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KR20040012678A - 지질 측정방법 및 그에 이용하는 시약 - Google Patents

지질 측정방법 및 그에 이용하는 시약 Download PDF

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KR20040012678A
KR20040012678A KR10-2003-7006399A KR20037006399A KR20040012678A KR 20040012678 A KR20040012678 A KR 20040012678A KR 20037006399 A KR20037006399 A KR 20037006399A KR 20040012678 A KR20040012678 A KR 20040012678A
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KR
South Korea
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cholesterol
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lipoprotein
measuring
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KR10-2003-7006399A
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야마모토미츠아키
야마모토쇼코
나카무라미츠히로
사이토가즈노리
Original Assignee
다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

본 발명은 유기 규소 화합물의 존재하에 혈액 성분중의 지질을 측정하는 것을 특징으로 하는 지질 측정방법 및 이에 사용하는 측정시약을 제공한다.
본 발명에 의하면, 측정 정밀도에 영향을 주지 않고, 또한 측정기기에 부담을 주지 않으며, 더욱이 용이하게 입수할 수 있는 등의 조건을 만족하면서, 직접법의 특수한 조건을 일으키게 하는 것이 가능하다.

Description

지질 측정방법 및 그에 이용하는 시약{METHOD OF LIPID ASSAY AND REAGENT FOR USE THEREIN}
생체의 주요한 지질인 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 인지질은 혈액 중에서 아포 단백과 함께 리포단백을 형성하여 존재하고 있다. 이 리포단백은 물리적인 성질과 상태의 상이에 의하여, 카이로미크론, 초저비중 리포단백(VLDL), 저비중 리포단백(LDL), 고비중 리포단백(HDL) 등으로 분류된다. 이들 리포단백 가운데, LDL은 동맥 경화를 일으키는 원인 물질의 하나이고, HDL은 반대로 항동맥 경화작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
종래, 허혈성심 질환의 예방이나 치료효과의 판정을 목적으로 혈액중의 총콜레스테롤, 총트리글리세리드의 측정이 행하여져 왔으나, 역학적인 검토에 의하여, LDL중의 콜레스테롤 량이 동맥 경화성 질환의 발증 빈도와 정의 상관을 나타내는 한편, HDL 중의 콜레스테롤 양이 동맥 경화성 질환의 발증 빈도와 역의 상관을 나타내는 것이 밝혀져 LDL이나 HDL이라고 하는 리포단백 획분별의 변동을 파악하는 중요성이 인식되기에 이르렀다. 그리 하여, 현재에는 각 리포단백을 구성하는 단백 성분인 아포단백 B나 아포단백 A-I, 혹은 리포단백 획분별로 콜레스테롤을 측정하고 있다.
전술한 바와 같이, 혈액중의 지질성분의 측정 방법으로서는 모든 리포단백 중에 함유되는 특정의 지질의 총량, 예를 들면 총콜레스테롤이나 총트리글리세리드를 측정하는 것이나, LDL 또는 HDL이라는 특정의 리포 단백중의 콜레스테롤을 측정하는 방법 등이 있다.
이 중 전자는 측정 대상으로 하는 지질성분에 대한 효소와 이 지질성분과 효소와의 반응을 리포단백의 구별 없이 가능하게 하는 조건 (예를 들면 Triton X-100 등의 리포단백 선택성의 낮은 계면활성제)을 조합하여 실시되는 것이며, 모든 리포단백 중의 측정 대상 지질성분이 측정된다.
후자는 측정 대상으로 하는 지질성분에 대한 효소와 이 효소를 특정의 리포단백 중의 측정 대상 지질성분만이 반응 가능하게 하는 특수한 조건을 조합하여 실시되는 것이며, 특정의 리포단백 획분중의 측정 대상 지질성분이 측정된다.
이 특수한 조건을 만들기 위하여 종래는 초원심분리, 전기영동, 겔여과, 또는 응집제에 의한 침전(침전법)등의 수단에 의하여, 측정 시료 중으로부터, 측정 대상으로 하는 리포단백을 분리하는 방법(이하, 이들을 총칭하여 "응집법"이라고 한다)이 채용되고 있었다.
최근, 이들 응집법에 의하지 않고 특수한 조건을 일으키게 하는 방법 (이하,총칭할 때는 "직접법"이라고 한다)으로서 예를 들면, HDL 콜레스테롤 측정에 관한, 담즙산의 리포단백에 대한 반응시간의 차를 이용하는 방법(일본국 특공평 016720/1994호), 측정 대상 외의 리포단백을 응집시킨 상태로 효소 반응을 실시하는 방법(일본국 특개평 242110/1994호), 당화합물을 사용하는 방법(일본국 특허 제2653755호), 수식 효소를 사용하는 방법(일본국 특허 제2600065 호), 리포단백을 용해하지 않는 계면활성제를 사용하는 방법(일본국 특허 2799835호), 측정 대상 외의 리포단백중의 콜레스테롤을 미리 효소 반응에 의하여 소거하는 방법(일본국 특개평 000299/1997호), 카라기난을 사용하는 방법(일본국 특개평 121895/1997호), 리포단백 선택성이 있는 계면활성제를 사용하는 방법(일본국 특개평 056395/1999호), 칼리자렌(Calixarene)을 사용하는 방법(국제 공개 WO 98/59068호), 인화합물을 사용하는 방법(일본국 특개 116400/2000호) 등, 다수가 고안되고 있다.
이들의 직접법의 몇 개는 조작이 번잡한 응집법과 비교하여, 간편하기 때문에 실제로 일상적인 임상 검사의 분야에서 사용되고 있다. 그러나, 그의 실용화된 방법에 있어서도, 예를 들면, 시약에 응집제를 함유하는 방법에 대하여서는 생성된 응집물이 측정 정밀도에 영향을 주거나 또는, 응집제와 응집기구용 알칼리성 세제가 반응하여 유로가 응집괴로 막히는 등, 측정 기기에의 부담이 생기거나 또는 수식 효소를 사용하는 방법에 대하여서는 효소를 수식할 때의 공정관리(품질의 유지)나 경비증가의 문제가 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 측정 정밀도에 영향을 주지 않고, 또한, 측정기기에 부담을 주지 않고, 더욱이 용이하게 입수할 수 있는 등의 조건을 만족시키면서,직접법에 있어서의 특수한 조건을 일으키게 하는 것이 가능한 물질을 발견하고, 이를 이용한 혈액 등에 함유된 지질의 측정 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 적은 시료로, 간편한 조작에 의해 효율 좋게, 특정 리포단백 획분중의 지질성분을 분별 측정하는 방법 및 이 방법으로 사용하는 측정시약에 관한다.
도 1은 실시예 2에 나타낸 본 발명 방법과 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하지 않은 시약을 이용한 방법(대조법)에서 동일한 혈청 시료중의 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하고, 그 결과와 응집법에서의 결과의 상관을 조사한 도면이다. 도중, A는 대조법, B는 본 발명 방법이다.
도 2는 실시예 3A 및 3B에 나타낸 본 발명 방법과 본 발명의 유기 규소화합물을 함유하지 않은 시약을 이용한 방법(대조법)에서 동일한 혈청 시료중의 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하고, 그 결과와 응집법에서의 결과의 상관을 조사한 도면이다. 도중, A는 대조법, B는 실시예 3A 방법, C는 실시예 3B의 방법이다.
도 3은 실시예 4에 나타낸 본 발명 방법과 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하지 않은 시약을 이용한 방법(대조법)에서 동일한 혈청 시료중의 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하고, 그 결과와 응집법에서의 결과의 상관을 조사한 도면이다. 도중, A는 대조법, B는 본 발명 방법이다.
[발명의 실시의 형태]
본 발명 방법은 지질을 함유하는 검체 중에 유기 규소 화합물의 존재하에 공지의 지질 측정시약을 이용하여 지질을 측정함으로써 실시된다.
본 발명에서 이용되는 유기 규소 화합물로서는 실리콘 및 그의 유도체를 들 수가 있다. 이 실리콘은, 일반적으로 폴리실록산으로 불리는, 규소 원자와 산소 원자가 결합한 실록산 결합의 반복 구조 -(Si-O)n-로 되는 고분자중 알킬기나 아릴기 등의 유기 기를 가지는 것을 말한다. 실리콘의 물성은 그의 분자구조에 기인하며, 중합도, 측쇄기의 종류, 가교의 정도 등에 따라 점도, 휘발성 등이 다르며, 성상으로서는 액상, 그리이스상, 고무상, 수지상의 것이 있다. 이들의 실리콘 및 그의 유도체는 예를 들면, 실리콘, 고중합 실리콘, 환상 실리콘, 알킬 실리콘, 실리콘계 계면활성제, 변성 실리콘 오일 등의 분류 명으로 시판되고 있어 용이하게 입수 가능한 것이다. 상기 변성 실리콘 오일은 실리콘 오일에 유기 기를 도입한 것으로, 도입되는 유기기의 종류로부터는 아미노 변성, 에폭시 변성, 카르복실 변성,폴리에테르 변성, 알킬 변성 등의 타입으로 분류되며, 구조의 점으로부터는 측쇄형, 양말단형, 편말단형, 측쇄 양말단형으로 분류할 수 있다. 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이들 실리콘 및 그의 유도체는 단독으로, 또는 2종이상을 혼합하여 사용하여도 좋다. 또한, 각 회사로부터 개별 제품의 특성 등에 대하여 기재된 카탈로그가 발행되고 있어 이들을 참조하여 사용하는 유기 규소 화합물을 선택할 수가 있다.
본 발명의 유기 규소 화합물은 검체 및 목적으로 하는 지질 측정용의 시약과 동시에 가하여도, 또는 검체에 혼합시킨 후, 나머지의 지질 측정용 성분을 함유하는 시약을 혼합하여 목적으로 하는 지질을 측정하여도, 검체와 지질 측정용 시약의 일부를 혼합한 후, 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 시약을 가하여 목적으로 하는 지질을 측정하여도 좋다.
또한, 지질 측정용 시약을 첨가한 후, 최종적으로 목적으로 하는 지질을 검출하는 방법은 특히 제한되지 않고, 예를 들면 퍼옥시다제와 색원체를 다시 조합하여 행하는 흡광도 분석, 보효소나 과산화수소를 직접 검출하는 방법 등도 이용할 수가 있다.
본 발명에 있어서, 검체에 대한 유기 규소 화합물의 첨가량은 측정할 지질의 종류, 검체의 성질, 사용하는 시약의 종류 등, 또는 후술하는 계면활성제 또는 글리세롤의 배합의 유무나 그 양에 따라서 다르며, 실험적으로 최적 조건을 선택하여야 하지만, 일반적으로는 0.0001∼5 질량%(이하, 단순히 "%"로 나타낸다), 바람직하기로는 0.001∼5% 정도이다.
특히, 본 발명은 앞에서 예시한 직접법으로 실시되는 것, 환언하면 유기 규소 화합물과 직접법으로 사용되는 시약을 조합하여 사용할 수 있으며, 그렇게 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 리포단백을 용해하지 않는 계면활성제(일본국 특허 2799835호)나, 리포단백 선택성이 있는 계면활성제 (일본국 특개평 056395/1999호)와 조합하여 사용하면, 이들의 계면활성제의 성질을 보다 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는 유기 규소 화합물의 수용성을 조절하기 위하여, 예를 들면, 계면활성제나 글리세롤 등과 혼합하여 유화시켜서 사용하여도 좋다.이 중, 계면활성제로서는 음이온계, 비이온계, 양이온계, 양성계면활성제 등의 어느 것이어도 사용 가능하고, 특히 제한은 없지만, 알킬에테르카르복실산염, N-아실아미노산염, 알킬인산염, N-아실타우린염, 설폰산염, 알킬황산염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산염, 아세트산 베타인류, 이미다졸린류, 알킬 암모늄염, 아미드아민, 다가 알코올 지방산에스테르, 알킬글리세릴에테르와 그의 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄지방산 에스테르, 폴리옥시 소르비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 라놀린, 폴리옥시에틸렌 라놀린 알코올, 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체, 폴리옥시에틸렌 캐스터유, 폴리옥시에틸렌 경화 캐스터유, 폴리옥시에틸렌 스테롤, 폴리옥시에틸렌 수소 첨가 스테롤, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 알킬 에테르, 에틸렌디아민의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르,폴리옥시에틸렌 알킬아민, 자당 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐포름알데히드 축합물, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르인산, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 인산염 등을 예시할 수가 있다.
상기한 계면활성제는 단독으로, 또는 2종이상을 조합하여 사용하여 측정계 중에 첨가할 수가 있다. 이들 계면활성제가 조합 또는 첨가량은 실리콘 및 그의 유도체의 종류, 계면활성제의 종류 등에 따라서 다르며, 실험적으로 최적조건을 선택하여야 하지만, 일반적으로는 측정계 중의 농도로서 0.0001∼5% 정도이고, 0.001∼5% 정도로 하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 계면활성제 외에, 아크릴산·메타크릴산 알킬 공중합체, 카르복시 비닐 폴리머 등의 고분자 유화제, 에탄올 등의 유기용매, 측정의 특이성을 해치지 않는 실리콘 및 그의 유도체 등도 수용성 조정에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 측정되는 지질은 생체중에 있는 것이면 어느 것이라도 좋으나, 리포단백을 구성하는 지질인 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질이 특히 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 지질을 측정하기 위하여 사용되는 효소로서는 목적으로 하는 지질을 기질로 하는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 임상 검사법 제요 제 30판(Kanahara and Co., Ltd., 1993) 등에 기재되어 범용되고 있는 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질을 측정하기 위하여 사용되는 효소는 당연하게 사용 가능하고, 본 발명의 범위에 포함된다.
이들 지질 중, 예를 들면 콜레스테롤을 측정하는 경우는 콜레스테롤 데히드로제나제, 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제 등 일반적으로 콜레스테롤 측정에 사용되는 것이라면 어느 것이라도 지장 없이 사용 할 수 있다. 이것들은 미생물 유래, 동물유래, 식물유래 등, 어느 것이라도, 또한 유전자 조작에 의하여 만들어진 것이어도 좋고, 화학 수식의 유무도 묻지 않는다.
이들 효소는 필요에 따라 보효소나 검출을 위한 효소나 발색제 등과 조합하여 사용할 수 있으며, 보효소로서는 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오티드 등이, 효소로서는 퍼옥시다제 등이, 발색제로서는 트린다계의 색소나 아미노안티피린 등을 사용할 수 있다.
이들 검출을 위한 효소는 단독으로, 또는 2종이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 또한 그의 사용량은 효소에 따라 다르며, 특히 제한되는 것은 아니나, 0.001∼100단위/㎖로, 바람직하기로는 0.1∼100단위/㎖로 사용할 수 있다.
본 발명 방법을 유리하게 실시하기 위하여는 상기한 유기 규소 화합물, 지질을 측정하기 위한 효소, 발색제, 보효소 등을 적당 조합하여 조제한 지질 측정시약을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 측정의 특이성을 해치지 않고, 또한, 특정의 리포단백의 응집을 일으키지 않는 범위이면, 카타라제 등의 다른 효소나 염, pH 조정을 위한 완충제, 계면활성제, 방부제, 알부민 등의 단백질류, 항체, 항생 물질, 사포닌, 렉틴, 폴리 음이온 등 특정의 리포단백에 친화성을 가지는 시약을 배합할 수 있다.
이들 중, 완충제로서는 굿 완충제(Good's buffer), 인산, 트리스, 프탈산염 등 어느 것이라도 좋고, 반응액으로서 pH 4 내지 10의 범위에서 완충 작용을 가지는 조건을 설정할 수 있는 것이면 사용할 수 있다. 그의 사용량은 특히 제한되는 것은 아니나, 0.0005∼2 mol/ℓ로, 바람직하기로는 0.01∼1 mol/ℓ로 사용된다. 어떠한 것도 실시에 있어서는 사용하는 효소의 특성 또는 시약에 포함되는 그 외의 성분과의 관계 등으로부터, 실험적으로 최적 조건을 선택하여야 한다.
또, 본 발명 방법을 유리하게 실시하기 위한 지질 측정시약의 구체적인 예를 나타내면 다음과 같다.
(HDL 콜레스테롤 측정용 시약)
(1) 유기 규소 화합물
(2) 콜레스테롤 에스테라제
(3) 콜레스테롤 옥시다제
(4) 퍼옥시다제
(5) 발색제 (4-아미노안티피린과 디설포부틸 메타톨루이딘 등)
*소망에 따라, 리포단백 선택성이 있는 계면활성제 등을 사용할 수 있다.
(LDL-콜레스테롤 측정용 시약)
(제 1시약)
(1) 유기 규소 화합물
(2) 콜레스테롤 에스테라제
(3) 콜레스테롤 옥시다제
(4) 퍼옥시다제
(5) 2종 조합함으로서 발색하는 성분중 한쪽(예를 들면, 4-아미노안티피린등)
* 소망에 의하여, 리포단백 선택성이 있는 계면활성제 등
(제２시약)
(6) 2종 조합함으로서 발색하는 성분중 한쪽(예를 들면, 디설포부틸메타톨루이딘 등)
(7) 리포단백 선택성의 낮은 계면활성제
실시예
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 하등 제약되는 것은 아니다.
실시예 1
초원심분리법에 의해 조제한 HDL, LDL 획분을 시료로 하여 본 발명의 효과를 확인했다. HDL 및 LDL 획분 중의 콜레스테롤의 측정에는 하기 조성의 시약을 사용했다.
(제 1시약)
PIPES 완충액 (pH 6. 5) 50 mmol/ℓ
4-아미노안티피린 0.5 mol/ℓ,
(제 ２시약)
PIPES 완충액 (pH 6.5) 50 mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라제 1 단위/㎖
콜레스테롤옥시다제 1 단위/㎖
디설포부틸메타톨루이딘 1.0 mmol/ℓ
퍼옥시다제 5 단위/㎖
유기 규소 화합물 1 %
(모두 일본 유니카 제)
측정은 히타치 7170형 자동 분석기를 사용하여 행했다. 시료 2.4 ㎕에 제 1시약 240 ㎕를 첨가하고, 약 5분 후, 제 ２시약 80 ㎕를 다시 첨가했다. 제 ２시약 첨가 직전과 첨가 5분 후의 600 nm에서의 흡광도를 측정하고, 그의 차를 시료 흡광도로 했다. 대조로서 리포단백 선택성이 낮은 Triton X-100, 1%를 본 발명의 유기 규소 화합물의 대신 함유하는 제 ２시약을 사용했다.
Triton X-100을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 때의 시료 흡광도를 100으로 하고, 각종 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 때의 상대 시료 흡광도를 구했다. LDL에 대한 상대 시료 흡광도와 HDL 에 대한 상대 시료 흡광도의 비를 계산하여 효과를 비교했다. 결과를 표 1 에 나타냈다.
첨 가 성 분 HDL에 대한상대 흡광도 LDL에 대한상대 흡광도 상대 흡광도의 비 (LDL/HDL)
유기규소계 화합물 1(NUC-Silicon L7002)유기규소계 화합물 2(NUC-Silicon L7604)유기규소계 화합물 3(NUC-Silicon FZ2118)유기규소계 화합물 4(NUC-Silicon FZ2162)유기규소계 화합물 5(NUC-Silicon FZ2163)계면활성제(Triton X-100) 2394491449100 1915716100 0.040.100.310.500.331.00
본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 때의 상대 흡광도의 비는 0.04∼0.5이었다. 이것은 본 발명의 유기 규소 화합물이 LDL 중의 콜레스테롤과 효소와의 반응보다도, HDL 중의 콜레스테롤과 효소의 반응을 보다 가능하게 한다고 하는 특수 조건을 일으키게 하고 있는 것을 나타내는 것이다.
실시예 2
리포단백을 함유하는 20예의 혈청 검체를 시료로서 본 발명의 효과를 확인했다. 측정에는 다음의 조성의 시약을 이용했다.
(제 1시약)
Bis-Tris 완충액 (pH 6.0) 50 mmol/ℓ
콜레스테롤 옥시다제 1 단위/㎖
퍼옥시다제 1.25 단위/㎖
디설포부틸메타톨루이딘 0.5 mmol/ℓ
플루페남산 150 μmol/ℓ
(제 ２시약)
Bis-Tris 완충액 (pH 6) 50 mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라제
(아사히카세이) 1.5 단위/㎖
4-아미노안티피린 1.0 mmol/ℓ
에마르겐 B-66 1.5%
유기 규소 화합물 0.001%
(NUC-Silicon L720: 일본 유니카 제)
측정은 히타치 7170 형 자동 분석기를 사용하여 행했다. 시료 2.4 ㎕에 제 1시약 240 ㎕를 첨가하고, 약 5분 후, 제 ２시약 80 ㎕를 다시 첨가했다. 제 ２시약 첨가 직전과 첨가 5분 후의 600 nm에서의 흡광도를 측정하고, 그 차로부터 혈청 검체중의 HDL 콜레스테롤 농도를 구했다(2 포인트법). 교정용 물질로서 농도 기지의 콘트롤 혈청을 이용했다. 대조로서 본 발명의 유기 규소화합물을 함유하지 않는 제 ２시약을 사용했다.
시판의 응집법 시약(HDL-Cㆍ2 킷트; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.)을 사용하고, 동시에 혈청 시료중의 HDL 콜레스테롤 농도를 측정했다. 응집법 시약의 값을 X축, 실시예의 값을 Y축으로 하여, 상관계수, 회귀식(regression formula)을 비교했다. 결과를 표 2 및 도 1에 나타냈다.
(단위:㎎/dL)
검체 응집법 대조법 본법
1234567891011121314151617181920 83.283.272.769.868.168.362.361.156.954.452.752.349.045.643.339.839.532.332.266.9 81.475.270.464.067.665.560.059.056.249.351.852.548.048.140.939.841.333.033.868.2 84.477.471.364.768.366.360.859.156.549.253.252.648.448.141.139.940.732.733.568.3
상관계수 - 0.989 0.989
기울기 - 0.891 0.935
절편 - 4.8 2.8
본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 경우, 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하지 않는 제 ２시약으로 측정했을 경우에 대하여, 기울기, 절편이 함께 개선되고 있다. 이것은 본 발명의 유기 규소 화합물이 LDL 중의 콜레스테롤과 효소와의 반응보다, HDL 중의 콜레스테롤과 효소의 반응을 보다 가능하게 한다고 하는 특수 조건을 일으키게 하여 리포단백 선택성이 있는 계면활성제의 특성을 보다 향상시키는 것을 나타내는 것이다.
실시예 3
리포단백을 함유하는 26예의 혈청 검체를 시료로서 제 ２시약에 함유시킴 본 발명의 유기 규소 화합물을 NET-SG-60A(실시예 3A) 또는 NET-SG-60C(실시예 3B) (모두 0.05%, 일본 서팩탄트 제)로 하는 이외는 모두 실시예 2와 동일한 조건으로 본 발명의 효과를 확인했다. 결과를 표 3 및 도 2에 나타냈다.
(단위: ㎎/dL)
검체 응집법 대조법 본법
실시예 3A 실시예 3B
1234567891011121314151617181920212223242526 44.549.348.869.767.266.440.328.645.346.841.741.155.652.662.232.748.247.441.153.344.075.359.437.150.636.9 47.851.151.172.466.969.142.232.447.948.244.145.059.256.262.235.948.349.245.154.846.078.261.739.755.040.9 46.750.951.072.767.969.142.230.846.648.143.342.758.655.363.034.848.549.645.054.245.879.560.539.353.040.4 47.051.150.973.667.569.142.230.546.648.243.043.659.256.162.335.049.249.045.054.345.980.161.239.653.540.3
상관계수기울기절편 --- 0.9950.9634.3 0.9971.0061.8 0.9961.0151.5
본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 경우, 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하지 않는 제２시약으로 측정했을 경우에 대하여, 기울기, 절편의 모두가 개선되고 있었다. 이것은 본 발명의 유기 규소 화합물이 LDL 중의 콜레스테롤과 효소와의 반응보다, HDL 중의 콜레스테롤과 효소의 반응을 보다 가능하게 하는 특수 조건을 일으키게 하여 리포단백 선택성이 있는 계면활성제의 특성을 보다 향상시키는 것을 나타내는 것이다.
실시예 4
리포단백을 함유하는 30예의 혈청 검체를 시료로서 제 ２시약에 함유시키는 본 발명의 유기 규소 화합물을 KF-700(0.08%, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.)으로 하는 이외는 모두 실시예 2와 동일한 조건으로 본 발명의 효과를 확인했다. 결과를 표 4 및 도 3에 나타냈다.
검체 응집법 대조법 본법
123456789101112131415161718192021222324252627282930 98.695.087.484.080.476.674.271.869.263.660.060.859.858.655.855.854.452.049.048.645.043.445.044.642.041.838.038.437.035.0 98.794.587.984.782.679.076.674.670.667.663.864.763.260.959.760.058.356.353.849.548.247.146.847.044.043.042.341.138.537.0 98.295.089.484.581.879.276.174.170.067.464.263.962.961.359.259.157.154.652.848.847.546.646.045.842.942.040.939.937.236.0
상관계수기울기절편 --- 0.9970.9634.7 0.9970.9882.7
본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 경우, 본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하지 않는 제 ２시약으로 측정했을 경우에 대하여, 기울기, 절편 모두 개선되고 있었다. 이것은 본 발명의 유기 규소 화합물이 LDL중의 콜레스테롤과 효소와의 반응보다, HDL중의 콜레스테롤과 효소의 반응을 보다 가능하게 한다고 하는 특수 조건을 일으키게 하여 리포단백 선택성이 있는 계면활성제의 특성을 보다 향상시키는 것을 나타내는 것이다.
실시예 5
리포단백을 함유하는 20예의 혈청 검체를 시료로서 제 ２시약에 함유시키는 본 발명의 유기 규소 화합물을 표 5로 하는 이외는 모두 실시예 2 와 같은 조건으로 본 발명의 효과를 확인했다. 덧붙여 실시예 5A∼5D의 유기 규소 화합물은 에탄올에 10%가 되도록 용해하고, 또한, 5E 및 5F의 유기 규소 화합물은 SH8400(Dow Corning Toray Silicone Co., Ltd.)와 함께, 각각이 10%가 되도록 에탄올에 용해, 혼합한 후, 제 ２시약의 조제로 사용했다. 결과를 표 6에 나타냈다.
실시예 유기 규소화합물*
5A BY11-030(0.03%)
5B BY22-008M(0.05%)
5C SH-244(0.03%)
5D SH-245(0.05%)
5E DC345(0.02%)
5F SH200C-2cs(0.02%)
*: 모두 Dow Corning Toray Silicone Co., Ltd. 제품
(단위: ㎎/dL)
검체 응집법 대조법 본법
실시예5A 실시예5B 실시예5C 실시예5D 실시예5E 실시예5F
1234567891011121314151617181920 90.481.477.974.472.069.968.065.465.359.958.757.956.254.052.751.850.049.443.041.1 92.083.181.577.972.970.867.270.466.762.860.761.258.555.655.352.151.152.346.143.9 93.083.182.678.274.071.168.870.366.862.460.661.657.155.655.452.452.152.544.743.2 94.584.382.079.276.071.469.371.067.163.360.962.157.857.355.552.752.451.944.944.0 93.282.882.278.573.171.168.669.666.162.761.361.257.656.354.952.650.551.745.543.4 94.782.882.679.274.271.969.271.867.963.661.761.659.155.755.753.252.052.345.443.7 93.085.982.878.575.071.469.670.568.262.660.762.058.656.755.653.151.752.044.843.8 92.783.582.978.074.270.768.469.967.262.060.461.657.455.655.352.452.152.344.243.5
상관관계기울기절편 --- 0.9950.9892.81 0.9961.0210.99 0.9961.0380.54 0.9961.0171.15 0.9961.0291.15 0.9971.0370.56 0.9961.0230.82
본 발명의 유기 규소 화합물을 함유하는 제 ２시약으로 측정했을 경우, 본 발명의 유기 규소화합물을 함유하지 않는 제 ２시약으로 측정했을 경우에 대하여, 절편이 특히 개선되고 있었다. 이것은 본 발명의 유기 규소 화합물이 LDL중의 콜레스테롤과 효소와의 반응보다, HDL중의 콜레스테롤과의 반응을 보다 가능하게 한다고 하는 특수 조건을 일으키게 하여 리포단백 선택성이 있는 계면활성제의 특성을 보다 향상시키는 것을 나타내는 것이다.
본 발명자들은 전기 과제에 대하여, 예의 연구한 결과, 측정 대상으로 하는 특정 리포단백 중의 지질성분, 예를 들면 HDL 콜레스테롤의 측정 시에 시약 중에 유기 규소 화합물을 함유시키고, 콜레스테롤을 기질로 하는 효소와 측정 시료를 혼합하면, 응집제나 수식 효소의 비존재하에서도, HDL 콜레스테롤만을 특이적으로 측정할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 유기 규소 화합물의 존재하에 지질을 측정하는 것을 특징으로 하는 지질 측정 방법 및 여기에 사용하는 시약을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 원심분리 등의 사전 처리의 필요가 없고, 간편한 조작으로 효율 좋게 특정 획분중의 지질(예를 들면, 콜레스테롤)을 정량할 수 있다. 또한, 적은 시료로, 간편한 조작에 의하여, 특이적인 측정이 가능하기 때문에, 각종 자동 분석 장치에 적용할 수 있으며, 임상검사의 영역에 있어서도 극히 유용하다. 특히, 리포단백 선택성이 높기 때문에, 절편, 기울기가 개선하게 되어, 미소한 리포단백 선택성의 제어가 가능하게 된다고 하는 이점을 가지는 것이다.

Claims (16)

  1. 유기 규소 화합물의 존재하에 혈액 성분중의 지질을 측정하는 것을 특징으로 하는 지질 측정방법.
  2. 제 1항에 있어서, 유기 규소 화합물이 실리콘 및/또는 그의 유도체인지질 측정방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 실리콘 또는 그의 유도체가 고중합 실리콘, 환상 실리콘, 실리콘계 계면활성제 및 변성 실리콘 오일로 이루어진 군에서 선택된 것인 지질 측정방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 1항에 있어서, 지질성분이 특정의 리포단백에 포함되는 지질인 지질 측정방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항의 어느 1항에 있어서, 지질성분이 콜레스테롤, 트리글리세리드 또는 인지질의 어느 하나인 지질 측정방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 1항에 있어서, 유기 규소 화합물이 존재하고, 응집제가 존재하지 않는 조건에 있어서, 리포단백에 효소를 작용시켜 리포단백 중에 함유되어 있는 지질을 검출하는 것을 특징으로 하는 지질 측정방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 1항에 있어서, 리포단백중의 지질에 대한 효소의 작용을, 리포단백 선택성이 있는 계면활성제의 존재하에서 행하는 지질 측정방법.
  8. 유기 규소 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 지질 측정시약.
  9. 제 8항에 있어서, 유기 규소 화합물이 실리콘 및/또는 그의 유도체인 지질 측정시약.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 실리콘 또는 그의 유도체가 고중합 실리콘, 환상 실리콘, 실리콘계 계면활성제 및 변성 실리콘 오일로 이루어진 군에서 선택되는 지질 측정시약.
  11. 제 8항 내지 제 10항의 어느 1항에 있어서, 지질성분이 특정의 리포단백에 포함되는 지질인 지질 측정시약.
  12. 제 8항 내지 제 11항의 어느 1항에 있어서, 지질성분이 콜레스테롤, 트리글리세리드 또는 인지질의 어느 하나인 지질 측정시약.
  13. 다음 성분 (1)∼(5)
    (1) 유기 규소 화합물
    (2) 콜레스테롤 에스테라제
    (3) 콜레스테롤 옥시다제
    (4) 퍼옥시다제
    (5) 발색제
    을 함유하는 HDL-콜레스테롤 측정용 시약.
  14. 제 13항에 있어서, 더욱이 리포단백 선택성이 있는 계면활성제를 배합한 HDL-콜레스테롤 측정용 시약.
  15. 다음 성분 (1)∼(5)
    (1) 유기 규소 화합물
    (2) 콜레스테롤 에스테라제
    (3) 콜레스테롤 옥시다제
    (4) 퍼옥시다제
    (5) 2종 조합하여 발색하는 성분중의 한 쪽
    을 함유하는 제 1시약과
    다음의 성분 (6) 및 (7)
    (6) 2종 조합하는 것으로 발색하는 성분중의 다른 한 쪽
    (7) 리포단백 선택성의 낮은 계면활성제
    을 함유하는 제 ２시약을 조합하여 되는 LDL-콜레스테롤 측정용 킷트.
  16. 제 15항에 있어서, 더욱이 제 1시약에 리포단백 선택성이 있는 계면활성제를배합한 LDL-콜레스테롤 측정용 킷트.
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