BRPI0414764B1

BRPI0414764B1 - Method for purifying succinic acid from fermentation

Info

Publication number: BRPI0414764B1
Application number: BRPI0414764-2A
Authority: BR
Inventors: Kushiki Takeshi; Satou Takeru; Sano Chiaki; Fujiwara Kenji
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2017-09-05
Also published as: EP1669459A4; CN1860237A; EP1669459B1; JPWO2005030973A1; US20060276674A1; JP4631706B2; WO2005030973A1; EP1669459A1; BRPI0414764A; BRPI0414764B8; CN100534972C

Description

MÉTODO PARA PURIFICAR ÁCIDO SUCCÍNICO A PARTIR DE CALDO DE FERMENTAÇÃO Área Técnica A presente invenção refere-se a uma técnica para purificar ácido succínico a partir de um caldo de fermentação em que se acumula um sal de ácido succínico. Técnica Antecedente Nos anos recentes, o ácido succínico chama a atenção como uma matéria prima de polímeros biodegradáveis. Além disso, o ácido succínico é amplamente usado como uma matéria prima de produtos químicos especiais como um intermediário do carbono 4. Para usar o ácido succínico como matéria prima de polímeros biodegradáveis e produtos químicos especiais é necessário produzir ácido succínico de alto teor de pureza a baixo custo. Isso acontece porque as impurezas contidas na matéria prima de ácido succínico podem inibir uma reação para produzir um produto final a partir do ácido succínico, ou degradar a qualidade do produto final.

Conseguintemente, para produzir ácido succínico para ser usado como matéria prima de polímeros ou produtos químicos especiais por fermentação ou por um método enzimático, é necessário remover eficientemente as impurezas de um caldo de fermentação ou mistura de reação enzimática que contêm uma grande quantidade de impurezas e produzir ácido succínico a baixo custo.

Na produção de ácido succínico por fermentação ou por um método enzimático, geralmente se acrescenta um contra-íon a um meio ou a uma solução de reação enzimática para manter o pH otimal. Portanto, o ácido succínico frequentemente existe na forma de um sal em um caldo de cultura ou em uma mistura de reação enzimática em que está acumulado o ácido succínico. Portanto, o contra-íon acrescentado ao meio de fermentação ou solução de reação enzimática precisa ser removido para que se produza um ácido succinico com alto teor de pureza. Além disso, o caldo de fermentação contém uma grande quantidade de impurezas, tais como outros ácidos e aminoácidos orgânicos, e essas impurezas também precisam ser removidas de modo eficiente.

Como métodos para produzir ácido succinico de alto teor de pureza, métodos que usam uma resina trocadora de ions, métodos que usam um sal dificilmente solúvel de ácido succinico, métodos que utilizam eletrodiálise e assim por diante foram relatados até o momento.

Os métodos que usam uma resina trocadora de ions são, grosso modo, classificados em métodos que usam uma resina trocadora de ânions e métodos que usam uma resina trocadora de cátions fracamente acidica.

Como método que usa uma resina trocadora de ânions, foi relatado um método que consiste em fazer uma matéria prima liquida contendo um sal de ácido succinico entrar em contato com uma resina trocadora de ânions para permitir que a resina adsorva o ácido succinico e, então, eluir o ácido succinico com um solvente orgânico, amônia aquosa ou semelhante (Vide Patentes - documentos 1 e 2). Entretanto, nesse método é preciso remover e coletar um solvente orgânico ou álcali como a amônia contida no eluato e isso complica o processo.

Além disso, foi relatado um método que consiste em permitir que uma resina trocadora de cátions adsorva um contra-ion para ácido succinico e coletar ácido succinico como uma solução de fluxo de travessia (Vide Patente -documento 3). No entanto, esse método tem um problema: como a resina trocadora de ions a ser usada é uma resina trocadora do cátions fracamente acidica, o contra-ion para ácido succinico no líquido de matéria prima fica limitado à amônia, e o método não pode ser aplicado a sais de ácido succínico com outros contra-íons.

Como método que usa um sal dificilmente solúvel de ácido succínico, é conhecido um método que consiste em acrescentar ion cálcio a um liquido de matéria prima contendo um sal de ácido succínico e coletar succinato de cálcio como um precipitado (Patente - Documento 4) . Porém, esse método tem um problema no sentido de que a remoção do sal de cálcio como produto secundário gerado por ocasião da remoção do cálcio do precipitado é complicada.

As Patentes - documentos 5 e 6 descrevem métodos que utilizam eletrodiálise. Entretanto, esses métodos têm um problema no sentido de que é difícil remover outro ácido orgânico (ácido acético) contido no líquido de matéria prima, pois ele mostra o mesmo comportamento que o ácido succínico.

Entrementes, como método para coletar um ácido orgânico tal como o ácido succínico de uma solução aquosa que contém o ácido orgânico, foi relatado um método para ajustar a concentração de ion hidrogênio na solução aquosa no nível necessário para ligar um ânion do ácido orgânico ou mais usando uma resina trocadora de íons tipo-H. (Patente - documento 7) . Descreve-se que, quando a concentração de ion hidrogênio é ajustada no nível necessário para ligar um ânion do ácido orgânico nesse método, uma concentração de 1 a 10¾ mais alta do que a concentração equivalente é preferível. Entretanto, é difícil remover completamente os cátions contidos em um caldo de fermentação como contra-ions para ácido succínico, mesmo que a concentração de ion hidrogênio seja ajustada na referida concentração; portanto, surge um problema de diminuição da pureza do ácido succínico.

(Patente - Documento 1) JP 62-238231A (Patente - Documento 2) Patente U.S. No. 5.132.456 (Patente - Documento 3) JP 62-238232A (Patente - Documento 4) JP 62-294090A (Patente - Documento 5) JP 02-283289A (Patente - Documento 6) JP 03-151884A (Patente - Documento 7) W001/66508 Descrição da Invenção Um objetivo da presente invenção é prover um método para purificar ácido succinico de alto teor de pureza, com bom rendimento, a partir de um caldo de fermentação ou de uma mistura de reação enzimática em que se acumulou um sal de ácido succinico.

Os inventores da presente invenção estudaram com afinco a fim de alcançar o objetivo mencionado acima. Como resultado, descobriram que as impurezas em um líquido que contém ácido succinico podiam ser eficientemente removidas combinando-se troca de íons usando certa quantidade ou mais de uma resina trocadora de cátions fortemente ácida tipo H com a cristalização do ácido succinico e, desse modo, o ácido succinico podia ser produzido com alto teor de pureza e bom rendimento e, assim sendo, realizaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê o seguinte: (1) Um método para purificar o ácido succinico a partir de um liquido que contém ácido succinico e que contém um cátion que é obtido por fermentação ou por um método enzimático, que consiste em fazer o liquido que contém ácido succinico entrar em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acidica tipo H em uma quantidade equivalente ou maior do que a quantidade de cátions que não íons hidrogênio contidos no líquido que contém ácido succinico, e precipitar um cristal de ácido succinico a partir do líquido tratado com troca de íons obtido, obtendo ácido succinico purificado. (2) 0 método de acordo com (1), em que o líquido que contém ácido succinico contem um sal de ácido succinico. (3) 0 método de acordo com (2), em que o sal de ácido succínico é selecionado entre succinato de sódio, succinato de potássio, succinato de magnésio, succinato de cálcio e succinato de amônio. (4) O método de acordo com (3), em que o líquido contendo ácido succínico contém um sal de ácido carbônico, e o líquido contendo ácido succínico é acrescido de um ácido a ser ajustado em pH 5,0 ou abaixo disso e, então, é posto em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H. (5) O método de acordo com (4), em que o líquido tratado com troca de íons é usado como o ácido. (6) O método de acordo com (4), em que o líquido tratado com troca de íons do qual o ácido succínico precipitado foi removido é usado como o ácido. (7) Um método para produzir ácido succínico, que consiste em permitir que células microbianas ou células bacterianas tratadas ajam sobre uma matéria prima orgânica em uma solução de reação aquosa para obter um líquido contendo ácido succínico, colocar o líquido contendo ácido succínico em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H em uma quantidade equivalente ou maior do que a quantidade de cátions que não os íons hidrogênio contidos no líquido que contém o ácido succínico, e precipitar um cristal de ácido succínico a partir do líquido tratado com troca de íons obtido, obtendo ácido succínico purificado. (8) O método de acordo com (7) em que a solução de reação aquosa é neutralizada com carbonato de magnésio ou hidróxido de magnésio.

Descrição das Incorporações Preferenciais O método da presente invenção é um método para purificar ácido succínico a partir de um líquido que contém ácido succínico contendo um cátion que é obtido por fermentação ou por um método enzimático, que consiste em colocar o liquido que contém ácido succinico em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H em uma quantidade equivalente ou maior do que a quantidade de cátions que não os ions hidrogênio contidos no liquido que contém o ácido succinico, e precipitar um cristal de ácido succinico do liquido tratado com troca de ions obtido, para obter ácido succinico purificado.

Doravante a presente invenção será explicada com detalhes. <1> Preparação do líquido que contém ácido succinico O líquido que contém ácido succinico contendo cátions que é obtido por fermentação ou por um método enzimático ao qual se aplica a presente invenção não é especialmente limitado, desde que contenha ácido succinico e cátion que não íon hidrogênio. Exemplos específicos do mesmo incluem caldo de fermentação contendo ácido succinico, e uma mistura de reação obtida usando-se uma bactéria que catalise uma reação para produzir ácido succinico a partir de uma fonte de carbono ou uma matéria prima ou intermediária da síntese do ácido succinico, células bacterianas tratadas, uma enzima e assim por diante. 0 líquido que contém ácido succinico contém, preferivelmente, um sal de ácido succinico, preferivelmente um sal neutro de ácido succinico. Exemplos específicos do sal incluem succinato de sódio, succinato de potássio, succinato de magnésio, succinato de cálcio, succinato de amônio e assim por diante. 0 método para produzir o líquido que contém ácido succinico na presente invenção não é especialmente limitado e podem ser usados, por exemplo, os métodos descritos em JP05-68576A e JP 11-196888A. Especificamente, um líquido que contém ácido succinico pode ser obtido permitindo-se que as células de uma bactéria que pertença ao gênero Brevibacteríum e que tenha capacidade de produzir ácido succinico, ou células bacterianas tratadas, ajam sobre uma solução de reação aquosa contendo uma matéria prima orgânica tal como ácido fumárico ou um sal do mesmo.

Exemplos do microorganismo citado acima incluem bactérias corineformes aeróbicas como a Brevibacteríum flavum da linhagem MJ-233, a Brevibacteríum flavum da linhagem MJ-233-AB-41 e assim por diante. A linhagem MJ-233 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Ciência e Tecnologia Industrial, Ministério do Comércio e Indústria Internacional) (Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão), em 28 de abril de 1975 e foi-lhe atribuído o número de acesso FERM P-3068. Depois o depósito foi convertido em um depósito internacional conforme as disposições do Tratado de Budapeste em 01 de maio de 1981, com o número de acesso FERM BP-1497. A linhagem MJ-233-AB-41 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão), em 17 de novembro de 1976, e foi-lhe atribuído o número de acesso FERM P-3812. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste em 01 de maio de 1981, com o número de acesso FERM BP-1498. O microorganismo a ser usado na presente invenção não está especialmente limitado às bactérias que pertencem ao gênero Brevibacteríum, desde que ele produza ácido succinico. Exemplos do referido microorganismo incluem microorganismos pertencentes ao gênero Cândida (JP 56- 17077Β), Anaerobiospírillum succíníciproducens, ou semelhantes. A solução de reação mencionada acima pode ser acrescida com nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido e/ou oxidado. A concentração a ser acrescentada é de 0,1 a 50 mM, preferivelmente de 1 a 40 mM.

Os microorganismos como as bactérias corineformes aeróbicas podem ser modificados de modo que a atividade intracelular da piruvato carboxilase (PC) seja intensificada. Por exemplo, a atividade da PC pode ser intensificada transformando-se um microorganismo com um gene que codifique para PC. Exemplos do gene de PC a ser usado incluem genes derivados de microorganismos, animais ou plantas e, mais especificamente, genes derivados do homem, camundongo, rato, levedura ou microorganismos pertencentes aos gêneros Corinebacterium, Bacillus, Rhizobium ou Escheríchía. A aquisição do gene de PC e das bactérias que produzem ácido succínico em que se introduz o gene de PC está descrita em JP 11-196888A. Além disso, espera-se também que a capacidade de produção de ácido succinico melhore intensificando-se a atividade da fosfoenol piruvato carboxilase de um microorganismo (JP 07-83714B, JP 09-121872A).

Exemplos específicos do gene de PC e de plasmídeo que contém o gene incluem pPC-PYC2 e o gene de PC (PYC2) contido no referido plasmídeo, que é derivado de Saccharomyces cerevisiae, conforme descrição em JP 11-196888A. Um outro gene de PC (PYC1) derivado de Saccharomyces cerevisiae também pode ser usado.

Quando se usa uma bactéria corineforme aeróbica, especialmente uma bactéria em que foi introduzido o gene de PC, e permite-se que a referida bactéria ou células tratadas da mesma ajam sobre uma solução de reação aquosa contendo uma matéria prima orgânica, a solução de reação deve conter preferivelmente íon carbonato, íon hidrogenocarbonato, ou gás dióxido de carbono. Além isso, essa reação é realizada preferivelmente sob condição anaeróbica.

Para usar uma bactéria corineforme aeróbica no método da presente invenção, podem-se usar células bacterianas após cultivo sob uma condição aeróbica geral. Como meio a ser usado para a cultura, podem-se empregar os meios que são usados para a cultura convencional de microorganismos. Por exemplo, pode ser usado um meio comum obtido adicionando-se nutrientes naturais como extrato de carne, extrato de levedura e peptona a uma composição consistindo de sais inorgânicos como sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de magnésio.

Após a cultura, as células bacterianas são coletadas por centrifugação, separação por membrana ou semelhante, e são usadas como estão ou como células bacterianas tratadas para a reação descrita abaixo. A expressão "células bacterianas tratada" usada no presente documento significa, por exemplo, células bacterianas imobilizadas com acrilamido, carrageenan ou semelhante, células rompidas, um sobrenadante da centrifugação das mesmas, ou uma fração que tenha a atividade da PC obtida purificando-se parcialmente o sobrenadante por meio de um tratamento com sulfato de amônio ou semelhante.

Para a solução de reação usa-se água, tampão, meio ou semelhante, e um meio contendo sais inorgânicos adequados é especialmente preferencial. A matéria prima orgânica a ser usada na presente invenção não é especialmente limitada, desde que possa ser convertida em ácido succinico na fermentação e possa ser selecionada entre matérias primas orgânicas comuns. Especificamente, são usados de preferência a glicose e o etanol, que não são dispendiosos e proporcionam uma alta taxa de produção de ácido succinico. Nesse caso, a concentração da glicose a ser acrescentada é preferivelmente de 0,5 a 500 g/L e a do etanol é preferivelmente de 0,5 a 30 g/L.

Além disso, os exemplos de matérias primas orgânicas a serem usadas com métodos enzimáticos incluem ácido fumárico ou um sal do mesmo, tal como o fumarato de sódio e o fumarato de amônio.

Quando se usam células microbianas vivas para a produção do liquido que contém ácido succinico, é difícil distinguir rigorosamente se o ácido succinico é produzido por fermentação ou por uma reação enzimática. Desde que um liquido contendo um cátion e ácido succinico possa ser obtido como resultado, o fato do ácido ser produzido por fermentação ou por uma reação enzimática não constitui um problema na presente invenção.

Geralmente é preferível adicionar-se um cátion como contra-íon para ácido succinico a fim de manter o pH otimal da solução de reação. No entanto, o referido contra-íon não precisa ser necessariamente acrescentado. O contra-íon para ácido succinico não é especialmente limitado, desde que o cátion não iniba a fermentação ou a reação enzimática. Como contra-íon para ácido succinico, geralmente se usa íon sódio, íon potássio, íon magnésio, íon cálcio, íon amônio ou uma combinação dos mesmos e, preferivelmente, usa-se íon sódio, íon potássio, íon magnésio, íon amônio ou uma combinação dos mesmos. A solução de reação é neutralizada preferivelmente com carbonato de magnésio e/ou hidróxido de magnésio, porque a taxa de produção e o rendimento de ácido succinico podem ser melhorados. A solução de reação é mantida preferivelmente com um pH de 5 a 10, e mais preferivelmente com pH de 6 a 9,5.

Quando se usa uma solução de reação contendo íon carbonato, ou íon hidrogenocarbonato, ou gás dióxido de carbono para a preparação do liquido que contém ácido succínico, adiciona-se íon carbonato ou íon hidrogenocarbonato em uma concentração de 1 a 500 mM, preferivelmente de 2 a 300 mM, mais preferivelmente de 3 a 200 mM. Quando o gás dióxido de carbono está contido na solução, de 50 mg a 25 g, preferivelmente de 100 mg a 15 g e, mais preferivelmente de 150 mg a 10 g de gás dióxido de carbono devem estar contidos para cada litro da solução.

Além disso, a condição anaeróbica citada acima significa que a reação é realizada ao mesmo tempo em que se mantém uma baixa concentração de oxigênio dissolvido na solução. A reação se realiza preferivelmente com uma concentração de oxigênio dissolvido de 0 a 2 ppm, mais preferivelmente de 0 a 1 ppm, e ainda mais preferivelmente de 0 a 0,5 ppm. Os exemplos de métodos para a referida reação incluem uma reação em um vaso selado sem qualquer ventilação, uma reação com fornecimento de um gás inerte como um gás nitrogênio, um método usando ventilação com um gás inerte contendo gás dióxido de carbono, e assim por diante. A reação geralmente é realizada a uma temperatura de 15 a 45°C, preferivelmente de 25 a 37°C. A reação é realizada com pH de 5 a 9, preferivelmente de 6 a 8. A reação geralmente é realizada por 5 a 120 horas. A quantidade de células bacterianas a serem usadas para a reação não é especialmente limitada, e elas são usadas em uma quantidade de 1 a 700 g/L, preferivelmente de 10 a 500 g/L, mais preferivelmente de 20 a 400 g/L. Quando se usam células bacterianas tratadas, elas são usadas preferivelmente em uma quantidade correspondente à quantidade de células bacterianas citada acima.

Os exemplos de células bacterianas tratadas mencionados acima incluem células bacterianas imobilizadas com acrilamido, carrageenan ou semelhante, células bacterianas rompidas, um sobrenadante da centrifugação das mesmas, uma fração obtida purificando-se parcialmente o sobrenadante por meio de um tratamento com sulfato de amônio ou semelhante, e assim por diante. 0 liquido que contém ácido succínico obtido conforme a descrição acima geralmente contém um cátíon como contra-íon para ácido succínico, ácidos orgânicos além do ácido succínico, aminoácidos, sais inorgânicos, proteínas, sacarídeos, lipídeos, células bacterianas, e assim por diante. <2> Troca de íons Na presente invenção, o líquido que contém ácido succínico obtido conforme a descrição acima é posto em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H em uma quantidade equivalente ou maior do que a quantidade de outros cátions que não os íons hidrogênio contidos no líquido que contém ácido succínico, e o cristal de ácido succínico é precipitado a partir do líquido tratado com troca de íons para se obter ácido succínico purificado.

Antes do processo de troca de íons ou cristalização, as células bacterianas ou células bacterianas tratadas são preferivelmente separadas do caldo de fermentação ou da mistura de reação enzimática. Em geral, esse procedimento é realizado de preferência antes da troca de íons, mas pode ser realizado após a troca de íons e antes do processo de cristalização. 0 método para separar células bacterianas ou células bacterianas tratadas do líquido que contém ácido succínico não é particularmente limitado, e quaisquer métodos usados comumente para a separação de células bacterianas, tais como filtração, centrifugação e uma combinação dos mesmos podem ser empregados.

Além disso, se um líquido que contém ácido succínico que contém íon carbonato, íon hidrogenocarbonato ou gás dióxido de carbono for posto em contato com uma resina trocadora de ions fortemente acídica tipo Η, o pH do liquido é reduzido como resultado da troca de ion e cátion hidrogênio e o ion carbonato e o ion hidrogenocarbonato recebem íon hidrogênio e são liberados como dióxido de carbono. Como o liquido pode borbulhar fortemente nessa hora, o procedimento de troca de ions pode se tornar muito difícil. Portanto, é preferível acrescentar um ácido ao líquido que contém o ácido succínico antes da troca de ions, para tornar o líquido acídico e, desse modo, causar decarbonilação. A condição acídica mencionada acima tem preferivelmente pH 5 ou inferior, mais preferivelmente pH 4,8 ou inferior. Embora o ácido a ser acrescentado não seja particularmente limitado, geralmente são usados ácidos não dispendiosos como o ácido hidroclórico e o ácido sulfúrico Além disso, como ácido a ser adicionado, pode-se usar o líquido que contém o ácido succínico após a operação de troca de ions descrita mais adiante (líquido tratado com troca de ions), ou o líquido tratado com troca de ions do qual o ácido succínico precipitado foi removido (líquor mãe após a remoção do ácido succínico cristalizado). Como esse líquido tratado com troca de ions e esse líquor mãe têm um pH baixo, eles são eficazes para baixar o pH do caldo de fermentação. Além do mais, eles têm a vantagem de nem diminuir o rendimento, nem aumentar o custo por descarte do ácido excedente, porque o líquido acrescentado pode ser reciclado repetindo-se os processos do método da presente invenção. 0 liquido que contém o ácido succínico, preferivelmente o liquido que contém o ácido succínico submetido a um tratamento de remoção de células e, se necessário, um tratamento de decarbonilação, é posto em contato cora uma resina trocadora de cátions tipo H. Por meio desse procedimento de troca de ions, os cátions e aminoácidos existentes no líquido que contém o ácido succínico são adsorvidos na resina trocadora de ions e, desse modo, são removidos. Os inventores da presente invenção descobriram que não apenas os aminoácidos básicos, mas também os aminoácidos neutros e acídicos haviam sido removidos por esse procedimento. Um caldo de fermentação geralmente tem um pH próximo do neutro. Nessa região do pH, os aminoácidos básicos são positivamente carregados, os aminoácidos neutros não são dissociados, e as aminoácidos acídicos são negatívamente carregados. Portanto, os aminoácidos acídicos e neutros não são adsorvidos na resina trocadora de cátions. Porém, se uma matéria prima líquida contendo sal de ácido succínico for posta em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acídica do tipo H, os cátions como contra-íons para ácido succínico são removidos da matéria prima líquida e substituídos por íon hidrogênio, resultando na redução do pH. Considera-se que, como resultado, os aminoácidos neutros e acídicos também são positivamente carregados e adsorvidos na resina trocadora de cátions. A resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H a ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, e podem ser usadas tanto as de nível alto como as de nível baixo de ligação cruzada. Além disso, podem ser usadas tanto as resinas do tipo gel como as do tipo poroso. Os exemplos específicos das mesmas incluem, sem limitação, as resinas disponíveis no mercado DIAION SK1B, SK104, SK110, PK212, PK216 (Mitsubishi Chemical Corporation), esses mesmos produtos com outras graduações e assim por diante.

Na presente invenção, uma resina trocadora de ions fortemente acídica precisa ser convertida para o tipo H antes do uso. 0 método para conversão ao tipo H não é particularmente limitado, e podem ser empregados os métodos usados comumente. Qualquer um dos métodos do tipo lote, método tipo coluna única e método tipo coluna múltipla pode ser usado (Kagaku Kogaku Binran (Chemical Engineering Handbook), 4a Edição Revisada, organizado pela Sociedade de Engenheiros Químicos, Japão, Maruzen). Além disso, usa-se um ácido para a conversão ao tipo H, e seleciona-se um ácido tendo pKa inferior ao pK da resina trocadora de íons fortemente acídica. Além disso, preferivelmente o ácido não tem capacidade de oxidação que causa a degradação da resina trocadora de íons. Qualquer ácido pode ser usado na presente invenção, desde que esses requisitos sejam satisfeitos. Em geral, usa-se como ácido o ácido hidroclórico, ácido sulfúrico diluído e semelhantes, mas sem limitação. 0 método para fazer o liquido que contém o ácido succínico entrar em contato com a resina trocadora de íons fortemente acídica tipo H não é especialmente limitado e podem-se empregar os métodos comumente usados conforme descrição acima. Qualquer método do tipo por lotes, método do tipo coluna única e método do tipo coluna múltipla pode ser empregado (Kagaku Kogaku Binran (Chemical Engineering Handbook}, 4a Edição Revisada, organizado pela Sociedade de Engenheiros Químicos, Japão, Maruzen). Geralmente é empregado um método de coluna, em que o líquido que contém o ácido succínico é passado através de uma coluna preenchida com a resina trocadora de íons fortemente acídica tipo H, embora também se possa usar um método por lotes.

Na presente invenção, o líquido obtido fazendo-se o líquido que contém o ácido succínico entrar em contato com a resina trocadora de íons fortemente acídica tipo H é definido como um líquido de fluxo de travessia.

Wa presente invenção, é necessário que a capacidade de troca da resina trocadora de íons fortemente acidica tipo H seja equivalente ou superior à quantidade de cátions que não os ions hidrogênio contidos no líquido que contém o ácido succínico. A expressão "cátions que não os íons hidrogênio" usada no presente documento inclui os aminoácidos que são negativamente carregados durante o tratamento de troca de íons conforme descrição acima, bem como cátions metálicos. As impurezas no líquido que contém o ácido succínico podem ser efetivamente removidas usando-se uma resina trocadora de íons fortemente acidica tipo H que tenha uma capacidade de troca equivalente ou superior à quantidade de cátions. Em especial, íons como íon sódio, íon potássio, íon magnésio e ion amônio e aminoácidos como serina, ácido glutâmico, alanina, valina, metionina e tirosina, que são difíceis de remover completamente apenas por cristalização, podem ser removidos eficientemente. A concentração total de cátions que não íon hidrogênio no líquido do fluxo de travessia é desejavelmente de 1,0% ou menos, preferivelmente de 0,51 ou menos, em relação ao ácido succínico.

Entre os cátions que não íon hidrogênio contidos no líquido que contém o ácido succínico ou no líquido do fluxo de travessia, a concentração de cátions metálicos pode ser medida, por exemplo, por um método de eletrodo íon-seletivo, método de absorção atômica, cromatografia de íons ou semelhante, e a concentração de aminoácidos pode ser medida usando-se um analisador de aminoácidos (Analytical Instrument Guide, 9a Edição, 5 de setembro de 2001, Associação de Fabricantes de Instrumentos Analíticos do Japão) ou semelhante. <3> Cristalização O cristal de ácido succínico é precipitado a partir do líquido que contém o ácido succínico que foi submetido à troca de íons. Os exemplos do método para precipitar o cristal incluem concentração, resfriamento do líquido tratado com troca de íons, ou acréscimo de um solvente orgânico no líquido tratado com troca de íons, ou uma combinação dos mesmos. 0 ácido succínico purificado pode ser obtido por esse procedimento. Em especial, os ácidos orgânicos que não o ácido succínico, bem como íon carbonato, íon amônio e assim por diante, que não podem ser completamente removidos pela cristalização, decarbonilação ou troca de íons, são removidos eficientemente por esses procedimentos.

As condições do procedimento de concentração não são particularmente limitadas e geralmente se usa a concentração a vácuo. Entretanto, a concentração não se limita a esse método, e pode-se empregar a concentração usando membrana de osmose inversa (Kagaku Kogaku Binran, 4a Edição Revisada, 1978, Maruzen), concentração usando eletrodíálise (Food Membrane Technology, 1999, Korin) e assim por diante. A concentração a vácuo é realizada preferivelmente sob uma pressão de 50 kPa ou inferior, preferivelmente 25 kPa ou inferior, especialmente preferível 15 kPa ou inferior.

Para precipitar cristal de ácido succínico por procedimento de concentração, o líquido é concentrado em uma concentração mais alta do que a solubilidade do ácido succínico. A solubilidade do ácido succínico é descrita, por exemplo, em Kagaku Binran Basic Part II, 2a Edição Revisada (Sociedade Química do Japão, 1975, Maruzen) e assim por diante.

Para precipitar o cristal de ácido succínico por resfriamento, o resfriamento é realizado de modo que o líquido seja resfriado a uma temperatura em que a concentração do ácido succínico no liquido se torna inferior à solubilidade do ácido succiníco. A solubilidade do ácido succinico é descrita, por exemplo, em Kagaku Binran Basic Part II, 2a Edição Revisada (Sociedade Química do Japão, 1975, Maruzen) e assim por diante.

Para precipitar o cristal de ácido succinico acrescentando um solvente orgânico, acrescenta-se um solvente orgânico como metanol ou etanol. A solubilidade do ácido succinico em um solvente orgânico é descrita, por exemplo, em Kagaku Binran Basic Part II, 2a Edição Revisada (Sociedade Química do Japão, 1975, Maruzen) e assim por diante. 0 ácido succinico pode ser cristalizado apenas por concentração, resfriamento ou acréscimo de um solvente orgânico, ou por uma combinação desses. 0 cristal precipitado é separado do líquor mãe de uma maneira convencional. Os exemplos de métodos de separação incluem, sem limitação, a filtração, filtração centrífuga, sedimentação centrífuga, etc.

Exemplos A presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos seguintes exemplos.

Exemplo de Referência 1: Construção de linhagem ampliada do gene da PC <1> Clonagem de um fragmento de DNA derivado da levedura Saccharomyces cerevisiae (PYC2) (A) Extração de um DNA total de Saccharomyces cerevisiae A linhagem W303-1A de Saccharomyces cerevisiae (Yeast, Vo91.2, pp. 1630167 (1986)) foi inoculada em 1 L de meio de crescimento de levedura (YPAD) [composição: 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glicose, 100 mg de adenina e 1000 ml de água destilada] usando-se uma alça de platina; foi cultivada até a fase tardia de crescimento logarítmico a 30°C, e as células foram coletadas.

As células obtidas foram suspensas a uma concentração de 10 mg/ml em 15 ml de uma solução contendo 10 mg/ml de lisozima, 10 mM NaCl, 20 mM tampão Tris (pH 8,0) e 1 iH EDTA*2Na (a concentração de cada componente é a concentração final). Então, a suspensão foi acrescida com proteinase K a uma concentração final de 100 μ5/ιη1 e foi incubada a 37 °C por uma hora. Então, a suspensão foi acrescida com dodecilsulfato de sódio (SDS) a uma concentração final de 0,5% e foi incubada a 50°C por 6 horas para lise. Esse lisato foi acrescido com uma quantidade equivalente de uma solução de fenol/clorofórmio e foi agitado lentamente à temperatura ambiente por 10 minutos, seguido por centrifugação (5.000 x g, 20 minutos, de 10 a 12°C) para separar a fração sobrenadante. Esse sobrenadante foi acrescido com acetato de sódio a uma concentração de 0,3 M e foi lentamente acrescido com 2 vezes o volume de etanol. 0 DNA que existia entre a camada aquosa e a camada de etanol foi apanhado com um bastão de vidro, lavado com etanol a 70%, e secado ao ar. O DNA obtido foi acrescido com 5 ml de lOmM tampão Tris (pH 7,5)/1 mM solução EDTA*2Na, descansou durante a noite a 4°C e foi usado para as seguintes experiências. (B) Clonagem de um fragmento de DNA contendo gene de PC derivado de Saccharomyces cerevisíae (PYC2) e construção de uma linhagem recombinante.

Foi realizada PCR usando como gabarito o DNA cromossômico preparado em (A) mencionado acima. Para a PCR, o seguinte par de primers foi sintetizado usando-se o "394 DNA/RNA Synthesizez" fabricado por Applied Biosystems, e foi usado: (a-1) 5'-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG-3' (SEQ ID NO: 1) (B— 1) 5'-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT ACT TT-3' (SEQ ID NO:2) A PCR foi realizada sob as seguintes condições, usando-se o "DNA Thermal Cycler" fabricado por Perkin Elmer Cetus e Recombinant TaqDNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) como reagente da reação: Mistura de reação: Tampão (lOx) de PCR 10 μΐ 1,25 mM mistura dNTP 16 μΐ DNA gabarito 10 μΐ (Conteúdo de DNA: Ιμΐϋ. ou menos) Primers a-1 e b-1 mencionados acima 1 μΐ cada (Concentração final: 0,25 μΜ) TaqDNA Polimerase recombinante 0,5 μΐ Água destilada esterilizada 61,5 μΐ Os componentes acima foram misturados, e 100 μΐ da mistura de reação foram usados para a PCR.

Ciclo da PCR: Estágio de desnaturação: 94°C por 60 segundos Estágio de recozímento: 52°C por 60 segundos Estágio de extensão: 72°C por 120 segundos. O ciclo acima foi repetido 25 vezes. 10 μΐ da mistura de reação obtida pela reação acima foram submetidos a eletroforese usando gel de agarose a 0,8% e, desse modo, um fragmento de DNA de cerca de 3,56 kb pode ser detectado. <2> Preparação de uma bactéria corineforme recombinante usando o gene da PC (A) Construção de um vetor "shuttle” Com base na seqüência da região necessária para a estabilização de um plasmídeo em uma bactéria corineforme, que existe no plasmídeo pCRY30 descrito em JP03-210184A, o seguinte par de primers foi sintetizado, usando o "394 DNA/RNA Synthesizer" fabricado por Applied Biosystems.

(a-2) 5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA CTG-3' (SEQ ID NO: 3) (b-2) 5' -TTT GM TTC GAT ATC MG CTT GCA CAT CM-3' (SEQ ID NO: 4) O plasmídeo pCRY30 é um plasmídeo construído conforme descrição abaixo. Isto é, um DNA do plasmídeo pBY503 (vide JP01-95785A para obter detalhes desse plasmídeo) é extraído da Brevibacterium stationis IFO 12144, que foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology = Órgão Depositário de Patentes Internacionais, Instituto Nacional de Ciência Industrial Avançada),(Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão)) em 18 de julho de 1988 com o número de acesso FERM P-10136 e, então, foi convertida para depósito internacional de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste em 18 de julho de 1988 e foi-lhe atribuído o número de acesso FERM BP-2515. Então, um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 4,0 kb e contendo um gene responsável pela replícação (região de replicação) do plasmídeo foi excisado com uma enzima de restrição Xhol, e um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 2,1 kb, contendo um gene responsável pela estabilização (região de estabilização) do plasmídeo foi excisado com as enzimas de restrição EcoRI e Kpnl. Incorporando-se esses dois fragmentos de DNA em cada um dos sítios EcoRI-Kpnl e Sall do plasmídeo pHSG298 (Takara Shuzo), o plasmídeo vetor pCRY30 pode ser preparado. A PCR foi realizada sob as condições seguintes, usando-se o "DNA Thermal Cycler" fabricado por Perkin Elmer Cetus e Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) como reagente de reação.

Mistura de reação: Tampão (lOx) de PCR 10 μΐ 1,25 mM mistura dNTP 16 μΐ DNA gabarito 10 μΐ (Conteúdo de DNA: 1 μΜ ou menos) Primers a-2 e b-2 mencionados acima 1 μΐ cada (Concentração final: 0,25 μΜ) TaqDNA Poiimerase recombinante 0,5 μΐ Água destilada esterilizada 61,5 μΐ Os componentes acima foram misturados, e 100 μΐ dessa mistura de reação foram usados para a PCR.

Ciclo da PCR: Estágio de desnaturação: 94°C por 60 segundos Estágio de recozimento: 52°C por 60 segundos Estágio de extensão: 72°C por 120 segundos. O ciclo acima foi repetido 25 vezes. 10 μΐ da mistura de reação obtida pela reação acima foram submetidos a eletroforese usando gel de agarose a 0,8% e, desse modo, foi possível detectar um fragmento de DNA de cerca de 1,1 kb. 10 μΐ da mistura de reação na qual um produto de ampliação foi confirmado acima, e 1 μΐ do plasmídeo pBluescriptIISK+ foram completamente digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e Xhol, respectivamente, e tratados a 70°C por 10 minutos para inativar as enzimas de restrição, e então esses foram misturados, acrescidos com 1 μΐ tampão ΙΟχ T4 DNA ligase e uma unidade de T4 DNA ligase, e água destilada esterilizada para completar 10 μΐ, e reagidos a 15PC por 3 horas para ligar os fragmentos.

Usando a solução contendo o plasmídeo obtida, Escherichia coli GM109 (Takara Shuzo) foi transformada pelo método de cloreto de cálcio [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] e espalhada sobre um meio [10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 16 g de agar dissolvidos em 1 L de água destilada] contendo 50 mg de ampicilina.

As linhagens que foram capazes de crescer nesse meio foram submetidas à cultura líquida de uma maneira convencional, e o DNA do plasmídeo foi extraído da solução de cultura e o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição (EcoRI, Xhol) para confirmar um fragmento inserido. Como resultado, um fragmento de DNA inserido tendo um comprimento de 1,1 kb foi identificado além do fragmento de DNA do plasmídeo pBluescríptIISK+ tendo um comprimento de 3,0 kb. Esse plasmídeo foi denominado pBSpar.

Com base na sequência da região necessária para a replicação de um plasmídeo em uma bactéria corineforme, que existe no plasmídeo pCRY 31 descrito na Patente US No. 5.185.262, o seguinte par de primers foi sintetizado usando o "394 DNA/KNA Synthesizer" fabricado por Applied Biosystems.

(a-3) 5' -TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-3' (SEQ ID NO: 5) (b-3) 5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3' (SEQ ID NO: 6) O plasmídeo pCRY31 mencionado acima é um plasmídeo construído como segue. Isto é, o plasmídeo pCRY3 (a Brevíbacterium flavum MJ233 GE102 que abriga esse plasmídeo foi depositada no National Institute of Bíoscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente International Patent Organism Deposítary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão)) em 8 de janeiro de 1988 com o número de acesso FERM P-9802 e, então, foi convertida para depósito internacional de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste em 8 de janeiro de 1988 e foi-lhe atribuído o número de acesso FERM BP-2513), que é obtido ligando-se a região de replicação mencionada acima derivada de pBY503 no plasmídeo pHSG398 (Takara Shuzo), é parcialmente digerido com Kpnl para se obter um fragmento de DNA. 0 pBY503 é preparado a partir da Brevibacteríum lactofermentum IF012144 {FERM BP-2515) e completamente digerido com Kpnl, produzindo um fragmento de DNA de cerca de 7 kb. Ligando-se os fragmentos de DNA acima e selecionando-se um plasmídeo que mostre um padrão de digestão mencionado na tabela seguinte quando é digerido com as enzimas de restrição, pode-se obter o pCRY31.

Tabela 1 A PCR foi realizada usando o "DNA Thermal Cycler" fabricado por Perkin Elmer Cetus e Recombinant Taq DNA Polymerase TaKaRa Taq (Takara Shuzo) como reagente de reação sob as seguintes condições.

Mistura de reação: Tampão (lOx) de PCR 10 μΐ 1,25 mM mistura dNTP 16 μΐ DNA gabarito 10 μΐ (Conteúdo de DNA: 1 μΜ ou menos) Primers a-3 e b-3 mencionados acima 1 μΐ cada (Concentração final: 0,25 μΜ) TaqDNA Polimerase recombinante 0,5 μΐ Água destilada esterilizada 61,5 μΐ Os componentes acima foram misturados, e 100 μΐ dessa mistura de reação foram usados para a PCR.

Ciclo da PCR: Estágio de desnaturação: 94°C por 60 segundos Estágio de recozimento: 52°C por 60 segundos Estágio de extensão: 72°C por 120 segundos. O ciclo acima foi repetido 25 vezes. 10 μΐ da mistura de reação obtida pela reação acima foram submetidos a eletroforese usando gel de agarose a 0,8% e, desse modo, foi possível detectar um fragmento de DNA de cerca de 1,8 kb. 10 μΐ da mistura de reação na qual um produto de ampliação foi confirmado acima, e 1 μΐ do plasmídeo pBSpar foram completamente digeridos com as enzimas de restrição Xhol e Kpnl e tratados a 70°C por 10 minutos para inativar as enzimas de restrição, e então esses foram misturados, acrescidas com 1 μΐ tampão ΙΟχ T4 DNA ligase e uma unidade de T4 DNA ligase, e água destilada esterilizada para completar 10 μΐ, e reagidos a 15°C por 3 horas para ligar os fragmentos.

Usando-se a solução contendo o plasmídeo obtida, a Escheríchia coli JM109 (Takara Shuzo) foi transformada pelo método de cloreto de cálcio [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] e espalhada sobre um meio [10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 16 g de agar dissolvidos em 1 L de água destilada] contendo 50 mg de ampícilina.

As linhagens que foram capazes de crescer nesse meio foram submetidas à cultura líquida de uma maneira convencional, e o DNA de plasmídeo foi extraído da solução de cultura e o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição (Xhol, Kpnl) para confirmar um fragmento inserido. Como resultado, um fragmento de DNA inserido tendo um comprimento de 1,8 kb foi identificado além do fragmento de DNA do plasmídeo pBSpar tendo um comprimento de 4,1 kb. Esse plasmídeo foi denominado pBSpar-rep. 1 μΐ do plasmídeo pBSpar-rep preparado conforme descrição acima e 1 μΐ de pHSG298 (Takara Shuzo) foram completamente digeridos com as enzimas de restrição Kpnl e EcoRI, e tratados a 70°c por 10 minutos para inativar as enzimas de restrição. Então, esses foram misturados, acrescidos com 1 μΐ de tampão ΙΟχ T4 DNA ligase e uma unidade de T4 DNA ligase, e água destilada esterilizada para completar 10 μΐ, e foram reagidos a 15 °C por 3 horas para ligar os fragmentos.

Usando a solução contendo plasmídeo obtida, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) foi transformada pelo método de cloreto de cálcio [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] e espalhada sobre um meio [10 g de tríptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 16 g de agar dissolvidos em 1 L de água destilada] contendo 50 mg de canamicina.

As linhagens que foram capazes de crescer nesse meio foram submetidas a cultura líquida de maneira convencional, um DNA de plasmídeo foi extraído da solução de cultura e o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição para confirmar um fragmento inserido. Como resultado, um fragmento de DNA inserido tendo um comprimento de 2,9 kb foi identificado além do fragmento de DNA do plasmídeo pHSG298 tendo um comprimento de 2,6 kb. Esse plasmídeo foi denominado pHSG298par-rep. (B) Inserção de um promotor tac Para ampliar um fragmento de promotor tac por PCR usando um plasmídeo pTrc99A (Pharmacia) contendo um promotor tac como gabarito, o seguinte par de primers foi sintetizado usando o "394 DNA/RNA Synthesizer" (fabricado por Applied Biosystems).

(a-4) 5' -TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3' (SEQ ID NO: 7) (b—4) 5' -TTT GGA TCC CM CAT ATG MC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC MT TCC ACA CAT-3' (SEQ ID NO:8) A PCR foi realizada usando o "DNA Thermal Cycler" fabricado por Perkin Elmer-Cetus e Recombinant TaqDNA polymerase TaKaRa (Takara Shuzo) como reagente da reação sob as seguintes condições.

Ciclo da PCR: Estágio de desnaturação: 94°C por 60 segundos Estágio de recozimento: 52°C por 60 segundos Estágio de extensão: 72°C por 120 segundos. 0 ciclo acima foi repetido 25 vezes. 10 μΐ da mistura de reação obtida pela reação acima foram submetidos a eletroforese usando gel de agarose a 3% e, desse modo, foi possível detectar um fragmento de DNA de cerca de 100 bp. 10 μΐ da mistura de reação na qual um produto de ampliação foi confirmado acima, e 5 μΐ do plasmídeo pHSG298par-rep preparado em (A) mencionado acima foram completamente digeridos com enzimas de restrição BamHI e Kpnl e tratados a 70°C por 10 minutos para inativar as enzimas de restrição. Então, esses foram misturados, acrescidos com 1 μΐ de tampão (ΙΟχ) T4 DNA ligase e uma unidade de T4 DNA ligase, e água destilada esterilizada para completar 10 μΐ, e reagidos a 15°C por 3 horas para ligar os fragmentos.

Usando a solução contendo plasmídeo obtida, Escherichia colí JM109 (Takara Shuzo) foi transformada pelo método de cloreto de cálcio [Journal of Molecular Biologyf 53, 159 (1970)] e espalhada sobre um meio [10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 16 g de agar dissolvidos em 1 L de água destilada] contendo 50 mg de canamicina.

As linhagens que foram capazes de crescer nesse meio foram submetidas a cultura líquida de maneira convencional, um DNA de plasmídeo foi extraído da solução de cultura e o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição para confirmar um fragmento inserido. Como resultado, um fragmento de DNA inserido tendo um comprimento de 0,1 kb foi identificado além do fragmento de DNA do plasmídeo preparado em (A) mencionado acima tendo um comprimento de 5,5 kb. Esse plasmídeo foi denominado pHSG298tac. (C) Inserção do gene da PC em um vetor "shuttle" 10 μΐ da mistura de reação na qual um produto de ampliação foi confirmado em (B) mencionado acima e 5 μΐ do plasmídeo pHSG298tac preparado em (B) mencionado acima foram digeridos com enzimas de restrição BglII e Ssel ou BamHI e Ssel, e tratados a 70°C por 10 minutos para inativar as enzimas de restrição. Então esses foram misturados, acrescidos com 1 μΐ de tampão (ΙΟχ) T4 DNA ligase e uma unidade de T4 DNA ligase e água destilada esterilizada para completar 10 μΐ e foram reagidos a 15°C por 3 horas para ligar os fragmentos.

Usando a solução contendo plasmídeo obtida, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) foi transformada pelo método de cloreto de cálcio [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)] e espalhada sobre um meio (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 16 g de agar dissolvidos em 1 L de água destilada) contendo 50 mg de canamicina.

As linhagens que foram capazes de crescer nesse meio foram submetidas a cultura líquida de maneira convencional, um DNA de plasmídeo foi extraído da solução de cultura e o plasmídeo foi digerido com enzimas de restrição (Ssel, Ndel) para confirmar um fragmento inserido. Como resultado, um fragmento de DNA inserido tendo um comprimento de 3,56 kb foi identificado além do fragmento de DNA do plasmídeo preparado em {B) mencionado acima tendo um comprimento de 5,6 kb.

Esse plasmídeo foi denominado pPC-PYC2. (D) Transformação da Brevibacterium flavum, linhagem MJ- 233-AB-41 O plasmídeo acima foi introduzido na Brevibacterium flavuin MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498) de acordo com o método descrito na Patente US No. 5.185.262.

Exemplo 1 O ácido succínico foi purificado a partir de um caldo de fermentação em que se acumulou o ácido succínico sal diamônio.

Preparação de resina trocadora de cátíons fortemente acldica tipo H A resina trocadora de cátions tipo H foi preparada como segue.

Uma coluna foi preenchida com 1,6 L da resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo Na, SK1BL (Mitsubishi Chemical Corporation). 5 L de 1 mol/L ácido hidroclórico foram passados através da coluna a uma velocidade de fluxo de 1,6 L/hora, para converter a resina ao tipo H. Subseqüentemente, 20 L de água pura foram passados pela coluna para lavar a resina e a resina foi usada para as seguintes experiências.

Produção de ácido succínico por fermentação 0 ácido succínico foi produzido por fermentação de acordo com o método seguinte.

Foram preparados 400 mL de um meio contendo 100 g de glicose, 0,5 g de sulfato de magnésio heptahidrato, 0,65 g de ácido ortofosfórico, 14,3 mL de solução de hidrólise de proteína de soja (conteúdo total de nitrogênio: 35 g/L), 1,0 g de sulfato de amônio, 20 mg de sulfato ferroso heptahidrato, 20 mg de sulfato de manganês hidrato, 1 mg de D-biotina, 1 mg de hidrocloreto de tiamina e 0,05 mL de anti-espumante (GD-113, NOF Corporation) por litro; o meio foi ajustado para pH 6,5 com 1 N KOH, despejado em uma jarra fermentadora de 1 litro e esterilizado por aquecimento a 120° por 20 minutos. Após o resfriamento do meio, a linhagem MJ-233-AB-41 da Brevibacterium flavum transformada com o plasmídeo pPC-PYC2 foi inoculada no meio, e o meio foi mantido na temperatura de 30°C. A cultura foi realizada por 20 horas com aeração de 300 ml por minuto e agitação a 700 rpm, ao mesmo tempo em que o pH foi ajustado para 7,6 com gás de amônia. 100 ml da solução de cultura obtida foram usando para a seguinte fermentação de ácido succínico.

Foram preparados 79 ml de uma solução de sacarídeo contendo 520 g de glicose e 2,6 g de sulfato de magnésio heptahidrato por litro e a solução foi esterilizada por aquecimento a 120°C por 20 minutos. Foram preparados 221 ml de um meio contendo 1,21 g de ácido ortofosfórico, 5,39 ml de solução de hidrólise de proteína de soja (conteúdo total de nitrogênio: 35 g/L), 1,86 g de sulfato de amônio, 37,14 mg de sulfato ferroso heptahidrato, 37,14 mg de sulfato de manganês hidrato, 1,86 mg de D-biotina, 1,86 mg de hidrocloreto de tiamina e 0,09 mL de anti-espumante (GD-113) por litro; o meio foi ajustado para pH 6,5 com 1 N KOH e então foi esterilizado por aquecimento a 120°C por 20 minutos. A solução esterilizada de sacarídeo e o meio esterilizado foram colocados em uma jarra fermentadora de 1 L, resfriados, e então acrescidos com 100 mL do caldo de cultura mencionado acima para completar o volume total de 400 mL e então foram mantidos na temperatura de 30°C. A fermentação do ácido succínico foi realizada por 24 horas com aeração de 20 ml por minuto e agitação a 400 rpm, ao mesmo tempo em que o meio foi ajustado para pH 7,6 com gás de amônia. A fermentação de ácido succínico descrita acima foi realizada 9 vezes para se obter 3,6 L de caldo de cultura com uma concentração de ácido succínico de 25 g/L. Purificação de um cristal de ácido succínico proveniente do caldo de fermentação em que se acumulou o ácido succínico 0 caldo de cultura obtido foi esterilizado por aquecimento a 120°C por 20 minutos e, então, foi centrifugado a 5000 x g por 20 minutos para se obter 3,5 L de sobrenadante. 0 sobrenadante obtido foi passado através da já mencionada resina trocadora de cátions tipo H para se obter 2,2 L de um líquido de fluxo de travessia. O líquido do fluxo de travessia obtido foi concentrado usando-se um evaporador rotativo até a concentração do ácido succínico ficar em 19,2%, para precipitar um cristal de ácido succínico e obter-se uma pasta de ácido succínico. A pasta de ácido succínico obtida foi resfriada até 10°C para precipitar o cristal de ácido succínico. 0 cristal e o líquor mãe foram separados. O cristal de ácido succínico obtido foi re-suspenso em uma solução aquosa saturada de ácido succínico com um volume de 15 vezes o peso do cristal para lavar o cristal e então o cristal foi separado.

Exemplo Comparativo 1 0 caldo de fermentação no qual o ácido succínico estava acumulado da mesma maneira que no Exemplo 1 foi esterilizado (12 0 °C, 20 minutos), e as células foram removidas (5000 x g, 20 minutos). Esse caldo de fermentação foi concentrado usando-se um evaporador rotativo de modo que a concentração do ácido succínico ficou em 234 g/L. O líquido concentrado obtido foi ajustado para pH 2,2 com a adição de ácido sulfúrico e foi resfriado até 10°C para precipitar o cristal de ácido succínico. Então, o cristal foi separado da mesma maneira que no Exemplo 1, e lavado com uma solução de ácido succínico aquosa saturada, obtendo-se um cristal lavado. A Tabela 2 mostra os valores analíticos dos cristais de ácido succínico obtidos no Exemplo 1 e no Exemplo Comparativo 1.

Tabela 2 Valores analíticos dos cristais de ácido succínico obtidos no Exemplo 1 e no Exemplo Comparativo 1 (unidade = % do peso) n.d. (não detectado) indica ^ 0,0001.

Como mostra a Tabela 2, outros ácidos orgânicos e aminoácidos quase nào foram detectados no cristal lavado do ácido succinico no Exemplo 1, ao passo que muitas quantidades de aminoácidos neutros e básicos foram detectadas nos do Exemplo Comparativo 1. Isso sugere que aminoácidos neutros e básicos são facilmente apanhados por um cristal obtido por cristalização do ácido succinico. 0 cristal de ácido succinico obtido no Exemplo Comparativo 1 tinha conteúdos muito baixos de ácidos orgânicos. Isso sugere que os ácidos orgânicos são relativamente bem removidos de um cristal pela cristalização do ácido succinico.

Considera-se que, no Exemplo 1, os aminoácidos neutros e básicos foram removidos por adsorção para a resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H e, portanto, não foram detectados no cristal de ácido succinico. Para confirmar isso, o liquido fornecido à coluna de resina trocadora de cátions fortemente acídica Tipo H e o líquido do fluxo de travessia no Exemplo 1 foram analisados. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 Resultados da análise do liquido fornecido à resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H e do líquido do fluxo de travessia no Exemplo 1 (unidade; g/g de ácido succinico) n.d. (não detectado) indica ^ 0,0001.

Como mostra a Tabela 3, pode-se notar que a maioria dos vários tipos de aminoácidos contidos no liquido fornecido foram removidos no líquido do fluxo de travessia obtido a partir da coluna de resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H. Isso sugere que os aminoácidos tenham sido removidos por adsorção para a resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H e, como resultado, quase não foram detectados no cristal de ácido succínico como o produto objetivo.

Exemplo 2 O cristal de ácido succínico foi purificado a partir de um líquido de fermentação no qual se acumularam simultaneamente o succinato dissódico e o hídrogenocarbonato de sódio.

Preparação de uma resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H 4,7 L de resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H foram preparados da mesma maneira que no Exemplo 1.

Produção de succinato dissòdico e hidrogenocarbonato de > sódio por fermentação A fermentação acumulando simultaneamente o succinato sódico e o carbonato de sódio foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1, provendo-se para que o pH fosse ajustado usando 2,5 mol/L de solução aquosa de i carbonato de sódio em vez de amônia. Como resultado, foram obtidos 3,1 L de caldo de cultura tendo uma concentração de ácido succínico de 70 g/L.

Purificação de um cristal de ácido succínico a partir de caldo de fermentação 3,1 L do caldo de fermentação obtido foram submetidos a filtração por fluxo cruzado usando, para remover células, o módulo de membrana MF (módulo de membrana PELLICON-2 fabricado por Millipore; área efetiva da membrana: 0,1 m2, tamanho do poro: 0,22 μη). Quando 2,6 L do filtrado haviam sido obtidos, acrescentou-se 1 L de água pura ao líquido que circulava na membrana para filtração por diluição. Como resultado, foram obtidos 3,6 L de filtrado dos quais as células haviam sido removidas, Decarbonilação por adição de ácido O líquido obtido, do qual as células foram removidas, foi ajustado para pH 4,0 por acréscimo do líquido do fluxo de travessia da coluna trocadora de íons e líquor mãe da cristalização obtido no Exemplo 1 para realizar a decarbonilação e, desse modo, obteve-se um líquido decarbonilado.

Carga do líquido na resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H O líquido decarbonilado obtido foi passado através de uma coluna preenchida com a resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H a uma velocidade de fluxo de 4,7 L/hora, obtendo-se 3,5 L de um liquido de fluxo de travessia. Após a conclusão da carga, 3,8 L de água pura foram também passados através da coluna e, desse modo, foi i obtido um total de 7,3 L de liquido de fluxo de travessia.

Cristalização do ácido succínico 0 líquido do fluxo de travessia obtido, com um volume de 7,3 L, foi passado através de uma coluna de carvão ativo granular para descoloração e então o líquido foi concentrado da mesma maneira que no Exemplo 1, até uma concentração de ácido succínico de 30% do peso, e a pasta obtida foi agitada durante a noite a 10°C. Então, o cristal de ácido succínico foi separado da mesma maneira que no Exemplo 1, e foi lavado com uma solução aquosa saturada de ácido succínico, obtendo-se um cristal lavado de ácido succínico.

Os valores da análise do cristal de ácido succínico obtidos no Exemplo 2 são mostrados abaixo.

Tabela 4 Valores analíticos do cristal de ácido succínico obtido no Exemplo 2 (unidade: % do peso n.d. (não detectado) indica i 0,0001 Como mostra a Tabela 4, mesmo quando um caldo de fermentação no qual se acumulou o succinato sódico foi usado como matéria prima, foi possível obter um ácido succinico com um teor de pureza extremamente alto. Assim sendo, a presente invenção também pode ser usada com um caldo de fermentação contendo um cátion monovalente como contra-ion para ácido succinico.

Exemplo Comparativo 2 Da mesma maneira que no Exemplo 2, o cristal de ácido succinico foi purificado usando-se como matéria prima um líquido de fermentação no qual succinato dissódico e hidrogenocarbonato de sódio haviam sido acumulados simultaneamente. Neste exemplo, o líquido foi passado através de uma resina trocadora de ions fortemente acídica tipo H, sem realizar a decarbonilação.

Carga do líquido na resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H

As células foram removidas do caldo de fermentação previamente mencionado e o líquido obtido, do qual as células haviam sido removidas, foi passado através da coluna de resina trocadora de cátions tipo H. Como resultado, o liquido borbulhou na superfície superior da coluna de resina trocadora de cátions e a operação de troca de íons não pode ser realizada. Portanto, não foi possível realizar o processo de cristalização.

Exemplo 3 Produção de ácido succínico a partir de caldo de fermentação contendo succinato de magnésio 0 ácido succínico foi purificado a partir de um caldo de fermentação contendo succinato de magnésio como um sal metálico dívalente.

Preparação de resina trocadora de cátions fortemente acldica tipo H e produção de ácido succínico por fermentação Da mesma maneira que no Exemplo 1, foram preparados 4,7 L de resina trocadora de cátions fortemente acídíca tipo H. A fermentação do succinato de magnésio foi realizada pelo mesmo método de cultura que no Exemplo 1, provendo-se para que hidróxido de magnésio fosse usado como neutralizador em lugar de amônia. Especificamente, foram usados 2,5 mol/L de pasta de hidróxido de magnésio em vez de amônia para ajuste do pH. O pH do meio foi mantido em 7,5 a 7,7. Como resultado, foi obtido 1 L de caldo de cultura com uma concentração de ácido succínico de 50 g/L. O caldo de cultura obtido foi esterilizado por aquecimento a 120 °C por 20 minutos e centrifugado a 5000 x g por 15 minutos para precipitar células bacterianas e, desse modo, obter-se um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi passado através da resina trocadora de cátions fortemente acídica tipo H da mesma maneira que no Exemplo 1 e o líquido do fluxo de travessia obtido foi concentrado a vácuo, obtendo-se um cristal de ácido succínico. A Tabela 5 mostra os valores da análise do cristal de ácido succínico obtidos no Exemplo 3.

Tabela 5 Valores analíticos do cristal de ácido succínico obtido no Exemplo 3 n.d. (não detectado) indica ^ 0,0001 Como mostra a Tabela 5, descobriu-se que, de acordo com a presente invenção, ácido succínico de alto teor de pureza também pode ser obtido a partir do sal de magnésio de ácido succínico, que é um sal de cátion divalente. Desse modo, a presente invenção pode ser aplicada não apenas a um caldo de fermentação que contém o ácido succínico tendo um cátion monovalente como contra-íon, mas também a um caldo de fermentação que contém o ácido succínico tendo um cátion divalente como contra-íon.

Aplicabilidade na Indústria De acordo com a presente invenção, ácido succínico de alto teor de pureza pode ser facilmente obtido a partir de um líquido contendo ácido succínico obtido por fermentação ou por um método enzímátíco.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para purificar ácido succinico a partir de um liquido inicial, obtido pelo método da fermentação ou pelo método enzimático, caracterizado por: compreender as etapas de: a) adicionar um ácido a esse liquido inicial, para ajustá-lo ao pH 5,0 ou inferior, b) colocar liquido da etapa (a) em contato com uma resina trocadora de cátions fortemente acidica do tipo H em quantidade equivalente ou maior que a quantidade de cátions diferentes do ion hidrogênio nesse liquido (a); c) precipitar um cristal de ácido succinico do liquido tratado com a troca de ions para obtenção do ácido succinico purificado, e pelo fato de que o liquido inicial: a) ainda contém cátions, e b) contém um sal de ácido carbônico.

2. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado: pelo fato do liquido inicial conter um sal de ácido succinico.

3. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 2 caracterizado: pelo fato do sal de ácido succinico ser selecionado dentre o succinato de sódio, o succinato de potássio, o succinato de magnésio, o succinato de cálcio e o succinato de amônia.

4. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado: pelo fato do liquido tratado com a troca de ions ser usado como ácido.

5. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado: pelo fato do liquido tratado com a troca de ions do qual o ácido succinico foi removido ser usado como ácido.

6. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: conter uma etapa inicial, antes da etapa (a) , de permitir que células bacterianas, ou células bacterianas tratadas, ajam sobre matéria prima orgânica contida em solução de reação aquosa para obter um liquido que contem ácido succinico.

7. Método para purificar ácido succinico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado: pela solução de reação aquosa ser neutralizada com carbonato de magnésio ou hidróxido de magnésio.