BRPI0617491B1 - Processo para produção de ácido succínico - Google Patents

Abstract

processo para produçao de ácido succínico - descreve-se um processo para produção de ácido succínico, que consiste naetapa de reação de uma bactéria que foi modificada de modo a aumentar a expressão de um gene suce1, ou de um produto produzido por qualquer tratamento da bactéria, com uma matéria prima orgânica em urna solução de reação contendo um íon carbonato, um íon bicarbonato ou gás diáxido de carbono para, desse modo, produzir o ácido succínico desejado.

Description

Área Técnica

A presente invenção refere-se à produção de ácido succínico usando bactérias, tais como bactérias 5 co ri ne formes.

Técnica Antecedente

Para a produção de ácidos não-amino orgânicos, inclusive ácido succínico, por fermentação, geralmente são usadas bactérias anaeróbicas como as dos- gêneros 10 Anaerobiospirillum e Actinobacillus (Document©/Patente 1 e Do cument o/ Pa tent e 2, e Documento/Não Patente 1) . O us o de bactérias anaeróbicas resulta em alto rendimento dos produtos, ao mesmo tempo- em que exige muitos nutrientes para a proliferação das bactérias. Portanto, é necessário 15 acrescentar uma grande quantidade de uma fonte de nitrogênio orgânico, tal com© milhoçina (CSL, do inglês Corn Steep liquor) ao meio de cultura. A adição de uma fonte abundante de nitrogênio orgânico não apenas leva a um aumento do custo do meio de cultura, mas também leva a um 20 aumento do custo da purificação para isolamento do produto, não sendo, portanto, econômica.

Além disso, são conhecidos nessa arte métodos pelos quais bactérias aeróbicas como as bactérias corineformes são cultivadas sob condições aeróbicas para que as células 25 bacterianas proliferem; as células são, então, colhidas e lavadas para permitir que as células, como bactérias em descanso, produzam ácido não-amino orgânico sem aeração por oxigênio (Documento/Patente 3 e Documento/Patente 4). Esses métodos são econômicos porque a quantidade de nitrogênio 30 orgânico a ser adicionada para que as células bacterianas proliferem pode ser pequena e ainda assim permitir que as células proliferem suficientemente em um meio de cultura simples. Porém, esses métodos podem ser aprimorados em termos da produtividade do ácido orgânico em questão, sua concentração e sua taxa de produção por célula bacteriana, bem como em termos de simplificação do processo de produção, e assim por diante. Além disso, também foi relatada a produção de ácido não-amino orgânico por fermentação usando uma bactéria com maior atividade de fosfoenol piruvato carboxilase (por exemplo, Documento/ Patente 5).

Todas as sequências de genomas de uma bactéria corineforme foram identificadas para previsão das funções de sequências putativas codificadoras de proteína nas sequências (Documento/Não Patente 2) . Q gene denominado sucEl na presente invenção é uma delas, e prevê-se que codifique a permease. Entretanto, as funções reais do gene não foram elucidadas, e o envolvimento do gene em um caminho sintético para o ácido succiniço ainda é desconhecido. Documento/Patente No. 1: ÜS 5.142.834 A Documento/Patente No. 2: US 5.504.004 A Documento/Patente No. 3: JP 11-113588 A Documento/Patente No. 4: JP 11-196888 A Documento/Patente No. 5: JP-11-196887 A Documento/Não Patente No. 1: International Journal of Systematic Bacteriology ('1993) , 49, 207-216 Documento/Não Patente No. 2r Appl. Microbiol. Biotechnol. 62(2-3), 99-109 (2003)

Descrição da Invenção

Um objetivo da presente invenção é proporcionar um processo para a produção de ácido succinico com alta produtividade.

Qs inventores da presente invenção conduziram uma intensa investigação para resolver os problemas acima e realizaram a presente invenção descobrindo que a taxa de consumo de matérias primas orgânicas, a taxa de produção do ácido succínicQ, ou seu rendimento, podem ser aumentados permitindo-se que bactérias sejam modificadas de modo a aumentar a expressão de um gene sucEl, ou que suas células tratadas ajam sobre uma matéria prima orgânica em uma solução de reação contendo ion carbonato, ion bicarbonato ou gás dióxido de carbono.

De acordo com a presente invenção, provê-se o seguinte: (1) üm método para produzir ácido succínico, que consiste em: permitir que uma bactéria modificada de modo a aumentar a expressão de um gene sucEl, ou que células tratadas da mesma ajam sobre uma matéria prima orgânica em uma solução de reação contendo ion carbonato, ion bicarbonato, ou gás dióxido de carbono, para produzir o ácido succínico, e coletar o ácido succínico. (2) 0 método de acordo com (1) acima, em que a bactéria é selecionada no grupo que consiste de bactéria corineforme, bactéria Bacillus, e bactéria Rtiizcbium. (3j O método de acordo com (1) ou (2) acima, em que a bactéria é modificada de tal modo que a expressão do gene sucEl é intensificada pelo aumento do número de cópias do gene ou pela modificação de uma sequência reguladora da expressão do gene. (4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3) acima, em que o gene sucEl é um DNA conforme (a) ou (b) abaixo: (a) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de nucleotídeos de número 571 a 2.187 da SEQ ID NO: 15; ou (b) um DNA que se hibridiza com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos de nucleotideos de número 571 a 2.187 da SEQ ID NO: 15 sob condições rigorosas e aprimora a capacidade de produção do ácido succínico de uma bactéria aumentando a expressão do gene na bactéria. (5) O método de acordo com qualquer um de (1) a (4) em que a bactéria é adicionalmente modificada de modo que a atividade de lactato desidrogenase diminua pana 10% ou menos, em comparação com uma cepa não modificada. (6) O método de acordo com qualquer um de (1) a (5) acima, em que a bactéria é adicionalmente modificada, de 5 tal modo que a atividade de piruvato carboxilase é aumentada. (7) Um método para produzir um polímero contendo ácido succínico, que consiste nas seguintes etapas: produção de ácido succínico de acordo com qualquer dos 10 métodos de (1) a (6) acima, e polxmerização do acid© succínico obtido. Breve Descrição dos Desenhos (8) Figura 1 é um desenho que mostra a construção do plasmideo pBS3 para ruptura de gene. Os números nos 15 círculos mostram os números de SEQ ID dos primers (iniciadores:) . A Figura 2 é um desenho que mostra a construção do plasmideo pBS4 para ruptura de gene. Os números nos círculos mostram os números de SEQ ID dos primers. 20 A Figura 3 é um desenho que mostra a construção de um plasmideo para ruptura do sucEl. Os números nos círculos mostram os números de SEQ ID dos primers. A Figura 4 é um desenho que mostra a construção de um plasmideo para amplificar o sucEl. Qs números nos círculos 25 mostram os números de SEQ ID dos primers.

Descrição das Incorporações Preferenciais

A seguir, incorporações da presente invenção serão descritas com detalhes.

A bactéria a ser usada na presente invenção é uma 30 bactéria que tenha a capacidade de produzir ácido succínico e que tenha sido modificada para aumentar a expressão: de um gene sucEl. Tal bactéria pode ser obtida modificando-se uma cepa mãe que tenha a capacidade de produzir ácido succínico, de tal modo que a expressão de um gene sucEl seja intensificada. No caso de se usar uma cepa mãe que não tenha capacidade de produzir ácido succínico, a bactéria pode ser obtida conferindo-se a ela a capacidade de produzir ácido succínico e modificando-se a bactéria para aumentar a expressão de um gene sucEl-

Não há uma limitação específica para que uma cepa mãe de bactéria possa ser usada na presente invenção. Entretanto, são preferíveis as bactérias corineformes, bactérias Bacillus, bactérias Rhizobium e bactérias Escherichia. Entre essas, as bactérias corineformes são mais preferíveis. Exemplos de bactérias coxineformes incluem um microorganismo que pertence ao gênero Cor^nebacterium, um microorganism© que pertence ao gênero Brevibactexiuffl e um microorganism© que pertence ao gênero Arthrobacter. Entre esses, as bactérias pertencentes ao gênero Corynebacfcerium ou Brevibacterium são preferíveis, e as bactérias pertencentes a Corynebacterium glutamicum, Brevíbacterlum fiavam, Brevibacterium ammoniagenes ou Brevibacterium lactofermentw são ainda mais preferíveis.

Exemplos específicos de cepas mãe preferenciais incluem Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BB-1497), Brevibacterium flavum MJ-233 AB-41 (FERM BB-1498), Brevibacteri um ammoniagenes ATCCif72, Corynebacterium glutamicum AICG31831, ATCC13032 e Brevibacterium. lactofermentam ATEG13869. A Brevibacterium fiavam é classificada atualmente como Corynebacterium glutamicum em alguns casos (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. e Schleifer, K.H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol.41, p255-260). Portanto, na presente invenção, a cepa Brevibacteriuαi flavum MJ-233 e sua cepa mutante MJ-233 AB-41 são definidas como sendo as mesmas cepas que a cepa Corynebacteri um glutamictía KJ-233 e a cepa Corynebacterium glutamicum MJ-233 AB-41, respectivamente.

A Brevibacterium flavum MJ-233 foi depositada com- o número de acesso FERM P-3068 no National Institute of Bioscience and Human Technology (Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana)t Agency of Industrial Science and

Technology (Agência da Ciência e Tecnologia Industrial)r Ministry of International Trade and Industry (Ministério do Comércio e Industria Internacional), (atualmente International Batent Organism Depositary - Órgão Depositário de Patentes Internacionais), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada) em Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão, em 28 de abril de 1975 e depois convertida para o depósito internacional conforme o Tratado de Budapeste em maio de 198-1, com o número de acesso PERM BB-1497.

As bactérias a serem usadas como cepa mãe para a obtenção da bactéria usada no método da presente invenção podem ser de quaisquer cepas, inclusive cepas mutantes 20 obtidas por meio de tratamentos para mutação em geral, tais como irradiação UV e tratamento com NTG, e cepas recombinantes induzidas por procedimentos genéticos, tais como técnicas de fusão celular e ré-combinação de genes, bem como cepas do tipo selvagem.

Nos casos de uso de uma cepa mãe que não tenha capacidade de produzir ácido succínico, a capacidade de produzir ácido succínico é conferida por tratamento de mutação ou recombinação gênica. Entretanto-, quando a capacidade de produzir ácido succínico é conferida por modificação para aumentar a expressão de um gene sucEl, nem sempre é necessário conferir a capacidade de produzir ácido succínico.

O termo "capacidade de produzir ácido succínico-" usado no presente refere-se a uma capacidade de acumular acido succinic© em um meio de cultura a tal ponto que se coleta o ácido succínico quando a bactéria é cultivada no meio de cultura.

Um exemplo de método para conferir ou aumentar a 5 capacidade de produzir ácido succinico por cultivo é um método para modificar uma bactéria de modo que aumente a expressão de um gene codificador de. uma enzima envolvida na biossintese do ácido succinico. Exemplos de enzimas envolvidas na biossintese de ácido succinico incluem uma 10 piruvato carboxilase conforme descrição abaixo e uma fumarato reductase conforme descrição em JP 2005-095169. Bactérias que têm os genes da piruvato carboxilase e fumarato reductase são descritas em JP 2002-511'250 A, JP 11-196888 A, JP 2005-95169 A, etc.

A modificação para conferir a capacidade de produzir ácido succínico pode ser realizada rompendo-se um gene que codifica a lactato desidrogenase, que é uma enzima que pode ser expressa sob condições anaeróbicas, conforme descrição abaixo. Ao mesmo tempo, a capacidade de produzir ácido 20 succinico pode ser conferida por um método que inclui: o tratamento de uma bactéria com raios ultravioleta, ou com um mutagene a ser usado para tratamento de mutação em geral, tal como N-metil-N''nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou et 11 metano sulfonato (EMS), e a seleção de uma cepa capaz de produzir ácido succínico. Um exemplo de mutante capaz de produzir ácido succínico inclui uma cepa ácido glutâmico- auxotrófica, conforme descrição em JP 2005-065641 A. Pode-se obter uma bactéria para ser usada no método da presente invenção modificando-se uma bactéria que tenha 30 capacidade de produzir ácido succínico conforme descrição acima, de modo a aumentar a expressão de um gene sucEl. Não há preferência entre a modificação para conferir a capacidade de produzir ácido succinico e a modificação para aumentar a expressão de um gene sucEl. Prevê-se que uma proteína codificada por um gene sucEl (sucE: do inglês succinate exporter) seja um tipo de permease. Trata-se de uma proteína capaz de melhorar a "capacidade de produzir ácido succínico" de uma bactéria 5 quando a expressão do gene ê intensificada na bactéria.

Exemplos do gene sucEl a ser usado para obter-se uma bactéria usada no método da presente invenção incluem um gene sucEl derivado de Brevibacterium fiavam MJ-233 (nucleotídeos números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15), um gene 10 sucEl derivado de C. glutamioam ATCC13032 (sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17) , um gene sucEl derivado de C. efficiens YS314 (sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 19) e um gene sucEl derivado de G. éiphtheriae gravis NCTC13129 (sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:23). O 15 gene sucEl derivado de C. glutamicum ATCC13032 está depositado como NCgl213Q na sequência de genomas depositada com o No. de Acesso GenBank NC# 00 34 50 (a sequência de aminpácidos está depositada com o No. de Acesso GenBank NP#601414). O gene sucEl derivado de C. efficiens YS314 20 está depositado como CE2102 na seqüência de genomas depositada com o No. de Acesso GenBank NC#004369. © gene sucEl derivado de C. diphtheriae gravis NCTC13129 está depositado como DIP0830 com o No. de^ Acesso GenBank NC#002935-

Além disso, o gene sucEl a ser usado para a obtenção de uma bactéria a ser usada no método da presente invenção pode ser um gene homólogo do sucEl derivado de outro microorganismo, desde que seja capaz de melhorar a capacidade de produzir ácido succínico da bactéria por meio 30 do aumento da expressão na bactéria. 0 homólogo de um gene sucEl pode ser encontrado em BLAST (/blast.genome.jp/) ou semelhante, com referência à seqüência de nucleotídeos números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15.

Conforme foi descrito acima, já foram determinadas sequências de genes sucEl, de mode que os genes podem ser obtidos usando-se primers preparados com base nas sequências de nucleotideos. Por exemplo, uma região que inclui sucEl e sua região adjacente, inclusive a região reguladora de sucEl de C. glutamicuia^ pode ser obtida por PCB. (do inglês polpmerase chain reaction; vide White, I.J. e outros, Trends Genet. 5, 185 (19'8 91 ) usando-se primers mostrados em SEQ ID NOS: 13 e 14, e usando-se DNA cromossômico de uma bactéria corineforme como template (molde). Um homólogo de sucEl de outro microorganismo pode ser obtido do mesmo modo acima.

As sequências de nucleotideos de genes sucEl são diferentes com base nos tipos ou cepas de bactérias corineformes e, portanto, um gene sucEl a ser usado para a obtenção de uma bactéria usada no método da presente invenção não se limita a um gene que tem a seqüência de nucleotideos números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15, ou a seqüência de SEQ ID NO: 17 ou 19, e pode ser um mutante ou um gene artificialmente modificado que codifica uma proteína tendo uma seqüência de SEQ ID NO: 16, 18, ou 20, inclusive substituição, supressão, inserção, adição, etc., de um ou vários aminoácidos em uma ou várias posições, desde que o gene melhore a capacidade de produzir ácido succinico da bactéria quando a expressão do gene é intensificada na bactéria. Na presente invenção, apesar de depender das posições conformacionais ou tipos de resíduos de aminoácidos em uma proteína, o termo "um ou vários" significa especificamente de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10 e, mais preferivelmente, de 1 a 5. Ao mesmo tempo, a acima mencionada substituição, supressão, inserção, adição, inversão, etc. de aminoácidos, pode ser causada por uma mutação naturalmente ocorrente (mutante ou variante) devida a diferenças individuais entre bactérias que têm um gene sucEl ou a diferenças. entre espécies de bactérias.

A substituição ©itada acima é, preferivelmente, uma substituição conservadora que é uma mutação neutra, não causando qualquer mudança nas funções. Exemplos de mutação conservadora incluem: quando um aminoácido aromático está 5 em um sítio substitucional, substituição entre phe, trp, e tyr; quando um aminoácido hidrofôbico está em um sítio substitucional, substituição entre leu, ile, e val; no caso de um aminoácido polar, substituição entre gin e asn; no caso de um aminoácido básico, substituição entre lys, arg, 10 e bis; no caso de um aminoácido acídico, substituição entre asp e glu, e no caso de um aminoácido que tenha um grupo hidroxil, substituição entre ser e thr. Exemplos específicos da substituição conservadora incluem: substituição de ala por ser ou thr; substituição de arg por 15 gin, his ou lys; substituição de asn por glu, gin, lys, his ou asp; substituição de asp por asn, glu, ou gin; substituição de glu por gly, asn, gin, lys ou asp; substituição de gly por pro; substituição de his por asn, lys, gin, arg ou tyr; substituição de ile por leu, met, val 20 ou phe; substituição de leu por ile, met, val ou phe; substituição de lys por asn, glu, gin, his ou arg; substituição de met por ile, leu, val ou phe; substituição de phe por trp, tyr, met, ile ou leu; substituição de ser por thr ou ala; substituição de thr por ser ou ala; substituição de trp por phe ou tyr; substituição de tyr por his, phe, ou trp e substituição de val por met, ile ou leu.

Além disso, o gene sucEl pode ter uma seqüência codificando uma proteína que tenha homologia de no mínimo 80%, preferivelmente no mínimo 90% mais preferivelmente, no 30 mínimo 95% e, mais preferivelmente ainda, no mínimo 97% em relação a toda a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 16, 18 ou 20, e codificando uma proteína capaz de aprimorar a capacidade de produzir ácido succínico de uma bactéria quando sua expressão é intensificada. Mais ainda, o grau de degeneração de um gene varia dependendo dos hospedeiros em que o gene é introduzido e, portanto, um códon pode ser substituído, de modo que seja adequado para a introdução do sucEl em um hospedeiro. Além do mais, o gene sucEl pode ser um gene que codifique uma proteína com seqüência alongada ou suprimida no lado N- ou G-terminal, desde que o gene tenha uma função para aprimorar a capacidade de produzir ácido succínico de uma bactéria quando sua expressão for acentuada. Por exemplo, o comprimento do resíduo de aminoácidos a ser alongado ou suprimido é de 50 ou menos, preferivelmente de 20 ou menos, mais preferivelmente de 10 ou menos, e, mais preferivelmente ainda, de 5 ou menos.

Mais especificamente, o gene sucEl pode ser um gene que codifique uma proteína que tenha a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 18 ou 20, com alongamento ou supressão de cinco a 50 amxnoácidos no lado N-termxnal ou de 5 a 50 aminoácidos no lado C-terminal.

Genes homólogos ao gene sucEl podem ser obtidos modificando-se a seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos de números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15, ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:17 ou 19, de modo que os resíduos de aminoácidos em um sitio específico de uma proteína codificada pelo gene sejam substituídos, suprimidos, inseridos, ou adicionados, por exemplo, pela mutação específica do sítio. Ao mesmo tempo, os genes podem ser obtidos por um tratamento de mutação conhecido, conforme descrição abaixo. 0 tratamento de mutação pode ser realizado como segue: uma mutação é introduzida artificialmente no sucEl por recombinação genica por meio de: tratamento ia vii-ao com hidroxilamina ou semelhante, da seqüência de nucleotídeos dos nucleotídeos de números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15, ou da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 ou 19; tratamento de um microorganismo que tenha o gene, tal como uma bactéria corineforme, por raios ultravioleta ou por um mutagene usado para um tratamento geral de mutação, tal como N-metil-N'’ -nitro-N- nitrosoguanidina (NTG), ou etil metano sulfonato (SEM); PCR propensa a erros; embaralhamento de DNA, ou Step-JO?, para 5 introduzir uma mutação em um gene sucEl artificialmente por recombinação genica, de modo a produzir um gene sucEl com alto nível de atividade (Firth A.E., Patrick W.M. ; Bioinformatics. 2 jun 2005; Statistics of protein library construction) .

Se tais genes homólogos de sucEl codificam ou não uma proteína capaz de melhorar a capacidade de produzir ácido succínico por meio de aumento da expressão pode ser confirmado, por exemplo, introduzindo-se esses genes em uma bactéria corineforme do tipo selvagem e verificando-se se 15 houve melhora da capacidade de produzir ácido succínico.

Entrementes, exemplos do gene sucEl incluem uma proteína codificadora de DNA que se hibridiza com uma seqüência complementar à seqüência de nucleotídeos números 571 a 218 7 de SEQ ID NO: 15, ou seqüência de nucleotídeos 20 de SEQ ID NO. 17 ou 19, ou uma sonda que é preparada com base nas sequências sob condições rigorosas e melhora a capacidade de produzir ácido succínico de uma bactéria quando sua expressão é aumentada. O termo "condições rigorosas", quando usado no presente, refere-se a condições 25 em que o assim chamado híbrido específico é formado e o híbrido não específico não é formado. Os exemplos dessas condições incluem; condições em que DNAs com alta homologia, por exemplo, DNAs com pelo menos 80% de homologia, preferivelmente pelo menos 90%, mais 30 preferivelmente 95%, e ainda mais preferivelmente, 97% de homologia se hibridizam entre si, ou condições para lavagem em hibridização Southern geral, isto é, condições que incluem lavagem a uma temperatura e concentração de sal de 60°C, 1 x SSG, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SSC, mais preferivelmente, 68 °C, 0,1 x SSG, 0,1% SDS uma vez, mais preferivelmente duas, ou três vezes.

Uma seqüência parcial da seqüência de nucleotideos números 571 a 2187 de SEQ ID NO: 15 ou seqüência de SEQ ID 5 NO: 17 ou 19 pode ser usada como sonda- A referida sonda pode ser preparada por BCR usando-se oligonucleotídeos preparados com base nessas sequências de nucleotideos como primers e usando-se um fragmento de DNA que contenha a seqüência como template. Por exemplo, no caso de se usar um 10 fragmento de DNA com um comprimento de cerca de 300 bp como sonda, uma condição para lavagem na hibridização pode ser 50 °C, 2 x SSC, 0,1% SDS. Modifiça-se uma bactéria de modo a aumentar o nível de expressão do gene sucEl descrito acima.

A frase "modificada de modo a aumentar a expressão de um gene sucEl" refere-se a um caso em que o número de moléculas- do produto de SucEl por célula aumenta em comparação com uma cepa mãe ou uma cepa do tipo selvagem, um caso em que a atividade por molécula do produto de SucEl 20 aumenta, etc. Exemplos da bactéria corineforme do tipo selvagem a ser usada para comparação incluem Corynebacteriuni glutamicum (Brevibacterium lacto fermentam} ATCC13869 ou ATCG13032. © nível mais alto da expressão do gene sucEl pode ser 25 confirmado comparando-se o nível de mRNA de sucEl com o de uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada. Exemplos de métodos usados para confirmar o nível de expressão incluem hibridização Northern, e RT-BCR (Molecular Cloning (Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring 30 Harbor (USA} 2001). © nível de expressão pode ser qualquer nível, desde que esse nível seja mais alto em comparação com uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada e, por exemplo, o nível é preferivelmente no mínimo 1,5 vez mais alto, mais preferivelmente no mínimo 2 vezes mais a alto, e ainda mais preferivelmente, no mínimo 3 vezes mais alto em comparação com uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada.

O nível de expressão de um gene sucEl pode elevar-se aumentando-se © número de cópias do gene sucEl. Por exemplo, o número de cópias d© gene sucEl pode ser aumentado como segue: ligando-se um fragmento contendo um gene sucEl a um vetor que funcione em uma bactéria corineforme, preferivelmente um vetor multicópias, para preparar um DNA recombinante, e introduzindo-se o DNA em uma bactéria corineforme que tenha capacidade de produzir ácido succínico conforme descrição acima, para transformar as células. Alternativamente, o número de cópias do gene sucEl pode ser aumentado introduzindo-se o DNA recombinante mencionado acima em uma bactéria corineforme dp tipo selvagem para produzir uma cepa transformada, e conferindo- se a capacidade de produzir ácido succínico à cepa transformada. Adicionalmente, o número de cópias pode ser aumentado transferindo-se uma cópia ou múltiplas cópias de um gene que codifique sucEl para um cromossomo. A transferência do gene sucEl para um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando-se uma parte do gene sucEl como sonda.

Além disso, pode-se aumentar a expressão de um gene sucEl modificando-se uma seqüência reguladora da expressão do gene sucEl. Por exemplo, © aumento pode ser conseguido substituindo-se uma seqüência promotora de sucEl com uma promotora mais forte, ou fazendo-se uma seqüência promotora próxima a uma seqüência de consenso (WO-OQ/18935).

Métodos para a construção de um microorganismo com capacidade de produzir ácido succínico e modificado de modo a elevar o nível de expressão de um gene sucEl serão mostrados abaixo. Esses métodos podem ser conduzidos de acordo com um manual como Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).

Rode-se aumentar o nível de expressão de um gene aumentando-se o número de cópias de um gene sucEl, e pode- se aumentar o número de cópias amplificando-se o gene sucEl 5 com um plasmideo, conforme descrição abaixo. Primeiramente, um gene sucEl é clonado de um cromossomo de uma bactéria corineforme ou semelhante. Um DNA çromossômico pode ser preparado a partir de uma bactéria que sirva como doadora de DNA, por exemplo, pelo método de Saito e Miura (vide H.

Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72,619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, organizado por The Society for Biotechnology, Japão, p97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) ou semelhante. Os oligonucleotídeos a serem usados na BCR podem ser sintetizados com base nas 15 informações conhecidas mencionadas acima e, por exemplo, os oligonucleotídeos sintéticos descritos em SEQ ID Nos: 13 e 14 podem ser usados para amplificar um gene sucEl.

Preferivelmente, amplifica-se um fragmento de gene consistindo em um gene sucEl amplificado por BÇR, 20 inserindo-o em um vetor que tenha uma origem de replicação que seja autonomamente replicável em um microorganismo. O vetor é usado- para transformar uma bactéria. Em especial, no caso de se introduzir o fragmento em uma bactéria corineforme, se um DNA recombinante preparado conectando-se 25 o fragmento a um DNA vetor que é autonomamente replicável em células de Escherichia co li e/ou de uma bactéria corineforme for introduzido em Escherichia coll, as operações subsequentes serão facilmente realizadas. Exemplos do vetor que é autonomamente replicável em células 30 de Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG298, RSEIOIO, pBR322, pACXClM, e pMW219.

No caso de se usar uma bactéria corineforme como hospedeira, o DNA mencionado acima pode ser inserido em um vetor que funcione em bactérias corineformes. O vetor que funciona era bactérias corineformes é, por exemplo, um plasmídeo capaz de replicar-se autonomamente em bactérias corineformes. Exemplos específicos do plasmídeo que é autonomamente replicável em bactérias corineformes incluem: plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pGRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX, descritos em JP 02-72876 A e US 5/185,262; plasmídeos pCRY2 e pCRY3, descritos em JP 01-191686 A; pAM330, descrito em JP 58-67679 A; pHM1519, descrito em JP 58-77895 A; pAJ655, pAJβll, e pAJ1844, descritos em JP 5810 192900 A; pCGl, descrito em JP 57-134500 A; pCG2, descrito em JP 58-35197 A; pCG4, pCGll, etc., descritos em JP 57183799 A, e pVK7, descrito em JP 10-215883 A.

Além disso, um vetor obtido excisando-se um fragmento de DNA que possibilita que um plasmídeo se replique 15 autonomamente em bactérias corineformes de um daqueles vetores e inserindo-se o fragmento no vetor para

Escherichia coli pode ser usado como um assim chamado vetor shuttle (vetor ponte) , que se replica autonomamente tanto- em Escherichia coli quanto em bactérias corineformes.

Para se preparar um DNA recombinante pela ligação de um gene sucEl a um vetor que funciona em bactérias corineformes, o vetor é clivado com uma enzima de restrição adequada para a extremidade do gene sucEl. O sítio da enzima de: restrição pode ser introduzido previamente em um 25 oligonucleotídeo sintético a ser usado para amplificar o sucEl. Geralmente a ligação é realizada usando-se uma ligase, tal como ligase T4 DNA.

Para introduzir um plasmídeo recombinante preparado conforme descrição acima em uma bactéria, pode-se empregar 30 qualquer método de transformação relatado até o presente.

Por exemplo, pode-se empregar o método de tratamento das células receptoras com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade do DNA, que foi relatado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53 159 ftw 1970)), e o método do uso de células competentes preparadas por cultivo de células para introduzir um DNA, que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G. A. e Young, F.E., Gene, 1,153 (1977)). Além desses métodos, pode-se empregar a introdução de um DNA recombinante em células receptoras de DNA semelhantes a protoplastos ou esferoplastos em que um DNA recombinante pode ser facilmente integrado, cujo método foi relatado como aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetos, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978)); Hinnen, A., Hicks, J.B.,r Gink, G.B., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929 (1978)). Além disso, a transformação de bactérias também pode ser feita pelo método de pulso elétrico (JP 02-207791 A) ou pelo método de transferência conjugal {Biotechnology NY") ■ 1991 jan., 9(1): 84-7).

O número de cópias de sucEl pode ser aumentado integrando-se múltiplas cópias de sucEl em um DNA cromossômico de uma bactéria. Para integrar múltiplas cópias de sucEl em um DNA cromossômico de uma bactéria, pode-se realizar recombinação homóloga tomando como alvo uma seqüência que exista em múltiplas cópias em um DNA cromossômico. A seqüência existente em múltiplas cópias em um DNA cromossômico pode ser um DNA repetitivo, ou repetição invertida em uma extremidade de um transposon. Alternativamente, conforme revela JP 02-109985 A, o número de cópias pode ser aumentado carregando-se sucEl em um transposon e transferindo-o para integrar múltiplas cópias, do gene em um DNA cromossômico (JP 02-109985 A, JP 07107976 A, Mol. Gen, Genet., 245, 397-405 (1994), Plasmid. 2000 Nov; 4 4 (3) : 285-91) .

Além disso, o número de cópias de sucEl pode ser aumentado como segue: introduzindo-se um gene sucEl em um plasmideo que tenha uma origem de replicação que não pode ser replicada em um hospedeiro, ou em um plasmideo que tenha uma origem de replicação que não possa se replicar em um hospedeiro e uma capacidade de transferência conjugal para um hospedeiro, e amplificando-se o gene no cromossomo. Os exemplos de um vetor a ser usado incluem pSUP3Ql (Simo e outros, Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pKlSmob ou pKlSmob (Schaefer e outros, Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 3267884; USA 5487993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard e outros, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf e outros, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516), e pBGS8 (Spratt e outros, 1986, Gene, 41:337-342). Um vetor plasmideo contendo um gene sucEl é transferido para dentro de uma bactéria por conjugação ou transformação. Um método de conjugação foi descrito, por exemplo, por Schaefer e outros (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Um método de transformação foi descrito, por exemplo, por Theirbach e outros {Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican e Shivinan {Bio/Technology 1, 1067-1070 (1989)), e Tauch e outros, {EEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).

Além disso, a atividade de sucEl pode ser aumentada como segue: substituindo-se uma seqüência reguladora da expressão, tal com© uma promotora de sucEl, em um DNA cromossômico ou em um plasmideo, com uma promotora mais forte; modificando-se um fator envolvido na regulação da expressão de sucEl, por exemplo, um operador ou repressor; ou ligando-se uma terminadora mais forte (Hamilton e outros, Journal of Bacteriology 171: 4616-4622). Exemplos de promotoras fortes conhecidas incluem promotora lac, promotora trp, promotora trc e promotora PS2. Exemplos de íw um método para avaliar a força de uma promotora e promotoras fortes foram descritos por Goldstein e outros (Prokaryotic Promoters in biotechnology. Biotechnol. Anna. Rev., 1995, 1. 105-128). Conforme descrição em WO 00/18935, uma promotora pode ser modificada para se tornar mais forte introduzindo-se uma substituição nucleotídica de vários nucleotídeos em uma região promotora de um gene-alvo-, de modo que a seqüência fique mais próxima de uma seqüência de consenso. Por exemplo, a região -35 pode ser modificada para TTGACA ou TTGCCA, ao mesmo tempo em que a região -10 pode ser modificada para TATAAT e TATAAG. Além disso, sabe- se que a eficiência da tradução do mRNA é significativamente afetada por uma substituição de vários nucleotídeos em uma seqüência de um espaçador entre um sitio de ligação de ribossomo (RBS, do inglês Ribosome Binding Site') e um códon de iniciação da tradução, especialmente uma seqüência imediatamente a montante do códon de iniciação, e que a seqüência pode ser modificada.

Pode-se aumentar o nível de expressão prolongando-se o tempo de sobrevivência de m-RNA ou evitando-se a degradação de uma proteína enzima em uma célula. Uma seqüência reguladora da expressão, tal como uma promotora a montante de um gene sucEl pode ser identificada usando-se um vetor para procura de promotora ou um software para encontrar genes, como o GENETXX. A referida substituição ou modificação da promotora aumenta a expressão de um gene sucEl. A substituição de uma seqüência reguladora da expressão pode ser feita usando-se um plasmídeo sensível à temperatura, por exemplo. Exemplos de plasmídeos de uma bactéria corineforme sensíveis à temperatura incluem p48K, pSFKT2 (JP 2000-262288 A), e pHS€4 (FR 1992-2667875 A e JP 05-7491 A) . Esses plasmídeos são autonomamente replicáveis a pelo menos 25°C, mas não são autonomamente replicáveis a 37 °G. Escherichia coli AJI2571 portando pHSG4 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human TeGhnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) , (atualmente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão), em 11 de outubro de 1990; foi-lhe atribuído o número de acesso FERM P-11763, e o depósito foi então convertido em um depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em 26 de agosto de 1991, com o número de acesso PERM BP-3524. A modificação de uma seqüência reguladora da expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias de um gene sucEl.

No método da presente invenção, é mais eficaz o uso de uma cepa bacteriana modificada de modo que, além de um aumento da expressão de sucEl, haja uma diminuição da atividade de lactato desidrogenase (LDH). A expressão "diminuição da atividade de lactato desidrogenase", quando usada no presente, refere-se a uma diminuição da atividade de lactato desidrogenase em comparação à de uma cepa não modificada quanto à lactato desidrogenase.. A atividade de lactato desidrogenase é reduzida, preferivelmente, a 10% ou menos por célula bacteriana, em comparação com a de uma cepa não modificada quanto à lactato desidrogenase. Além disso, a atividade de lactato desidrogenase pode ser completamente eliminada. A diminuição da atividade de lactato desidrogenase pode ser confirmada medindo-se a atividade de lactato desidrogenase por um método conhecido (L. Kanarek e R.L. Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). Exemplos específicos de um método para produzir um mutante obtido modificando-se uma bactéria corineforme de modo que a atividade de lactato desidrogenase seja reduzida incluem a recombinação homóloga em cromossomos descrita em JP 11- 206385 A e um método que usa um gene SaoB descrito no capítulo de Exemplos na presente descrição (Schafer, A. e outros. Gene 145 (1994) 69-73). Uma bactéria corineforme da presente invenção, modificada de modo que a expressão de sucEl aumente e a atividade de lactato desidrogenase diminua, pode ser obtida preparando-se uma bactéria na qual um gene de LDH tenha sido rompido, por exemplo, pelo método descrito no Exemplo 2 abaixo, e transformando-se a bactéria com um vetor recombinante contendo um gene sucEl. ■Entretanto, não há preferência entre a modificação para diminuir a atividade de LDH e a expressão de um gene sucEl.

Para diminuir ou eliminar a atividade de LDH, uma mutação para atingir a diminuição ou perda da atividade de LDH em uma célula pode ser introduzida em um gene de LDH em um cromossomo, por meio de um método geral de tratamento de mutação. Por exemplo, pode-se atingir esse objetivo suprimindo-se um gene codificador da LDH em um cromossomo por recombinação gênica ou modificando-se uma seqüência reguladora da expressão, tal como uma sequência promotora ou seqüência de Shine-Dalgarno (SD) . Além disso, pode-se alcançar esse objetivo introduzindo-se uma substituição de aminoácido (mutação missense) em regiões que codificam LDH em um cromossomo; introduzindo-se um stop côdon (mutação nonsense); introduzindo-se uma mutação de fraaieshift (■deslocamento do quadro de leitura do DNA) que adiciona ou suprime um ou dois nucleotídeos, ou suprimindo-se uma região parcial ou inteira de um gene (Journal of Biological Chemistry 272; 8611-8617 (1997). Ao mesmo tempo, pode-se conseguir a diminuição ou eliminação da atividade de LDH construindo-se um gene codificador de LDH mutante com uma supressão em urna região codificadora e substituindo-se um gene de LDH normal em um cromossomo com o referido gene- por recombinação homóloga ou introduzindo-se um transposon ou um fator IS no gene.

Para se introduzir uma mutação para diminuir ou eliminar a atividade de LDH por recombinação gênica, pode- se usar, por exemplo, o seguinte método: um gene de LDH em um cromossomo pode ser substituído com o gene de LDH mutante como segue: preparando-se um gene de LDH mutante modificando-se uma seqüência parcial de um gene de LDH de modo que não seja produzida uma enzima capaz de funcionar normalmente; transformando-se uma bactéria corineforme com um DNA contendo o gene, e realizando-se uma recpmbinação entre o gene mutante e um gene em um cromossomo. Essa mutação sítio-específica por substituição de gene usando recombinação homóloga foi estabelecida e pode ser realizada por um método que usa um DNA linear, ou um método que usa um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (üS 6.303.383 ou JP 05-007491 A). Ao mesmo tempo, a mutação sítio-específiça por substituição de gene usando recombinação homóloga pode ser realizada usando-se um plasmídeo que não tenha qualquer capacidade de replicação em um hospedeiro. Exemplos de um plasmídeo sensível à temperatura, de uma bactéria oorineforme, incluem os acima mencionados p48K, pSFKT2 (ÜS 6.303.383), e pHSCÍ (FR 1992-2667875 A e JP 05-7491 A).

Além disso, em um processo para romper um gene conforme descrição acima, pode-se usar levansucrase como marcador para a recombinação gênica (Schafer, A e outros. Gene 145 (1994)69-73).

Na reação da presente invenção, uma bactéria é modificada de tal modo que, além do aumento da expressão de sucEl, a atividade de piruvato carboxilase também é aumentada. A expressão "a atividade de piruvato carboxilase é aumentada" refere-se a um aumento da atividade de piruvato carboxilase em comparação à de uma cepa nã© modificada, tal como uma cepa do tipo •selvagem ou cepa mãe. A atividade de piruvato carboxilase pode ser medida, por exemplo, por um método para medir uma redução em NADH, conforme descrição abaixo. Uma bactéria corineforme modificada de modo que as expressões de sucEl e piruvato carboxilase sejam acentuadas pode ser preparada 5 expressando-se o gene sucEl e o gene da piruvato carboxilase (PC) em níveis elevados em uma bactéria corineforme- da mesma maneira que o método descrito em JP 11-196888 A.

Um gene de PC a ser usado em um método da presente 10 invenção é um gene que tem uma seqüência de nucleotideos determinada, ou um gene obtido isolando-se um fragmento de DNA codificador de uma proteína que tem atividade de PC de um cromossomo de qualquer microorganismo, animal, planta, etc., e determinando-se a seqüência de nucleotideos. Apos a 15 determinação da seqüência de- nucleotideos, pode-se usar um gene sintetizado com base na seqüência.

Exemplos do gene de PC incluem um gene de PC derivado de uma bactéria corineforme como a CorynebacteriuiR glutamiçum (Peters-Wendisch, P.G. e outros. Microbiology, 20 vol. 144 (1998) p-915-927) (SEQ ID NO: 21). Além disso, para o gene de PC, desde que não haja qualquer defeito substancial nas funções da PC codificada, isto é, nas propriedades envolvidas na fixação do dióxido de carbono, parte dos nucleotideos na seqüência de nucleotideos de SEQ 25 ID NO: 21 podem ser substituídos por outros nucleotideos, suprimidos ou inseridos com outro nucleotídeo. Alternativamente, parte da seqüência de nucleotideos pode ser deslocada. Qualquer um desses derivativos pode ser usado na presente invenção. Um DNA que hibridize com um DNA 30 que tem uma seqüência de nucleotideos de SEQ ID NO: 21 sob condições rigorosas, ou um DNA que tenha homologia de, no mínimo, 90%, preferivelmente no mínimo 95% ou, mais preferivelmente, no mínimo 99%, com a seqüência de nucleotideos de SEQ ID NO: 21 e que codifique uma proteína que tenha a atividade de BC pode ser usado preferencialmente. Aqui, as condições rigorosas incluem quaisquer das condições que permitem hibridização em concentrações salinas que correspondem às condições: de 5 lavagem na hibridização southern convencional, 60 °C, 1 x SSC, 0,1% SDS e, preferivelmente, 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

O gene de BC obtido de qualquer bactéria além da Corynebacterium glutamicum, ou de qualquer microorganismo, animal ou planta, também pode ser usado. Em especial, os 10 genes de PC de microorganismos, animais e plantas descritos abaixo, têm seqüências conhecidas (as referências são indicadas abaixo) . © gene de PC pode ser obtido da mesma maneira que foi descrita acima com hibridização ou amplificação de porções ORE (do inglês Open Reading Frame') 15 com o método de BCR (do inglês Polymerase Chain Reaction). Homo sapiens: [Biochem. Biopiiys. Res. Comm., 202, 10Q9- 1014, (1994)] Mrs musculus [Proc. Natl. Acad. Sci. (ISA., 90, 17661779, (1993)] 20 Rat© [GENE, 165, 331-332, (1995)] Levedura; Saccharomyces cerevisiae [Mol. Gen. Genet., 229, 307-315, (1991)] Schizosaccharomyces pombe [DDB J No. de Acesso D78170] 25 Bad lias stearothermophilus [GENE, 191, 47-50, (1997)] Rhizobium etli [J. Baαteriol., 178, 5960-5970, (1996) ] Q aumento de urn gene de PC pode ser realizado da 30 mesma maneira descrita acima com referência a um gene sucEl.

Na presente invenção, o ácido suecinico é produzido usando-se uma bactéria que tenha capacidade de produzir ácido succínico e- seja modificada de modo que a expressão de urn gene sucEl seja aumentada.

Quando se usa a bactéria mencionada acima na reação para produção de ácido succínico, podem-se usar células submetidas à cultura em slant em meio de cultura sólido, tal como agar e, preferivelmente, a •bactéria mencionada acima pode ser previamente cultivada em um mexo liquido (cultura semeada) antes do uso. O ácido succínico é produzido permitindo-se que a referida bactéria cultivada em cultura semeada aja sobre a matéria prima orgânica ao mesmo tempo em que a bactéria está crescendo em um meio contendo ion carbonato, ion bicarbonato ou dióxido de carbono e materiais orgânicos. Caso se use uma bactéria corineforme aeróbica para o processo da presente invenção, é preferível usar a bactéria após incubar as células bacterianas sob condições aeróbicas normais. O meio usado para a incubação pode ser qualquer meio usado normalmente para a cultura de microorganismos. Por exemplo, pode-se usar um meio convencional, que é preparado acrescentando-se uma fonte de nutriente natural como extrato de carne, extrato de levedura ou peptona a uma composição contendo um sal inorgânico como sulfato de amónio, fosfato de potássio ou sulfato de magnésio. Após a cultura, as células bacterianas são colhidas por centrifugação, separação de membranas ou semelhante e, depois, são usadas para a reação.

Na presente invenção também podem ser usadas células tratadas de células bacterianas. Por exemplo, as células tratadas de células bacterianas incluem células bacterianas imobilizadas que são imobilizadas em acrilamida, carrageno, ou semelhante, restos de células bacterianas esmagadas, sobrenadante da centrifugação das mesmas, ou fração obtida purificando-se parcialmente o sobrenadante com tratamento de sulfato de amónio, ou semelhante. A matéria prima orgânica a ser usada no método da presente invenção não é limitada, desde que o material seja uma fonte de carbono que possa ser assimilada pelo microorganismo da presente invenção e convertida em ácido succínico. Geralmente, pode-se usar um carboidrato fermentável de: carboidrato como galactose, lactose, glicose, frutose, glicerol, sucrose, sacarose, amido, ou celulose; ou um poliálcool como glicerina, manitol, xilitol ou ribitol. Entre esses, glicose, frutose e glicerol são preferíveis e a glicose ê especialmente preferível.

Além disso, um líquido de sacarificação do amido, melado ou semelhante que contenha os carboidratos fermentáveis acima também pode ser usado. Esses carboidratos fermentáveis podem ser usados isoladamente ou em combinações. A quantidade de matéria prima acima não é especificamente limitada, e é vantajoso que seja a maior possível dentro da faixa que não inibe a geração de ácido succínico, geralmente na faixa de 5 a 30% (peso/volume), preferivelmente, de 10 a 20% (peso/volume). Além disso, as matérias primas orgânicas podem ser suplementarmente adicionadas, à medida que a matéria prima orgânica acima diminuir com o progresso da reação. O líquido de reação que contém o íon carbonato, o íon bicarbonato, ou dióxido de carbono e as matérias primas orgânicas não é especificamente limitado e, por exemplo, 25 pode ser qualquer meio de cultura para o cultivo de bactérias ou qualquer tampão, inclusive um tampão de fosfato. O líquido de reação é, preferivelmente, uma solução aquosa contendo uma fonte de nitrogênio, um sal inorgânico, e semelhantes. Aqui, a fonte de nitrogênio não 30 é especificamente limitada, desde que possa gerar ácido succínico por assimilação do microorganismo da presente invenção. Especificamente, as fontes de nitrogênio incluem vários compostos orgânicos e inorgânicos de nitrogênio, tais como sal de amónio, nitrato, uréia, hidrolizado de í. soja, hidrolizado de caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de carne e milhocina. Os sais inorgânicos incluem vários tipos de fosfatos, sulfatos e sais metálicos de magnésio, potássio, manganês, ferro, zinco e semelhantes. Além disso, quaisquer fatores que promovam o crescimento de células bacterianas, inclusive vitaminas como a biotina, ácido pantotênico, inositol e ácido nicotínico, nucleotídeos e aminoácidos podem ser adicionados, se necessário. Mais ainda, é desejável que uma quantidade ótima de um agente anti-espuma disponível no mercado seja acrescentada ao meio de cultura para impedir a formação de espuma na hora da reação.

O pH do líquido de reação pode ser ajustado acrescentando-se carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, ou semelhante. 0 pH para a reação da presente invenção geralmente é um pH de 5 a 10, preferivelmente pH de β a 9,5 e, portanto, o pH do liquido de reação pode ser ajustado dentro da faixa acima com um material alcalino, carbonato, uréia ou semelhante, mesmo durante a reação, se necessário. © líquido de reação usado na presente invenção pode ser água, um tampão, um meio de cultura, ou semelhante, mas o meio de cultura é pref erível. © meio de cultura pode conter, por exemplo, as. matérias primas orgânicas descritas acima, juntamente com ion carbonato ou bicarbonato, ou dióxido de: carbono, sendo que a reação pode ser conduzida sob condições anaeróbicas. © ion carbonato ou ion bicarbonato pode ser fornecido por meio de carbonato de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, ou ácido bicarbônico de potássio, que também pode ser usado como um agente neutralizante. Entretanto, se houver necessidade, o ion carbonato ou ion bicarbonato também pode ser fornecido por meio do ácido carbônico ou ácido bicarbônico, ou sais desses, ou dióxido de carbono. Os exemplos específicos dos sais de ácido carbônico ou bicarbônico incluem carbonato de magnésio, 5 carbonato de amónio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de amónio, bicarbonato de sódio e bicarbonato de potássio. Além disso, o íon carbonato ou íon bicarbonato é adicionado em uma concentração de 0,001 a 5 M, preferivelmente de 0,1 a 3 M, mais preferivelmente, de 1 10 a 2 M. Quando o líquido de reação contém dióxido de carbono, a quantidade de dióxido de carbono contido é de 50 mg a 25 g, preferivelmente de 100 mg a 15 g e, mais preferivelmente, de 150 mg a 10 g por litro da solução.

A temperatura ótima para o crescimento da bactéria a 15 ser usada na reação da presente invenção fica geralmente na faixa de 25 a 35 °G. A temperatura da reação fica geralmente na faixa d 25 a 40 °C, preferivelmente na faixa de 30 a 37°G. O numero de células bacterianas usadas na reação é, sem limitação específica, de 1 a 7 00 g/L, preferivelmente 20 de 10 a 500- g/L e, mais preferivelmente, de 20 a 4 00 g/L. Q tempo de reação é preferivelmente de 1 a 168 horas e, mais preferivelmente, de 3 a 72 horas.

Para cultivar a bactéria, é necessário fornecer oxigénio por aeração e agitação. Por outro lado, o ácido 25 succínico pode ser produzido na reação com aeração e agitação, ou pode ser produzido na reação sob condições anaeróbicas, sem aeração, nem fornecimento de oxigênio. A expressão "condições anaeróbicas", no presente documento, significa que uma reação é conduzida ao mesmo tempo em que 30 se mantém baixa a concentração de oxigênio dissolvido na solução. Nesse caso, é preferível conduzir uma reação com uma concentração de oxigênio dissolvido de 0 a 2 ppm, preferivelmente de 0 a 1 ppm e, mais preferivelmente, de 0 a 0,5 ppm. Para essa finalidade, o método pode ser um 29/3-9 método no qual um vaso é hermeticamente selado para realizar a reação sob condições de ausência total de aeração; um método no qual um gás inerte, tal como gás nitrogênio, é fornecido e reagido; ou um método no qual se 5 realiza aeração com gás inerte contendo dióxido de carbono. © ácido succínico acumulado no liquido de reação (solução de cultura) pode ser isolado e purificado a partir do líquido de reação de acordo com procedimentos convencionais. Especificamente, o ácido succínico pode ser 10 isolado e purificado: por meio da remoção dos componentes sólidos- das células: bacterianas ou semelhantes por centrifugação, filtração ou semelhante, e dessalgamento com uma resina trocadora de ions ou semelhante, seguido por cristalização a partir da solução ou cromatografia de 15 coluna.

Além disso, na presente invenção, após a produção de ácido succínico pelo método da presente invenção conforme descrição acima, pode-se conduzir uma reação de polimerização usando o ácido succínico obtido como matéria 20 prima para produzir um polímero contendo ácido succínico.

Nos últimos anos, ao mesmo tempo em que o número de produtos industriais que respeitam o meio ambiente vem aumentando, os polímeros preparados usando-se matérias primas de origem vegetal têm atraído atenção. O ácido 25 succínico a ser produzido de acordo com a presente invenção pode ser processado como polímeros, tais como poliéster e poliamida. Exemplos específicos de polímeros contendo ácido succínico incluem um poliéster de ácido succínico obtido por meio da polimerização entre um diol, tal como 30 butanodiol ou etileno glicol e ácido succínico, e uma poliamida obtida por meio de polimerização entre uma diamina como hexametileno-diamina e ácido succínico. Além disso, o ácido succínico ou uma composição- contendo o ácido succínico que pode ser obtido pelo método da presente invenção pode ser usada para aditivos alimentares, produtos farmacêuticos, cosméticos e semelhantes. Exemplos Exemplo 1 Construção de um Vetor para Rompimento de Gene (A) Construção do pBS3 © plasmídeo pBS3 foi obtido por PCR usando-se o DNA cromossômico de Bacillus subtilis como template, ao passo que as SEQ ID NOs: 1 e 2 foram usadas como primers. A 10 reação de PCR foi conduzida usando-se LA tag (TaKaRa) de modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94 °C por 5 minutos e então um ciclo de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 49 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 2 minutos foi repetido 25 vezes. © 15 produto da PCR assim obtido foi purificado por procedimentos convencionais e então foi digerido com BgTII e BamHI, seguido por "blunt-endingr" (terminação abrupta) .

O fragmento foi inserido no sítio pHSG299 digerido com Avail e "blunt-ended". Q DNA foi usado para transformar 20 células competentes de Escherichia coli UM109 (TAKARA SHUZO CO., LTD.) e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 25 μg,/ml de canamicina (doravante aqui abreviada como Km), e em seguida foram cultivadas de um dia para o outro. Subsequentemente, as colônias que apareceram 25 foram colhidas e uma única colônia foi então isolada, e desse modo obteve-se um transformante. Um plasmídeo foi extraído do transformante resultante e um plasmídeo no qual o produto da PCR foi inserido recebeu o nome de pBS3. A Figura 1 mostra o procedimento para construção do pBS3. (B) Construção do pBS4Ç

Um plasmídeo, no qual o sítio Smal de um gene de resistência a Km presente no pBS3 é rompido por substituição de nucleotídeo sem causar qualquer substituxção de aminoácidos, foi obtido por PCR cruzada.

Primeiramente, a PCR. foi realizada usando-se o pBS3 como template e usando-se DNAs sintéticos de SEQ ID NOs: 3 e 4 da Listagem de Sequências como primers, para obter um produto amplificado da região N-terminal do gene de resistência a Km. Por outro lado, a fim de obter-se um produto amplificado da região C-terminal do gene de resistência a Km, a PCR foi conduzida usando-se o pBS3 como template e usando-se DNAs sintéticos de SEQ ID NOs: 5 e 6 da Listagem de Sequências como primers. A PCR foi conduzida usando-se Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) , de modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 98 °C por 5 minutos e então um ciclo de desnaturação a 98 °C por 10 segundos-, recozimento a 57 °C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 minuto foi repetido 25 vezes, produzindo assim o produto de PCR desejado.

As SEQ ID NOs: 4 e 5 da Listagem de Sequências são parcialmente complementares entre si, e o sitio Smal nas sequências foi rompido por substituição de nucleotideos, sem causar qualquer substituição de aminoácidos. Em seguida, para se obter um fragmento do gene mutante de resistência a Km contendo o sítio Smal rompido, os produtos- gênicos das- regiões N-terminal e C-terminal do gene de resistência a Km mencionado acima foram misturados em uma concentração aproximadamente equimolar, e a PCR foi conduzida usando-se a mistura de produtos gênicos com© template e DNAs sintéticos das SEQ ID NOs: 3 e 6 da Listagem de Seqüências como primers, obtendo-se desse modo um produto amplificado de um gene de resistência a Km no qual havia sido introduzida uma mutação. A PCR foi conduzida usando-se Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa), de modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 98°C por 5 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 98 °C por 10 segundos, recozimento a 57 °C por 30 segundos, e alongamento a 72°C por 1,5 minutos foi repetido 25 vezes, obtendo-se dessa maneira o produto de PCR desejado. 0 produto da PCR foi purificado de acordo com procedimentos convencionais e então digerido com Banll, seguido por inserção no sítio Banll no acima mencionado pBS3. 0 DNA 5 obtido foi usado para transformar células competentes de Escherichia coll JM109 (TAKARA SHUZO CO., LTD.) e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 25 μg de Km por ml, e em seguida foram cultivadas de um dia para o outro. Subseqüentemente, as colônias que 10 apareceram foram colhidas e uma única colônia foi isolada, obtendo-se assim um transformante. Extraiu-se o plasmídeo do transformante resultante e um plasmídeo no qual o produto da PCR foi inserido recebeu o nome de pBS4S. A Figura 2 mostra o processo de construção do pBS4S. Exemplo 2- Construção de uma Cepa com Gene sucEl Rompido (A) Clonagem de um Fragmento para Romper o Gene sucEl Um fragmento de um gene, no qual a ORE do gene sucEl derivado de Brevibacterium flavum MJ233 foi suprimida, foi 20 obtido por PCR cruzada usando-se oom© primers DNAs sintéticos que foram designados com base na seqüência de nucleotídeos ao redor de NCgl2130 do gene de

Gorpnebacterium glutamlcum ATCC13032 (No. de Acesso GenBank Database NC#003450), que já foi descrito. Especificamente, 25 a PCR foi conduzida de acordo com os procedimentos convencionais, usando-se um DNA cromossômico de

Brevibacterium flavum cepa MJ233 como template, e usando-se DNAs sintéticos das SEQ ID NOs: 7 e 8 da Listagem de Sequências como primers, para obter-se um produto 30 amplificado da região N-terminal do gene sucEl. Por outro lado, a fim de se obter um produto amplificado da região C- terminal do gene sucEl, foi conduzida a PCR de acordo com os procedimentos convencionais, usando-se um DNA genômico de Brevibacteriam flavum MJ233 como template e usando-se DNAs sintéticos das SEQ ID NOs: 9 e IQ da Listagem de Seqüências como primers. A PCR foi conduzida usando se Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa), de tai mode que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94 °C por 3 5 minutos e então um ciclo de desnaturação a 94° G por 30 segundos, recozimento a 60°C por 30 segundos e alongamento a 72 °C por 1 minuto foi repetido 30 vezes, obtendo-se desse modo o produto de PCR desejado. As SEQ ID NOs: 8 e 9 da Listagem de Sequências são complementares entre si e têm 10 estruturas nas quais as sequências inteiras de ORF em sucEl são suprimidas. Em seguida, a fim de se obter um fragmento do gene sucEl no qual uma seqüência interna é suprimida, os produtos gênicos das regiões N-terminal e C-terminal do acima mencionado sucEl foram misturados em uma concentração 15 aproximadamente equimolar e conduziu-se PCR de acordo com os procedimentos convencionais, usando-se a mistura dos produtos gênicos como template e usando-se DNAs sintéticos de SEQ ID NOs: 11 e 12 da Lista de Sequências como primers, obtendo-se um produto amplificado do gene sucEl com ORE 20 suprimida. A PCR foi realizada usando-se Pyrobest DNA

Polymerase (TaKaRa), de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94°C por 3 minutos e, então, um ciclo de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 58°C por 30 segundos, e alongamento a 72°C por 2 minutos 25 foi repetido 30 vezes, obtendo-se o produto de PCR desejado. © produto da PCR obtido desse modo foi purificado de acordo com os procedimentos convencionais e então digerido com BamHI, seguido por inserção no sitio BamHI do pBS4S construido no item (B) do Exemplo 1. © DNA obtido foi 30 usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (TAKARA SHÜZ© CO., LTD.) e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 100 μM de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal, e 25 μg:/ml de Km, sendo em seguida cultivadas de um dia para o outro.

Subseqüentemente, as colônias brancas que apareceram foram colhidas, e então uma única colônia foi isolada, obtendo-se dessa maneira um transformante. Plasmideo foi extraído do transformante resultante, e um plasmideo no qual o produto da PCR foi inserido recebeu a denominação pBSiSAsucEl. A Figura 3 mostra o processo de construção do plasmideo. (Bj Preparação de Cepa com sucEl rompido O pBSdSΔsucEl obtido no item (A) acima não contém uma região que possibilite a replicação autônoma em uma célula de uma bactéria corineforme. Portanto, quando uma bactéria corineforme é transformada com o plasmideo, uma cepa na qual o plasmideo é integrado em um cromossomo por recombinação homóloga aparece com uma frequência muito baixa como um t rans formant e. A Brevibacterium flavum, cepa MJ233ΔLDH (cepa MJ233Δ/LD:H descrita em JP 2005-95169 A) foi transformada pelo método de pulso elétrico, usando-se uma alta concentração do plasmideo pBS4SAsucEl e as células transformadas foram aplicadas em meio de agar DM-Dex (5 g/L glicose, 10 g/L polipeptona, 10 g/L extrato de levedura, 1 g/L KH2PO4, 0.4 g/L MgSO4-7H2©, 0.01 g/L FeS©4-7H2O, 0.01 g/L MnSOí-lHaO, 3 g/L uréia, 1.2 g/L hidrolisado de soja, pH 7.5 (KOH) e suplementado com agar 1,5%) contendo 50 μg de canamicina por ml e foram, em seguida, cultivadas à temperatura de 31,5°C por cerca de 24 horas. Deve-se notar que o plasmideo usado foi um plasmideo extraído de um transformante: de Escherichia coii SCSI 10 (Stratagene) transformada com pBS4SΔsucEl. Nos casos em que a recombinação homóloga ©corre entre o fragmento de gene sucEl do plasmideo e o mesmo gene no genoma d©: Brevibacterium flavum cepa MJ233, as colônias crescidas no meio precisam ter um gene resistente à canamicina e um gene SacB derivado do plasmideo no mesmo genoma. Subsequentemente, os recombinantes cruzados simples foram cultivados em um meio líquido: SM-Dex sem canamicina, a uma temperatura de 31,5°Ç de um dia para o outro e, após a diluição adequada, foram aplicados em um meio de agar Dex-SlO contendo 10% de sucrose e sem canamicina (100 g/L sucrose, 10 g/L polipeptona, 10 g/L extrato de levedura, 1 5 g/L KH2BO4, 0.4 g/L MgSOvlHaQ, 0.01 g/L FeS04-7H20, 0.01 g/L MnSO4-4H20, 3 g/L uréia, 1.2 g/L hidrolisado de soja, 10 μg/L bio tina, pH 7.5 (KQH), e suplementado com agar 1,5%;) e cultivados à temperatura de 31,5°C por cerca de 24 horas, produzindo desse modo clones resistentes à sucrose. As 10 cepas foram modificadas de modo a não expressarem um gene sacB normal e incluir cepas a partir das quais o pBS4SΔsucEl foi curado pela segunda recombinação homóloga. Além disso, as cepas submetidas à segunda recombinação homóloga incluem uma cepa em que o gene sucEl foi 15 substituído por um gene do tip© suprimido derivado de pBS4SΔsucEl e uma cepa na qual um gene sucEl reverteu-se em um gene do tipo selvagem. Pode-se verificar facilmente se o gene sucEl é do tipo mutante ou do tipo selvagem como segue: extraindo-se DNAs cromossômicos de células bacterianas obtidas por cultura em um meio de agar DEX-SIO, e detectando-se um gene sucEl por PCR. Entre os recombinantes resultantes do segundo- cruzamento, foi obtida uma cepa de um produto de PCR de tamanho menor que a obtida por PCR usando DNA cromossômico da cepa MJ233 como template 25 quando um gene sucEl é amplificado usando-se primers para amplificar o gene (SEQ ID NOs: 7 e 10 da Listagem de Sequências), e a cepa foi usada como cepa com sucEl suprimido nas experiências seguintes. A cepa com sucEl suprimido recebeu o nome de MJ233ΔldhΔsucEl. Exemplo 3

Construção de uma Cepa com sucEl Amplificado (A) Clonagem do Gene sucEl Dm plasmídeo para amplificar um gene sucEl derivado de Brevibacterium flavum, cepa MJ233, foi construído como í / - ô- segue. Realizou-se PCR usando como primers DNAs sintéticos das SEQ ID NOs: 13 e 14 da Listagem de Sequências, designadas com base na seqüência de nucleotídeos nas proximidades de NÇgl2130 de Corynebacterium glutamicum ATCG13032 (No. de Acesso Genbank Database NCOQ3450) e usando como template um DNA genômico de Brevibacterium flavum, cepa MJ233- A PCR foi conduzida usando-se Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) , de tal modo que foi realizado um ciclo de retenção de calor a 94°C por 3 minutos e então um ciclo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 60°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 2,5 minuto foi repetido 30 vezes, obtendo-se desse modo o produto de PCR desejado. Q produto de PCR obtido foi purificado de acordo com um método convencional, e digerido com Sse83871, seguido por inserção no sítio Sse83871 de pVK9. Q DNA obtido foi usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (TAKARA SHÜZ© CO., LTD.) e as células transformadas foram aplicadas em um meio LB contendo 100 μM IPTG, 40 μg/ml X-Gal, e 25 μg/ml Km, seguido por cultura de um dia para o outro. Depois disso, as colônias brancas que apareceram foram separadas e uma única colônia foi então isolada e desse modo obteve-se um transformante. Plasmídeo foi extraído do transformante resultante e um plasmídeo com estrutura mostrada na Figura 4 recebeu o nome de pVK9sucEl. Q pVK9 é um vetor shuttle produzido inserindo-se uma região envolvida na replicação autônoma em bactérias corineformes obtidas pela digestão de pHK4 (JP 05-007491) com BamHI e Kpnl e "blunt-ending", em um pHSG299 (Takara Bio) que foi digerido com Avail e "blunt-ended". (B) Criação de uma Cepa çpm sucEl Amplificado Brevibacterium flavum cepa MJ233ΔLDH e cepa MJ233ΔLDHΔsucEl foram transformadas com pVK9sucEl e pVK9 obtidos no item (A) respectivamente pelo método de pulso elétrico, e as células obtidas foram aplicadas em um meio CM-Dex agar (5 g/L glicose, 10 g/L polipeptona, 10 g/L extrato de levedura, 1 g/L KH2PO4, 0.4 g/L MgSO4-7H2©, 0.01 g/L FeSQ4-7H2O, 0.01 g/L MnSO4-7H2D, 3 g/L uréia, e 1.2 g/L 5 hidrolisado de so j a, pH 7.5 (KOH) , suplementado com agar 1,5%) contend© 2-5- μg/ml de canamicina e cultivadas a 31,5°G por cerca de 2 4 horas. As colônias que apareceram foram purificadas e plasmídeos foram extraídos por um método convencional, seguido por confirmação da introdução do 10 plasmideo desejado. Exemplo 4

Produção de Ácido Succinico pelas Cepas Modificadas, com sucEl Uma cepa obtida introduzindo-se pVK9 ou pVK9sucEl em 15 Brevibacterium flavum cepa MJ233Δldh (WO 2005/021770) e uma cepa obtida introduzindo-se pVK9 ou pVKSsucEl na cepa MJ233ΔldhΔsucEl foram respectivamente cultivadas para produzir acido succinico como segue. Células bacterianas obtidas por cultura em meio CM-Dex em placas foram 20 inoculadas em 20 ml de um meio de cultura semeado (20 g/L glicose, 1.4 g/L (MH4)2SQ4, 0.5 g/L KH2PO4, 0.5 g/L K2HPG4, 0.5 g/L MgSQ4-7H2O, 4 g/L uréia, 0.02 g/L FeS04-7H20, 0.02 g/L MnSO4-7H2O7 200 μg/L biotina, 200 μg/L VBl-HCl, 1 g/L extrato de levedura, e 1 g/L ácido casamino) e foram 25 cultivadas com agitação sob condições aeróbicas a 31,5 °C em um frasco Sakaguchi, por cerca de 8 horas. Depois disso, 700 μl da solução de cultura semeada foram coletados e imediatamente misturados com 700 μl de um meio de cultura principal (carbonato de magnésio 30 esterilizado por calor seco foi misturado em uma concentração final de 143 g/L com uma solução contendo 200 g/L de glicose e 30 g/L de sulfeto de sódio que foram. submetidos à filtração! em um tubo Eppendorf, seguido por agitação da cultura a 31,5 °C. 48 horas mais tarde, a cultura foi interrompida e a quantidade de ácido succínico produzido foi analisada por cromatografia líquida. Na análise, duas colunas Shim-pack SCR-102H (Simadzu) foram conectadas em série, e amostras foram eluídas com 5 mM de ácido p-toluenosulfônico a 40°C. Os eluatos foram neutralizados com 20 mM de solução Bis-Tris contendo 5 mM de acido p-toluenosulfônico e 100 μM de EDTA e as condutividades elétricas foram medidas usando-se CDD-IOAD (Simadzu) para medir a quantidade de ácido succínico. A Tabela 1 mostra os resultados da avaliação de várias amostras de cepas bacterianas.

No caso de MJ233Δldh/pVK9sucEl:, verificou-se que a quantidade de ácido succínico acumulado era cerca de 1,5 vez maior que a quantidade no caso de M1233Δldh/pVK9. Os resultados revelaram que o aumento da expressão de sucEl é eficaz para a produção fermentativa de ácido succínico.

Por outro lado, no caso da cepa MJ233ΔldhΔsucEl/pVK9, não houve qualquer acúmulo de ácido succínico. Esse fato significa que a perda de um gene sucEl de uma bactéria produtora de ácido succínico diminui significativamente a capacidade de produzir ácido succínico. No caso da cepa MJ233ΔldhΔsucEl/pvK9sucEl, obtida pela complementação de sucEl na cepa que teve o sucEl suprimido com um plasmídeo, verificou-se que a quantidade de ácido succínico acumulado foi maior que a quantidade acumulada no caso de Md233ΔldhΔsucEl/pVK9. O número de cópias do pVK9 em uma célula foi de cerca de 10; portanto, quando o pVK9/sucEl é introduzido na cepa MJ233ΔldhΔsucEl, o nível de expressão do sucEl é mais alto do que o nível de expressão no caso de uma cepa do tipo selvagem. Os resultados mostram que o aumento da expressão de sucEl é eficaz para a produção do ácido succínico. Tabela 1 Produção de Ácido Succínico por Cepas. Modificadas cpm sucEl

Aplicabilidade Industrial

De acordo com © processo de produção da presente invenção, ácido succínico pode ser produzido rapidamente com alta eficiência- 0 ácido succínico obtido pode ser 5 usado como aditivo alimentar, medicamento, cosmético, e assim por diante. Além disso, usando-se o ácido succínico obtido como matéria prima, também é passível produzir um polímero contendo ácido succínico por meio de uma reação de polimerização.

Claims (5)

1. Método para produzir ácido succínico, caracterizado por compreender (a) transformar uma bactéria que compreende os nucleotídeos 571 a 2187 de Seq ID n° 15 (gene sucEl) com um vetor recombinante compreendendo os nucleotídeos 571 a 2187 de Seq ID n° 15 (gene sucEl) de modo a aumentar o número de cópias do gene sucE1; (b) contatar a bactéria obtida em (a) ou suas células imobilizadas ou esmagadas com uma matéria prima orgânica em uma solução de reação contendo íon carbonato, íon bicarbonato ou dióxido de carbono para produzir ácido succínico e (c) coletar o ácido succínico produzido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por bactéria ser selecionada a partir de um grupo que consiste de bactéria corineforme, bactéria Bacillus, e bactéria Rhizobium.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pela bactéria ser modificada de modo que a atividade lactato desidrogenase seja decrescida por meio de mutação ou exclusão de um gene que codifica lactato desidrogenase.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela bactéria ser modificada de modo que a atividade de piruvato carboxilase seja aumentada por meio de transformação da bactéria com um vetor recombinante que compreende um gene que codifica piruvato carboxilase.

5. Método para produzir um polímero que contém ácido succínico, selecionado de um grupo que consiste de poliéster de ácido succínico e ácido succínico poliamida, caracterizado por compreender as etapas de: produzir ácido succínico pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4; e polimerizar o ácido succínico obtido.

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