"Antibiotiques et leur préparation"
La présente invention est relative à une nouvelle substance antibiotique, appelée antibiotique C-15003, à sa préparation ainsi qu'à un procédé pour la production de dérivés à partir de cet antibiotique.
On a recueilli de nombreux échantillons de sol et autres
et on a effectué un examen des micro-organismes isolés à partir de <EMI ID=1.1>
des micro-organismes sont capables de produire un nouvel antibiotique, que ces micro-organismes appartiennent au genre Nocardia et qu'en cultivant l'un quelconque des ces micro-organismes dans un milieu approprié, il était possible d'obtenir une accumulation de l'antibiotique dans le bouillon cultivé. On a également constaté qu'on pouvait obtenir des dérivés à partir de cet antibiotique. Il s'ensuivit des études plus poussées, conduisant au développement de la présente invention.
La présente invention est par conséquent relative :
(1) à l'antibiotique C-15003 répondant à la formule générale (I)
<EMI ID=2.1>
(2) à un procédé de production de l'antibiotique C-15003, ce procédé consistant à cultiver une souche productrice d'antibiotique C-15003 du genre Nocardia dans un milieu de telle sorte que la souche puisse élaborer et accumuler de l'antibiotique C-15003 dans le bouillon cultivé, et à récupérer l'antibiotique C-15003 de ce bouillon ; et
(3) à un procédé de production d'un composé répondant à la formule (II) :
<EMI ID=3.1>
ce procédé consistant à hydrolyser l'antibiotique C-15003 de la formule générale (I) :
<EMI ID=4.1>
Dans le contexte de la présente invention, l'expression "antibiotique C-15003" englobe d'une manière générale les trois composés répondant à la formule générale (I) ci-dessus, ou bien elle se rapporte à un mélange de deux ou trois de ces composés ou encore à l'un quelconque de ces composés. En se référant également à la formule générale (I), le composé dans lequel R représente le
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manière plus abrégée "C-15003 P-3" ; le composé dans lequel R re-
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
appelé "antibiotique C-15003 P-4" ou, d'une manière plus abrégée, <EMI ID=8.1>
échantillons lors de l'examen des micro-organismes producteurs d'antibiotiques.
Les caractéristiques microbiologiques de la souche
n[deg.] C-15003 sont étudiées par des méthodes analogues à celles proposées par Schirling & Gottlieb (International Journal of Syste-
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servations à 28[deg.]C pendant une période de 21 jours sont les suivants
1) Caractéristique* morphologiques
Le mycélium végétatif s'étend bien et se développe sous la forme de ramifications, à la fois sur de l'agar et en milieu
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de diamètre et, dans certains cas, elles peuvent se diviser en fragment* ressemblant à des bactéries en forme de baguettes ou à de courtes longueurs d'hyphes ramifiées. La souche donne une bonne croissance sur divers milieux taxonomiques, avec le mycélium aérien qui est superposé au mycélium végétatif, bien qu'elle forme fréquemment des corps du type corémium (50-200 x 200 - 1000
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grand nombre des mycéliums aériens sont flexibles, 'une configuration droite ou en forme de spirale, lâche étant rencontrée en quelques occasions. Un examen au microscope de cultures âgées révèle que seulement dans quelques cas les cellules du type conidies apparaissent sous forme de chaînes, tandis que les suspensions cellulaires obtenues à partir de la surface de ces cultures, ainsi qu'on l'a examiné au microscope, contiennent de nombreux
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Des examens au microscope électronique ont montré que ces corps présentent des surfaces lisses.
2) Constituants des cellules
La souche est cultivée, tout en étant soumise à une agitation à secousses,dans un milieu ISP n[deg.] 1 modifié à 28[deg.]C pendant
66 à 90 heures, période après laquelle les cellules sont receuillies et rincées. On examine en appliquant la méthode de B.Becker et collaborateurs [Allied Microbiology 12, 421 (1964)] et,la méthode de M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine
71, 934 (1968)], les cellules entières précédentes pour ce qui est de la composition de leur acide diamino-pimélique et de leur sucre. On a constaté que le premier de ces constituants était sous la forme méso, tandis qu'on a décelé des taches qui correspondent au galactose et à l'arabinose.
3) Caractéristiques sur des milieux taxonomiques
La souche montre une bonne croissance sur divers milieux, le mycélium végétatif étant incolore à jaune pâle lors des phases initiales de culture et brun jaunâtre clair à brun jaunâtre lors des phases ultérieures. La souche produit des pigments solubles, allant de la couleur jaune à brun jaunâtre, dans divers milieux taxonomiques. Le mycélium aérien est pulvérulent et donne généralement lieu à une croissance modérée, allant du blanc au jaune ou au brun jaunâtre clair. Les caractéristiques de la souche dans divers milieux taxonomiques sont données dans le tableau 1.
Tableau 1 : caractéristiques de la souche n[deg.] C-15003 en cul-ture sur divers milieux taxonomiques
(A) Agar au sucrose et nitrate :
<EMI ID=13.1>
ambre (3 le) , formation de corps du type corémium
Mycélium aérien (MA): peu développé, blanc Pigment soluble (PS): aucun ou brun jaunatre pale
(B) Agar au glycérolet nitrate :
<EMI ID=14.1>
corémium
MA: modérée, blanc
PS: aucun
(C) Agar au glucose et à l'asparagine :
C: modérée, Souci Brite (3 pa) à jaune Brite (2 pa) .
MA: peu développé, blanc
PS: jaune Brite (2 pa)*
(D) Agar au glycérol et à l'asparagine :
<EMI ID=15.1>
corémium
MA: peu développé, blanc
PS: aucun
(E) Agar à l'amidon
<EMI ID=16.1>
corps du type corémium
<EMI ID=17.1>
PS: aucun
(F) Agar nutritif
<EMI ID=18.1>
tion de corps du type corémium
MA: peu développé, blanc
PS: aucun (G) Agar au malate de calcium :
C: modérée, Ivoire Lt (2 ca) à Blé Lt (2 ea) , formation de
corps du type corémium
<EMI ID=19.1>
PS: aucun
(H) Agar à l'extrait de levure - extrait de malt
C: modérée, ambre (3 le) à jaune Brite (3 la) , formation de
corps du type corémium
<EMI ID=20.1>
PS: aucun
(I) Agar à la farine d'avoine :
<EMI ID=21.1>
tion de corps du type corémium
MA: peu développé, blanc à jaune clair
PS: aucun
(J) Agar à la peptone-extrait de levure - fer
C: modérée, jaune colonial (2 ga)
MA: aucun
PS: jaune colonial (2 ga)
(K) Agar à la tyrosine
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tion de corps du type corémium
<EMI ID=23.1>
PS: Camel (3 ie)*
Codes de couleur suivant le Color Harmony Manual, 4ième éd.
(Container Corporation of America, 1958).
4) Caractéristiques physiologiques
Les caractéristiques physiologiques de la souche sont indiquées au tableau 2. Gamme de températures pour la croissance:
12[deg.]C à 38[deg.]C. La gamme de températures à laquelle on obtient une bonne croissance aérienne sur de l'agar (ISP n[deg.] 2) est de 20 à 35[deg.]C.
Tableau 2 : caractéristiques physiologiques de la souche n[deg.]
C-15003
Gamme de températures pour la croissance : 12 à 38[deg.]C.
Gamme de températures pour la croissance aérienne : 20 à 35[deg.]C Liquéfaction de la gélatine : positive
Hydrolyse de l'amidon : positive
Réduction des nitrates : positive
Peptonisation du lait : positive
Coagulation du lait : négative
Décomposition de la caséine : positive
Production de pigments mélanoldes :
négative (agar à la peptone-extrait de levure-fer), positive (agar à la tyrosine)
Décomposition de la tyrosine : positive
Décomposition de la xanthine : négative
Décomposition de l'hypoxanthine : négative
Tolérance au lysozyme : positive
Tolérance au chlorure de sodium : 2%
5) Utilisation de diverses sources de carbone L'utilisation de diverses sources de carbone est étudiée en utilisant un milieu décrit par Pridham & Gottlieb [journal of Bacteriology 56, 107 (1948)] et un milieu de base répondant à la même composition auquel on a ajouté 0,1% d'extrait de levure. Le spectre obtenu est indiqué au Tableau 3.
Tableau 3 : utilisation de sources de carbone par la souche
n[deg.] C-15003
<EMI ID=24.1>
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� milieu de base avec 0,1% d'extrait de levure
Note: +++: croissance abondante
++: bonne croissance
+: croissance
faible croissance
-: pas de croissance 6) Autres caractéristiques
Les cellules furent recueillies par le procédé décrit précédemment en 2) et de l'ADN fut préparé par un procédé aralogue à celui de J. Marmur et collaborateurs (Journal of Molecular Bio-
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était de l'ordre de 71 moles %.
La coloration du Gram du mycélium végétatif de cette souche était positive.
Les caractéristiques précédentes de la souche n[deg.] C-15003 furent ensuite comparées aux publications de S.A. Waksman "The Actinomycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co., 1961), et de R.E. Buchanan et N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ième éd, 1974", ainsi qu'à d'autres publications.
Bien qu'on pense que cette souche appartient au Groupe III du genre Nocardia, l'impossibilité de trouver une espèce quelconque présentant les caractéristiques décrites jusqu'ici parmi les souches connues mène à la conclusion que cette souche représente une nouvelle espèce de micro-organisme.
Cette souche n[deg.] C-15003 a été déposée à l'Institut de la Recherche sur les Fermentations, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) sous le numéro de collection 3992, à l'Institut de la Fermentation, Osaka (IFO) sous le numéro de collection IFO
<EMI ID=27.1>
U.S.A., sous le numéro de collection 31281.
Bien que la souche n[deg.] C-15003 soit une nouvelle espèce du genre Nocardia, ainsi qu'on vient de le mentionner, elle est susceptible, comme le sont d'une manière générale les micro-organismes, de subir des modifications et des mutations, soit spontanément soit sous l'influence d'un mutagène.
Par exemple, les nombreuses variantes de la souche qui peuvent être obtenues par irradiation avec des rayons X, des rayons gamma, de la lumière ultraviolette, etc, par un isolement monocellulaire, par une culture su:
des milieux contenant diverses substances chimiques, ou par tout autre traitement mutagène, ainsi que les mutants provenant spontanément de la souche, ne doivent pas être considérés comme représentant une autre espèce distincte quelconque mais, plutôt, on peut invariablement utiliser pour les besoins de la présente invention l'un quelconque de ces variantes et mutants capables de produire du C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4.
A titre d'exemple, le fait de soumettre la souche n[deg.] C-15003 à divers traitements mutagènes permet d'obtenir des mutants pratiquement dépourvus de la propriété de produire des pigments solubles, des mutants avec des mycéliums de support qui sont incolore , vert jaunâtre , brun rougeatre ou rouge orange , des mutants dont les hyphes sont prêtes à se fragmenter sous la forme d'éléments bacillaires ou de fragments d'hyphes courts. ramifiés, ainsi que des mutants avec un mycélium aérien blanc abondant ou pratiquement sans mycélium aérien.
Le milieu utilisé pour cultiver une souche productrice d'antibiotique C-15003 de ce type peut être un milieu liquide ou solide quelconque, pour autant qu'il contienne des agents nutritifs que la souche peut utiliser, bien qu'il soit préférable d'utiliser un milieu liquide pour des essais de production intense. Le milieu peut comprendre des sources de carbone et d'azote que la souche n[deg.] C-15003 peut assimiler et digérer, des matières inorganiques, des agents nutritifs sous la forme de traces, etc. Comme exemple de sources de carbone de ce type, on peut mentionner le glucose, le lactose, le sucrose, le maltose, la dextrine, l'amidon, le glycérol, le mannitol, le sorbitol, etc., les graisses et les huiles (par exemple l'huile de soja, l'huile de lard, l'huile de poulet, etc.) etc. Les sources d'azote, par exemple, peuvent
être un extrait de viande, un extrait de levure, de la levure desséchée, de la farine de soja, de la liqueur de mais, de la peptone, de la farine de graines de coton, des mélasses usées, de l'urée, des sels d'ammonium (par exemple le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, etc.) etc. Le milieu peut contenir en outre des sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium, etc., des sels de fer, de manganèse, de zinc, de cobalt, de nickel, etc., des sels d'acide phosphorique, d'acide borique, etc., ainsi que des sels d'acide organique tels que des acétates et des propionates. De plus, le milieu peut contenir, sous la forme de compléments, divers aminoacides (par exemple de l'acide glutamique, de l'acide aspartique, de l'alanine, de la glycine, de la lysine, de la méthionine, de
la proline, etc.), des peptides (par exemple des dipeptides, des
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tinique, B12' C, E, etc.), des acides nucléiques (par exemple purine, pyrimidine et leurs dérivés),etc. En ce qui concerne l'ajustement du pH du milieu, on peut ajouter un acide inorganique ou organique, un alcali, un tampon, etc. Des quantités appropriées d'huiles, de graisses, d'agents tensio-actifs, etc, peuvent également être ajoutées comme antimousses.
La culture peut être réalisée sous des conditions stationnaires, de secousses,sous des conditions aérobies immergées ou sous l'une quelconque des autres conditions de culture. Pour les essais de production élevée, il est préférable d'utiliser un culture aérobie immergée. Bien que les conditions de culture dépendent évidemment de l'état et de la composition du milieu, de la souche, de la méthode de culture et d'autres facteurs, il est normalement préférable de réaliser l'incubation à 20-35[deg.]C avec un pH initial d'environ 7,0, ou aux environs de cette valeur. Une
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stade de culture intermédiaire, avec un pH initial de 6,5 à 7,5. Bien que la période d'incubation puisse également varier en fonction des mêmes facteurs que ceux qui ont été mentionnés précédemment, il est souhaitable de poursuivre l'incubation jusqu'à ce que le titre de la substance antibiotique désirée soit au maximum. Dans le cas d'une culture à secousses ou d'une culture immergée aérobie en milieu liquide, la période requise est normalement de l'ordre de 48 à 144 heures.
La puissance de l'antibiotique est examinée avec Tetrahymena pyriformis W, à titre de micro-organisme d'essai. C'est ainsi que l'on fait croître le micro-organisme dont question ci-
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d'extrait de levure (Difco), 2 g de glucose, 1000 ml d'eau distil-
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44 à 48 heures, et que l'on détermine la puissance de l'antibiotique par la méthode de dilution en série avec un contrôle de la turbidité de la croissance, de l'effet sur des cellules tumorales ascitiques,et au moyen d'une chromatographie sur couche mince, qui sera décrite ci-après.
Les nouveaux antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4 sont obtenus et s'accumulent dans le bouillon de fermentation ré-sultant, par la voie extracellulaire et intracellulaire.
Ces substances ont également été décelées par la chromatographie sur couche mince. C'est ainsi que l'on sépare le bouillon de fermentation en cellules et filtrat par filtration ou centrifugation et que l'on extrait le filtrat avec le même volume d'acétate d'éthyle. On ajoute aux cellules la même quantité d'acétone (70%) et d'eau qu'au filtrat et, après une agitation
de 1 heure à 20[deg.]C, on filtre la suspension. On sépare l'acétone du filtrat et on extrait le filtrat aqueux résultant avec de l'acétate d'éthyle. Chacun des extraits est concentré à 1/100 de son volume et est soumis à une chromatographie en couche mince sur une plaque de verre avec gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne�, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20)'(système solvant : chloroforme-méthanol : 9/1). La puissance est déterminée en fonction de l'intensité des taches décelées par irradiation avec de la lumière ultraviolette à 2537 A.
Etant donné que les C-15003 P-3, P-3' et/ou P-4, que l'on obtient ainsi dans le bouillon de fermentation, sont des substances neutres lipophyles, on peut les récupérer d'une manière appropriée par les processus de séparation et de purification que l'on utilise normalement pour la récolte de métabolites microbiens de ce type. Par exemple, on peut utiliser une méthode qui utilise la différence de solubilité entre l'antibiotique et les impuretés, des moyens qui font appel à l'affinité adsorbante de divers adsorbants tels que du carbone activé, des résines non ioniques macroporeuses, du gel de silice, de l'alumine, etc., une méthode pour séparer les impuretés au moyen de résines échangeuses d'ions, etc., ces différentes méthodes étant appliquées isolément, en combinaison et ce de manière appropriée, ou bien à plusieurs reprises.
Puisque, ainsi qu'on l'a déjà mentionné, les C-15003 P-3, P-3' et P-4 apparaissent à la fois dans le filtrat et les c ellules, les antibiotiques sont séparés et purifiés au moyen d'un tel adsorbant, si l'on en utilise, soit directement soit après une extraction au solvant dans le cas du filtrat, ou après une extraction au solvant dans le cas de cellules microbiennes. L'extraction au solvant peut être réalisée par l'une ou l'autre des méthodes suivantes, ou bien par d'autres méthodes, comme, par exemple,
(1) une extraction au solvant à partir du bouillon de culture avant la séparation des cellules et (2) une extraction au solvant des cellules et du filtrat obtenus par un procédé de filtration, de centrifugation ou par tout autre procédé. Pour extraire le filtrat et les cellules indépendamment, on peut utiliser avantageusement le procédé suivant.
Les solvants convenant pour l'extraction du filtrat sont des solvants organiques non miscibles dans l'eau, tels que des esters d'acides gras, par exemple l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle, des alcools, par exemple le butancl, des hydrocarbures halogénés, par exemple le chloroforme, et des cétones, par exemple la méthyl isobutyl cétone. L'extraction est réalisée à un pH proche de la neutralité et, de préférence, on extrait le fluide de culture préalablement ajusté à pH 7 avec de l'acétate d'éthyle.
On lave l'extrait avec de l'eau et on le concentre sous pression réduite. Ensuite, on ajoute un solvant non polaire tel que de l'éther de pétrole ou de l'hexane au concentré et en récupère le produit brut I contenant le composé actif. Etant donné qu'en chromatographie sur couche mince, on décèle un certain nombre de taches en plus de l'antibiotique C-15003, on soumet ensuite le
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qu'à titre de processus de purification classique_la chromatographie par adsorption se révèle intéressante et, à ce propos, on peut utiliser l'un des adsorbants ordinaires tels que du gel de silice, de l'alumine, une résine adsorbante non ionique macroporeuse, etc. En ce qui concerne la purification du produit I brut, le gel de silice se révèle le plus intéressant. Le développement peut être réalisé, par exemple en partant avec de l'éther de pétro le et de l'hexane et on réalise l'élution de l'antibiotique C-1500 par l'addition d'un solvant polaire, tel que l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol ou le méthanol.
Un procédé caractéristique consiste en une chromatographie sur colonne dans laquelle on utilise comme support du gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm) et dans laquelle on augmente graduellement le rapport hexane/acétate d'éthyle. L'éluat est échantillonné et examiné au moyen d'une chromatographie sur couche mince et les fractions contenant le C-15003 sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Ensuite, on ajoute au concentré de l'éther de pétrole ou de l'hexane, de sorte que l'on obtient le produit II brut. Puisque ce produit contient encore des impuretés, il est à nouveau purifié de la façon suivante. Par exemple, on peut puseconde colonne à
rifier le produit II au moyen d'une / base de gel de silice en utilisant un système solvant différent. Le système de développement peut, à cet effet, consister en un hydrocarbure halogéné tel que le dichlorométhane ou le chloroforme, avec l'addition d'un solvant polaire tel qu'un alcool, par exemple le méthanol ou
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L'ordre des systèmes solvants pour les première et seconde colonnes à base de sel de silice peut être inversé et, de plus, on peut utiliser des solvants organiques ordinaires conjointement aux systèmes précédents, si cela s'avère nécessaire.
Si l'on utilise une résine adsorbante macroporeuse comme moyen de purification pour le produit brut II, on réalise l'élu-tion de l'antibiotique C-15003 avec un mélange d'eau et d'un alcoql inférieur, d'une cétone inférieure ou d'un ester. L'alcool inférieur peut, par exemple, être le méthanol, l'éthanol, le propanol ou le butanol, et la cétone inférieure peut, par exemple, être l'acétone ou la méthyl éthyl cétone. L'ester peut, par exemple, être l'acétate d'éthyle. Suivant un processus caractéristicrue, le produit II brut est dissous dans un mélange de méthanol
(60%) et d'eau et adsorbé sur une colonne de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K.). La colonne est lavée avec un mélange de méthanol (70%) et d'eau et, ensuite, l'élution est réalisée avec un mélange de méthanol (90%) et d'eau. De cette manière, l'antibiotique C-15003 est élué de la colonne.
Dans chacun des procédés décrits précédemment, les fractions contenant l'antibiotique C-15003 sont rassemblées et concen-
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mes d'acétate d'éthyle et on laisse le mélange au repos, de sorte que des cristaux d'antibiotique C-15003 se séparent. Ces cristaux contiennent du C-15003 P-3, P-3' et P-4. Ces composés sont ensuite séparés l'un de l'autre au moyen d'un adsorbant, tel qu'un de ceux mentionnés précédemment. C'est ainsi qu'en utilisant du gel de silice ou une résine adsorbante non ionique macroporeuse et les solvants précédents, les composés désirés peuvent être élués par fractions. Si, par exemple, on utilise du gel de silice, on réalise le développement avec de l'hexane, de l'acétate d'éthyle ou un mélange de chloroforme et de méthanol, de sorte que les C-15003 P-4, P-3' et P-3 émergent dans cet ordre. Après détection au moyen d'une chromatographie sur couche mince, les fractions cor-
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vement sous pression réduite et l'on ajoute de l'acétate d'éthyle aux concentrés. De cette manière, on peut obtenir les différents composés sous la forme de cristaux. Si l'on utilise une résine ad- <EMI ID=36.1>
ter/eau. Par exemple, au moyen de la méthode d'élution en gradient impliquant l'utilisation d'un mélange de méthanol (60%) et d'eau et d'un mélange de méthanol (95%) et d'eau, auxquels on a ajouté 5% de chlorure de sodium, les C-15003 P-3, P-3' et P-4 émergent dans l'ordre mentionné. Après l'échantillonnage et la détection par chromatographie .sur couche mince- chaque groupe de fractions actives est concentré sous pression réduite et cristallisé dans de l'acétate d'éthyle.
Les cristaux isolés comprennent l'acétate d'éthyle comme solvant de cristallisation et, après un séchage sur du pentoxyde de phosphore à 70[deg.]C pendant 8 heures, ces cristaux montrent les propriétés physiques et chimiques suivantes (tableau IV)
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En se basant sur la formule moléculaire précédente indiquée ci-dessus et sur les résultats de l'activité antimicrobienne et antitumor�le données ci-après, on compare l'antibiotique de l'invention à des groupes connus d'antibiotiques. Une recherche dans la littérature n'a pas permis de localiser un groupe distinct similaire à l'antibiotique C-15003.
Toutefois, une recherche des substances qui pourraient donner des absorptions ultraviolettes similaires à celles de l'antibiotique de la Frésente invention parmi les constituants des plantes et parmi les autres composés organiques d'origine naturelle a mené aux groupes de la maytanacine et, en se basant tout particulièrement sur les formules moléculaires impliquées, on a constaté que l'antibiotique de l'invention appartenait au groupe de composés du type de la maytanacine contenant deux atomes d'azote. La maytanacine a été obtenue comme constituant d'une plante et a été rapportée dans le "Journal of American Chemical Societv"97, 5294 (1975). Le spectre de masse de la maytanacine est le suivant :
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P-4 est une preuve que ces composés ont un squelette identique à celui de la maytanacine, ces composés ne se différenciant de la maytanacine que dans le type du groupe acyle en position 3. Il est donc clair que l'antibiotique C-15003 est un nouveau composé. Lorsque l'on dégrade chacun des C-15003 P-3, P-3' et P-4 avec un alcali et qu'on le s analyse au moyen d'une chromatographie en phase gazeuse pour déterminer les acides carboxyliques qui s'en libèrent, on a constaté que de l'acide isobutyrique, de l'acide butyrique et de 1 acide isovalérique pouvaient être obtenus respective-ment à partir du C-15003 P-3, du C-15003 P-3<1> et du C-15003 P-4. On donne ci-après les structures basées sur les résultats précédents, des antibiotiques C-15003 P-3, P-3' et P-4.
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Activité biologique :
A) Activité antimicrobienne :
Avec de l'agar au trypticase-soja (BEL) comme milieu d'essai, on examine les concentrations inhibitrices contre les micro-organismes cités ci-après au moyen de la méthode au disque de papier. C'est ainsi que des disques de papier filtre (Toyo Seisakusho, du type mince,'8 mm de diamètre) imprégnés chacun avec 0,02 ml d'une solution à 300 �g/ml de C-15003 P-3, P-3' ou P-4 sont placés sur des plaques inoculées respectivement avec les micro-organismes cités ci-après de manière à examiner les concentrations inhibitrices minimales. Les résultats montrent que les antibiotiques n'ont aucune activité contre les micro-organismes suivants :
<EMI ID=43.1>
Pseudomonas aeruqinosa, Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae,
Serratia marcescens, Mycobacterium avium
D'un autre côté, au moyen de plaques d'agar contenant le milieu d'essai (3,5 g d'hydrogénophosphate disodique, 0.5 g de dihydrogénophosphate monopotassique, 5 g d'extrait de levure (Difco),
10 g de glucose, 15 g d'agar, 1000 ml d'eau distillée, pH de 7,0), on examine l'inhibition du point de vue de la croissance contre Talaromyces avellaneus. Dans cet essai, les concentrations inhibitrices minimales sont de 3 ug/ml pour le C-15003 P-3 et le C-
15003 P-3', et de 1,5 pg/ml pour le C-15003 P-4.
De plus, la souche sauvage de Tetrahymena pyriformis W, à titre de micro-organisme d'essai, est cultivée sur un milieu d'essai [formé de 20 g de Protéose-peptone (Difco), 1 g d'extrait de levure, 2 g de glucose,
1000 ml d'eau distillée et 10 ml de tampon phosphate 1 M de pH 7,0� à 28[deg.]C pendant 44 à 48 heures et on détermine l'activité inhibitrice sur la croissance des composés antibiotiques contre ce microorganisme particulier par la méthode de dilution en série. L'inhi-
<EMI ID=44.1>
et P-3', et à 0,5 �g/ml pour le C-15003 P-4.
L'activité fongicide est également représentée au tableau 5. Ainsi qu'on peut le voir d'après le tableau 5, le C-15003 présente une activité inhibitrice sur la croissance vis-à-vis de micro-organismes qui provoquent des maladies aux plantes= Les disques de papier filtre imprégnés avec 0,02 ml d'une solution à
1000 �g/ml de C-15003 sont placés sur des plaques inoculées respectivement avec les micro-organimses représentés au tableau 5.
Tableau 5 Spectres antimicrobiens
<EMI ID=45.1>
Tableau 5 (suite)
<EMI ID=46.1>
<EMI ID=47.1>
GB : milieu à base d'agar nutritif au glucose B) Activité antitumorale
On étudie les effets thérapeutiques des C-15003 P-3,
P-3' et P-4 (dosés par voie intrapéritonéale pendant 9 jours consécutifs) sur des leucémies P388 chez des souris (1 x 10 cellules/ animal, souris, transplantées par voie intrapéritonéale). Les résultats montrent qu'en fonction du rapport prolongeant la durée d'existence, ces composés présentent une activité antitumorale
<EMI ID=48.1>
C) Toxicité
Dans un essai de toxicité aiguë en prenant des souris comme animaux d'essai, qui implique des injections intrapéritonéales de C-15003 P-3, P-3' et P-4, ces antibiotiques montrent
<EMI ID=49.1>
Ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, l'antibiotique
forte
C-15003 présente une/activité inhibitrice vis-à-vis des champignons et-des protozoaires et- par conséquent, on peut le considérer comme étant un agent fongicide ou antiprotozoaire intéressant De plus, étant donné que l'antibiotique C-15003 présente la propriété de prolonger la durée d'existence des mammifères attein ts de tumeurs (par exemple des souris), on s'attend également à ce que le composé puisse être utilisé à titre de substance antitumorale.
L'antibiotique C-15003, à titre d'agent fongicide et antiprotozoaire, peut être utilisé avantageusement pour une estimation de l'écologie bactérienne dans le sol, les boues actives, le fluide corporel des animaux, etc. C'est ainsi que lorsque l'on doit isoler des bactéries intéressantes à partir d'échantillons
de sol ou lorsque l'on doit examiner les actions de bactéries indépendamment de celles de champignons et de protozoaires conjointement à la mise en oeuvre et à l'analyse d'un système de boues actives utilisé dans le traitement d'eaux résiduaires, on peut utiliser l'antibiotique de la présente invention pour obtenir une c-roissance sélective de la flore bactérienne sans permettre la croissance des champignons et protozoaires se trouvant également dans l'échantillon. Dans un cas caractéristique, on ajoute l'échan
ou
tillon à un milieu liquide/solide et on ajoute 0,1 ml d'une solution à 10-100 �g/ml de l'antibiotique dans un mélange de méthanol
(1%) et d'eau par ml du milieu, qui est ensuite incubé.
L'antibiotique C-15003 peut également être utilisé comme agent antimicrobien pour le traitement des maladies des plantes provoquées par les micro-organismes mentionnés au tableau 5 précédent.
Dans une application caractéristique, on utilise l'antibiotique C-15003 sous la forme d'une solution aqueuse méthanolique <EMI ID=50.1>
la pourriture brun rougeatre de l'écorce, la brunissure, l'helminthosporiose et la flétrissure généralisée de l'écorce des plants de riz.
Il apparaît donc clairement que les C-15003 P-3, P-3' et P-4 sont tous de nouveaux composés ayant le même squelette et qu'ils peuvent également être utilisés comme intermédiaires pour la production d'autres composés intéressants du point de vue pharmaceutique. C'est ainsi qu'au moyen d'une réaction de dêsacylation, on peut obtenir le P-15003 P-0 (maytansinol) avec un groupe hydroxyle en position 3 à partir du présent antibiotique. A cet effet, étant donné que le groupe acyle est en position bêta par rapport au groupe carbonyle, on peut utiliser avantageusement la réaction d'hydrolyse réductrice ordinaire. C'est ainsi qu'au moyen d'un hydrure de métal complexe [par exemple l'hydrure de li-
<EMI ID=51.1> drolytiquement, sans modifier les autres groupes fonctionnels, par exemple les groupes carbonyle ou époxy, les doubles liaisons carbone-carbone, etc., pour obtenir du maytansinol. Les résultats physiques et chimiques obtenus sur cet échantillon de maytansinol préparé de cette manière sont conformesaux résultats donnés par Kupchan et collaborateurs dans "The Journal of American Chemical Society"97, 5294-5215 (1975) .
Les exemples suivants illustrent plus en détail la présente invention, mais ne constituent en aucun cas une limitation
<EMI ID=52.1>
dication contraire et la relation entre les parties et les parties en volume est une relation entre grammes et millilitres, et les pourcentages sont en poids/volume, sauf indication contraire.
Exemple 1
On utilise Nocardia n[deg.] C-15003 (IFO 13726 ; FERM 3992 ; ATCC 31281) , que l'on a fait croître sur un milieu à base d'agar à l'extrait de levure-extrait de malt, pour inoculer un fermenteur d'une capacité de 200 parties en volume contenant 40 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement (2% de glucose, 3% d'amidon soluble, 1% de farine de soja brute, 1% de liqueur de macération de mais, 0,5% de polypeptone, 0,3% de NaCl, 0,5%
<EMI ID=53.1>
rature de 28[deg.]C pendant 48 heures de manière à obtenir un inoculum. Une portion de 0,5 partie en volume de l'inoculum ainsi obtenu est transférée dans un fermenteur d'une capacité de 200 parties en volume contenant 40 parties en volume d'un milieu de fermentation composé de 5% de dextrine, de 3% de liqueur de macération de mais,
<EMI ID=54.1>
vée à une température de 28[deg.]C pendant 90 heures de manière à obtenir un inoculum (culture d'ensemencement).
An moyen de la méthode de dilution en série en utilisant Tetrahymena pyriformis W à titre de micro-organisme d'essai et l'antibiotique C-15003 P-3 à titre d'échantillon standard, on trouve que la culture précédente a un titre de 25 ug/ml.
Exemple 2
Une portion de 10 parties en volume de l'inoculum (ensemencement) obtenu dans l'exemple 1, est transférée dans un fermenteur d'une capacité de 2000 parties en volume contenant 500 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement (le même que ci-dessus) et incubée à 28[deg.]C pendant 4 8 heures. Une portion de 500 parties en volume de la culture résultante est transférée dans un réservoir en acier inoxydable d'une capacité de 50000 parties en volume contenant 30000 parties en volume du milieu de culture d'ensemencement et cultivée à 28[deg.]C, sous une aération de 30000 parties en volume/minute, une agitation à 280 tours par minute (1/2DT) et une pression interne de 1 kg/cm<2>, de manière à obtenir une culture d'ensemencement.
On utilise cette culture pour ensemencer un réservoir en acier inoxydable d'une capacité de
200000 parties en volume contenant 100000 parties en volume d'un milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1, à un taux d'inoculation de 10%. Le milieu inoculé est incubé à
28[deg.]C, sous une aération de 100.000 parties en volume/minute, une agitation à 200 tours par minute (1/2 DT) et une pression interne de 1 kg/cm<2> pendant 90 heures. En utilisant le même processus que celui décrit dans l'exemple 1, on trouve que la culture obtenue a un titre de 25 �g/ml.
Exemple 3
On ajoute à 95.000 parties en volume de la culture obtenue dans l'exemple 2, 2000 parties d'Hyflo-supercel (Johnes and Manville Products, Etats-Unis d'Amérique) et, après un mélange intense, on filtre le mélange sur un filtre sous pression pour obtenir 85000 parties en volume de filtrat et 32000 parties de cellules humides. Les 85000 parties en volume du filtrat sont agitées et extraites avec 30000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On répète encore une fois ce processus. Les couches à l'acétate d'éthyle sont rassemblées, lavées deux fois avec 30000 parties en volume d'eau, séchées par addition de 500 parties de sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite à 200 parties en volume. On ajoute de l'éther de pétrole au concentré et on récupère le précipité résultant par filtration (52 parties�.
On agite ce produit brut I avec 100 parties en volume d'acétate d'éthyle et on sépare par filtration les matières insolubles. Le filtrat est agité avec 10 parties de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm) et on sépare l'acétate d'éthyle sous pression réduite. Le résidu est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice (400 parties en volume). On réalise l'élution avec 500 parties en volume d'hexane, 500 parties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (3/1), 500 par.ties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle (1/1),
500 parties en volume d'un mélange d'hexane et d'acétate d'éthyle
(1/3), 500 parties en volume d'acétate d'éthyle et 1000 parties er volume d'un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol (50/1), l'éluat étant recueilli soue la forme de fractions de 100*parties en volume.
Une portion d'une partie en volume de chacune des fractions est concentrée à sec, et l'on.ajoute 0,1 partie en volume d'acétate d'éthyle au concentré de manière à obtenir un mélange. Le mélange est réparti sous la forme de gouttes à 2,5 cm du bord inférieur d'une plaque de verre à base de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 60 F 254' 0,25 mm, 20 x 20) et développé sur une distance d'environ 17 cm avec un système solvant formé d'acétate d'éthyle et de méthanol (19/1). Après le développement, on réalise la détection au moyen de lumière ultraviolette (2537A).
Les fractions actives n[deg.] 23 à 28 avec un Rf de 0,6 à 0,65 sont recueillies et concentrées sous pression réduite jusqu'à environ 20 parties en volume. On ajoute à ce concentré
150 parties en volume d'éther de pétrole de manière à obtenir 15 parties d'un produit brut II.
Exemple 4
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humides obtenues dans l'exemple 3, avec 50.000 parties en volume
<EMI ID=56.1> blés et on sépare l'acétone par concentration sous pression réduite. On fait passer le système aqueux résultant dans une color ne formée de 5.000 parties en volume de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K.). On lave la colonne avec 20.000 parties en volume
<EMI ID=57.1>
par une élution avec 15.000 parties en volume d'un mélange de méthanol (90%) et d'eau. L'éluat est concentré sous pression rédui te à 3.000 parties en volume et secoué avec 3.000 parties en volume d'eau et 3.000 parties en volume d'acétate d'éthyle. On répète le processus ci-dessus. Les couches à l'acétate d'éthyle sont combinées, lavées avec de l'eau, séchées par l'addition de sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression réduite à
200 parties en volume. Après l'addition d'éther de pétrole, on récupère le précipité par filtration (28 parties). On purifie
le produit ci-dessus au moyen d'une colonne de gel de silice et on récupère 8,0 parties de produit brut II.
Exemple 5
On dissout 1,5 partie du produit brut II obtenu dans l'exemple 3 dans 10 parties en volume d'acétate d'éthyle et on agite à fond la solution avec 4 parties de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, 0,05-0,2 mm). L'acétate d'éthyle est séparé sous pression réduite. On applique le résidu au sommet d'une colonne formée de 300 parties en volume de gel de silice et on lave d'abord la colonne avec 500 parties en volume de chloroforme et on l'élue ensuite avec 500 parties en volume de chloroforme-méthanol (50/1), 500 parties en volume de chloroforme-méthanol (20/1) et 500 parties en volume de chloroforme-méthanol
(10/1). L'éluat est recueilli sous la forme de fractions de 25 parties en volume.
Une portion de 0,5 partie en volume de chacune des frac-
<EMI ID=58.1> tré 0,05 partie en volume d'acétate d'éthyle, et on soumet le mélange à titre d'échantillon à une chromatographie sur couche mince avec gel de silice (système de développement : chloroforme-métha-
<EMI ID=59.1>
0
Les fractions Nos 39 et 40 absorbant à 2537A dans la zone de Rf de 0,50-0,60 sont recueillies et concentrées à sec
sous pression réduite. On ajoute au résidu 2 parties en volume d'acétate d'éthyle et on laisse le mélange au repos, de sorte que l'on obtient 0,150 patie de cristaux d'antibiotique C-15003.
Les cristaux d'antibiotique C-15003 dont question cidessus (0,150 partie) sont dissous dans 15 parties en volume de méthanol, cette opération étant suivie d'une addition de 0,300 partie de chlorure de sodium et de 15 parties en volume d'eau. Une colonne est garnie avec 200 parties en volume de Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K.) et est calibrée avec 600 parties en volume d'ur mélange de méthanol (50%) et d'eau contenant 5% de NaCl. On fait ensuite passer la solution d'échantillonnage préparée ci-dessus dans la colonne, et on réalise une élution en gradient en utilisant 1.500 parties en volume d'un mélange de méthanol (60%) et d'eau contenant 5% de NaCl et 1.500 parties en volume d'un mélange de méthanol (95%) et d'eau. On recueille l'éluat sous la forme
de fractions de 15 parties en volume et on examine chacune des fractions au moyen d'une chromatographie sur couche mince avec
gel de silice. Les fractions 145 à 153 contiennent du C-15003 P-3, les fractions 167 à 180 contiennent du C-15003 P-3' et du C-15003 P-4, et les fractions 185 à 190 contiennent du C-15003 P-4.
Chaque groupe de fractions est concentré et dissous
<EMI ID=60.1>
en volume d'acétate d'éthyle. La solution est secouée dans un entonnoir à décantation, la couche aqueuse est séparée et, après un lavage avec 2 portions d'eau de 50 parties en volume, la couche à l'acétate d'éthyle est séchée sur sulfate de sodium anhydre, concentrée et laissée au repos. On obtient de cette manière des cris taux à partir de chaque groupe de fractions. Les cristaux sont recueillis par filtration et séchés.
<EMI ID=61.1>
(0,018 partie) sont dissous dans 0,3 partie en volume d'acétate d'éthyle et répartis sous la forme de gouttes en une ligne à une distance de 2,5 cm du bord inférieur d'une plaque de verre à base de gel de silice (Merck, République Fédérale d'Allemagne, Keiselgel 60 F254 0,25 mm, 20 x 20), cette opération étant suivie d'un développement au moyen d'un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol (19/1). Après un développement jusqu'à environ une distance de 18 cm, les bandes d'absorption à Rf 0.68 (P-4) et Rf 0,65
(P-3') sont enlevées par grattage et chacune d'entre elles est extraite indépendamment deux fois avec de l'acétate d'éthyle contenant une petite quantité d'eau. L'extrait à l'acétate d'éthyle résultant est lavé avec de l'eau, séché sur sulfate de sodium anhydre, concentré sous pression réduite et laissé au repos.
On obtient respectivement 0,010 partie de cristaux de C-15003 P-4 et 0,003 partie de cristaux de C-15003 P-3' à partir des fractions dont le Rf est de 0,68 et le Rf de 0,65.
Exemple 6
1.000 parties en volume de la culture de l'exemple 2 sont inoculées dans un réservoir d'acier inoxydable d'une capacité de 200.000 parties en vclume contenant 100.000 parties en volume d'un milieu de culture d'ensemencement et on incube le milieu inoculé à une température de 28[deg.]C sous une aération (100.000 parties <EMI ID=62.1> 48 heures de manière à obtenir une culture d'ensemencement. Cette culture d'ensemencement est transférée dans un réservoir d'acier inoxydable d'une capacité de 2.000.000 de parties en volume contenant 1.000.000 de parties en volume d'un milieu de fermentation similaire à celui utilisé dans l'exemple 1, à un taux de transfert de 10%. On réalise la culture à une température de 28[deg.]C sous une aération (1.000.000 de parties en volume/minute), une agitation
<EMI ID=63.1>
pendant 90 heures. On constate, en utilisant le processus décrit dans l'exemple 1, que la culture résultante a un titre de 20 ug/ ml.
On ajoute à 900.000 parties en volume de la culture précédente, 900.000 parties en volume d'acétone et, après une agitation dé 1 heure, 20.000 parties d'Hyflo-Supercel (Johnes and Manville, Etats-Unis d'Amérique). Le mélange est à nouveau agité et filtré sur un filtre sous pression.
On ajoute 500.000 parties en volume d'eau à 1.700.000 parties en volume du filtrat résultant et on extrait le mélange au moyen d'un appareil Podbielniak (Podbielniak, Inc.) avec
1.000.000 de:parties en volume d'acétate d'éthyle. La couche à l'acétate d'éthyle est lavée avec de l'eau, séchée par l'addition de sulfate de sodium anhydre et concentrée sous pression réduite. On ajoute de l'éther de pétrole au concentré, on récupère le précipité résultant par filtration et on le sèche. On obtient au moyen du procédé ci-dessus 68 parties de produit brut I. Ensuite, comme dans les exemples 3, 4 et 5, on purifie le produit brut pour obtenir 9,5 parties de C-15003 P-3, 0,300 partie de C-15003 P-3' et 2,5 parties de C-15003 P-4.
Exemple 7
On dissout dans 1 partie en volume de tétrahydrofuranne 0,015 partie des cristaux d'antibiotique C-15003