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Procédé de purification do bouillons de fermentation
La présente invention se rapporte à des perfection- nements apportés à la purification de bouillons ou jus de fermentation en vue de les débarrasser de matières cellu- laires et d'autres impuretés.
Dans la production de substances organiques par des procédés de fermentation, on obtient généralement, à l'issue de la fermentation, un bouillon ou jus contenant, outre les produits recherchés, différentes matières solides ou semi-solides telles que les cellules du ou des microor- ganismes utilisés pour la fermentation, des matières rési-
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duelles du milieu de culture et d'autres impuretés en solution ou en suspension aqueuse.
Le produit de la fer- mentation, qui se présente généralement sous la forme @ d'une solution, peut être isolé, lorsque les matières solides et semi-solides ont été retirées, en faisant appel à des procédés classiques tels que cristallisation, extrac- tion, précipitation et moyens analogues,
A l'échelle industrielle, la Réparation de matières cellulaires des bouillons de fermentation se heurte à de sérieuses difficultés, cette séparation ne pouvant s'ef- fectuer aisément par filtration ou par centrifugation. De plus, lesdites matières cellulaires produisent un effet inhibiteur 3ors de la cristallisation et, si l'on fait appel à un échangeur d'ions, ces matières tendent rapide- ment à engorger la résine.
L'invention a trait à un procédé de purification de bouillons de fermentation permettant notamment de séparer de ces derniers les matières cellulaires et autres impuretés.
Ce procédé est remarquable notamment par le fait que l'on traite le bouillon de fermentation avec de l'hydroxyde de calcium, que l'on convertit l'hydroxyde de calcium compris dans le bouillon en carbonate de calcium et que l'on sépara le carbonate de calcium du susdit bouillon avec les matières cellulaires et autres impuretés qui précipitent en même temps.
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On connaît dans l'industrie sucrière un procédé de purification des mélasses appelé communément: "Purifi- cation à la chaux"; il est toutefois très surprenant qu'un procédé analogue puisse être appliqué avec succès pour l'élimination des cellules de microorganismes vivants ou non d'un bouillon de fermentation.
Un certain nombre de réactions semble se produire au cours du procédé; elles sont exposées ci-dessous mais il va de soi que ces considérations théoriques n'ont pas une portée limitative. En premier lieu, le contact de l'hydroxyde de calcium avec les parois cellulaires provoque une dénaturation des protéines qui composent principalement les cellules. Ces cellules se racornissent et, simultanément, acquièrent une charge négative. Le carbonate de chaclium, qui se forme peu à peu à partir de l'hydroxyde de calcium,pos- sède une charge positive ut absorbe les matières cellulaires négativement chargées avec, éventuellement, d'autres impu- retés telles que matières colorantes par exemple.
Le carbo- nate de calcium étant insoluble dans l'eau, il précipite avec lesdites matières cellulaires et autres impuretés, ce qui permet de les séparer aisément du bouillon et d'obtenir une solution claire des produits de fermentation. La sépara- tion du précipité peut être effectuée par tout moyen conve- nable, notamment par filtrage, centrifugation, décantation, etc...
Selon une forme d'exécution préférée du procédé, on ajoute au bouillon de fermentation à traiter une charge d'une solution de chaux, par exemple sous la forme d'un lait de
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chaux, calculée de façon que la teneur en calcium du bouillon soit comprise entre 0,1 et 10 %, do préférence 5 % environ (rapport pondéral basé sur l'oxyde). On laisse réagir le mélange pendant une période relativement courte, de préférence 10 à 20 minutes, avant la conversion de l'hydroxyde de calcium en carbonate de calcium .
Suivant une variante de réalisation, l'hydroxyde de calcium peut être formé in situ en ajoutant au bouillon do fermentation de l'oxyde de calcium finement broyé.
De préférence, le traitement à l'hydroxyde do cal- cium est effectué à une température élevée, comprise par exemple entre 70 et 90 C. Lorsque ce traitement est opéré par addition d'oxyde de calcium broyé, il n'est généralement pas nécessaire de chauffer le bouillon car la réaction est exothermique; dans la plupart des cas, la chaleur libérée est suffisante pour atteindre la température désirée,
On a remarqué que le rendement du filtrage d'un bouillon de fermentation peut être amélioré si, avant la conversion de l'hydroxyde de calcium en carbonate de calcium, le bouillon est maintenu pendant une période de 5 à 40 mi- nutes à une température comprise entre 70 et 90 C ot pré- férablement 10 à 20 minutes 4 75 - 85 C.
La conversion de l'hydroxyde de calcium en carbonate de calcium s'opère par l'introduction d'ions de carbonate dans le bouillon. De bons résultats sont obtenus en faisant passer dans le bouillon un courant de dioxyde de carbone, Jusqu'à ce
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que le pH atteigne une valeur do 7,5 environ. On peut également introduire dans le bouillon une quantité appro priée de carbonate d'un métal alcalin, notamment du oar- bonate de soude.
Suivant une autre forme d'exécution du procédé, la conversion de l'hydroxyde de calcium en carbonate de cal- cium est effectuée en deux étapes et à des pH de valeurs différentes, avec séparation intermédiaire des substances précipitées. Lors de la première étape, le pH est amené à 9,4 -9,5 environ, de préférence au moyen d'un courant de dioxyde de carbone, ut le bouillon est filtré une pre- mière fois.
La solution filtrée est alors traitée à nouveau nu dioxyde de carbone Jusque l'obtention de pH 7,7 puis elle est filtrée une seconde fois,
Lorsque la conversion do l'hydroxyde de calcium en carbonate de calcium est effectuée en deux étapes, le bouillon est, de préférence,maintenu avant la conversion dans les conditions déjà exposées ci-dessus, c'est-à-dire à une température comprise entre 70 et 90 C pendant 5 à 40 minutes, par exemple à 75 - 85 C pendant 10 à 20 minutes.
Si les substances précipitées sont retirées du bouil- lon par filtrage, cette dernière opération peut avoir lieu à la température ambiante, mais il est préférable qu'elle, soit effectuée à une température comprise entre 50 et 60 C environ.
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Le procédé .selon l'invention permet d'obtenir unu solution de fermentation exempte de matières cellulaires et autres substances colloïdales et à partir de laquelle un pro- duit de fermentation de grande pureté est susceptible d'être extrait par des moyens simples et économiquesCe procédé présente un intérêt tout particulier pour la séparation des matières cellulaires de bouillons de fermentation se rappor- tant à la production par fermentation de l'acide g@utamique (acide L-glutamique) dans des milieux qui peuvent contenir ou non de la biotine.
Toutefois, l'application du présent procédé n'est pas limitée à de tels bouillons ou milieux et il peut être utilisa avantageusement pour l'élimination des cellules de microorganismes et autres impuretés nu cours de la production, par des procédés de fermentation, de différents acides aminés tels que: alanine, acide aspartique, ornithine, lysine, valine, thréonine, homosérine, isoleucine, acide dia- minopimélique ou (le lours sels et bétaines; de substances antibiotiques:
pénicilline, auréomycine, streptomycine, mito- - veine; de nucléotides: acide inosinique (inesine-5-phosphate), @@nthosine, ou, enfin, d'autres substances organiques telles @ l'acide citrique, l'acide allo-isocitrique, l'acide itaco- nique, l'acide malique, l'acide orotique, le 5-cétofruotoso, etc...
Les exemples suivants illustrent la mise; en couvre du procédé selon l'invention, laquelle n'est cependant pas li- mitée aux conditions qui y sont exposées, Les parties et pour- centages expriment des rapports pondéraux.
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100 parties d'un bouillon de fermentation contenant 16 % de matières solides, lesquelles comprennent notamment
5 % d'acide glutamique et 3 % de matières cellulaires, ont été chauffées 80 C. 10 parties d'un lait de chaux, con- tenant 40 % d'hydroxyde du calcium, ont été ajoutées pendant
20 minutes sous bonne agitation.
Apres une période de réaction de 10 minutes, un courant du dioxyde de carbone est introduit dans le bouillon sous bonne agitation jusqu'à l'obtention de pH 7,5. On laisse s'écouler une période de réaction de 15 mi- nutes et le carbonate de calcium précipité est filtré avec les matières cellulaires qui' précipitent en même temps, en vue d'obtenir un filtrat clair et exempt d'impuretés. L'acide glu- tamique est isolé par des moyens conventionnels, par exemple un précipitant le produit à un point isoélectrique déterminé (pH 3,2).
Exemple 2
10 parties d'oxyde de calcium finement broyé sont ajoutées à 100 parties d'un bouillon de fermentation contenant 10 % de matières solides, lesquelles comprennent notamment 2,5% de bétain3 et 2,5 % de matires cellulaires. La réaction étant exothermique, la température du bouillon passe de 20 C à 90 C durant la conversion de l'oxyde de calcium en carbonate de cal- cium. Apres 30 minutes, 19 parties de carbonate de soude sont introduites dans le bouillon et la réaction est maintenue pon- dant 20 minutes-. Lu carbonate de calcium précipité est alors
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filtré, de même que les matières cellulaires qui précipi- tent en même temps.
On obtient une solution claire dont on peut éventuellement isoler la bétaïne, par exemple à l'aide d'un échangeur d'ions.
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3,5 parties de chaux sont ajoutées à 100 parties d'un bouillon de.- fermentation contenant des matières cellu- laires et 5,5 parties d'acide glutamique. Le pH du bouillon est compris, à l'origine, entre 12,2 et 12,4, Loouillon est chauffé à 75 - 85 C et maintenu à cette température, sous bonne agitation, pendant'10 à 20 minutes.
Le pH est alors' ajusté à 9,4 - 9,5 au moyen d'un courant de dioxyde de carbone et la température est abaissée à 50 - 60 C. Le bouillon est alors aisément filtré une pre- mière fois à cette dernière température.
On fait passer à nouveau un courant de dioxyde do carbone dans le filtrat Jusqu'à l'obtention de pH 7.7 puis ce dernier est filtré une seconde fois.
On obtient une solution claire d'acide glutamique qui peut être isolé par cristallisation en 2 fractions succes- sives. La pureté de la première fraction est de 95 % et celle de la seconde est de 90 %. Le rendement est compris entre 75 et 80 %.
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Process for the purification of fermentation broths
The present invention relates to improvements in the purification of fermentation broths or juices with a view to ridding them of cellular matter and other impurities.
In the production of organic substances by fermentation processes, one generally obtains, at the end of the fermentation, a broth or juice containing, in addition to the desired products, various solid or semi-solid materials such as the cells of the microor (s). - organisms used for fermentation, residual materials
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duels of the culture medium and other impurities in solution or in aqueous suspension.
The fermentation product, which is usually in the form of a solution, can be isolated, when the solids and semi-solids have been removed, using conventional methods such as crystallization, extrac- tion. tion, precipitation and the like,
On an industrial scale, the repair of cellular material in fermentation broths comes up against serious difficulties, this separation not being able to be easily carried out by filtration or by centrifugation. In addition, said cellular materials produce an inhibitory effect on crystallization and, if an ion exchanger is used, these materials quickly tend to clog the resin.
The invention relates to a process for the purification of fermentation broths making it possible in particular to separate cell matter and other impurities therefrom.
This process is remarkable in particular by the fact that the fermentation broth is treated with calcium hydroxide, that the calcium hydroxide included in the broth is converted into calcium carbonate and that the mixture is separated. calcium carbonate from the above broth with cellular material and other impurities which precipitate at the same time.
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A process for purifying molasses commonly known as "lime purification" is known in the sugar industry; it is, however, very surprising that a similar process can be successfully applied for the removal of cells of living and non-living microorganisms from fermentation broth.
A number of reactions appear to occur during the process; they are set out below, but it goes without saying that these theoretical considerations are not limiting in scope. In the first place, the contact of calcium hydroxide with the cell walls causes a denaturation of the proteins which mainly make up the cells. These cells shrivel up and, simultaneously, acquire a negative charge. Chaclium carbonate, which gradually forms from calcium hydroxide, is positively charged and absorbs negatively charged cellular materials with, optionally, other impurities such as coloring materials for example.
Calcium carbonate being insoluble in water, it precipitates with said cellular material and other impurities, which allows them to be easily separated from the broth and to obtain a clear solution of the fermentation products. Separation of the precipitate can be carried out by any suitable means, in particular by filtering, centrifugation, decantation, etc.
According to a preferred embodiment of the process, is added to the fermentation broth to be treated a charge of a solution of lime, for example in the form of a milk of
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lime, calculated so that the calcium content of the broth is between 0.1 and 10%, preferably about 5% (weight ratio based on the oxide). The mixture is allowed to react for a relatively short period, preferably 10 to 20 minutes, before the conversion of the calcium hydroxide to calcium carbonate.
In an alternative embodiment, the calcium hydroxide can be formed in situ by adding finely ground calcium oxide to the fermentation broth.
Preferably, the treatment with calcium hydroxide is carried out at an elevated temperature, for example between 70 and 90 C. When this treatment is carried out by addition of ground calcium oxide, it is generally not necessary. to heat the broth because the reaction is exothermic; in most cases, the heat released is sufficient to reach the desired temperature,
It has been observed that the filtration efficiency of a fermentation broth can be improved if, prior to the conversion of the calcium hydroxide to calcium carbonate, the broth is kept for a period of 5 to 40 minutes at a temperature. between 70 and 90 C ot preferably 10 to 20 minutes 4 75 - 85 C.
The conversion of calcium hydroxide into calcium carbonate takes place by the introduction of carbonate ions into the broth. Good results are obtained by passing a stream of carbon dioxide through the broth, until
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that the pH reaches a value of approximately 7.5. It is also possible to introduce into the broth a suitable quantity of carbonate of an alkali metal, in particular sodium carbonate.
According to another embodiment of the process, the conversion of calcium hydroxide to calcium carbonate is carried out in two stages and at different pH values, with intermediate separation of the precipitated substances. In the first step, the pH is brought to about 9.4 -9.5, preferably by means of a stream of carbon dioxide, and the broth is filtered a first time.
The filtered solution is then treated again with carbon dioxide until a pH of 7.7 is obtained, then it is filtered a second time,
When the conversion of calcium hydroxide to calcium carbonate is carried out in two stages, the broth is preferably maintained before the conversion under the conditions already set out above, that is to say at a temperature between between 70 and 90 C for 5 to 40 minutes, for example at 75 - 85 C for 10 to 20 minutes.
If the precipitated substances are removed from the broth by filtration, this latter operation can take place at room temperature, but it is preferable that it be carried out at a temperature between about 50 and 60 ° C.
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The process according to the invention makes it possible to obtain a fermentation solution which is free from cellular matter and other colloidal substances and from which a fermentation product of high purity can be extracted by simple and economical means. Of particular interest in the separation of cellular material from fermentation broths relating to the fermentation production of g utamic acid (L-glutamic acid) in media which may or may not contain biotin.
However, the application of the present process is not limited to such broths or media and it can be used advantageously for the removal of cells of microorganisms and other impurities during the production, by fermentation processes, of various amino acids such as: alanine, aspartic acid, ornithine, lysine, valine, threonine, homoserine, isoleucine, dia- minopimelic acid or (bear salts and betaines; antibiotic substances:
penicillin, aureomycin, streptomycin, mitovein; of nucleotides: inosinic acid (inesine-5-phosphate), @@ nthosine, or, finally, other organic substances such @ citric acid, alloisocitric acid, itaconic acid, malic, orotic acid, 5-ketofruotoso, etc ...
The following examples illustrate the setting; covers the process according to the invention, which, however, is not limited to the conditions set out therein. The parts and percentages express weight ratios.
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100 parts of a fermentation broth containing 16% solids, which especially comprises
5% glutamic acid and 3% cellular material, were heated to 80 ° C. 10 parts of a lime milk, containing 40% calcium hydroxide, were added for
20 minutes with good stirring.
After a reaction period of 10 minutes, a stream of carbon dioxide is introduced into the broth with good stirring until pH 7.5 is obtained. A reaction period of 15 minutes is allowed to elapse and the precipitated calcium carbonate is filtered with the cellular material which simultaneously precipitates, to obtain a clear filtrate free from impurities. Glutamic acid is isolated by conventional means, for example by precipitating the product at a determined isoelectric point (pH 3.2).
Example 2
10 parts of finely ground calcium oxide are added to 100 parts of a fermentation broth containing 10% solids, which in particular comprise 2.5% betain3 and 2.5% cellular matter. As the reaction is exothermic, the temperature of the broth increases from 20 C to 90 C during the conversion of calcium oxide to calcium carbonate. After 30 minutes, 19 parts of sodium carbonate are added to the broth and the reaction is kept for 20 minutes. The precipitated calcium carbonate is then
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filtered, as well as cellular material which precipitates at the same time.
A clear solution is obtained from which the betaine can optionally be isolated, for example using an ion exchanger.
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3.5 parts of lime are added to 100 parts of a fermentation broth containing cellular material and 5.5 parts of glutamic acid. The pH of the broth is originally between 12.2 and 12.4, Loouillon is heated to 75-85 C and maintained at this temperature, with good stirring, for'10 to 20 minutes.
The pH is then adjusted to 9.4 - 9.5 by means of a stream of carbon dioxide and the temperature is lowered to 50 - 60 C. The broth is then easily filtered a first time at this latter temperature. .
A stream of carbon dioxide is passed through the filtrate again until pH 7.7 is obtained, then the latter is filtered a second time.
A clear solution of glutamic acid is obtained which can be isolated by crystallization in 2 successive fractions. The purity of the first fraction is 95% and that of the second is 90%. The yield is between 75 and 80%.