pacientes) nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: tampões adicionais; con- servantes; co-solventes; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metioni- na; agentes quelantes, tal como EDTA; complexos de metais (por exemplo, complexos Zn-proteína); polímeros biodegradáveis, tais como poliésteres; contra-íons formadores de sais, tais como sódio, álcoois de açúcares polii- droxilados; aminoácidos, tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, e treonina; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcares, tais como lactitol, es- taquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietilenoglicol; agentes redutores que contêm enxofre, tais como uréia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol, e tiossulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular, tais como albumina de soro hu- mano, albumina de soro bovino, gelatina, ou outras imunoglobulinas; e polí- meros hidrofílicos, tal como poli(vinil-pirrolidona).

Formulações de Proteínas Exemplificativas ΜΥΟ-029

Em um exemplo, uma formulação de MYO-029 com viscosidade reduzida pode ser formulada usando 1 mg/mL a 300 mg/mL do anticorpo MYO-029. A formulação de MYO-029 inclui geralmente entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. A formulação pode incluir cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de histidina. A formulação po- de incluir cerca de 1 % a cerca de 5% (p/v) de sacarose ou trealose. Em al- guns casos, a formulação pode incluir cerca de 10 mM a cerca de 25 mM de metionina. Em certas formulações de MYO-029, adiciona-se 0,05-0,2% (p/v) de Polissorbato-20 ou Polossorbato-80. O pH da fórmula é geralmente entre 5,5 e 6,5. Em um exemplo específico, a formulação de MYO-029 compreen- de 150 mg/mL do anticorpo MYO-029, 10 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 20 mM de histidina, 4% de sacarose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo específico, a formulação de MYO-029 compreende 75 mg/mL do anticorpo MYO-029, 5 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 2% da sacarose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo específico, uma formulação do anticorpo MYO-029 compreende 150 mg/mL do anticorpo MYO-029, 10 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 20 mM de histidina, 20 mM de metionina, 4% de sacarose, 0,2% de Polissorbato-80, e tem um pH de 6,0.

MYO-028

As formulações de MYO-028 com viscosidade reduzida podem ser formuladas usando 1 mg/mL a 300 mg/mL do anticorpo MYO-028. A formulação de MYO-028 inclui geralmente entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. A formulação pode inclu- ir entre cerca de 5 mM e cerca de 25 mM de histidina. A formulação pode incluir entre cerca de 1 % e cerca de 5% (p/v) de sacarose ou trealose. O pH de uma formulação de MYO-028 é geralmente entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em um exemplos específico, uma formulação do anticorpo MYO-028 50 mg/mL do anticorpo, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e tem um pH de 6,5. Em outro exemplo específico, uma formulação do anticorpo MYO-028 compreende 50 mg/mL do anticorpo, 10 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e tem um pH de 6,5. J695

As formulações de J695 com viscosidade reduzida podem ser formuladas usando 1 mg/mL a 300 mg/mL do anticorpo J695. A formulação de A J695 inclui geralmente entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM de clore- to de cálcio ou cloreto de magnésio. A formulação pode incluir cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de histidina. A formulação pode incluir cerca de 1% a cerca de 5% (p/v) de sacarose ou trealose. Em alguns casos, a formulação pode incluir cerca de 10 mM a cerca de 25 mM de metionina. Em certas for- mulações de J695, adiciona-se entre cerca de 1% a cerca de 5% (p/v) de manitol. O pH da formulação é geralmente entre 5,5 e 6,5. Em um exemplo específico, uma formulação do anticorpo J695 compreende 100 mg/mL do anticorpo J695, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% de manitol, 1% de sacarose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo específico, uma com- posição do anticorpo J695 compreende 100 mg/mL do anticorpo J695, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 5mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 4% de manitol, 1% de sacarose, e tem um pH de 6.0. Em ou- tra modalidade específica, a formulação do anticorpo J695 compreende 100 mg/mL do anticorpo J695, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 10 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 4% de manitol, 1% da sacarose, e tem um pH de 6,0. IMA-638

As formulações da proteína IMA-638 podem ser formuladas u- sando 1 mg/mL a 300 mg/mL do anticorpo IMA-638. Uma formulação com viscosidade reduzida que contém IMA-638 inclui geralmente entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. A formu- lação pode incluir cerca de 5 mM a cerca de 25 mM de histidina. A formula- ção pode incluir também cerca de 1% a cerca de 10% (p/v) de sacarose ou trealose. O pH da formulação é geralmente entre 5,5 e 6,5. Em um exemplo específico, a formulação do anticorpo IMA-638 compreende 50 mg/mL do anticorpo IMA-638, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo específico, a formulação do anticorpo IMA-638 com- preende 100 mg/mL do anticorpo IMA-638, 20 mM de histidina, 10% de sa- carose, e tem um pH de 6,0. Em outro exemplo específico, a formulação do anticorpo the IMA-638 compreende 50 mg/mL do anticorpo IMA-638, 5 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 10 mM de histidin, 10% de sa- carose, e tem um pH de 6,0. Em ainda outro exemplo específico, a formula- ção do anticorpo IMA-638 compreende 100 mg/mL do anticorpo IMA-638, 10 mM de cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, 20 mM de histidina, 10% de sacarose, e tem um pH de 6,0.

Métodos de Estocaqem

Uma formulação de proteína com viscosidade reduzida aqui descrita pode ser estocada por qualquer método apropriado conhecido pelos versados nessas técnicas. Os exemplos não-limitativos de métodos para preparar uma formulação com viscosidade reduzida para estocagem incluem congelar, liofilizar, e atomizar a formulação de proteína.

Em alguns casos, uma formulação com viscosidade reduzida é congelada para estocagem. Conseqüentemente, é desejável que a formula- ção seja relativamente estável sob tais codições, incluindo quando submeti- da a ciclos de congelamento/descongelamento. Um método para determinar a adequabilidade de uma formulação para estocagem congelada é submeter uma amostra da formulação a pelo menos dois, por exemplo, três a dez ci- clos de congelamento (por exemplo, a -20°C ou -80°C) e descongelamento (por exemplo, por descongleamento rápido à temperatura ambiente ou des- congelamento lento sobre gelo), determinar quantidade de espécies de baixo peso molecular (LMW) e/ou espécies de alto peso molecular (HMW) que se acumularam depois dos ciclos de congelamento/descongelamento e compa- rá-la com a quantidade de espécies de baixo peso molecular (LMW) ou es- pécies de alto peso molecular (HMW) presente na amostra antes do proce- dimento de congelamento/descongelamento. Um aumento nas espécies de baixo peso molecular (LMW) ou espécies de alto peso molecular (HMW) in- dica estabilidade diminuída de uma proteína estocada como parte da formu- lação. Uma cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de ta- manho (SEC-HPLC) pode ser usada para determinar a presença de espé- cies de baixo peso molecular (LMW) e espécies de alto peso molecular (HMW). Uma formulação apropriada pode acumular espécies de baixo peso molecular (LMW) ou espécies de alto peso molecular (HMW) indesejáveis, mas não até o grau que a presença das espécies de baixo peso molecular (LMW) ou espécies de alto peso molecular (HMW) tornem a formulação ina- dequada para seu uso pretendido.

Em alguns casos, uma formulação é estocada como um líquido. Conseqüentemente, é desejável que a formulação líquida seja relativamente estável sob tais condições, incluindo em várias temperaturas. Um método para determinar a estabilidade de uma formulação para estocagem líquida é estocar a amostra de formulação em várias temperaturas (tais como 2-8°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, e 50°C) e monitorar a quantidade (por exemplo, mudança na porcentagem) de espécies de baixo peso mole- cular (LMW) e/ou espécies de alto peso molecular (HMW) que se acumulam no decorrer do tempo. Adicionalmente, o perfil de carga elétrica pode ser monitorado por cromatografia líquida de alto desempenho por troca catiônica (CEX-HPLC).

Geralmente, a porcentagem de espécies de baixo peso molecu- lar ou espécies de alto peso molecular é determinada como uma porcenta- gem do teor total de proteína em uma formulação ou como uma mudança no aumento da porcentagem no decorrer do tempo), conforme apropriado para o ensaio e o parâmetro que está sendo determinado. Geralmente, e em e- xemplos não-limitativos, a mudança na porcentagem de proteína em espé- cies de baixo peso molecular ou espécies de alto peso molecular em uma formulação com viscosidade reduzida não é maior do que 10%, por exemplo, não maior do que cerca de 8%, não maior do que cerca de 5%, ou não maior do que cerca de 3% com relação ao parâmetro testado (por exemplo, tempo, temperatura, compostos adicionais na formulação, liofilização, ou agitação).

Alternativamente, uma formulação pode ser estocada depois de liofilização. O termo "liofilização", como aqui utilizado, refere-se a um pro- cesso pelo qual o material a ser secado é primeiramente congelado, e em seguida, efetua-se a remoção do gelo ou do solvente congelado por subli- mação em um ambiente sob vácuo. Um excipiente (por exemplo, um liopro- tetor) pode ser incluído em formulações que vão ser liofilizadas, para aumen- tar a estabilidade do produto liofilizado após a estocagem. O termo "formula- ção reconstituída", como aqui utilizado, refere-se a uma formulação que foi preparada dissolvendo uma formulação de proteína liofilizada em um diluen- te, de tal modo que a proteína seja dispersada no diluente. O termo "diluen- te", como aqui utilizado, é uma substância que é farmaceuticamente aceitá- vel (segura e atóxica para administração a um ser humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, tal como uma formulação reconstitu- ida depois da liofilização. Os exemplos não-limitativos de diluentes incluem água esterilizada, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução com pH tamponado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solção salina estéril, solução de Ringer, solução de dextrose, ou soluções aquosas de sais e/ou tampões.

É útil testar uma formulação com viscosidade reduzida quanto à estabilidade do componente proteína da formulação depois da liofilização, para determinar a adequabilidade de uma formulação. O método é similar àquele descrito acima para congelamento, exceto que a amostra da formula- ção é liofilizada ao invés de congelada, reconstituída usando um diluente e a formulação reconstituída é testada quanto à presença de espécies de baixo peso molecular (LMW) e/ou espécies de alto peso molecular (HMW). Um aumento nas espécies de baixo peso molecular (LMW) ou espécies de alto peso molecular (HMW) na amostra liofilizada em comparação com uma a- mostra de formulação correspondente que não foi liofilizada indica estabili- dade diminuída na amostra liofilizada.

Em alguns casos, uma formulação é atomizada e depois estoca- da. Para a atomização, uma formulação líquida é transformada em aerossol na presença de uma corrente de gás seco. A água é removida das gotículas da formulação para dentro da corrente de gás, resultando em partículas se- cas da formulação do fármaco. Excipientes podem ser incluídos na formula- ção para (1) proteger a proteína durante a desidratação da atomização, (2) proteger a proteína durante a estocagem depois da atomização, e/ou (3) conferir à solução propriedades apropriadas para a transformação em ae- rossol. O método é similar àquele descrito acima para o congelamento, ex- ceto que a amostra da formulação é atomizada ao invés de congelada, re- constituída em um diluente e a formulação reconstituída é testada quanto à presença de espécies de baixo peso molecular (LMW) e/ou espécies de alto peso molecular (HMW). Um aumento nas espécies de baixo peso molecular (LMW) ou espécies de alto peso molecular na amostra atomizada em com- paração com uma amostra de formulação correspondente que não foi Iiofili- zada indica estabilidade diminuída na amostra atomizada.

Métodos de Tratamento

As formulações com viscosidade reduzida aqui descritas são úteis como composições farmacêuticas no tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio em um paciente que necessita do tratamento. O termo "tratamento" refere-se ao tratamento terapêutico e também ao trata- mento profilático ou preventivo. O tratamento inclui a aplicação ou adminis- tração da formulação com viscosidade reduzida ao corpo, um tecido isolado, ou célula de um paciente que tem um distúrbio, um sintoma, de um distúrbio, está em risco de contrair um distúrbio, ou uma predisposição a um distúrbio, com o propósito de curar, restabelecer a saúde, minorar, aliviar, alterar, re- mediar, melhorar, recuperar, ou afetar o distúrbio, o sintoma do distúrbio, ou a predisposição para o distúrbio. Os que "necessitam do tratamento" incluem aqueles que já têm um distúrbio, bem como aqueles nos quais um distúrbio vai ser prevenido. O termo "distúrbio" é qualquer condição que se beneficia- ria do tratamento com uma formulação de proteína aqui descrita. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições pato- lógicas que predispose o indivíduo (paciente) ao distúrbio em questão. Os exemplos não-limitativos de distúrbios a serem tratados usando uma formu- lação aqui descrita incluem distúrbios auto-imunes, distúrbios inflamatórios, distúrbios de emaciação, alergias, cânceres, distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, diabetes Tipo II, artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, asma, dermatite, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica, eosinofilia, fibrose, e excesso de produção de muco. Em uma modalidade, a formulação com viscosidade reduzida apropriada para uso como uma composição farmacêutica compreende um anticorpo antimiostatina e um agente redutor de viscosidade. Em uma moda- lidade, o anticorpo antimiostatina é MYO-029. Em outras modalidades, o an- ticorpo antimiostatina é MYO-022 ou MYO-028. O anticorpo antimiostatina está geralmente em uma concentração entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 300 mg/mL na formulação. Em outra modalidade, o agente redutor de visco- sidade está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 20 mM na composição farmacêutica. Em outra modalidade, o agente redutor de visco- sidade está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 14 mM na composição farmacêutica. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo antimiostatina, um agente redutor de viscosidade, e um tampão, onde o pH da formulação é entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. As composições farmacêuticas aqui descritas podem conter também outras proteínas, fármacos, e/ou excipientes. Particularmente, outras proteínas ou substâncias úteis para tratar o distúrbio em questão podem ser adicionadas à formulação. As composições farmacêuticas que contêm um anticorpo an- timiostatina são úteis no tratamento ou prevenção de distúrbios tais como, porém sem limitações, distúrbios de emaciação muscular, distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, e diabetes Tipo II.

Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreen- de um anticorpo anti-IL-12 e um agente redutor de viscosidade. Em uma modalidade, o anticorpo anti-IL-12 é J695. O anticorpo anti-IL-12 está geral- mente em uma concentração entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 300 mg/mL na formulação. Em outra modalidade, o agente redutor de viscosida- de está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 20 mM na com- posição farmacêutica. Em outra modalidade, o agente redutor de viscosida- de está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 14 mM na com- posição farmacêutica. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo anti-IL-12, um agente redutor de viscosidade, e um tampão, onde o pH da formulação é entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. As composições farmacêuticas aqui descritas podem conter também outras proteínas, fármacos, e/ou excipientes. Particularmente, outras proteínas ou substâncias úteis para tratar o distúrbio em questão podem ser adicionadas à formulação. As composições farmacêuticas que contêm o anticorpo anti-IL- 12 são úteis no tratamento ou prevenção de distúrbios tais como, porém sem limitações, distúrbios auto-imunes, distúrbios inflamatórios, artrite reumatói- de, doença de Crohn, psoríase, e artrite psoriática.

Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreen- de um anticorpo anti-IL-13 e um agente redutor de viscosidade. Em uma modalidade, o anticorpo anti-IL-13 é IMA-638. O anticorpo anti-IL-13 está geralmente em uma concentração entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 300 mg/mL na formulação. Em outra modalidade, o agente redutor de visco- sidade está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 20 mM na composição farmacêutica. Em outra modalidade, o agente redutor de visco- sidade está em uma concentração final entre cerca de 0,5 mM e 14 mM na composição farmacêutica. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo anti-IL-13, um agente redutor de viscosidade, e um tampão, onde o pH da formulação é entre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. As composições farmacêuticas aqui descritas podem conter também outras proteínas, fármacos, e/ou excipientes. Particularmente, outras proteínas ou substâncias úteis para tratar o distúrbio em questão podem ser adicionadas à formulação. As composições farmacêticas que contêm o anticorpo anti-IL-

13 são úteis o tratamento ou prevenção de distúrbios tais como, porém sem limitações, distúrbios asmáticos, distúrbios atópicos, doença pulmonar obs- trutiva crônica, condições que envolvem inflamação das vias aéreas, eosino- filia, fibrose e excesso de produçã de muco, condições inflamatórias, condi- ções auto-imunes, tumores ou cânceres, e infecção viral. Administração

Uma formulação com viscosidade reduzida aqui descrita pode ser administrada a um indivíduo que necessita do tratamento usando méto- dos conhecidos nessas técnicas, tais como por infusão única ou múltipla maciça durante um longo período de tempo de uma maneira apropriada, por exemplo, injeção ou infusão por via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intralesional ou intra-articular, administração tó- pica, inalação, ou por meio de liberação prolongada ou liberação estendida. Caso a formulação tenha sido Iiofilizadal o material Iiofilizado é primeiramen- te reconstituído em um líquido apropriado antes da administração. O material liofilizado pode ser reconstituído, por exemplo, em água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, ou na mesma formu- lação em que a proteína estava antes da liofilização.

As composições parenterais podem ser preparadas na forma de dosagem unitária para facilidade da administração e uniformidade da dosa- gem. O termo "forma de dosagem unitária" como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente distintas apropriadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predetermi- nada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico deseja- do, em associação com o veículo farmacêutico selecionado.

No caso de um método por inalação, tal como um inalãdor com dose medida, o dispositivo é projetado para distribuir uma quantidade apro- priada de uma formulação. Para administração por inalação, os compostos são distribuídos na forma de um spray de aerossol a partir de um recipiente ou embalagem pressurizada que contém um propelente apropriado, por e- xemplo, um gás, tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. Alternati- vãmente, uma forma de dosagem inalada pode ser fornecida como um ina- lador de pó seco.

Uma formulação com viscosidade reduzida pode ficar também retida em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacer- vação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidró- xi-metil-celulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por e- xemplo, lipossoma, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartícu- las, e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em "Remington1S Pharmaceutical Sciences", 20a edição (supra).

Preparações com liberação prolongada das formulações de pro- teínas aqui descritas também podem ser preparadas. Os exemplos apropri- ados de preparações com liberação prolongada incluem matrizes semiper- meáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos, que contêm a formulação de pro- teína. Os exemplos de matrizes para liberação prolongada incluem poliéste- res, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidróxi-etila), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ- etila, copolímero de etileno e acetato de vinila não-degradável, copolímeros de ácido lático e ácido glicólico degradáveis, e ácido poli-D-(-)-3-hidróxi- butírico. As formulações com liberação prolongada das proteínas aqui des- critas podem ser desenvolvidas usando, por exemplo, polímero de ácido po- lilático-co-glicólico (PLGA), devido à sua biocompatibilidade e ampla faixa de propriedades biodegradáveis. Os produtos da degradação de PLGÀ, os áci- dos lático e glicólico, podem ser depurados rapidamente dentro do corpo humano. Além disso, a capacidade de degradação deste polímero pode ser ajustada desdes meses até anos, dependendo do seu peso molecular e composição. Composições lipossômicas também podem ser usadas para formular as proteínas ou anticorpos aqui descritos. Dosagem

A toxicidade e a eficácia terapêutica de uma formulação podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos nessas téc- nicas, usando, por exemplo, culturas de células ou cobaias, por exemplo, para determinar a DL50 (a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e ele pode ser ex- presso como a relação DL5o/DE50.

Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e es- tudos animais podem ser usados para formular uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais formulações fica geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que inclui a DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer formulação usada no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que inclui a Cl50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge a inibição meia- máxima de sintomas), determinada na cultura de células. Essas informações podem ser usadas para determinar mais precisamente as doses úteis em humanos. Os níveis plasmáticos podem ser medidos, por exemplo, por cro- matografia líquida de alto desempenho.

A dosagem apropriada da proteína da formulação dependerá do tipo de distúrbio a ser tratado, da gravidade do distúrbio, se o agente é ad- ministrado com propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, his- tória clínica do paciente e resposta ao agente, e do critério do médico aten- dente. Uma formulação é distribuída geralmente de tal modo que a dosagem fique entre cerca de 0,1 mg de proteína/kg de peso corporal e 100 mg de proteína/kg de peso corporal. A formulação é administrada ao paciente uma vez ou durante uma série de tratamentos. Em uma modalidade, uma formu- lação de anticorpo antimiostatina (por exemplo, MYO-22, MYO-28, MYO- 029) é distribuída para um paciente que dela necessita em uma dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Em outra modalidade, uma formula- ção de anticorpo anti-IL-12 é administrada a um paciente que dela necessita em uma dosagem de 1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal. Em uma modali- dade adicional, uma formulação de anticorpo anti-IL-13 é administrada a um paciente que dela necessita em uma dosagem de cerca de 0,5 mg/kg a cer- ca de 5 mg/kg de peso corporal do paciente.

Uma formulação a ser usada para administração in vivo deve ser estéril. Uma formulação pode ser tornada estéril, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes ou depois da formulação de um líquido ou liofilização e reconstituição. As composições terapêuticas aqui descritas são geralmente colocadas dentro de um recipiente que tem um orifício de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intraveno- sa, ou frasco que tem uma tampa que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

Artigos Fabricados Em outra modalidade, fornece-se um artigo fabricado que con- tém uma formulação aqui descrita e tipicamente fornece instruções para seu uso. O artigo fabricado compreende um recipiente apropriado para conter a formulação. Os recipientes apropriados incluem, sem limitações, vidros, frascos (por exemplo, frascos com dois compartimentos), seringas (por e- xemplo, seringas com um ou dois compartimentos), tubos de ensaio, nebuli- zadores, inaladores (por exemplo, inaladores com dose medida ou inalado- res para pó seco), ou depósitos. O recipiente pode ser fabricado a partir de uma série de materiais, tais como vidro, metal ou plástico (por exemplo, poli- carbonato, poliestireno, polipropileno). O recipiente retém a formulação, e o rótulo sobre o recipiente ou fornecido junto com ele pode indicar orientações para reconstituição e/ou uso. O rótulo pode indicar ainda que a formulação é útil ou intencionada para administração subcutânea. O recipiente que retém a formulação pode ser um frasco para múltiplos usos, que permite adminis- trações repetidas (por exemplo, 2-6 doses) da formulação. O artigo maufatu- rado pode compreender ainda um segundo recipiente que compreende um diluente apropriado (por exemplo, água para injeção (WFI), NaCI a 0,9%, água bacteriostática para injeção (BWFI), ou solução salina tamponada com fosfato). Quando o artigo fabricado compreende uma versão Iiofilizada de uma formulação de proteína, misturar um diluente com a formulação Iiofiliza- da produzirá uma concentração final de proteína na formulação reconstituída de geralmente pelo menos 20 mg/mL. O artigo fabricado pode incuir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, inclu- indo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instru- ções para uso.

A invenção será agora ilustrada adicionalmente pelos exemplos que se seguem. Os exemplos são fornecidos com propósitos meramente ilustrativos. Eles não devem ser interpretados de forma alguma como Iimita- tivos do âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Viscosidade de Formlacões de Anticorpos Os anticorpos peptídeo anti-β-amilóide (anti-AB), anti-IL-13, anti- IL-12 (J695) e antimiostatina (MYO-029) foram formulados como descrito na Tabela 1. A viscosidade destas formulações de anticorpos foi medida usan- do um reômetro de cone e placa Anton Paar Physica MCR301. Espeçifica- mente, usou-se um cone CP25-1 (24,971 mm de diâmetro, ângulo de 1,002°) para todas medições; a velocidade de cisalhamento foi constante em 898 1/s por uma duração de 100 segundos. As medições foram feitas a cada 10 segundos. As medições da viscosidade foram realizadas a 4 0C e tam- bém a 25 °C, usando uma unidade de controle de temperatura Peltier embu- tida. A carga da amostra de líquido sobre a placa foi de 90 μΙ. Cada amostra foi analisada em triplicata.

A Tabela 1 abaixo lista as viscosidades de diferentes anticorpos em diferentes concentrações e em diferentes formulações.

Table 1

<table>table see original document page 38</column></row><table> Os dados indicados na Tabela 1 demonstram que a viscosidade de antimiostatina (MYO-029) é significativamente mais alta em comparação com os outros anticorpos listados na tabela. As viscosidades de todos anti- corpos aumentaram a 4°C. Este aumento é proporcionalmente muito mais alto no caso de MYO-029.

Exemplo 2

Efeitos de Vários Sais sobre a Viscosidade de uma Formulação do Anticorpo MYQ-029

O anticorpo MYO-029 em uma concentração de 73 mg/mL, foi formulado em histidina 10 mM, 2% de sacarose, pH 6,0. Soluções concen- tradas de sais (por exemplo, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, cloreto de sódio e bifosfato de sódio) foram diluídas dentro da formulação do anti- corpo MYO-029, usando uma pipeta. O efeito destes sais sobre a viscosida- de da formulação do anticorpo MYO-029 foi medido como descrito no Exem- plo 1. Estes dados estão ilustrados na Figura 1.

MgCl2 e também CaCl2 em concentrações na faixa entre cerca de 5 mM e cerca de 20 mM reduziram significativamente a viscosidade da formulação do anticorpo MYQ-029. NaCl e NaH2PO4, por outro lado, tiveram pouco efeito nesta faixa.

Assim sendo, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, em con- centrações de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, são agentes redutores de viscosidade eficazes para formulações do anticorpo MYO-029, diferentemen- te de cloreto sódio e bifosfato de sódio.

Exemplo 3

Efeito de Cloreto de Cálcio sobre a Viscosidade de uma Formulação do Anti- corpo J695

A viscosidade de uma formulação do anticorpo J695 é medida em duas concentrações diferentes do anticorpo J695, isto é, 100 mg/mL e 300 mg/mL.

A viscosidade da formulação do anticorpo J695 na concentração mais alta sera mais alta do que a viscosidade da formulação do anticorpo J695 na concentração mais baixa. O cloreto de cálcio é adicionado até uma concentração final de cerca de 5 mM a 20 mM para 300 mg/mL da formulação do anticorpo J695. Neste caso, espera-se que a viscosidade da formulação do anticorpo dimi- nua em comparação com a formulação de J695 sem cloreto de cálcio.

Conseqüentemente, o cloreto de cálcio em concentrações de 5 mM a cerca de 20 mM é eficaz como um agente redutor de viscosidade para formulações do anticorpo J695.

Exemplo 4

Efeito de Cloreto de Cálcio sobre a Viscosidade de uma Formulação do Anti- corpo MYO-028

MYO-028, outro anticorpo antimiostâtina, foi concentrado usando Centricon Ultrafree®-4 até uma concentração de 95 mg/mL. Adicionou-se cloreto de cálcio ao MYO-028, de acordo com a Tabela 2 abaixo:

Tabela 2

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MYO-028 foi formulado a 95 mg/mL em histidina 10 mM, 5% de sacarose, pH 6,5. A solução de CaCl2 consistia em histidina 10mM, 2% de sacarose, CaCl2 2 M A solução de tampão consistia em histidina 10 mM, 5% de sacarose, pH 6,5.

A viscosidade destas formulações do anticorpo MYO-028 foi medida usando o mesmo método de reômetro descrito no Exemplo 1 com o uso adicional de um sifão de solvente para impedir a evaporação, uma carga de amostra líquida de 100 μL de of MYO-028 sobre a placa, e o teste foi rea- lizado à temperatura ambiente.

Os dados destes experimentos estão ilustrados na Figura 2.

A adição de CaCl2 diminuiu a viscosidade de uma formulação do anticorpo MYO-028 a 25 mM e 50 mM de CaCl2 em comparação com uma formulação de MYO-028 sem CaCl2. Estes dados demonstram a adequabili- dade de CaCl2 para uso como um agente para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína, por exemplo, para formular uma formulação de anti- corpo com viscosidade reduzida.

Exemplo 5

Efeito de Cloreto de Cálcio sobre a Viscosidade de uma formulação do Anti- corpo IMA-638

Para testar o efeito de cloreto de cálcio sobre a viscosidade de uma formulação do anticorpo IMA-638, diferentes quantidades de cloreto de cálcio foram adicionadas com uma pipeta às alíquotas do anticorpo anti-IL- 13, IMA-638. As alíquotas do anticorpo IMA-638 tinham uma concentração de proteína de aproximadamente 150 mg/mL. A Figura 3 fornece uma repre- sentação gráfica do efeito de cloreto de cálcio sobre a viscosidade de formu- lações da proteína IMA-638.

A viscosidade de IMA-638 não apresentou a mesma redução que aquela observada para MYO-029. Estes dados demonstram um método para idetificar um agente redutor de viscosidade apropriado apra uso com uma formulação de proteína.

Exemplo 6

Efeito de Cloreto de cálcio sobre a Estabilidade do Anticorpo MYQ-029

A adição de um composto (isto é, um agente redutor de viscosi- dade, por exemplo, CaCl2) a uma formulação de proteína poderia potencial- mente afetar a estabilidade das moléculas devido a tensões induzidas por congelamento/descongelamento. Este efeito poderia ser prejudicial, benéfi- co, ou não ter qualquer efeito sobre a estabilidade de proteínas durante o congelamento e descongelamento.

Para avaliar o efeito de um agente (isto é, CaCl2) sobre a degra- dação induzida por cengelamento/descongelamento do anticorpo MYO-029, a molécula foi submetida a 10 ciclos de congelamento e descongelamento a -80°C e 37°C, na presença ou ausência de CaCl2 5 mM. A substância far- macológica MYO-029 foi formulada em histidina 10 mM, 2% de sacarose, na presença ou ausência de cloreto de cálcio por ultrafiltração e diafiltração. A concentração final de proteína foi de aproximadamente 75 mg/mL. Alíquotas de 20 microlitros foram congeladas a -80°C e descongeladas à temperatura ambiente. Isto foi repetido por 5 e 10 ciclos de congelamen- to/descongelamento. As amostras foram diluídas 25 vezes com o tampão da formulação e analisadas medindo a absorvância a 280 nm para a concentra- ção de proteína e por SEC-HPLC para a porcentagem de produtos de alto peso molecular (% de HMW).

O efeito de degradação induzida por congelamen- to/descongelamento foi avaliado por (i) recuperação da proteína (absorvân- cia a 280 nm), e (ii) porcentagem de formação de produtos de alto peso mo- lecular (% dè HMW), determinada por cromatografia líquida de alto desem- penho por exclusão de tamanho (SEC-HPLC). A formação de HMW a via de degradação mais comum para esta molécula. Os resultados destes estudos estão ilustrados na Figura 4A e na Figura 4B.

Comparado com a amostra de controle correspondente sem CaCl2, a adição de CaCl2 5 mM à formulação não teve qualquer efeito sobre a recuperação de proteína ou formação de % de HMW. Assim sendo, a adi- ção de cloreto de cálcio parece não afetar a estabilidade de formulações do anticorpo MYO-029. Isto indica a adequabilidade de CaCl2 para uso como um agente redutor de viscosidade em uma formulação de proteína, por e- xemplo, em uma formulação de anticorpo com viscosidade reduzida.

Exemplo 7

Efeito de Cloreto de Cálcio sobre a Estabilidade de uma Formulação do An- ticorpo MYO-029

A adição de CaCl2 a uma formulação de proteína poderia poten- cialmente afetar a estabilidade líquida das moléculas no decorrer do tempo. Este efeito poderia ser prejudicial, benéfico, ou não ter qualquer efeito sobre a estabilidade de proteínas durante a estocagem.

Para avaliar o efeito deste agente sobre a estabilidade do líquido de MYO-029 sobre a degradação induzida por calor, as formulações que contêm MYO-029 foram submetidas à estocagem a 50 °C por até sete dias. Alíquotas foram retiradas em vários pontos no tempo e analisadas quanto à concentração de proteína por absorvância a 280 nm, e a % de HMW foi ana- lisada por SEC-HPLC. Os dados estão ilustrados na Figura 5A e na Figura 5Β.

Comparado com a amostra de controle, a adição de CaCb à formulação não teve qualquer efeito negativo sobre a estabilidade da proteí- na no estado líquido estocada a 50 °C. A porcentagem de HMW na substân- cia farmacológica também pareceu ser ligeiramente menor no material que contém CaCb- Estes dados demonstram aida mais a adequabilidade de usar CaCI2 como um agente redutor de viscosidade. Eles demonstram também um método para determinar a adequabilidade de um agente que reduz a vis- cosidade de uma formulação de proteína, por exemplo, com relação à possi- bilidade de o agente ter um efeito sobre a estabilidade da proteína na formu- lação. Exemplo 8

Efeito de Cloreto de Cálcio sobre a Estabilidade de MYQ-029 Liofilizado

A adição de um agente tal como CaCI2 a uma formulação de pro- teína poderia potencialmente afetar a estabilidade de formas de dosagem liofilizadas de proteínas no decorrer do tempo. Este efeito poderia ser preju- dicial, benéfico ou não ter qualquer efeito sobre a estabilidade de proteínas durante a estocagem.

Para avaliar o efeito deste excipiente sobre a estabilidade de MYO-029 liofilizado, uma formulação que contém a molécula é Iiofilizada com e sem (controle) CaCI2 5 mM é submetida à estocagem a 50 0C e 4 0C por quarto semanas. Os frascos são removidos e analisados quanto à con- centração de proteína por absorvância a 280 nm, porcentagem de produtos de alto peso molecular (HMW) por SEC-HPLC, e distribuição de carga elétri- ca por cromatografia líquida de alto desempenho por troca catônica (CEX- HPLC). O volume de retirada do frasco e a viscosidade (apenas um ponto no tempo) também são medidos.

A. Viscosidade do Produto Farmacológico Reconstituído

A viscosidade do produto farmacológico MYO-029 (que é medi- da de uma maneira substancialmente igual ao Exemplo 1) a aproximada- mente 150 mg/mL é reduzida quando cloreto de cálcio 5 mM está presente na formulação. Β. Volume de Retirada do Frasco

A quantidade de produtofarmacológico que pode ser removida do frasco com uma seringa de 1 mL e agulha 21 G é melhorada quando Ca- CI2 está presente na formulação.

C. Concentração de Proteína

Comparado com o controle, a adição de CaCI2 à formulação não afeta a recuperação da proteína.

D. Alto Peso Molecular

CaCI2 5 mM não terá qualquer efeito significativo sobre a porcen- tagem de espécies de alto peso molecular (HMW), que é formada depois de quarto semanas de estocagem a 4 0C. Entretanto, a 50 °C, espera-se que a taxa de formação de HMW seja significativamente reduzida em comparação com o controle.

E. Distribuição de Carga Elétrica

Pontos no tempo de estabilidade são analisados por CEX-HPLC, uma ferramenta cromatográfica usada para estudar diferenças de carga elé- trica em proteínas. Na CEX-HPLC, as moléculas mais negativamente carre- gadas eluem mais cedo do que as moléculas positivamente carregadas. Es- te método é usado para detectar a desamidação de resíduos de asparagina para dar ácido aspártico ou isoaspártico. A deamidação resulta em um au- mento na carga elétrica líquida das proteínas, e elas eluirão mais cedo da coluna de HPLC. Neste experimento, investiga-se o efeito que o cloreto de cálcio tem sobre a degradação da proteína, resultando em uma mudança de carga elétrica diferente daquela do controle. Comparado com o controle sem cloreto de cálcio, espera-se que as mesmas mudanças de carga elétrica o- corram no decorrer do tempo. Assim sendo, espera-se que o CaCI2 não te- nha qualquer efeito sobre a distribuição de carga elétrica de MYO-029 em ambas temperaturas de estocagem.

Resumindo, em comparação com uma amostra de controle, a adição de CaCI2 a uma formulação não terá qualquer efeito negativo signifi- cativo sobre a estabilidade da proteína na formulação em relação ao controle experimental sem cloreto de cálcio no estado Iiofilizado quando estocada a 4°C e 50°C. Em alguns casos, CaCl2 demonstra ser benéfico para a estabili- dade da proteína.

OUTRAS MODALIDADES

Deve-se entender que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição precedente preten- de ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações apensadas. Outros aspectos, vantagens, e modificações es- tão dentro do âmbito das reivindicações apensadas.

Claims

1. Método para reduzir a viscosidade de uma formulação de pro- teína, onde o método compreende; (a) disponibilizar uma formulação de proteína; e (b) adicionar cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio à formula- ção de proteína até uma concentração entre cerca de 0,5 mM e cerca de 20 mM, onde a viscosidade da formulação de proteína com o cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio é reduzida em comparação com a viscosidade de uma formulação de proteína sem o agente redutor de viscosidade.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína é selecioanda no grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão de Ig, um receptor, um fator de transcrição, uma enzima, um ligante, e um fragmento biologicamente ativo deles.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína é um anticorpo ou um seu fragmento biologicamente ativo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína é uma proteína de fusão Ig.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína é um anticorpo e o anticorpo é um anticorpo antimiostatina, um anticorpo anti- IL-12, ou um anticorpo anti-IL-13.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, onde o anticorpo antimiostatina é MYO-029, onde o anticorpo anti-IL-12 é J695, e onde o anti- corpo anti-IL-13 é IMA-638.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a viscosidade da formulação de proteína é reduzida em pelo menos cerca de 5% em com- paração com a viscosidade da formulação na ausência do agente redutor de viscosidade.

8. Formulação com viscosidade reduzida, compreendendo: (i) uma proteína; (ii) um agente redutor de viscosidade em uma concentração en- tre cerca de 5 mM e cerca de 20 mM na formulação, onde o agente redutor de viscosidade não é cloreto de sódio ou bifosfato de sódio; e (iii) um tampão; onde o pH da formulação é cerca de 5,5-6,5.

9. Formulação com viscosidade reduzida, de acordo com a rei- vindicação 8, onde a proteína é selecionada no grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão de Ig, um receptor, um fator de transcrição, uma enzima, um ligante, e fragmentos biologicamente ativos deles.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, onde a proteína é um anticorpo ou um seu fragmento biologicamente ativo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, onde a proteína é uma proteína dé fusão de Ig.

12. Formulação de proteína, de acordo com a reivindicação 8, onde o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de mag- nésio.

13. Formulação de anticorpo antimiostatina, compreendendo: (i) um anticorpo antimiostatina ou um seu fragmento ligante de miostatina; (ii) um agente redutor de viscosidade; e (iii) um tampão, onde o pH da formulação é cerca de 5,5-6,5.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde o anticorpo antimiostatina é um anticorpo monoclonal.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde o anticorpo antimiostatina é um anticorpo monoclonal humanizado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde o anticorpo antimiostatina se liga à miostatina com uma Kd de cerca de 6 χ 10"11 Μ, de- terminado por Biacore®.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde o anticorpo antimiostatina é selecionado no grupo que consiste em MYO-022, MYO-028, e MYO-029.

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde o anticorpo antimiostatina na formulação está em uma concentração de cerca de 25 mg/m L a cerca de 400 mg/mL.

19. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio.

20. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio em uma concentração de cerca de -5 mM a cerca de 20 mM.

21. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde o tampão é um tampão de histidina! em uma concentração na formulação de cerca de 4 mM a cerca de 60 mM.

22. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde a formula- ção compreende ainda um crioprotetor.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, onde o crioprote- tor é sacarose ou trealose em uma concentração na formulação de cerca de -0,5% a cerca de 5% (peso/volume).

24. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde a formula- ção compreende ainda um tensoativo em uma concentração na formulação de cerca de 0% a 0,2% (peso/volume).

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, onde o tensoati- vo é Polissorbato-20 ou Polissorbato-80.

26. Método, de acordo com a reivindicação 13, onde a formula- ção compreende ainda um antioxidante.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde o antioxi- dante é metionina, e a concentração de metionina na formulação é entre cerca de 2 mM e cerca de 20 mM.

28. Formulação de anticorpo antimiostatina, de acordo com a reivindicação 13, onde (i) o anticorpo antimiostatina é um anticorpo antimiostatina com- pletamente humanizado em uma concentração de 20 mg/mL a cerca de 400 mg/mL; (ii) o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio em uma concentração cerca de 5 mM a 20 mM; e (iii) o tampão é um tampão de histidina em uma concentração cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, onde o pH da formulação é cerca de 6,0.

29. Formulação, de acordo com a reivindicação 13, onde a for- mulação pe liofilizada.

30. Formulação, de acordo com a reivindicação 13, onde a vis- cosidade da formulação é reduzida em pelo menos cerca de 5% em compa- ração com uma formulação sem o agente redutor de viscosidade.

31. Composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio selecionado no grupo que consiste em distrofia muscular, sarcopenia, ca- quexia, e diabetes Tipo II, onde a composição farmacêutica compreende uma formulação de anticorpo antimiostatina como definida na reivindicação -9.

32. Método para tratar um distúrbio selecionado no grupo que consiste em distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, e diabetes Tipo Il dia- betes, onde o método compreende administrar uma quantidade farmaceuti- camente eficaz de uma formulação de anticorpo que compreende: (i) um anticorpo antimiostatina ou um seu fragmento Iigante de miostatina; (ii) um agente redutor de viscosidade; e (iii) um tampão, onde o pH da formulação é cerca de 5,5-6,5.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, onde a formula- ção de anticorpo é administrada por injeção, infusão intravenosa, ou admi- nistração pulmonar por intermédio de um nebulizador ou como um pó seco.

34. Kit que compreende um recipiente que contém a formulação como definida na reivindicação 1.

35. Kit, de acordo com a reivindicação 34, compreendendo ainda orientações para a administração da dita formulação.

36. Método para reduzir a viscosidade de uma formulação de proteína, onde o método compreende (i) disponibilizar uma formulação de proteína; e21/12/2006Wyeth (ii) adicionar um agente redutor de viscosidade à formulação de proteína, onde o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, e onde a concentração do agente redutor de viscosidade na formulação é entre cerca de 1 mM e cerca de 25 mM.

37. Método para identificar uma formulação de proteína com vis- cosidade reduzida, onde o método compreende (i) disponibilizar uma formulação de proteína; (ii) adicionar um agente redutor de viscosidade à formulação de proteína, onde o agente redutor de viscosidade é cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio, e onde a concentração do agente redutor de viscosidade na formulação é entre cerca de 1 mM e cerca de 25 mM, formando desta forma uma formulação com viscosidade reduzida potencial; e (iii) determinar a viscosidade da formulação de proteína com vis- cosidade reduzida potencial, onde quando a viscosidade da formulação de proteína com vis- cosidade reduzida potencial é reduzida em comparação com a viscosidade da formulação de proteína sem o agente redutor de viscosidade, a formula- ção é uma formulação com viscosidade reduzida.

38. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o método compreende ainda determinar a estabilidade da formulação de proteína.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, onde o método compreende ainda determinar a estabilidade da formulação de proteína.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, onde a estabili- dade da formulação de proteína é determinada depois depois de congelar e descongelar a formulação de proteína, depois de estocar a formulação de proteína a 509C por 1-7 dias, ou depois da liofilização.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, onde a estabili- dade é determinada testando a porcentagem de espécies de alto peso mole- cular, a porcentagem de espécies de baixo peso molecular, ou a distribuição de carga elétrica da formulação de proteína em comparação com um contro- le.