<Desc/Clms Page number 1>
'PERFECTIONNEMENTS,APPORTES-AUX:PROCEDES POUR LE TRAITEMENT
D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention est relative à la purification du produit connu sous le nom de Terramycine (marque déposée) et elle concerne plus particulièrement la préparation de sels métallo-organiques basiques de la Terramycineo
La Terramycine est un antibiotique qui a été décrit et spécifié en premier lieu dans le brevet E.U.A. 2.516.080 accordé le 18 juillet 1950.
Sa nature est amphotérique et on sait qu'il forme des sels acides, tels que des chlorhydrates, et certains composés'basiques tels que le sel sodiqueo Plusieurs de ces composés conviennent en soi à la thérapeutie et à la nutri- tiono Plusieurs sont utiles comme intermédiaires pour la récupération et la purification de l'antibiotique pur à partir de bouillons de fermentation bruts dans lesquels les microorganismes sont fortement dilués et dans les- quels ces microorganismes ont été élaborés.
On a découvert maintenant que la Terramycine peut être récupé- rée et purifiée et que certains nouveaux composés basiques de la Terramycine peuvent être préparés par un procédé comprenant la précipitation sélective de l'antibiotique hors des solutions aqueuses très diluées dans lesquelles il se trouve. Cette précipitation est obtenue en traitant la solution aqueu- se de Terramycine en présence d'ions métalliques polyvalents, par une base organique relativement soluble dans l'eau et choisi dans le groupe constitué par les amines et les sels d'ammonium quaternaires.
Le précipité obtenu comprend un sel métallique basique et polyvalent de Terramycine et le radi- cal amino ou ammonium quaternaire, lequel sel a une solubilité qui, d'une manière inattendue, est faible et qui permet la récupération d'une propor- tion substantielle de la totalité de l'antibiotique qui se trouve dans la solution diluée. La ré'gération de la Terramycine purifiée ou des composés simples de ce sel est alors effectuée par une méthode choisie parmi plusieurs suivant que 1-'on désire obtenir l'antibiotique pur ou ses sels acides. Le
<Desc/Clms Page number 2>
sel métallo-organique précipité peut être dissous dans un solvant par aci- dification et, en réglant convenablement le pH, la Terramycine amphotérique est alors précipitée et récupérée à partir de la solution.
Suivant une va- riante et de préférence, le sel métallo-organique est dissous dans un solvant organique, tel que le méthanol ou du méthanol contenant de l'acide chlorhy- drique ou du chlorure de calcium. La solution est alors clarifiée, si néces- saire par un adsorbant décolorant et elle est filtrée. L'addition d'un aci- de concentrée tel que l'acide chlorhydriqueà la solution clarifiée provo- que la séparation d'un sel acide cristallisée extrêmement pur, de la Terra- mycine, par exemple le chlorhydrate.
Une application préférée du procédé, faisant l'objet de l'inven- tione est la récupération de la Terramycine à partir de bouillons de fermen- tation de microorganismes. Ces bouillons ont généralement une activité de 500 mcg/ml ou davantage et contiennent déjà des ions métalliques polyvalents qui sont des impuretés résiduaires provenant du milieu de culture nutritif initiale Une amine organique ou un sel d'ammonium quaternaire substitué par un groupement organique, qui est propre à se dissoudre tout au moins en par- tie dans un tel bouillon pour suppléer à la réaction, est ajouté et le mi- lieu est de préférence alcalinisé et maintenu à un pH neutre ou basique.
Le précipité obtenu est séparé et un sel complexe de Terramycine est récupé- réa ce sel contenant à la fois les constituants métalliques et la base organique ajoutée. Il donne aux essais environ 300-500 mog/mg en Terramycine active. L'opération en une phase permet donc principalement de concentrer et de purifier la Terramycine.
Le sel complexe peut être aisément décomposé pour récupérer la Terramycine pure ou les sels acides simples de celle-ci, le produit pouvant être utilisé directement pour la thérapeutie ou la nutri- tiono Par exemple, les sels d'ammonium quaternaires, ayant des poids molé- culaires élevés, sont des germicides particulièrement fortso
Comme spécifié plus haut, les sels métallo-organiques complexes peuvent être traités pour régénérer la Terramycine qu'ils contiennent en les dissolvante de préférence après l'enlèvement de l'humidité en excès, dans les alcools et cétones inférieurs. A cet effet, le méthanol est un solvant très avantageux car son prix de revient est très faible, il peut être aisément récupéré et il intervient pour procurer un produit ayant une pureté élevée.
Généralement on prépare une solution méthanolique contenant environ 5,3 à 6,8 litres du solvant par kilogramme de Terramyoine active et on la traite ensuite avec de l'acide chlorhydrique concentréo- Dans ces con- ditions il peut y avoir une tendance à la précipitation de Terramycine am- photérique avant que la conversion de l'antibiotique en son chlorhydrate ait eu lieu. Une addition supplémentaire d'acide dissout la plus grande partie de la Terramycine mais un faible résidu peut subsister. Pour éviter la per- te de cette proportion réduite, le précipité séché de Terramycine-base orga- nique est,, de préférence,, ajouté au méthanol utilisé comme solvant pendant que le pH apparent de la solution est maintenu continuellement à environ 2-2,5 par l'addition diacide chlorhydrique concentré.
On obtient ainsi une solution claire. Du chlorure de calcium peut être utilisé dans un but à peu près le même, c'est-à-dire pour augmenter la solubilité de la Terramyci- ne dans le méthanol et pour empêcher sa précipitation prématurée. Quand une solution claire est obtenue, l'introduction d'un acide concentré, par exemple une quantité additionnelle d'acide chlorhydrique, donne lieu à la formation du sel acide simple de Terramycine que l'on désire obtenir.
Quand l'acide chlorhydrique est utilisé préliminairement pour faciliter la dissolution du sel complexée environ 0,4 à Ce? ml de l'acide concentré (36%) est nécessaire pour dissoudre le sel métallo-organique en équivalence à 1.0g de Terramycine active et on prépare ainsi des solutions ayant des ac- tivités d'environ 60.000 à 150.000 mcg/ml ou davantage en Terramycine.
Cette solution claire peut alors être traitée avec un absorbant tel que du charbon décolorant, pour enlever une variété d'impuretés contaminanteso On se sert généralement d'environ 0,5 à environ 1,5 g de carbone par gramme de Terramycine active., contenue dans la solution, la proportion la plus grande donnant un produit ayant une pureté meilleure sans pertes importantes dues à l'adsorption de l'antibiotique. L'adsorbant peut être séparé à l'ai-
<Desc/Clms Page number 3>
de d'un agent facilitant la filtration et lavé avec un solvant acidulé pour enlever les matières résiduaires.
Le chlorhydrate de Terramycine cristallise ou un sel analogue de bonne qualité est préparé à partir de la solution clarifiée ainsi obtenue en ajoutant un acide formateur de sel de Terramycine tel que 1-'acide chlor-
EMI3.1
hydrique concentre,, Un sel acide de Terramyoine, tel que lé chlorhydrate, se sépare à l'état cristallin, de la solution. Si on le désire on peut con- centrer la solution avant de procéder à la cristallisation En général, il est nécessaire de se servir d'un rapport d'au moins 200 ml diacide chlorhy.- drique concentré par kilogramme d'aiitîbiotîque, présent dans la solution.
Des quantités diacide un peu plus grandes peuvent améliorer le rendement en cristaux obtenus et 950 ml diacide par kilogramme de Terramycine active est une proportion fréquemment préférée. Les 'Volumes, qui donnent les résul- tats optima, sont aisément déterminés par un spécialiste du métier mais l'ad- dition de plus d'un litre diacide par kg d'antibiotique n'est pas souvent recommandable. La cristallisation est faite, de la manière'la plus parti- que, à peu près à la température ambiante bien qu9une température plus basse puisse donner un rendement légèrement meilleur.
A des température plus élevées le rendement est un peu diminuéo
En plus de la régénération de la Terramycine par.cristallisation
EMI3.2
directe de ses sels acides à partir de aompoiésmétallo-organiques, la régéné- ration peut être effectuée en dissolvant les composés en question dans un solvant organique, tel que le méthanol, à l'aide 'un acide. La présente d'une
EMI3.3
proportion minime d'eau n'est pas gênante. De lacide sulfurique est le plus souvent utilisé à cet effet. Les impuretés précipitées, telles que du sul- fate de calcium.!' sont enlevées par filtration et le pH est augmenté depuis une valeur d'environ 5 à environ 7. Un précipité contenant une proportion
EMI3.4
de Terramycine amphotérique libre est ainsi obtenu.
Celle-ci peut, si on le désire, être convertie en un sel acide cristallisé par les moyens usuelso Le solvant organique peut être enlevé par distillation et remplacé par de l'eau avant filtrationo Ceci augmente le rendement jusqu'à un certain de- gréo Suivant une variante, le produit peut être filtré et le solvant peut être enlevé pour obtenir un deuxième précipité d'une activité un peu moin- dre et qui peut être recyclé pour subir un traitement ultérieur.
EMI3.5
Une variété d'amines et de composés d'amuonium quateraires or- ganiques et différents peuvent être utilisés pour le traitement faisant l'ob-
EMI3.6
jet de l'invention en vue de préparer les sels basiques de la Terramyoine. Il est préférable que le poids moléculaire de la base soit suffisamment éle- vé afin qu'un précipité soit aisément formé dans le système dilué pour sé- parer une proportion appréciable de la teneur totale en antibiotique.
Les
EMI3.7
bouillons de fermentation de Terramyoînep quand ils sont préparés selon la kéthode décrite dans le brevet E.UoAo 205l6o0S0>> ont une actitivé d'au moins 50 meg/ml de IPantibiotiquso La base organique ou son sel doit également être relativement soluble dans l'eau afin que la réaction, par laquelle on
EMI3.8
obtient la formation de la Terramyoine insoluble puisse se faire en un temps raisonnable. Des exemples de basas organiques préférées sont les amines
EMI3.9
primaires, secondaires et tertiaires, des halogénures d9ammonîum quaternai res et analogues. Parmi ces derniers.. les chlorures d'alcoyle-triméthyl am- monium à longue chaine, dans lesquels le groupement alcoyle contient environ huit atomes de carbone ou davantage, sont particulièrement économiques et
EMI3.10
utiles.
Plutôt que d'utiliser ces composés individuels.\> il est possible de se servir de leurs mélanges industriels qui se trouvent sur le marché et qui comportent des chlorures d'alcoyle et aldéhyde trirêthyl ammonium contenant de huit à dix huit atomes de carbone (C8 à C18). Ces matières ne sont pas coûteuses et très efficaces. Divers groupements tels que les chaînes alcoy- les peuvent être substitués à un ou plusieurs radicaux alcoyles de ces com-
EMI3.11
posés.
Parmi les amine3,!> leSt genres aliphatiques à longue chaîne telles que 19octylamine, la nonylamine ou la ecylamine9 ou des mélanges industriels contenant plusieurs de ces substances donnent tout spécialement de bons ré- sultatso D'autres bases organiques, telles que des composés hétérocycliques
EMI3.12
et des eyelo-alcoyle amines ainsi que des bases quaternaires de ces composés
<Desc/Clms Page number 4>
peuvent être utilisés.
En général, il semble qu'environ huit atomes de car- bone soient nécessaires? au moins, pour le précipitant organique utilisés
Un précipitant organique et basique? particulièrement utile,
EMI4.1
pour les bouillons de fermentation de Terramyoïne, est le produit connu sous le nom de Arquad 0 que l'on peut se procurer sous la forme d'une solution à 50 % dlisopropano1 ou d'une solution aqueuse à 33 %0 Ce produit est un mé- lange technique contenant environ 50 % de chlorure de dodecyl-triméthyl-ammo- nium et des quantités moindres de chlorures de octyl-e deeyl-, tetradecyl-, hexadecyl=p octadecyl- et octadecenyl-triméthyl-ammonium.
La quantité rédui- te d9isopropanol introduite quand on se sert de la solution ne gêne pas sé- rieusement le rendement de la précipitation des sels de Terramycineo Un vo- lume aussi réduit que 0,5 % en volume de la solution aqueuse à 33 % peut être utilisé avec de très bons résultats pour le traitement en question et l'ac- tivité des bouillons de fermentation est généralement réduite à moins de 100 mag/ml.
Quand on diminue la proportion du réactif il existe une tendan- ce à ce que plus de Terramycine reste dissoute dans la solution. Il n'est généralement pas pratique d'augmenter la quantité de Terramycine précipitée
EMI4.2
et cet accroissement n'augmente pas fortement la quantité de Terramyeine"pré- cipitée ce fait indiquant que la limite de solubilité est atteinte. En ef- fet, un usage de quantités excessives du produit Arquard comme précipitant peut également être peu pratique à cause de la dissolution partielle du pré- cipité qui en résulte parfois. En général une proportion d'environ 1.0 à environ 2,5 g (à sec) de ce réactif particulier par litre d'un bouillon nor- mal est préférée.
D'autres préoipitants de ce genre pour la Terramycine sont également efficaces dans une proportion approximativement la même. On peut admettre, toutefois, que pour des composés, ayant un poids moléculaire moindre, on doit se servir de quantités plus petites et que lorsqu'ils ont un poids moléculaire supérieur, ces quantités doivent être un peu plus gran- des.
Le degré de précipitation de la Terramycine hors de solutions aqueuses,, plus spécialement des bouillons de fermentation, par des bases or- ganiques varie avec la valeur du pH pour laquelle la solution est réglée, L'utilisation de pH inférieur à environ 5,5 est peu pratique alors que des pH d'environ 6 à environ 10 donnent des résultats excellents.
Gomme la sta- bilité de la Terramycine diminue avec les pH plus élevée, un pH d'environ 800 à 9.5 est préférée La méthode généralement utilisée pour récupérer la Terramycine à partir d'un bouillon de fermentation de micro-organismes est de séparer le mycelium par filtration du bouillon acidifié, d'ajouter la base organique que l'on désire utiliser comme précipitant et de régler en- suite le pH de la solution avec un alcali soluble tel que la soude ou po- tasse caustique. On a observé que l'addition rapide d'une solution alca- line tend à provoquer la précipitation d'un produit finement divisé qui peut être difficile à filtrer. Une addition plus lente donne un produit plus aisément filtrable.
Les précipités qui sont obtenus par le traitement des solu- tions de Terramycine avec les différentes bases organiques utilisables en présence d'ions métalliques polyvalents ne sont pas constitués par des sels simples de l'antibiotique et de la base choisie mais sont plutôt des sels complexes de ces substances, ces sels contenant divers ions métalliques pré- sents au cours du traitement. Ceci est prouvé par le fait que l'on 'nob- tient aucun précipité quand on traite une solution aqueuse diluée de Terra- myoine pure, dont la concentration est comparable à celle d'un bouillon de
EMI4.3
fermentation usuel de Terramyeine, avec une amine qui est connue comme con- venant à la précipitation de la Terramysine hors des bouillons de fermenta- tion.
Toutefois, 19addîtîon de quantités réduites d'ions métalliques bi- ou tri-valents à une telle solution de Terramyeine pure provoque la précipi- tation aisée des sels antibiotiques. Apparemment les précipités sont con-
EMI4.4
stitués par des composés complexes de Terramyolne., de la base organique et d'un ou de plusieurs ions métalliques polyvalents. Comme indiqué plus haut, ces derniers sont normalement présents dans les bouillons de fermentationo Par exemple, un précipité typique obtenu à partir d'un bouillon de fermenta-
<Desc/Clms Page number 5>
tion de Terramycine.. traité avec du Arquad C a été analysé et on a trouvé qu'il contient approximativement 51 % de Terramycine, 19 % de l'ion ammonium quater- naire et 7 % de cendres.
Les composants métalliques des cendres contiennent environ 45 % de magnésium et environ 45 % de calcium. Comme les milieux uti- lisés pour la préparation de Terramycine par fermentation varient un peu en ce qui concerne leur composition en ions métalliques, la composition du pré- cipité, obtenu avec une amine donnée ou avec un sel quaternaire déterminé,, varie également. Les milieux de fermentation normaux de la Terramycine con- tiennent au moins une-quantité d'ions métalliques polyvalents suffisants pour assurer la précipitation quand une base organique est ajoutée au bouillon fil- tré et quand le pH est rendu basique.
En réalité, le bouillon contient sou- vent plus de constituants métalliques que nécessaire auquel cas 1-'excédent peut être enlevé préalablement par des moyens appropriés? par exemple par la méthode de séquestration. Si le bouillon de Terramycine contient'une quan- tité insuffisante d'ions métalliques on peut ajouter du fer, du zinc.. du magnésium et analogue pour aider davantage à la précipitation.' Ces additions doivent être faites, évidemment, de manière à traiter convenablement une so- lution aqueuse de Terramyoine qui ne provient pas d'un bouillon ou de métaux qu'il contient naturellement. Les diverses bases organiques varient en ce qui concerne leur sélectivité, comme on peut s'y attendre.
La proportion de 19antibiotique qui se trouve dans les sels précipités ne reste pas constante avec les différents précipitants. La composition du précipité varie évidem- ment aussi quelque peu avec le pH utilisé.
Bien qu'il soit possible de se servir de solutions ou de bouil- lons ayant une activité en Terramyoine de 500 meg/ml et moins, on préfère se servir de solutions ou de bouillons donc Inactivité est un peu plus éle- vée afin que le produit obtenu ait une activité élevée et soit formé avec un bon rendement. En général, une fraction seulement du sel d'ammonium quaternaire ou autre base organique réactive est trouvée dans le précipité obtenu c'est-à-dire qu'on doit se servir d'un excès si l'on veut récupérer pour ainsi dire complètement l'antibiotique. Un excès molaire, à peu près égal à trois, du réactif est généralement le plus avantageux.
Pour la récupération de Terramycine pure ou de ses sels simples comme le chlorhydrate de Terramycine à partir de solutions de complexes mé- tallo-organiques, la base organique utilisée comme précipitant et un peu de l'anti-biotique lui-même subsiste dans la liqueur-mère et dans les résidus.
Il peut être désirable de récupérer et à-utiliser à nouveau ces matières.
Par exemple, si la liqueur-mère est recyclée et ajoutée à la charge suivan- te de la solution ou du bouillon de Terramycine à traiter conformément à l'invention la quantité de base organique, qui est alors nécessaire, peut être notablement réduite sans abaisser d'une manière appréciable le rende- ment en précipité de Teramycine. Une partie ou la,totalité du solvant peut d'abord être séparé de la liqueur-mère avant son addition à la charge suivante mais ceci n'est pas essentiel. Certaines impuretés colorées peu- vent être ramenées dans la liqueur-mère et donnent un sel de Terramycine un peu plus foncé. Si l'opération de recyclage est répétée trop souvent, cet assombrissement de la couleur du produit peut être gênant et le rendement peut diminuer.
Toutefois le recyclage de la liqueur-mère pour plusieurs fois est parfaitement faisable et ne diminue pas la qualité.
Le procédé, faisant l'objet de l'invention présente plusieurs avantages. Il fait intervenir des réactifs économiques, aisément disponi= bles et de toxicité réduite. On obtient un sel cristallisé de qualité éle- vée à partir de solutions de Terramyoine très diluées et/ou très brutes.
Le traitement comprend un minimum d'opérations et fournit de bons rendements en antibiotique.
Les exemples? donnés ci-après, ne sont nullement limitatifs ou restrictifs et servent uniquement à illustrer l'objet de l'invention.
EXEMPLE 1.- Une quantité de bouillon de Terramycine, filtré et acidifié? contenant 25,3 g de l'antibiotique est traitée avec 5 g diacide citrique par litre de solution pour séquestrer une partie des ions métalliques poly-
<Desc/Clms Page number 6>
valents dans celle-ci. On ajoute ensuite-5 ml d'une.solution aqueuse à 33 % dArquad G par litre de bouillon et on règle le pH de la solution à 9.0 en y ajoutant une solution de soude caustique au cours d'une période d'une heu- re. Un précipité complexe contenant de la Terramycine et mélangé à des bases
EMI6.1
aléo7l-trîméthyl-ammonîum ainsi que différents métaux est obtenu et ce pré- cipité est filtré en se servant d'un agent faoilitant la filtration.
Le fil- trat résiduel est soumis à un essai et on trouve qu'il contient 0,83 g de Terramycine active. Le gateau recueilli sur le filtre est séché à 50 sous vide et est ensuite broyé. La matière solide, finement divisée, ainsi obte- nue est extraite avec une quantité suffisante de méthanol et on recueille
EMI6.2
une solution contenant 136 mg/ml de Terramycineo On filtre cette solution et on ajoute par portions de l'acide chlorhydrique concentré en agitant con- stamment. On obtient la séparation de chlorhydrate de Terramycine cristal- lisé que l'on filtre, que 1-'on lave avec du méthanol acidifié et que 1-l'on sè- che. On obtient en tout 14,2 g de chlorhydrate de Terramycine cristallisé et purifié par un traitement simple.
EMI6.3
EXEMPLE II - On traite du bouillon filtré de Terramycine contenant 25,3 g de Terramycine active avec 0,2 % d9Arquad G (solution aqueuse à 33 %). A cette solution on ajoute la liqueur-mère obtenue par cristallisation du chlorhydrate de Terramycine préparé selon l'exemple I. Cette liqueur recy- clée contient 6,6 gr de Terramycine active. Le pH de là solution mélangée est ajusté à 9.0 par addition lente d'une solution de soude caustique. Le
EMI6.4
filtrat contient 1.08 g de l'antibîotîque. Le précipité contient des sels complexes métallo-quaternaires dl'ammonium, la teneur totale en antibiotique étant de 29,8 g.
Ce produit est dissous dans le méthanol et de l'acide chlorhydrique concentré est ajouté simultanément suivant une quantité corres- pondant à 0,48 ml diacide par gramme de Terramycine active. On obtient une
EMI6.5
solution contenant 62,5 mg/ml de antibiotique. On traite ce produit avec 0,99 g d'un charbon activé, qui se trouve dans le commerce, par gramme de
EMI6.6
Terramycine active. Après avoir agité pendant une demi-heure, le charbon est filtré à l'aide d'un agent facilitant la filtration. A la solution cla- rifiée on ajoute 0,19 g de chlorure de calcium anhydre par gramme de Terra- mycine pour empêcher la cristallisation prématurée de la Terramycine ampho- térique et pour obtenir la formation de chlorhydrate de Terramycine de qua- lité élevée.
A la solution claire on ajoute 0,60 ml diacide chlorhydrique concentré par gramme d'antibiotique en présence. Ceci donne lieu à la for- mation de chlorhydrate de Terramycine cristallisé. Les cristaux sont filtrés lavés soigneusement avec du méthanol avant d'être séchés sous vide à 50 .
On obtient au total 15,75 g du sel acide cristallisé. La liqueur-mère ré-
EMI6.7
sultant de la cristallisation, contient 19,3 mg/ml d'anti-biotique epest-à- dire au total 8,56 g. Une quantité plus grande de 1-'antibiotique peut être récupérée par une deuxième extraction des gâteaux recueillis sur le filtre ou à partir du charbon décolorant.
EXEMPLE III.- Du bouillon de Terramycine filtré est traité avec divers sels de chlorures d'ammonium quaternaires en solution aqueuse (H2O) et dans
EMI6.8
une solution d-isopropanol (IPO). Du Arquad 12 est constitué principalement par du chlorure de dodéoyitriméthiammonium et le Arquad 18 est le composé octadécyle correspondant. Dans le tableau ci-dessous on donne le volume du
EMI6.9
réactif utilisé pour traiter 500 ml de bouillon de Terramycine9 Inactivité du bouillon épuisé après enlèvement du précipité par la base organique et Inactivité du précipité après séchage.
Le pH de chaque échantillon du bouil- lon est réglé à 9.0 avec de la soude caustique pour obtenir la précipitation.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> Réactif <SEP> Volume <SEP> Activité <SEP> du <SEP> Activité <SEP> du
<tb>
<tb> filtrat <SEP> produit <SEP> sé-
<tb>
<tb> chée
<tb>
EMI7.2
-=-------- --- Arquad 0 (33% dans H 20) 2,5 ml 45mcg/ml 505 mcg/ml Arquad 12 (33% dans H0) 2,5 " 40 If 480 " Arquad 12 (50% dans IPO) li, 65 " 40 515 " Arquad 18 (50% dans IPO) le65 n .50 " À45, "
Il est à noter que des changements dans la nature de la base organique utilisée ne modifient pas, d'une manière appréciable;,-la séparation effective de 1?antibiotique d'avec le bouillon ou la qualité du produit.
EMI7.3
EXEMPLE IVo- On a constaté qu9un autre groupe de sels d9ammonium quaternai- res et certaines amines sont très efficaces pour obtenir la précipitation de la Terramycine daveo le bouillon de fermentation clarifié de Terramyoineo
Un tel bouillon est traité avec 5 g diacide citrique par litre de bouillon et µ des portions d'un litre du bouillon traité on ajoute des
EMI7.4
portions de 5.0g (5a0 ml des liquides) des réactifs indiqués ci-dessous.
Dans chaque cas la solution est réglée par l'addition de soude caustique di- luée pour un pH d'environ 8,5 à environ 9.0. Les produits précipités, con- tenant la Terramycine sont filtrés en se servant d'une proportion réduite d'une substance facilitant la filtration. On soumet les filtrats, fournis par chacun des précipités, à un essai par une méthode biologique normalisée en vue de connaître 1-'antibiotique résiduel. Dans le tableau ci-dessous sont indiqués les réactifs intéressants en question avec leur marque de fabrique et leur désignation générique ainsi que le pourcentage de la Terramycine récupérée hors du bouillon de fermentation.
EMI7.5
<tb>
Réactif <SEP> % <SEP> de <SEP> Terramycine <SEP> séparée <SEP> du
<tb> bouillon <SEP> de <SEP> fermentation
<tb>
EMI7.6
ommomommommmAmo odm.ommmeoooomo' ommmmmoammmmmomme chlorure d9alcoyle (C 8 à C 18) triméthylmammonium (Arquad 0) 93 %
EMI7.7
<tb> Un <SEP> chlorure <SEP> substitué
<tb>
<tb> stearyle-imidazolinium <SEP> (Quaternary <SEP> S) <SEP> 93
<tb>
EMI7.8
chlorure d JI a1coy1benzy1- triméthy1-ammoniu]!!.
96
EMI7.9
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> p-di-isobutyl
<tb>
<tb> phenoxy <SEP> ethoxy <SEP> éthyl <SEP> diméthyl
<tb>
<tb> benzyl <SEP> ammonium <SEP> 96
<tb>
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> cetyl <SEP> diméthyl
<tb>
<tb> benzyl <SEP> ammonium <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb> décylamine <SEP> 93
<tb>
<tb>
<tb> nonylamine <SEP> 78
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> octylamine <SEP> 90
<tb>
<tb>
<tb> une <SEP> imidazoline <SEP> à <SEP> poids <SEP> moléculaire
<tb>
<tb> élevé <SEP> (Amine-C) <SEP> 96
<tb>
<tb> une <SEP> imidazoline <SEP> à <SEP> poids
<tb>
<tb> moléculaire <SEP> élevé <SEP> (Amine-0) <SEP> 88
<tb>
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui procède, 1?invention ne se limite aucunement à celui de ses modes d'ap-
EMI7.10
plication non pluq qu-là ceux des modes de réalisation de ses diverses par- ties,
ayant plus-spécialement été indiqués; elle en embrassée au contraire toutes les varianteso
<Desc / Clms Page number 1>
'' IMPROVEMENTS, PROVIDED-TO: PROCESSING PROCESSES
ANTIBIOTICS.
The invention relates to the purification of the product known under the name of Terramycin (registered trademark) and it relates more particularly to the preparation of basic metallo-organic salts of Terramycineo
Terramycin is an antibiotic which was first described and specified in the E.U.A. 2,516,080 granted on July 18, 1950.
Its nature is amphoteric and is known to form acidic salts, such as hydrochlorides, and certain basic compounds such as sodium salt. Several of these compounds are inherently suitable for therapy and nutrition. Several are useful as intermediates for the recovery and purification of pure antibiotic from crude fermentation broths in which the microorganisms are highly diluted and in which these microorganisms have been produced.
It has now been discovered that Terramycin can be recovered and purified and that certain new basic Terramycin compounds can be prepared by a process comprising the selective precipitation of the antibiotic from the very dilute aqueous solutions in which it is found. This precipitation is obtained by treating the aqueous solution of Terramycin in the presence of polyvalent metal ions, with an organic base which is relatively soluble in water and selected from the group consisting of amines and quaternary ammonium salts.
The resulting precipitate comprises a basic and polyvalent metal salt of Terramycin and the amino or quaternary ammonium radical, which salt has a solubility which, unexpectedly, is low and which allows the recovery of a substantial proportion of the substance. all of the antibiotic in the diluted solution. The regeneration of the purified terramycin or of the simple compounds of this salt is then carried out by a method chosen from among several depending on whether it is desired to obtain the pure antibiotic or its acid salts. The
<Desc / Clms Page number 2>
The precipitated metal-organic salt can be dissolved in a solvent by acidification and, with proper pH adjustment, the amphoteric terramycin is then precipitated and recovered from solution.
Alternatively, and preferably, the metalloorganic salt is dissolved in an organic solvent, such as methanol or methanol containing hydrochloric acid or calcium chloride. The solution is then clarified, if necessary with a decolorizing adsorbent, and is filtered. The addition of a concentrated acid such as hydrochloric acid to the clarified solution causes the separation of an extremely pure crystalline acid salt, terramycin, for example the hydrochloride.
A preferred application of the process which is the subject of the invention is the recovery of terramycin from fermentation broths of microorganisms. These broths typically have an activity of 500 mcg / ml or more and already contain polyvalent metal ions which are residual impurities from the initial nutrient culture medium An organic amine or a quaternary ammonium salt substituted with an organic group, which is capable of dissolving at least in part in such a broth to supplement the reaction, is added and the medium is preferably basified and maintained at neutral or basic pH.
The precipitate obtained is separated and a complex salt of Terramycin is recovered, this salt containing both the metal constituents and the added organic base. It gives the tests approximately 300-500 mog / mg of active Terramycin. The single-phase operation therefore mainly allows the concentration and purification of Terramycin.
The complex salt can be easily broken down to recover pure Terramycin or the simple acid salts thereof, the product can be used directly for therapy or nutrition. For example, quaternary ammonium salts, having molar weights. - high cells, are particularly strong germicides
As specified above, complex metallo-organic salts can be treated to regenerate the Terramycin they contain by dissolving them, preferably after removing excess moisture, in lower alcohols and ketones. For this purpose, methanol is a very advantageous solvent because its cost price is very low, it can be easily recovered and it intervenes to provide a product having a high purity.
Usually a methanolic solution is prepared containing about 5.3 to 6.8 liters of the solvent per kilogram of active Terramyoin and then treated with concentrated hydrochloric acid. Under these conditions there may be a tendency to precipitate. of terramycin america before conversion of the antibiotic to its hydrochloride has taken place. Further addition of acid dissolves most of the Terramycin but a small residue may remain. To avoid loss of this reduced proportion, the dried precipitate of Terramycin-organic base is preferably added to the methanol used as a solvent while the apparent pH of the solution is continuously maintained at about 2-2. , 5 by the addition of concentrated hydrochloric acid.
This gives a clear solution. Calcium chloride can be used for much the same purpose, i.e., to increase the solubility of Terramycin in methanol and to prevent its premature precipitation. When a clear solution is obtained, the introduction of a concentrated acid, for example an additional quantity of hydrochloric acid, results in the formation of the simple acid salt of Terramycin which is desired.
When hydrochloric acid is used preliminarily to facilitate the dissolution of the complexed salt about 0.4 to Ce? ml of the concentrated acid (36%) is required to dissolve the metalloorganic salt in equivalence to 1.0 g of active Terramycin and thus solutions are prepared having activities of about 60,000 to 150,000 mcg / ml or more in Terramycin.
This clear solution can then be treated with an absorbent, such as bleaching charcoal, to remove a variety of contaminating impurities o Usually about 0.5 to about 1.5 g of carbon is used per gram of active Terramycin., Contained. in the solution, the greater proportion giving a product having a better purity without significant losses due to the adsorption of the antibiotic. The adsorbent can be separated by
<Desc / Clms Page number 3>
of a filtration aid and washed with an acidulated solvent to remove residual material.
Crystallized Terramycin hydrochloride or an analogous salt of good quality is prepared from the clarified solution thus obtained by adding a terramycin salt-forming acid such as 1-chloracid.
EMI3.1
Concentrated water, An acid salt of Terramyonia, such as hydrochloride, crystalline out of solution. If desired, the solution can be concentrated prior to crystallization. In general, it is necessary to use a ratio of at least 200 ml of concentrated hydrochloric acid per kilogram of biotic acid present in the solution.
Slightly larger amounts of diacid can improve the yield of crystals obtained and 950 ml of diacid per kilogram of active terramycin is a frequently preferred proportion. Volumes, which give optimum results, are readily determined by one skilled in the art but the addition of more than one liter of diacid per kg of antibiotic is often not advisable. Crystallization is most typically done at about room temperature although a lower temperature may give slightly better yield.
At higher temperatures the efficiency is slightly reduced.
In addition to the regeneration of Terramycin by crystallization
EMI3.2
Directly of its acidic salts from metalloorganic compounds, the regeneration can be carried out by dissolving the compounds in question in an organic solvent, such as methanol, with an acid. The present of a
EMI3.3
minimal proportion of water is not a problem. Sulfuric acid is most often used for this purpose. Precipitated impurities, such as calcium sulphate. are removed by filtration and the pH is increased from a value of about 5 to about 7. A precipitate containing a proportion
EMI3.4
of free amphoteric terramycin is thus obtained.
This can, if desired, be converted into an acid salt crystallized by the usual means o The organic solvent can be removed by distillation and replaced with water before filtration o This increases the yield up to a certain degree o Alternatively, the product can be filtered and the solvent can be removed to obtain a second precipitate of somewhat lower activity which can be recycled for further processing.
EMI3.5
A variety of organic and different quaternary amines and ammonium compounds can be used for the treatment under consideration.
EMI3.6
jet of the invention with a view to preparing the basic salts of Terramyoine. It is preferable that the molecular weight of the base is sufficiently high so that a precipitate is readily formed in the dilute system to separate an appreciable proportion of the total antibiotic content.
The
EMI3.7
Terramyoînep fermentation broths when prepared according to the method described in the patent E.UoAo 205l6o0S0 >> have an activity of at least 50 meg / ml of IPantibiotiquso The organic base or its salt must also be relatively soluble in water so that the reaction, by which we
EMI3.8
obtains the formation of the insoluble Terramyoine can be done in a reasonable time. Examples of preferred organic basas are amines
EMI3.9
primary, secondary and tertiary, quaternary ammonium halides and the like. Of these, the long chain alkyl trimethyl ammonium chlorides, in which the alkyl group contains about eight or more carbon atoms, are particularly economical and
EMI3.10
useful.
Rather than using these individual compounds. \> It is possible to use their commercially available industrial mixtures which contain alkyl chlorides and aldehyde trirethyl ammonium containing eight to eighteen carbon atoms (C8 to C18). These materials are inexpensive and very effective. Various groups such as alkyl chains can be substituted for one or more alkyl radicals of these compounds.
EMI3.11
posed.
Among the amine3,!> The long chain aliphatic genera such as octylamine, nonylamine or ecylamine9 or industrial mixtures containing several of these substances give especially good results. Other organic bases, such as heterocyclic compounds
EMI3.12
and eyelo-alkyl amines as well as quaternary bases of these compounds
<Desc / Clms Page number 4>
can be used.
In general, it seems that about eight carbon atoms are needed? at least for the organic precipitant used
An organic and basic precipitant? particularly useful,
EMI4.1
for Terramyoin fermentation broths, is the product known as Arquad 0 which can be obtained as a 50% solution of isopropano1 or a 33% aqueous solution 0 This product is a technical mixture containing about 50% dodecyl-trimethyl-ammonium chloride and lesser amounts of e-octyl-, tetradecyl-, hexadecyl = p-octadecyl- and octadecenyl-trimethyl-ammonium chlorides.
The reduced amount of isopropanol introduced when using the solution does not seriously interfere with the precipitation yield of Terramycino salts. A volume as small as 0.5% by volume of the 33% aqueous solution can be used with very good results for the treatment in question and the activity of fermentation broths is generally reduced to less than 100 mag / ml.
When the proportion of the reagent is decreased there is a tendency that more Terramycin remains dissolved in the solution. It is generally not practical to increase the amount of Terramycin precipitated
EMI4.2
and this increase does not greatly increase the amount of Terramyeine "precipitated, indicating that the solubility limit has been reached. Indeed, use of excessive amounts of the Arquard product as a precipitant can also be impractical due to the lack of convenience. partial dissolution of the precipitate which sometimes results In general from about 1.0 to about 2.5 g (dry) of this particular reagent per liter of normal broth is preferred.
Other such prepitants for Terramycin are also effective in approximately the same amount. It can be assumed, however, that for compounds having a lower molecular weight smaller amounts should be used and that when they have a higher molecular weight these amounts should be somewhat larger.
The degree of precipitation of Terramycin from aqueous solutions, more especially fermentation broths, by organic bases varies with the pH value to which the solution is adjusted. The use of pH less than about 5.5 is impractical while pHs of about 6 to about 10 give excellent results.
As the stability of Terramycin decreases with higher pHs, a pH of about 800 to 9.5 is preferred The method generally used to recover Terramycin from a fermentation broth of microorganisms is to separate the mycelium by filtration of the acidified broth, add the organic base which one wishes to use as a precipitant and then adjust the pH of the solution with a soluble alkali such as sodium hydroxide or caustic pot. It has been observed that rapid addition of an alkaline solution tends to precipitate a finely divided product which may be difficult to filter. Slower addition results in a more easily filterable product.
The precipitates which are obtained by the treatment of terramycin solutions with the various organic bases which can be used in the presence of polyvalent metal ions are not constituted by simple salts of the antibiotic and of the base chosen but are rather complex salts. of these substances, these salts containing various metal ions present during processing. This is proved by the fact that no precipitate is obtained when treating a dilute aqueous solution of pure Terramyoin, the concentration of which is comparable to that of a broth of
EMI4.3
The usual fermentation of Terramyeine, with an amine which is known to be suitable for precipitating Terramysine from fermentation broths.
However, the addition of reduced amounts of bi- or tri-valent metal ions to such a pure terramyeine solution causes easy precipitation of the antibiotic salts. Apparently the precipitates are con-
EMI4.4
composed of complex compounds of Terramyolne., the organic base and one or more polyvalent metal ions. As indicated above, these are normally present in fermentation brothso For example, a typical precipitate obtained from fermentation broth-
<Desc / Clms Page number 5>
Terramycin treated with Arquad C was analyzed and found to contain approximately 51% Terramycin, 19% quaternary ammonium ion and 7% ash.
The metal components of the ash contain about 45% magnesium and about 45% calcium. As the media used for the preparation of Terramycin by fermentation vary a little as regards their composition of metal ions, the composition of the precipitate, obtained with a given amine or with a given quaternary salt, also varies. Normal Terramycin fermentation media contain at least an amount of polyvalent metal ions sufficient to ensure precipitation when an organic base is added to the filtered broth and when the pH is made basic.
In fact, the broth often contains more metal constituents than necessary in which case the excess can be removed beforehand by suitable means. for example by the sequestration method. If the Terramycin broth contains an insufficient amount of metal ions, iron, zinc, magnesium and the like can be added to further aid in precipitation. These additions must, of course, be made in such a way as to properly treat an aqueous solution of Terramyonia which is not derived from a broth or from metals which it naturally contains. The various organic bases vary in their selectivity, as would be expected.
The proportion of the antibiotic which is found in the precipitated salts does not remain constant with the different precipitants. The composition of the precipitate obviously also varies somewhat with the pH used.
Although it is possible to use solutions or broths having a Terramyoine activity of 500 meg / ml and less, it is preferred to use solutions or broths therefore the inactivity is a little higher so that the product obtained has a high activity and is formed in a good yield. In general, only a fraction of the quaternary ammonium salt or other reactive organic base is found in the resulting precipitate, i.e. an excess must be used if one is to recover virtually completely. the antibiotic. A roughly three molar excess of the reagent is generally most desirable.
For the recovery of pure Terramycin or its simple salts such as Terramycin hydrochloride from solutions of metal-organic complexes, the organic base used as precipitant and a little of the anti-biotic itself remains in the liquor. -mother and in the residues.
It may be desirable to recover and reuse these materials.
For example, if the mother liquor is recycled and added to the next batch of the Terramycin solution or broth to be treated according to the invention the amount of organic base, which is then required, can be significantly reduced without lowering. appreciably the precipitate yield of Teramycin. Some or all of the solvent can first be separated from the mother liquor before it is added to the next feed, but this is not essential. Some colored impurities can be brought back into the mother liquor and result in a slightly darker Terramycin salt. If the recycling operation is repeated too often, this darkening of the color of the product can be troublesome and the yield can decrease.
However, recycling the mother liquor for several times is perfectly feasible and does not reduce the quality.
The method forming the subject of the invention has several advantages. It involves economical reagents, easily available and of reduced toxicity. A high quality crystalline salt is obtained from very dilute and / or very crude terramyoine solutions.
The treatment involves minimal operations and provides good antibiotic yields.
The examples? given below, are in no way limiting or restrictive and serve only to illustrate the subject of the invention.
EXAMPLE 1.- A quantity of Terramycin broth, filtered and acidified? containing 25.3 g of the antibiotic is treated with 5 g of citric acid per liter of solution to sequester part of the poly- metal ions.
<Desc / Clms Page number 6>
values in it. Then 5 ml of a 33% aqueous solution of Arquad G per liter of broth are added and the pH of the solution is adjusted to 9.0 by adding a solution of caustic soda to it over a period of one hour. re. A complex precipitate containing Terramycin and mixed with bases
EMI6.1
alo7l-tri-methyl-ammonium as well as various metals is obtained and this precipitate is filtered using a filter aid agent.
The residual filtrate is tested and found to contain 0.83 g of active terramycin. The cake collected on the filter is dried at 50 under vacuum and is then crushed. The finely divided solid material thus obtained is extracted with a sufficient quantity of methanol and collected.
EMI6.2
a solution containing 136 mg / ml of Terramycino This solution is filtered and concentrated hydrochloric acid is added in portions with constant stirring. The separation of crystallized terramycin hydrochloride is obtained, which is filtered, washed with acidified methanol and dried. A total of 14.2 g of crystallized and purified terramycin hydrochloride is obtained by simple work-up.
EMI6.3
EXAMPLE II Filtered Terramycin broth containing 25.3 g of active Terramycin is treated with 0.2% Arquad G (33% aqueous solution). To this solution is added the mother liquor obtained by crystallization of the terramycin hydrochloride prepared according to Example I. This recycled liquor contains 6.6 g of active terramycin. The pH of the mixed solution is adjusted to 9.0 by slowly adding a solution of caustic soda. The
EMI6.4
filtrate contains 1.08 g of the antibiotic. The precipitate contains complex metallo-quaternary ammonium salts, the total antibiotic content being 29.8 g.
This product is dissolved in methanol and concentrated hydrochloric acid is added simultaneously in an amount corresponding to 0.48 ml of diacid per gram of active terramycin. We get a
EMI6.5
solution containing 62.5 mg / ml of antibiotic. This product is treated with 0.99 g of an activated charcoal, which is commercially available, per gram of
EMI6.6
Active terramycin. After stirring for half an hour, the charcoal is filtered using a filtration aid. To the cleared solution, 0.19 g of anhydrous calcium chloride per gram of terramycin is added to prevent premature crystallization of the amphoteric terramycin and to achieve the formation of high quality terramycin hydrochloride.
0.60 ml of concentrated hydrochloric acid per gram of antibiotic present is added to the clear solution. This gives rise to the formation of crystallized Terramycin hydrochloride. The crystals are filtered, washed carefully with methanol before being dried under vacuum at 50.
A total of 15.75 g of the crystallized acid salt is obtained. The mother liquor re-
EMI6.7
resulting from crystallization, contains 19.3 mg / ml of anti-biotic ep, ie a total of 8.56 g. A larger quantity of the 1-antibiotic can be recovered by a second extraction of the cakes collected on the filter or from the decolorizing charcoal.
EXAMPLE III - Filtered Terramycin broth is treated with various salts of quaternary ammonium chlorides in aqueous solution (H2O) and in
EMI6.8
a solution of isopropanol (IPO). Arquad 12 consists mainly of dodeoyitrimethiammonium chloride and Arquad 18 is the corresponding octadecyl compound. In the table below we give the volume of the
EMI6.9
reagent used to treat 500 ml of Terramycin broth9 Inactivity of exhausted broth after removal of the precipitate with the organic base and Inactivity of the precipitate after drying.
The pH of each sample of the broth is adjusted to 9.0 with caustic soda to obtain precipitation.
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb> Reagent <SEP> Volume <SEP> Activity <SEP> of <SEP> Activity <SEP> of
<tb>
<tb> filtrate <SEP> product <SEP> se-
<tb>
<tb> chée
<tb>
EMI7.2
- = -------- --- Arquad 0 (33% in H 20) 2.5 ml 45mcg / ml 505 mcg / ml Arquad 12 (33% in H0) 2.5 "40 If 480" Arquad 12 (50% in IPO) li, 65 "40 515" Arquad 18 (50% in IPO) le65 n .50 "À45,"
It should be noted that changes in the nature of the organic base used do not appreciably modify the effective separation of the antibiotic from the broth or the quality of the product.
EMI7.3
EXAMPLE IVo- Another group of quaternary ammonium salts and certain amines has been found to be very effective in obtaining the precipitation of Terramycin from the clarified fermentation broth of Terramyoineo.
Such a broth is treated with 5 g of citric acid per liter of broth and µ of the one liter portions of the treated broth are added
EMI7.4
5.0g portions (5a0 ml of liquids) of the reagents indicated below.
In each case the solution is adjusted by the addition of diluted caustic soda to a pH of about 8.5 to about 9.0. The precipitated products containing Terramycin are filtered using a reduced proportion of a substance which facilitates the filtration. The filtrates, provided by each of the precipitates, are subjected to a test by a standard biological method in order to know the residual 1-antibiotic. In the table below are indicated the reagents of interest in question with their trade name and their generic designation as well as the percentage of Terramycin recovered from the fermentation broth.
EMI7.5
<tb>
Reagent <SEP>% <SEP> of <SEP> Terramycin <SEP> separated <SEP> from
<tb> broth <SEP> from <SEP> fermentation
<tb>
EMI7.6
ommomommommmAmo odm.ommmeoooomo 'ommmmmoammmmmomme alkyl chloride (C 8 to C 18) trimethylmammonium (Arquad 0) 93%
EMI7.7
<tb> A substituted <SEP> chloride <SEP>
<tb>
<tb> stearyle-imidazolinium <SEP> (Quaternary <SEP> S) <SEP> 93
<tb>
EMI7.8
JI a1coy1benzy1-trimethyl-ammoniu] chloride !!.
96
EMI7.9
<tb> <SEP> p-di-isobutyl <SEP> chloride
<tb>
<tb> phenoxy <SEP> ethoxy <SEP> ethyl <SEP> dimethyl
<tb>
<tb> benzyl <SEP> ammonium <SEP> 96
<tb>
<tb> <SEP> cetyl <SEP> dimethyl chloride <SEP>
<tb>
<tb> benzyl <SEP> ammonium <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb> decylamine <SEP> 93
<tb>
<tb>
<tb> nonylamine <SEP> 78
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> octylamine <SEP> 90
<tb>
<tb>
<tb> a <SEP> imidazoline <SEP> at <SEP> molecular weight <SEP>
<tb>
<tb> high <SEP> (Amine-C) <SEP> 96
<tb>
<tb> an imidazoline <SEP> <SEP> at <SEP> weight
<tb>
<tb> molecular <SEP> high <SEP> (Amine-0) <SEP> 88
<tb>
As goes without saying and as it follows moreover already from what proceeds, the invention is in no way limited to that of its methods of application.
EMI7.10
plication not more than those of the embodiments of its various parts,
more especially indicated; on the contrary, she embraced all the variants.