BR0012311B1

BR0012311B1 - método e agente para tratamento prévio de amostra para quantificação de colesterol, método e kit para quantificação de colesterol em lipo-proteìnas especìficas usando o mesmo, método para a quantificação de colesterol livre e total.

Info

Publication number: BR0012311B1
Application number: BRPI0012311-0A
Authority: BR
Inventors: Mitsuhiro Nakamura; Yuriko Taniguchi; Mitsuhisa Manaba; Mitsuaki Yamamoto
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2012-12-11
Also published as: US20160177371A1; PT1197564E; CN1504753A; US20040265939A1; MY125519A; EP1197564A4; KR20020026446A; MXPA02000067A; CY1105245T1; TWI319009B; CN1167809C; TW200413535A; EP1598426A1; JP2012191953A; WO2000078999A1; US20090226945A1; CN100392093C; US7335483B2; ATE360089T1; EP1197564A1

Description

"MÉTODO E AGENTE PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL, MÉTODO E KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS USANDO O MESMO, MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL LIVRE E TOTAL" Escopo Técnico

A presente invenção está relacinada a um método de tratamento prévio para separar e quantificar de maneira precisa e eficiente o colesterol, que existe numa fração especifica, através de procedimentos simples e utilizando uma pequena quantidade de uma amostra e também a um método para a medida do colesterol numa fração especifica através do uso do método de tratamento prévio.

Estado da Técnica

Os lipidios tais como o colesterol formam complexos are com apoproteinas no sangue para formar Iipo- proteinas. Dependendo das diferenças nas propriedades físicas, as lipo-proteínas são classificadas em quilomicron, lipo-proteína com densidade muito baixa (VLDL), lipo-proteina com baixa densidade (LDL), lipo-proteína com alta densidade (HDL) e assim por diante. Dentre estas lipo-proteínas, é sabido que a LDL é uma das substâncias que induz à arterioesclerose, ao passo em que sabe-se que a HDL apresenta atividade anti-arteriosclerótica. Do ponto de vista epidemiológico, sabe-se que o nível de colesterol LDL apresenta uma correlação positiva com a frequencia de estabelecimento de doença arterioesclerótica ao passo em se sabe que o nível de colesterol HDL apresenta uma correlação inversa com a frequencia de estabelecimento de doença arterioesclerótica. Nestes nossos dias, as medições de colesterol LDL ou HDL são portanto efetuadas com freqüência para a prevenção ou diagnóstico de doenças cardíacas de isquemia. Os métodos conhecidos para a medição do percentual de LDL ou HDL no colesterol são, por exemplo, um método no qual o percentual de LDL ou HDL é separado do das outras lipo-proteínas através de separação por meio de ultra-centrifugação e posterior medição do colesterol; e um outro método no qual após a separação do percentual de LDL ou HDL das outras lipo-proteínas através de eletroforese, os seus lipídios são marcados e a intensidade de coração revelada é medida.

Estes métodos no entanto não são not usados na prática, pois envolvem um ou mais problemas devido ao fato de que os procediment os sao intrincados e muitas amostras não podem ser manipuladas. Um método para a medição do percentual de HDL no colesterol, que é usado atualmente no campo dos testes clínicos é o método de precipitação no qual um reagente de precipitação é adicionado a uma amostra para aglutinar lipo-proteínas distintas da HDL, sendo o aglutinado resultante removido através de centrifugação e o colesterol sobrenadante que contem apenas HDL é isolado e então medido. Este método é mais simples se comparado com a ultracentrifugação ou a eletroforese, mas devido à inclusão dos procedimentos de adição do reagente de precipitação e execução da separação, requer uma quantidade relativamente grande de cada amostra, envolve um problema em potential corespondente à produção de um erro analítico e não torna possível automatizar completamente todas as etapas de análise. Por outro lado, tem sido estudados métodos para a quantificação enzimática fracional de HDL no colesterol. Os métodos conhecidos incluem, por exemplo, a condução de uma reação enzimática em presença de um sal de ácido biliar e um surfactante não-iônico (JP 63-126498 Aj esce método faz uso do fato de que uma reação enzimática se processa na proporção determinada pela concentração de LDL no colesterol numa etapa inicial da reação e a velocidade da reação subsequente é função da concentração de HDL no colesterol. Existe entretanto um problema quanto à precisão porque a reação com o HDL no colesterol e a reação com outras lipo-proteinas no colesterol não podem ser completamente distinguidas. Também incluídos nos métodos conhecidos é o método de fazer cora que lipo-proteínas distintas das de HDL se aglutinem antecipadamente, fazendo com que o HDL do colesterol reja sozinho de forma enzimática e inativar a enzima e, ao mesmo tempo, redissolver o aglutinado, seguido pela medição da absorvência (JP 6-242110 A) . este método, entretanto, requer pelo menos três procedimentos para adicionar reagentes de maneira que possa ser aplicado apenas em analizadores automáticos específicos, causando um problema quando se contempla uma aplicabilidade mais ampla. Além disso, este método não é satisfatório do ponto de vista de danos ao equipamento analítico e disposição dos reagentes devido ao uso de um sal numa alta concentração quando da redissolução de um aglutinado. Um outro método é também conhecido (JP 9-299 A) , que compreende fazer com que, numa primeira reação, a colesterol oxidase e a colesterol esterase atuem sobre Iipo- proteínas diferentes da HDL em presença de um surfactante especial e fazer com que o colesterol, que está contido nas tais outras lipo-proteínas, reaja preferencialmente e então medir o HDL no colesterol enquanto se inibe qualquer reação do colesterol nas lipo-proteínas distintas da HDL. Este método, entretanto, é consideravelmente diferente da presente invenção tendo em vista que na primeira reação, osurfactante especial, a colesterol oxidase e a colesterol esterase são necessárias ao mesmo tempo para colocar, fora do sistema da reação, tanto o colesterol livre quanto o colesterol esterificado nas lipo-proteínas distintas do HDL. Além disso, a Patente Japonesa No. 2,600,065 revela um método que faz uso combinado de um reagente de precipitação, que está adaptado para causar a precipitação de lipo-proteínas distintas da HDL e um reagente para a medição do colesterol para medir o colesterol (HDL-C) em HDL não-precipitado. Este método apresenta utilidade prática quando uma enzima modificada é usada como enzima e o sulfato de α-ciclodextrina é usado como um reagente de precipitação. Este método, entretanto, envolve também um problema de precisão pois a turbidez, que ocorre como resultado do uso do reagente de precipitação, interfere com o sistema de medição. Com relação à medição de HDL-C por uma enzima modificada, "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", 19(5), 305-320, que é considerado um documento publicado refernte ao método patenteado descrito acima, revela que, em face ao reconhecimento da incapacidade de medição do HDL-C em um soro de um paciente hiperlipidêmico por meio de enzima modificada devido a um erro

_ _____positivo (ou seja, obtenção de um resultado de valor mais alto se

comparado com aquele obtido através do método de precipitação) induzido quando a enzima modificada é simplesmente introduzida num sistema de reação, a HDL-C foi medida utilizando-se o sulfato de ciclodextrina, um poli-ânion e cloreto de magnésio como um reagente de precipitação para evitar o erro positivo. Para reduzir a influência da turbidez causada pelo reagente de precipitação no método patenteado anteriormente descrito são conhecidas também certas técnicas, incluindo fazer com quê um surfactante exista simultaneamente (JP 8-116996 A) , usar um anti-corpo (JP 9-96637 A) e empregar um composto de açúcar (JP 7-301636 A) . Todos estes, entretanto., necessitam como premissa da inclusão de um reagente que induza a formação de um aglutinado, de maneira que é fundamentalmente indispensável que estes usem um reagente de precipitação tal como um poli-ânion. Os atuais inventores descobriram recentemente que o uso de uma substância, que atua apenas sobre uma lipo-proteína específica, torna possível quantificar com precisão o colesterol numa fração específica sem usar um reagente de precipitação e depositaram pedidos de patente (JP 9-244821) neste sentido. Este método apresenta uma correlação extremamente alta com o método de precipitação convencional, mas comparado em valores de medição com o método de precipitação, reconhece-se que este método apresenta uma tendência similar à do método anteriormente descrito relatado em "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI {ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES) ". Para obter dados consistentes com aqueles obtidos através do método de precipitação convencional em instituições médicas e similares, um poli-ânion ou similar é adicionado. Do ponto de vista do problema de aparecimento de uma mancha ou afim numa célula e o espalhamento dos valores de medição, entretanto, não se deseja adicionar um poli-ânion ou similar e formar um precipitado num sistema de medição. De maneira correspondente, é desejado intensamente que se elimine o precipitado do sistema. Além disso, também não é economicamente razoável usar um poli-ânion ou similar para tornar os dados resultantes consistenmtes com aqueles obtidos através do método de precipitação embora o poli-ânion ou similar não seja necessário do ponto de vista do princípio da medição, portanto, existe também um desejo premente pela sua solução. Um objeto da presente invenção é, portanto, prover um método que possa quantificar de maneira precisa e eficiente o colesterol numa fração específica por meio de procedimentos simples fundamentalmente sem a necessidade de um poli-ânion ou similar e que seja adequadamente aplicável a vários analizadores automáticos.

Apresentação da Presente Invenção Os atuais inventores efetuaram uma investigação

detalhada por uma causa que pudesse ser responsável pelo problema descrito anteriormente relatado em "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES) " , ou seja, o problema de que um valor de colesterol numa fração específica conforme quantificado utilizando uma substância que age apenas sobre uma lipo-proteína específica tal como a HDL se torna mais alto do que o valor correspondente conforme determinado através do método de precipitação; e chegaram à conclusão de que de lipo-proteínas naõ- HDL (LDL, VLDL e similares) cujo colesterol não deveria a princípio ser medido, uma pequena quantidade de colesterol livre existindo em suas superfícies ou nas proximidades de suas _ superfícies é liberada para causar um erro positivo. Com base nesta descoberta, foi determinado que um valor de " colesterol obtido através de um método para quantificação fazendo uso de uma substância que atua apenas sobre uma lipo-proteína específica se torna coerente com o valor correspondente obtido através do método de precipitação quando o valor de colesterol é medido após o consumo antecipado apenas do colesterol livre sob condições nas quais as lipo-proteínas permanecem substancialmente inalteradas, completando assim a a presente invenção. Descrita especificamente, a presente invenção proporciona um método para o tratamento prévio de uma amostra, que contem várias lipo-proteínas, antes de medir o colesterol existente numa lipo-proteína específica dentre aquelas na amostra, que compreende fazer com que uma enzima, que atua sobre o col esterol livre como um substrato, atue sobre a amostra para consumir antecipadamente apenas o colesterol livre sob condições nas quais as lipo-proteínas permanecem substancialmente inalteradas. A presente invenção também "Ρ3Γ0Ό03Γί~! 1 \im ms t O ν^,Ο μαιο. a quantificação do colesterol existente numa lipo-proteína específica numa amostra, que compreende fazer com que uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, atue sobre a amostra com a lipo-proteína contida na mesma para consumir apenas o colesterol livre sob condições nas quais as lipo-proteínas permanecem substancialmente inalteradas; e então medir o colesterol, que existe na lipo-proteína específica, através do uso de uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um diagrama mostrando a correlação entre a presente invenção no Exemplo Ieo método de precipitação;

A Figura 2 é um diagrama mostrando a correlação entre a presente invenção-no-Exemplo 2 e o método de precipitação; e

A Figura 3 é um diagrama mostrando os efeitos de um acelerador de reação no Exemplo 5.

Melhores Modos para Realizar a Invenção Na presente invenção, aates de medir o colesterol existente numa lipo-proteína específica numa amostra, faz-se com que uma enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato atue, como um tratamento prévio, sobre uma amostra de maneira tal que o colesterol livre é consumido. Quanto à enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato, qualquer enzima pode ser usada desde que atue sobre o colesterol livre como um substrato. Exemplos ilustrativos seriam a colesterol dehidrogenase e a colesterol oxidase. Podem ser de qualquer origem tal como origem de microorganismo, origem animal ou vegetal e podem também ser aquelas preparadas através de engenharia genética. Além disso, as enzimas podem ser quimicamente modificadas ou não-modifiçadas. A enzima é geralmente usada numa concentração de 0,001 até 100 U/mL, sendo preferencial de 0,1 até 100 U/mL.

NenhuiTia limitação particular está imposed sobre as condições sob as quais se faz com que a enzima descrita anteriormente, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, atue sobre a amostra e as condições recomendadas para a enzima podem ser utilizadas. É no entanto necessário prestar atenção para que, durante a etapa na qual se faz com que a enzima que atua sobre o colesterol livre como um substato atue sobre uma amostra, não ocorra uma reação através da qual um colesterol esterifiçado é convertido em colesterol livre, especificamente, não é importante se a colesterol esterase existe ou não. O que se faz necessário é a manutenção de condições de maneira tal que a colesterol esterase seja impedida de agir na prática. Juntamente com a enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato, uma co-enzima pode também ser usada conforme a necessidade. É possível utilizar como co-enzima a nicotinamida adenina dinucleotídeo ou algo similar. Tais co-enzimas podem ser usadas isoladamente ou em combinação. A quantidade a ser usada varia dependendo da co-enzima. urna co-enzima pode entretanto ser usada em concentrações de 0,001 até 100 U/mL, preferencialmente de 0,1 até 100 U/mL, embora nenhuma limitação particular seja imposta à este aspecto. Com relação à enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato e é usada na presente invenção, nenhuma limitação está imposta quanto à sua origem conforme descrito acima. Sua concentração e características similares podem ser escolhidas de maneira adequada com o objetivo de alcançar o desempenho e a facilidade de manuseio desejada. De maneira correspondente, se for desejado completar o tratamento prévio dentro de um intervalo de tempo previamente determinado, por exemplo, só é necessário usar a enzima numa quantidade maior e se ao contrário se desejar economizar a enzima, só é necessário tornar o tempo de tratamento prévio mais longo. No caso de um reagente de laboratório para uso exclusivo em medições feitas por analizadores automáticos, entretanto, é desejável atender aos dois critérios ao mesmo tempo. Especificamente, é necessário que se complete o tratamento prévio em um tempo breve através do uso da enzima numa pequena -quantidade-, -Em- tais casos, a existência simultânea de um acelerador de reação selecionada do grupo descrito a seguir no tratamento prévio, que usa uma enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato, torna possível alcançar o desempenho desejado com uma quantidade reduzida da enzima sem tornar o tempo de tratamento prévio mais longo. Os aceleradores de reação utilizáveis para a finalidade descrita acima podem incluir, por exemplo, o ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"-terpiridina, o ácido tíglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina e a mevinolina, incluindo seus sais e derivados metálicos (derivados de alumínio e afins} sempre que os referidos sais e derivados metálicos existirem. Dentre estes, o ácido flufenâmico e o ácido mefenâmico são conhecidos como drogas anti-inflamatórias não-esteroidais e o ácido fusídico e a monensina são conhecidos como antibióticos. Ao usar iam destes compostos como um acelerador de reação, se faz, necessário escolher de maneira adequada a sua concentração e características similares levando em conta as suas propriedades físicas, o pH e a força iônica do sistema de medição e os tipos e concentrações de substâncias coexistentes. A concentração do acelerador de reação pode ser determinada de maneira empírica de acordo com as condições de um sistema de medição. Em geral, entretanto, o ácido flufenâmico pode ser utilizado numa concentração de cerca de 0,-01 até 100 mM; o ácido fusídico de cerca de 0,01 até 10 mM; o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina e o acetato de betametasona, cada um deles, numa concentração de cerca de 0,01 até 5 mM; a monensina e a mevinolina, cada uma delas, numa concentração de cerca de 0,01 até 1 mM; e o ácido tíglico -numa concentração de cerca de 1 até 500 mM. 0 uso do acelerador de reação descrito anteriormente tornou possível reduzir a quantidade da enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, para entre de um sétimo até um décimo. Quando a enzima é usada na mesma quantidade, por outro lado, o acelerador de reação pode encurtar o tempo de reação. No tratamento prévio descrito anteriormente pela enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato (e também pelo acelerador de reação, se necessário) , também é possível usar outras enzimas (com a exceção daquelas com influência substancial sobre as lipo-proteínas) e sais, amortecedores para a regulagem do plí, surfactances (com a exceção daqueles com influência substancial sobre as lipo-proteínas), conservantes, proteínas tais como a albumina e reagentes apresentando afinidade com lipo- proteínas específicas, tais como anticorpos, antibióticos, saponina, lectina e poli-ânion até o ponto em que não provocfuem aglutinação da lipo-proteína específica, de maneira tal que a ação da enzima é ajustada sem prejudicar a especificidade da medição. Na presente invenção, aquelas contendo os ingredientes a seguir podem, portanto, ser usadas como agentes de tratamento prévio para a medição do colesterol existente em lipo-proteínas específicas em amostras ,

(Ingredientes Essenciais)

As enzimas que atuam sobre o colesterol livre como urn substrato, por exemplo, a colesterol dehidrogenase e a colesterol oxidase.

(Ingredientes Opcionais)

Aceleradores de reação, por exemplo, o ácido f lufenâmico,, o ácido mefe-nâmico, a 2 , 2~: , 6 * , 2" -terpiridina, o ácido tíglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina e a líievinolina.

(Outros Ingredientes)

Co-enzimas tais como NAD, outras enzimas tais como a peroxidase, a catalase, a diaforase e a ácido ascórbico oxidase, ácidos tais como o ácido pirúvico, sais, amortecedores para a regulagem do pH, surfactantes não apresentando qualquer efeito substancial sobre as lipo-proteínas, conservantes, proteínas tais como albumina, acopladores tais como anticorpos, antibióticos, saponina, lectina, poliânions e 4-aminoantipirina, reagentes oxidances reveladores de cor tais como os doadores de hidrogênio, por exemplo o reagente de Trinder, os receptores de elétrons tais como o metasulfato de fenazina e redutores reveladores de cores tais como o tetrazolium nitroblue. Na presente invenção, o colesterol existente numa lipo-proteína específica numa amostra é medido depois de o colesterol livre nas lipo-proteínas haver diso consumido através do tratamento prévio descrito anteriormente. Qualquer método pode ser usado para a medição do colesterol existente na lipo-proteína específica na amostra desde que o método possa medir o colesterol existente na lipo-proteína específica através do uso de uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica. Um exemplo ilustrativo do método pode compreender a disposição, como uma substância que atua sobre a lipo-proteína específica, de -um surfactante selecionado dentre os éteres de fenil alquileno polioxietileno ou éteres de tribenzilfenil alquileno polioxietileno revelados na patente JP 11-56395 A; a adição de um reagente de enzima meaidora de colesterol em presença- -da substância; e então a medição da quantidade de colesterol reagido ao longo do tempo durante o qual o colesterol na lipo-proteína com alta densidade dentre as de lipo-proteínas reage preferencialmente com o reagente de enzima medidora de colesterol. Exemplos de produtos comerciais dentre os primeiros surfactantes, éteres de fenil alquileno polioxietileno, podem incluir "Emulgen A-60" (nome comercial, produto da Kao Corporation) , ao passo em que exemplos de produtos fcorflertíiais d s surfactantes posteriores, éteres de tribenzilfenil alquileno polioxietileno, podem incluir "Emulgen B66" (nome comercial, produto da Kao Corporation). Como um método alternativo, existe um mécodo que faz uso de enzimas modificadas, que são reveladas nas páginas 305-320 de "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS de BI0L0GICAL AMOSTRAS)", 19(5), cujas substâncias atuam apenas sobre as lipo-proteínas específicas, respectivamente. Embora o α-sulfato de ciclodextrina e o cloreto de magnésio stejam usados no método deste documento para inibir as reações com as frações da Iipo- proteína distintas da HDL, o uso do método de tratamento prévio descrito anteriormente desta invenção torna desnecessário o uso das referidas substâncias. Exceto pelo uso da substância que atua sobre o colesterol específico, o método para a medição de colesterol existente numa lipo-proteína específica pode ser praticado utilizando-se reagentes empregados em métodos convencionais de medição de colesterol. Exemplos de ingredientes que podem estar contidos em reagentes a serem usados podem incluir enzimas tais como a colesterol esterase, a colesterol oxidase, a colesterol dehidrogenase, a isocitrato dehidrogenase, a diaforase e a peroxidase, reveladores ue cores, co-enzimas, receptores de elétronsproteínas (albumina, etc.), conservantes, surfactantes, sais, ácidos e amortecedores para a regulagem do pH. Como surfactantes dentre os ingredientes descritos anteriormente, tanto os surfactantes iônicos quanto os não-iônicos são utilizáveis. Exemplos ilustrativos seriam os éteres de alquil polioxietileno, os éteres de alquilfenil polioxietileno, condensado de polioxietileno-polioxipropileno, sulfatos de éter de alquil polioxietileno, sais de alquilbenzenosulf onato e sais d'é ácido biliar. A quantidade do surfactante a ser usado varia dependendo do composto. 0 surfactante pode entretanto ser usado a 0,0001% até 5%, preferencialmente de 0,001% até 5%, embora nenhuma limitação particular seja imposta ao mesmo. Nenhuma limitação particular é imposta aos amostecedores. Os amostecedores convencionais tais como o amortecedor de Good, o amortecedor de fosfato, o amortecedor Tris e o amortecedor de ftalato são utilizáveis. O amortecedor pode ser usado a 0,005 M até 2 M, preferencialmente de 0,01 M até 1 M, embora nenhuma limitação particular esteja imposta ao mesmo. 0 método para a quantificação do colesterol numa fração específica de lipo-proteína através da presente invenção compreende tipicamente primeiramente a adição de um agente de tratamento prévio, que atua apenas sobre o colesterol livre, numa amostra de medição e fazendo com que o agente de tratamento prévio atue sobre a amostra e então adicionando e misturando um reagente para a medição de colesterol (doravante denominado "reagente para a quantificação"), que contém uma substância capaz de atuar sobre a lipo-proteína específica e um reagente utilizado para um método convencional para a medição de colesterol,. para medir a quantidade de colesterol na fração de lipo-proteína específica. Exemplos específicos, podem incluir, embora não estejam limitados a, um método que compreende a mistura de colesterol dehidrogenase e uma co-enzima (NAD) com a amostra e então a adicção de um reagente para a medição de colesterol que compreende colesterol esterase e colesterol oxidase; um método que compreende a mistura de colesterol dehidrogenase e NAD com a amostra e então a adição de um reagente para a medição de colesterol que compreende colester.ol esterase; um método que compreende a mistura da amostra com colesterol oxidase juntamente com peroxidase, 4-amino-antipirina ou catalase e então a adição de um reagente para a medição de colesterol que compreende colesterol esterase; e um método que compreende a mistura da amostra com colesterol oxidase juntamente com peroxidase, 4-aminoantipirina, etc. e então a adição de um reagente para a medição de colesterol que compreende colesterol esterase, colesterol dehidrogenase e NAD. Exemplos do método para a medição de colesterol numa fraçãode lipc-proteína específica podem incluir um método fazendo uso combinado de colesterol esterase e colesterol oxidase como uma enzima reagente e um método fazendo uso combinado de colesterol esterase e colesterol dehidrogenase, embora as enzimas conhecidas de ensaios sejam todas utilizáveis. Na presente invenção, a enzima para uso na primeira reação como a reação de tratamento prévio e a enzima para uso na medição de colesterol como o método para quantificação através da segunda reação pode ser a mesma ou pode ser diferente. Além disso, uma enzima pode ser utilizada numa quantidade de excesso na primeira reação e pode também ser usada na segunda reação. Em essência, só é necessário consumir o colesterol livre, que existe numa pequena quantidade nas superfícies da lipo-proteína, (primeira reação/reação de tratamento" prévio) e então levar o sistema de reação até um estado no qual a enzima atua apenas sobre a lipo-proteína específica a ser medida, de maneira que a maior parte do colesterol (colesterol livre + colesterol esterifiçado) que constitui a lipo-proteína possa ser quantificado. Além disso, nenhuma limitação particular está imposta sobre o método para a detecção final do colesterol após a adição do referido reagente de enzima para a medição de colesterol. É possível usar, por exemplo, a medição de absorção na qual a detecção é efetuada combinando-se peroxidase com um cromogene ou diaforase ou um receptor de elétron com um reagente redutor revelador de cor; ou um método no qual uma cc-enzima ou o peróxido de hidrogênio seja detectado diretamente, uma co-enzima pode ser amplificada através de um sistema de ciclagem de co-enzima. Para praticar o método da presente invenção com facilidade, é preferencial utilizar um kit para quantificação que é adequado ao método e está adaptado para efetuar a medição do colesterol na lipo-proteína específica. Embora tais kits possam ser prontamente projetados com base na explicação apresentada anteriormente, seus exemplos serão descritos a seguir através da divisão dos mesmos entre aqueles fazendo uso de colesterol oxidase e aqueles fazendo uso de colesterol dehidrogenase como exemplo típico de enzimas que atuam sobre o colesterol livre como um substrato.

[Kits fazendo uso de colesterol oxidase]

(a) "KIT PARA. QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os

seguintes reagentes (1) e (2) : (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol oxidase e uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio - (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica, colesterol esterase e vim revelador de cores.

(b) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol oxidase, colesterol esterase e uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proceína específica e um revelador de cores.

(c) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1), (2) e (3): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol oxidase e uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase e um revelador de cores.

Nos kits descritos anteriormente, o termo "substância consumidora de peróxido de hidrogênio" significa uma substância que consume e elimina o peróxido de hidrogênio produzido através da reação entre colesterol oxidase e colesterol. Exemplos ilustrativos seriam a catalase, acopladires tais como 4- aminoantipirina e agentes deoxi-redução reveladores de cores incluindo doadores de hidrogênio tais como o reagente de Trinder. Dentre estes, _ um acoplador tal como a 4-aminoantipirina e um doador de hidrogênio tal como o reagente de Trinder revelam uma cor quando reagem em combinação com peróxido de hidrogênio e são usáveis como revelador de cores no reagente (2) ou (3) descritos anteriormente. Como o reagente (1) para uso na etapa de tratamento prévio de acordo com a presente invenção, é preferencial que se use apenas um de um acoplador e um doador de hidrogênio e fazer com que o peróxido de hidrogênio seja consumido através dfe uma reação não-reveladora de cor. É desnecessário mencionar que também é possível submeter o peróxido de hidrogênio a uma reação de revelação de cor e então fazer um ajuste para um valor medido [este ajuste pode ser feito subtraindo-se a intensidade de uma cor, que é revelada através do reagente (1), da intensidade de uma cor revelada através do reagente (2) ou o reagente (3)].

[Kits fazendo uso de colesterol dehidrogenase] (d) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTERüL· EM

LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância, que atua apenas sobre a lipo-proteína específica e colesterol esterase.

(e) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1) e (2) : (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas s_obre a Iipo-proteína especifica, colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase e um revelador de cores. (f) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM

LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e colesterol esterase (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica.

(g) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os

seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e colesterol esterase (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância

que age apenas sobre a lipo-proteína específica, colesterol oxidase, peroxidase e um revelador de cores.

(h) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1), (2) e (3): (1) um primeiro reagente

compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase.

(i) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM

LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1), (2) e (3): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos);

(2) um segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase e um revelador de cores. (j) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL .EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por" coifipt^éfttiefr "OS> seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e uma substância consumidora de produto da reação da co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância, que atua apenas sobre a lipo-proteína específica e colesterol esterase.

(k) "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes (1) e (2): (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e uma substância consumidora de produto da reação da co-enzima (e compreendendo ainda um acelerador de reação em alguns exemplos); e (2) iam segundo reagente compreendendo uma substância que age apenas sobre a lipo-proteína específica, colesterol esterase e um revelador de cores.

Nos kits descritos anteriormente fazendo uso de colesterol dehidrogenase, o termo "substância consumidora de produto da reação da co-enzima" significa uma substância que converte uma co-enzima redutora (por exemplo, NADH), que ocorre através da reação entre colesterol, colesterol d.ehidrogenase e uma co-enzima (por exemplo, NAD) , de volta à co-enzima original. Um exemplo ilustrativo é a combinação de lactato dehidrogenase e ácido pirúvico (substrato) . Em cada um dos kits descritos anteriormente, o produto da reação da co-enzima é produzido através da adição do reagente (1). Em cada um dos kits (d), (f), (h) e (j) dos kits descritos anteriormente, é possível medir luz do mesmo comprimento de onda que a cor revelada através da adição do reagente (1) na etapa de medição sem aumentar o consumo dó produto da reação. Neste caso, entretanto, é necessário quantificar o colesterol na lipo-proteína específica através da subtração da intensidade de uma cor, que é revelada na etapa de tratamento prévio na qual o reagente (1) é adicionado, a partir da intensidade de uma cor revelada pelo reagente (2) ou pelo reagente (3). Como alternativa, pode também ser possível adicionar antecipadamente a substância, que consume o produto da reação, ao reagente (1) e após o consumo do produto da reação, adicionar o reagente (2) ou o reagente (3) para a revelação de uma cor. Neste caso, a adição de uma substância, que reduz a ação da substância que consume o produto da reação, ao reagente (2) ou ao reagente (3) é preferencial. Em cada um dos kits (e) , (g) , (!) e (k) , por outro lado, não é absolutamente necessário subtrair a intensidade da cor, que é revelada na etapa de tratamento prévio, da intensidade da cor medida na etapa de medição, porque na etapa de medição é medida uma cor revelada de um comprimento de onda diferente da cor revelada na etapa de tratamento prévio.

Deve ser observado que a aplicação dos aceleradores de reação anteriormente mencinados, tal como do ácido flufenâmico, ácido mefenâmico, 2,2 ' ,61,2"-terpiridina, ácido tíglico,, ácido fusídico, acetato de betametasona, monensina e mevinolina não está limitada nem ao método de tratamento prévio ou agente da presente invenção nem ao método para quantificação ou kit da presente invenção para colesterol numa lipo-proteína específica, o referido método para quantificação ou kit fazendo uso do método de tratamento prévio ou agente. Se a presença de um acelerador de reação tal como o ácido fulfenâmico for tolerada simultaneamente ao conduzir -se um método para < Quantificação de colesterol fazendo uso de uma enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato, por exemplo, um método para quantificação de colesterol livre fazendo uso combinado de colesterol oxidase, peroxidase, um revelador de cores e similares ou um método para quantificação de total colesterol fazendo uso combinado de colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase, um revelador de cores e similares, é possível gerar de forma óbvia efeitos vantajosos de maneira tal que a quantidade da enzima a ser utilizada, sendo a referida enzima capaz de atuar sobre o colesterol livre como um substrato e sendo a colesterol oxidase no método exemplificado acima, pode ser reduzida e o tempo do reação enzimática pode ser encurtado. Além disso, a referência à revelação desta especificação de -um método para a quantificação de colesterol (por exemplo, seleção de um surfactante para limitar um alvo de medição a uma lipo-proteína específica) torna possível projetar mais especificamente um método para a quantificação conforme desejado.

Aplicabilidade Industrial

A presente invenção tornou possível quantificar de maneira eficiente o colesterol numa fração específica através de procedimentos simples sem usar um pol c3.ilÍ OIi ou similar, sem mencionar um tratamento mecânico prévio tal como a centrifugação. Ccmo os métodos da presente invenção não formam um precipitado que de outra forma iria surgir através da adição do poli-ânion ou similar, o aparelho de medição (e especialmente, as células) e similares permanecem livres de uma mancha, e além do mais os valores medidos também permanecem livres de espalhamento

Os métodos de acordo com a presente invenção são, portanto, superiores aos métodos convencionais para medida de colesterol. Além disso, conforme ficará demosntrado nos exemplos subsequentes, os valores de medição apresentando um alto índice de correlação com aqueles obtidos através do método convencional de precipitação podem ser obtidos mesmo com respeito a amostras apresentando altos níveis de triglicérides.

Portanto, os métodos de acordo com a presente invenção são tajnbém excelentes no sentido de que eles são aplicáveis a várias amostras sem limitação. Além disso, o uso do acelerador de reação torna possível usar a enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, numa quantidade menor na etapa de tratamento prévio. Conforme foi descrito anteriormente, os métodos de acordo com a presente invenção permitem medições precisas e específicas de uma série de amostras através de prOceaimentos simples ao passo em que utiliza as amostras em pequenas quantidades. De maneira correspondente, eles podem ser aplicados a vários analizadores automáticos e são também extremamente úteis no campo dos testes clínicos.

A presente invenção será descrita a seguir com mais detalhes através dos Exemplos. Deve entretanto ser mantido em mente o fato de que a presente invenção não se encontra de maneira alguma limitada aos Exemplos.

Exemplo 1

Com respeito a cada uma de 3 0 amostras de soro contendo lipo-proteínas, o percentual de HDL no colesterol foi quantificado através do método descrito a seguir de acordo com a presente invenção e o método de precipitação e os valores de medição foram comparados.

(Método da Invenção) 100 mM de amortecedor de fosfato (Primeiro

reagente; pH 8,5) (300 uL) , que continha 0,1 U/mL de colesterol dehidrogenase (produto da Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 2,5 mM de NAD e 0,03% de 4-aminoantipirina, foram adicionados a cada amostra (3 μΐ,) (tratamento prévio) . Depois de cerca de 5 minutos, um reagente para α quantificação de colesterol (Segundo reagente) (100 μΐι) - que era composto por 1% de "Emulgen B-66", 1,3 U/mL de colesterol esterase (produto da Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), 2 U/mL de colesterol oxidase (produto da Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), 5 U/mL de peroxidase (produto da Toyobo Co., Ltd.) e 100 mM de amortecedor MES (pH 6) contendo 0,04% de disulfobutilmetatoluidino - foram adicionados. Pouco antes da adição do segundo reagente e uma vez transcorrido um intervalo de tempo de cinco minutos após a adição, a absorvência foi medida em 600 nm. A partir de uma diferença na absorvência foi determinada a concentração de HDL colesterol na amostra de soro (método de 2 pontos) . Uma amostra de soro de controle com uma concentração de colesterol HDL conhecida foi usada como substância de calibração. Os procedimentos acima foram conduzidos usando um analizador automático "Hitachi Model 7150". (Método de Precipitação)

o "Reagente de Fracionamento HDLC 2 'Daiichi1" (produto da Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) (200 μL) foi misturado com a amostra (200 uL) , seguido por centrifugação a 3.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante (50 uO foi coletado, seguido pela mistura com um reagente para a quantificação de colesterol (3 mL) composto de 1% de Triton X-IOOi colesterol esterase a 1 U/mL, colesterol oxidase a 1 U/mL, peroxidase a 5 U/mL e amortecedor MES a 100 mM (pH 6.5) contendo 0.04% dc disulfobutilmetatoluidino e 0,04% de 4-aminoantipirina. Depois que a mistura resultante foi incubada sob 370C durante 10 minutos, a sua absorvência a 600 nm foi medida para determinar a concentração de HDL no colesterol.

(Reaultadcs)

os resultados são apresentados na Tabela 1 e na

Figura 1.

Tabela 1

Amostra Método de Método da Amostra Método de Método da Num. Precipitação Invenção Num. Precipitação Invenção (mg/dL) (mg/dL.) (mg/dL) (mg/dL) 1 73 72 16 54 54 2 39 39 17 45 47 o -J 53 52 18 60 59 4 54 54 19 50 52 57 58 20 58 56 6 75 71 21 38 39 7 51 51 22 56 55 8 52 50 23 35 37 9 43 43 24 29 31 58 58 25 63 6 0 11 59 59 26 51 50 12 49 51 27 33 36 13 44 46 28 52 51 14 70 65 29 65 63 35 38 30 47 49 Conforme é prontamente visualizado a partir do^ resultados, o método da invenção, a despeito da omissão de um poli-ânion ou similar, apresentou um grau de correlação extremamente bom com o método convencional de precipitação.

Exemplo 2

Foram efetuadas medições através de um outro método da presente invenção, que era similar ao método da invenção conduzido no Exemplo 1 exceto pelo fato de que no primeiro reagente, a colesterol dehidrogenase, o NAD e o amortecedor de fosfato foram substituídos por colesterol oxidase a 5 U/mL (produto da Toyobo Co., Ltd.), peroxidase a 5 U/mL (produto da Toyobo Co., Ltd.) e amortecedor MES a 100 mM (pH 6). Os valores de medição foram comparados com aqueles obtidos através do método de precipitação do Exemplo 1. (Resultados)

os resultados são apresentados na tabela 2 e na

Figura 2.

Tabela 2

Amostra Método de Mátodo da Amostra Método de Mátodo da Num. Precipitação Invenção Num. Precipitação Invenção (mg/dL) (mg/dL) (rng/dL) (mg/dL) 1 73 73 16 54 54 2 39 38 17 45 47 3 53 52 18 60 61 Λ <± 54 56 19 50 50 57 57 20 58 55 6 75 74 21 38 37 7 51 52 22 56 56 8 52 50 23 35 35 9 43 44 24 29 29 58 58 25 63 61 11 59 57 26 51 52 12 49 51 27 33 33 13 44 45 28 52 52 14 70 69 29 65 66 35 37 30 47 46 Conforme é prontamente visualizado a partir dos resultados, o método da invenção, a despeito da omissão de um poli-ânion ou similar, apresentou uma taxa de correlação extremamente boa com o método convencional de precipitação.

Exemplo 3

Usando os reagentes do Exemplo 1 e do Exemplo 2, foram medidas cinco amostras de soro de diferentes níveis de triglicérides. Os valores de medição foram então comparados com aqueles obtidos através do método de precipitação. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Método de Precipitação (mg/dL) Método da Invenção no Exemplo 1 (mg/dL) Método da Invenção no Exemplo 2 (mg/dL) Nível de Triglicérides (mg/dL) Amostra A 47 49 49 198 Amostra B 49 50 49 301 Amostra C 26 27 24 742 Amostra D 60 61 61 517 Amostra E 37 40 36 428

Conforme mostrado na tabela 3, os valores de medição de níveis comparáveis com aqueles aobtidos através do método convencional foram também obtidos através da presente invenção com respeito às amostras de alto nível de triglicérides.

Exemplo 4

Foram efetuadas medições de maneira similar àquelas do Exemplo 2 excetopelo fato de que no primeiro reagente, a colesterol oxidase a 5 U/mL foi alterada para apresentar composições de reagente das concentrações e combinações de ingredientes mostradas abaixo na Tabela 4. Os valores de medição foram comparados com aqueles obtidos através do método de precipitação e também com aqueles obtidos através do método da invenção (sistema de teste padrão) do Exemplo 2. Incidentalmente, foi usado como um segundo reagente um reagente igual ao segundo reagente empregado no Exemplo 1.

(Composições de reagentes para teste) Tabela 4

Sistema de Teste Conteúdo da composição Padrão Colesterol oxidase (5 U/mL) A Cclesterol oxidase (1 U/mL) B Ácido flufenâmico + colesterol oxidase (0,15 mM) (1 U/mL) C Ácido mefenâmico + colesterol oxidase (0,1 mM) (1 U/mL) D 2,2',6',2"-terpiridina + colesterol oxidase (0.5 mM) (1 U/mL) E Ácido tíglico + colesterol oxidase (50 mM) (1 U/mL) F Ácido fusídico + colesterol oxidase (0,1 mM) (1 U/mL) G Acetato de betametasona + colesterol oxidase (0.2 mM) (1 U/mL) H Monensina + colesterol oxidase (0.2 mM) (1 U/mL) I Mevinolina + colesterol oxidase (0,05 rfiM) (1 U/mL)

(Resultados) Tabela 5

Amostra Método de Precipitação (mg/dL) Padrão A B C D E F G H I 1 80 77 72 77 68 76 74 74 74 74 76 2 76 74 72 74 64 73 71 73 74 74 73 3 75 72 70 72 66 71 70 70 70 71 71 4 71 72 71 70 66 69 69 71 69 71 72 71 70 70 69 61 68 67 68 70 69 70 6 71 70 67 70 63 68 68 67 69 70 68 7 69 66 63 66 61 65 65 65 64 65 66 8 67 69 70 68 60 68 67 66 69 68 68 9 66 65 65 65 59 65 64 63 65 65 65 65 65 64 65 58 65 64 62 64 65 63 11 57 58 56 57 C Λ J 57 56 57 57 58 57 12 56 5 6 55 55 49 55 54 53 55 55 55 13 54 55 54 55 50 54 53 53 53 54 54 14 53 54 54 52 46 53 52 52 54 52 53 52 53 52 51 47 52 51 49 52 51 52 16 51 53 51 50 46 50 51 49 51 51 51 17 49 50 48 48 44 47 48 47 48 48 49 18 47 48 48 46 41 46 46 45 47 47 47 19 45 46 48 44 38 46 43 45 47 . Al 46 - 47 47 49 45 40 46 45 45 48 47 47 21 42 44 44 43 39 43 42 41 43 44 43 22 39 42 43 41 37 41 41 39 41 41 41 23 32 35 36 33 31 36 34 32 34 34 33 24 18 20 22 19 17 23 19 18 21 20 19 40 42 42 41 38 45 41 40 41 42 41 Coef.de correlação 0, 996 0, 990 0, 998 0, 992 0, 995 0, 99 7 0, 99 7 0, 99 4 0,99 5 0,9 97 Declividade 0, 905 0, 838 0, 941 0, 832 0, 856 0, 88 8 0, 91 5 0, 87 7 0,89 1 0,9 17 Interseção 5,6 8,7 2,6 3,4 7,5 4, 6 2,8 6,3 5,7 4, 1 Quando a quantidade de colesterol oxidase foi reduzida para um quinto (sistema de teste A) comparado como sistema de teste padrão (Exemplo 2), o coeficiente de correlação caiu ligeiramente e o valor da interseção aumentou ligeiramente.

Quando foi usado o acelerador de reação, entretanto, foram obtidos resultados substancialmente comparáveis àqueles do sistema de teste padrão mesmo quando a quantidade de colesterol oxidase era de um quinto, Ficou assim evidente a partir destes resultados que o uso de um acelerador de reação torna possível reduzir a quantidade de colesterol oxidase a ser usada.

Exemplo 5

Os reagences de J até L mostrados a seguir na Tabela 6 foram preparados contendo normalmente 1,2 5 U/mL de peroxidase (produto da Toyobo Co., Ltd.), 0,01% de 4- aminoantipirina, 0,02% de disulfo-butilmetatoluidino e 50 mM de NaCl e eram diferentes entre si quanto ao tipo e pH do amortecedor e as concentrações de colesterol oxidase (produto da Toyobo Co., Ltd.) e de ácido fulfenâmico (produto da Sigma Chemical Co.) s

Tabela 6

Reagente 1-Amortecedor (pH) 2-Concentração de colesterol oxidase 3-Concentração de ácido fulfenâmico J 1- 50 mM Bis-Tris (pK 6,0) 2- 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/mL 3-0, 0,01, 0,05, 0,1 mM K 1- 50 mM PIPES (pH 7,0} 2- 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/mL 3-0, 0,1, 0,5, 1,0 mM L 1- 50 mM MOPS (pH 8,0) 2- 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/mL 3-0, 1,0, 5,0, 10,0 mM

Os reagentes de J até L (3 00 μL) foram

adicionados separadamente a alíquotas (3 μL) de cada amostra de soro. Depois que as misturas resultantes foram incubadas sob 370C durante 5 minutos, seus graus de absorvência foram medidos a 600 nm. Os procedimentos acima foram levados a cabo usando o analizador automático "Hitachi Modelo 7150". Quatro amostras de soro foram medidas com os reagentes de J até L. com respeito a cada um dos reagentes de J até L, os graus de absorvência relativa foram calculados para as concentrações individuais de colesterol oxidase e de ácido fulfenâmico assumindo-se que a absorvência obtida com um reagente contendo 5,0 U/mL de colesterol oxidase e 0 mM de ácido fulfenâmico era de 100. (Resultados)

Os resultados, que haviam sido obtidos fazendo- se a média entre as absorvências relativas das quatro amostras, estão apresentados na Figura 3, na qual "COD" significa colesterol oxidase. Conforme é prontamente percebido a partir dos resultados, o grau de absorvência relativo aumentou dependendo da concentração de ácido fulfenâmico independente do pH. Foi portanto confirmado que o uso do acelerador de reação torna possível reduzir a quantidade de colesterol oxidase a ser usada. Ficou também claro que o acelerador de reação é também usável num método para a medição de colesterol livre ou do colesterol total, que faz uso de uma enzima que atua sobre o colesterol livre como um substrato.

Claims

1 . "MÉTODO PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL", que contém várias lipo-proteínas, antes da medição do colesterol existente em uma lipo-proteina especifica dentre as lipo-proteinas da referida amostra, caracterizado por fazer com que uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, atue sobre a referida amostra para consumir antecipadamente apenas o referido colesterol livre sob condições em que as referidas lipo-proteinas permanecem substancialmente inalteradas.

2. "MÉTODO PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL", que contém várias lipo-proteinas, antes da medição do colesterol existente em uma lipo-proteina especifica dentre as lipo-proteinas da referida amostra, caracterizado por fazer com que uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato e um acelerador de reação, que é selecionado do grupo composto pelo ácido flufenámico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"-terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina atuem sobre a referida amostra para consumir antecipadamente apenas o referido colesterol livre sob condições em que as referidas lipo-proteinas permanecem substancialmente inalteradas.

3. "MÉTODO" de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida enzima é a colesterol oxidase ou a colesterol dehidrogenase.

4. "MÉTODO PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL", para a quantificação do colesterol existente numa lipo-proteina especifica numa amostra, caracterizado por fazer com que uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, atue sobre a referida amostra com a referida lipo-proteina contida na mesma consuma apenas o referido colesterol livre sob condições em que as referidas Iipo- proteínas permanecem substancialmente inalteradas; e então medir o referido colesterol, que existe na referida lipo-proteina específica, através do uso de uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina específica.

5. "MÉTODO PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL", para a quantificação do colesterol existente numa lipo-proteina específica numa amostra, caracterizado por fazer com que uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato e um acelerador de reação, que é selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"-terpiridina, o ácido tíglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina atue sobre a referida amostra com a referida lipo-proteina contida na mesma para consumir apenas o referido colesterol livre sob condições em que as referidas lipo-proteínas permanecem substancialmente inalteradas; e então medir o referido colesterol, que existe na referida lipo-proteina específica, através do uso de uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina específica.

6. "MÉTODO" de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a referida enzima é a colesterol oxidase e/ou a colesterol dehidrogenase.

7. "MÉTODO" de acordo com a reivindicação 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a referida lipo-proteina especifica é uma lipo-proteina com alta densidade.

8. "AGENTE PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL" para uma amostra a ter seu percentual de colesterol medido, compreendendo uma enzima, que atua sobre o colesterol livre como um substrato, caracterizado por compreender um acelerador de reação que é selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"-terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e substancialmente nenhuma substância que atua sobre a lipo-proteina.

9. "AGENTE PARA TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL", de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por comrpeender um acelerador de reação que é selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2' ,6',2"-terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e substancialmente nenhuma colesterol esterase.

10. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol oxidase e uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica, colesterol esterase e um revelador de cores.

11. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica e colesterol esterase.

12. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica, colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase e um revelador de cores.

13. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e colesterol esterase; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica, colesterol oxidase, peroxidase e um revelador de cores.

14. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol oxidase e uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase e um revelador de cores.

15. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase.

16. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase e uma co-enzima; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase e um revelador de cores.

17. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e uma substância consumidora de produto da reação da co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica e colesterol esterase.

18. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo colesterol dehidrogenase, uma co-enzima e uma substância consumidora de produto da reação da co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica, colesterol esterase e um revelador de cores.

19. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol oxidase, (b) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (c) uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina específica, colesterol esterase e um revelador de cores.

20. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tíglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (c) uma co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteína específica e colesterol esterase.

21. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol oxidase, (b) um acelerador de reação selected from ácido flufenâmico, ácido mefenâmico, 2, 2 1 , 6' , 2"-terpiridina, ácido tíglico, ácido fusídico, acetato de betametasona, monensina ou mevinolina, (c) colesterol esterase e (d) uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância, que atua apenas sobre a referida lipo-proteína específica e um revelador de cores.

22. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) uma co-enzima, (c) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (d) colesterol esterase; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteína específica.

23. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) uma co-enzima, (c) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (d) colesterol esterase; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteína especifica, colesterol oxidase, peroxidase e um revelador de cores.

24. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol oxidase, (b) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusídico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (c) uma substância consumidora de peróxido de hidrogênio; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase e um revelador de cores.

25. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (c) uma co-enzima; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol esterase.

26. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (c) uma co-enzima; (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica; e (3) um terceiro reagente compreendendo colesterol oxidase, colesterol esterase, peroxidase e um revelador de cores.

27. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) uma co-enzima, (c) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6', 2"- terpiridina, o ácido tíglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (d) substância consumidora de produto da reação da co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica e colesterol esterase.

28. "KIT PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLESTEROL EM LIPO-PROTEÍNAS ESPECÍFICAS" caracterizado por compreender os seguintes reagentes: (1) um primeiro reagente compreendendo (a) colesterol dehidrogenase, (b) uma co-enzima, (c) um acelerador de reação selecionado do grupo composto pelo ácido flufenâmico, o ácido mefenâmico, a 2,2',6',2"- terpiridina, o ácido tiglico, o ácido fusidico, o acetato de betametasona, a monensina ou a mevinolina e (d) substância consumidora de produto da reação da co-enzima; e (2) um segundo reagente compreendendo uma substância que atua apenas sobre a referida lipo-proteina especifica, colesterol esterase e um revelador de cores.