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La présente invention concerne des procédés métaboliques perfectionnés en particulier des procédés métaboliques appliqués à la production d'acide gibbérellique.
L'acide gibbérellique est un stimulant delà croissance des plantes pouvant être extrait des filtrats;de culture de certaine souches actives de la moi s issure Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme). Il est connu de préparer l'acide gibbérellique par la culture d'une souche active de Gibberella fujikuroi dans un milieu nutritif approprié, agité et aéré, contenant une source de carbone,, par exemple du glucose, une source d'azote, par exemple du nitrate d'ammonium, certains sels métalliques, par exemple du sulfate de
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magnésium et du phosphate monpotassique, et des traces de métaux tels que du fer, du cuivre, du zinc, du manganèse et du môlybdène.
Une caractéristique de ce procédé métabolique consiste en ce que l'acide est produit en majeure partie quand la synthèse propre' de la protéine ou la croissance active de la mois issure: est arrêtée.
Cet arrêt de la croissance active peut être le résultat de l'épuise- ment de l'un des constituants essentiels de la solution nutritive, par exemple l'azote ou le carbone.
Si on arrête la croissance active de la mois issure par épuisement d'un constituant essentiel du milieu, il est préférable que ce constituant essentiel ne soit pas la source de carbone.
Il est préférable, en effet, que du carbone demeure disponible pour satisfaire aux besoins de la moi s issure au cours du stade de production de l'acide gibbérellique. Dans certaines limites, plus il existe de carbone disponible pendant le stade-de production de l'acide, plus la production d'acide gibbérellique tend à augmenter Toutefois, une concentration élevée en carbone, en particulier quand elle existe sous forme de sucre, dans le stade initial du procédé métabolique, a tendance à diminuer le taux de croissance de la moi s issure, et a par conséquent un effet nuisible sur l'efficacité totale du procédé.
Suivant la présente invention, dans un procédé métabolique de préparation d'acide gibbérellique par la culture d'une souche active de Gibberella fujikuroi et-l'arrêt de la croissance active pour promouvoir la production d'acide gibbérellique, on maintient la quantité de carbone disponible au cours du stade de production d'acide gibbérellique, en ajoutant au milieu une source de carbone.
On peut ajouter la source de carbone de façon continue ou par charges espacées et une source de carbone appropriée peut être un sucre, par exemple du sucrose ou du glucose, un alcool polyhydri- que, par exemple de la glycérine ou ses esters, ou une huile végétale
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La source d'azote utilisée dans le milieu, peut être un se d'ammonium, un nitrate., de la liqueur de macération de mais ou une décoction de protéine, telle que la peptone, ou d'autres sources contenant de l' a.zote assimilable*
La présente invention permet d'amorcer une croissance hautement active de la moi.s issure tout en satisfaisant ses besoins en carbone au cours du stade de production d'acide gibbérellique.
L'invention est illustrée par 1.'exemple suivant.
On utilise deux fermentateurs A et B, chacun de 30 litres d'un milieu contenant:
EMI3.1
<tb> Fermentateur <SEP> A <SEP> Fermentateur <SEP> B
<tb> , <SEP> Poids <SEP> par <SEP> volume <SEP> poids <SEP> par <SEP> volume
<tb> Monohydrate <SEP> de <SEP> glucose <SEP> 10% <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> d'ammonium <SEP> 0,48% <SEP> 0,24%
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 0,5% <SEP> 0,5%
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1% <SEP> 0,1%
<tb>
<tb> Concentré <SEP> d'éléments <SEP> mineurs <SEP> 0,2% <SEP> vol/vol <SEP> 0,2% <SEP> vol/vo
<tb>
La composition du concentré d'éléments mineurs étant la suivante :
EMI3.2
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> cuivre <SEP> pentahydraté <SEP> 0,015 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> zinc <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> manganèse <SEP> heptahydraté <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb>
<tb> Molybdate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> K2Mo04 <SEP> 0,01.g
<tb>
<tb> Eau <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
On inocule les milieux par une souche active de Gibberella fujikuroi dont des échantillons sont déposés dans les collections de culture du "Commonwealth Mycological Institute", à Kew, .du ''Central Bureau vo@ Schimmelcultures" à Baarn et de la "Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agricul- ture", à Peoria, Illinois, U.S.A.;
on maintient ces milieux à 26,2 C, et on y insuffle de l'air à raison de 15 litres/minute. Après 118 heures de fermentation, après lesquelles la croissance active est pratiquement arrêtée, par ]--'épuisement de 1'azote'contenu dans les
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milieux, on ajoute du monohydrate de glucose sous forme'aseptique par portions de 15 g, pour maintenir la concentration en sucre des milieux au delà de 2-la en poids par volume.
Le tableau ci-après donne la quantité totale de sucre consommée par la moi sissure et la concentration en acide gibbérel- lique dans les deux milieux à mesure que la culture progresse.
EMI4.1
<tb>
Acide <SEP> gibbéréllioue <SEP> mg/1 <SEP> Sucre <SEP> utilisé <SEP> g/1
<tb>
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<tb> Durée <SEP> (heures <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> 'Fermenta-*
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> 573 <SEP> 324 <SEP> 409 <SEP> 355 <SEP> 237
<tb>
Le milieu utilisé dans le fermentateur A est pratiquement équilibré quant au carbône et à l'azote,
c'est-à-dire qu'il contient ces deux-'éléments nutritifs dans les proportions approximatives dans
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lesquelles ils sont absorbés par la moi s issure pendant sa croissance active. Par conséquent, le carbone serait épuisé-sensiblement au mê- me moment que l'azote, et en l'absence d'additions d'éléments nutri- tifs, on ne peut pas s'attendre à ce que la quantité d'acide gibbérellique produit dans la suite, dépasse 120 ml/litre.
'Toutefois, le tableau montre que si on effectue des additions d'une source de carbone., glucose monohydraté, après arrêt de la croissance active, on peut maintenir la production d'acide gibbérellique au moins jusqu'à ce que sa concentration s'élève à 324 mg/litre.
Dans le cas du fermentateur B, le milieu contient au début un excès de carbone qui demeure encore disponible quand l'azote contenu est épuisé, et on peut.s'attendre à ce que la production normale diacide gibbérellique .atteigne jusque 240 mg/litre.
Toutefois d.es additions de sucre visan.tà conserver du carbone disponible., a.boutissent à une concentration en acide qui s'élève jusqu'à 409 mg/litre.
Le milieu utilisé pendant le stade de croissance active de la moi s issure, est un milieu dit équilibré, dans lequel la concentration en azote peut être comprise dans la gamme de 0,017 à 0,26% en poids/volume, par exemple sous forme de 0,05 à 0,75% en poids/volume de nitrate d'ammonium et de préférence dans la gamme de 0,07 à 017% en poids par volume d'azote, par exemple scias forme de 0,2 à 0,5% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
On choisit alors la concentration en carbone, par exemple sous, . forme de sucrose, glucose ou glycérine, de manière à procurer un milieu dans lequel le l'apport du carbone à l'azote est de pré- férence compris entre les valeurs de 10:1 et de 25:1. Un milieu équilibré type., convenant à la croissance active, peut par exemple contenir 0,24% en poids/volume de nitrate d'ammonium et 3,18% en poids/volume de glycose monohydraté, c'est-à-dire avoir un rapport de C : N de 14 : 1 ou bien il peut contenir 0,48% en poids/volume de nitrate d'ammonium et 10% en poids/volume de glucose
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monohydraté, c'est-à-dire avoir un rapport C :N de 21:5.
Quand la croissance active est pratiquement arrêtée par épuisement de l'azote dans un milieu équilibré, il ne reste que peu ou pas d'excès de carbone dans le milieu, et il n'existe ainsi que peu ou pas de carbone à l'aide duquel la moisissure peut produire de l'acide gibbérellique. C'est à ce stade qu' on ajoute au milieu une source additionnelle de carbone dans le but d' entretenir la production d'acide gibbérellique.
La quantité de source de carbone ajoutée au milieu à la fin du stade de croissance active est réglée dans le but d'éviter l'inhibition de la moisissure pour la production d'acide gibbérel- lique. Un grand excès de source de carbone est désavantageux au sta- de de production de l'acide, et un excès raisonnable peut par exempl exister sous la forme de 0,1 à 10% en poids/volume de glucose, et plus particulièrement sous la forme de 1 à 4% en poids/volume de glucose .
On peut appliquer le procédé de l'invention en combinaison avec un procédé à stades multiples pour la production d'acide , gibberelliqüe, tel que décrit dans le brevet de même date de la
Demanderesse intitulé "Perfectionnements apartés aux procédés métaboliques".
Ainsi, la culture de la souche active de Cibberela fujikuroi peut s'effectuer en deux ou plusieurs stades, dont le permier stade est un stade de croissance active de ia moisissure dans un milieu approximativement équilibré, 'c'est-à-dire dans lequel le rapport C:N est compris entre 10 :1 25:1 le second stade étant un stade autours duquel la croissance active -se poursuite dans un milieu ayant un rapport C :N élevé, par exemple compris entre environ 30 :1 environ 55:
1, et la croissance active est arrêtée par épuisement de l'azote, en conservant un excès de la source de carbone, et le troisième stade étant un stade au cours duquel on introduit dans le milieu des quantités additionnelles de la source de carbone, en maintenant une concentration approximativement constante delà source de carbone dans le milieu, jusqu'à cessation
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de la production d'acide gibbérellique.
Ainsi., par exemple, on peut exécuter le premier stade dans un milieu qui contient 3,18% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24% en poids/volume de nitratedammonium, c'est-à-dire ayant un rapport C:N d'environ 14:1, et on peut alors exécuter le second stade dans un milieu non équilibre ayant un rapport C:N plus élevé, par exemple un milieu qui contient respectivement 16% en poids/volu- me ou 10% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/ volume de nitrate d'ummonium, c'est-à-dire ayant respectivement un rapport C:N de 41:1 ou 26:1. La croissance de la moisissure se poursuit jusqu'à ce que la source d'azote soit complètement épuisées il reste alors un excès de la source de carbone et la production d'acide gibbérellique commence.
Au cours de cette production décide gibbérellique, l'excès de la source de carbone s'épuise de façon continue, et quand cett source atteint une concentration d'environ 0,5 à 10% en poids/volume du milieu, on commence à ajouter de nouvelles quantités d'une source de carbone, qui peut être ou ne pas !être la même que celle utilisée dans les stades précédents, dans le but de maintenir une concentration constante en carbone dans le milieu et maintenir ainsi la production continue d'acide gibbérellique avec des rendements qui n'ont pas encore été atteints jusqu'à présent.
La source préférée de carbone est un sucre, par exemple du sucrose ou du glucose, et la concentration constante préférée de ce sucre au cours de la production continue d'acide gibbérellique est comprise dans la gamme d'environ 1% à environ 4% en poids/volume du.milieu. La concentration constante préférée peut être atteinte en ajoutant par intervalles des quantités de sucre au milieu pendant le stade final de production d'acide gibbérellique, par exemple à des intervalles de 12 à 24 heures. De cette façon, on obtient un milieu de culture qui contient jusqu'environ 1.000 mg d'acide gibbérellique par litre de milieu, et on peut séparer cet acide du milieu par des moyens connus.
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L'invention est illustrée davantage par les exemples suivants: EXEMPLE 1
EMI8.1
Prénaration de l'inoculum.
On inocule 5 litres d'un mélange nutritif contenant 8% en poids/volume de glucose monohydraté, 0,4% de nitrate d'ammonium (en poids/volume)., 0,5% en poids/volume de phosphate monopotassique, 0,1% en poids/volume de sulfate de magnésium heptahydraté, et 0,2% en volume/volume d'un concentré d'élément mineur, dont la composi- tion est décrite plus haut, à un pH de 3,47, à l'aide d'une culture
EMI8.2
sur agar de Gibberella fujikuroi. On maintient la milieu à bzz et on le remue et on l'aère à raison de 2,5 litres d'air par minute.
Fermentation de production.
Après 80 heures., on inocule 5 litres de la culture di- dessus dans un appareil fermentateur de 100 litres, contenant un milieu de nutrition préparé comme suit:
EMI8.3
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> 8% <SEP> en <SEP> poids/volume
<tb>
EMI8.4
Nitratedëmmonium bzz "
EMI8.5
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1% <SEP> "
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 0,5% <SEP> "
<tb>
<tb> Concentré <SEP> d'élément <SEP> mineur <SEP> 0,2% <SEP> en <SEP> volume/volume
<tb>
Eau pour parfaire à 75 litres.
La composition du concentré d'éléments mineurs est celle donnée plus haut. On stérilise le milieu, puis on le refroidit et on 1-lino- cule au moyen de 5 litres de l'inoculum décrit ci-dessus. On agite le milieu, on le maintient à une température de 26 C, et on l'aère par uncourant d'air de 0,5 volume d'air par volume de milieu de culture et par minute.
Quand la croissance active de la moisissure a cessée c'est-à-dire quand la source d'azote est complètement épuisée, commence la production d'acide gibbérellique, et la concentration de la source de carbone restante (glucose) décroît rapidement . 39 heures après.le début de la formation d'acide gibbé-
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rellique pendant le stade production de l'acide, la concentration en glucose est d'environ 0,9% en poids/volume et on ajoute alors des quantités additionnelles du sucre au milieu nutritif de.12 en 12 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 2% de glucose en poids/volume dans le milieu nutritif, pendant bout le reste du stade de formation diacide au cours de la fermentation Le tableau suivant donne la concentration 'en acide gibbérellique dans le milieu.,
en fonction de la consommation de glucose, à mesure que la fermentation progresse.
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<tb>
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<tb> 359 <SEP> 618 <SEP> 17,1
<tb>
On filtre ensuite les contenus des fermentateurs, et on extrait un échantillon de 58 litres du filtrat par l'acétate d'éthyle pour- séparer lacide gibbérellique, qu'on obtient ensuite par des moyens connus. On obtient ainsi 33,48 g d'acide gibbérellique sous forme de poudre cristalline incolore qui fond à 233-235 C en se décomposant.
On peut obtenir une seconde portion d'acide gibbérellique à partir du filtrat de cristallisation.
EXEMPLE 2
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydrat é et 0,24% en poids/volume de nitrate .d'ammonium dans le milieu nutritif utilisé dans le stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, par 20% en poids/volume de glucose monohydraté e't 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
Au coars du stade de production diacide gibbérellique, le glucose en excès existant
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dans le milieu nutritif est rapidement consomme., et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté à des intervalles de 12 heures, après environ 74 heures, afin de mainte une concentration d'environ 4% en poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant le restant du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation. Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction du glucose consommé, à mesure que la fermentation progresse.
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Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Sucre <SEP> utilisé
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4
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<tb> 508 <SEP> 826 <SEP> 35,0
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EXEMPLE
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1 excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et les 0,24% en poids/volume.de nitrate d'ammonium dans le milieu nutritif utilisé dans la fermentation productive, par 20% en poids/volume
EMI11.1
<té glucose monohydraté et 0% en poids/volume de nitrate .d'rmmon.im Au cours du stade de production d'acide gibbérellique, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif, est rapidement épuisé et on ajoute de 12 en 12 heures des quantités additionnelles de glucose monohydraté après environ 26 heures,
-afin de maintenir une concentration d'environ 10% en poids/volume de glucose pendant tout le restant du stade de production de 1,1 acide gibbérellique de la fermentation Le tableau ci-après donne la concentration en, acide gibbérellique du :milieu, en fonction du glucose consommé à mesure que la fermentation progresse.
EMI11.2
.Age (heures après -Acide gi'bbéri11ique Sucre consomme 1 -9 ino c.,tLia-t mg±y±re ' Lep- :Q01d:YIQ
EMI11.3
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6
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<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
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.
EXEMPLE 4
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24% en poids/volume de nitrate d'ammonium par 16,0% en poids/vo- lume de glucos,e monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium. Au cours du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, l'excès de glucose présent dans le milieu nutritif est épuisé-et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 162 heures et ensuite à des intervalles de 12 à 24 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 1 à 3% eh poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation.
Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction de la concentration en glucose à mesure que la fermentation progresse.
EMI12.2
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Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucre
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<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb> Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucre
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31
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<tb> 520 <SEP> 956 <SEP> 1n41
<tb>
On sépare l'acide gibbérellique par des moyens connus., par filtration du mélange de fermentation et passage du filtrat (63 litres) à travers du carbone. On sépare l'acide gibbérellique absorbé par élutriation, puis on l'obtient et le purifie par cristallisation. On obtient ainsi 63,0 g d'acide glbbérellique,
<Desc/Clms Page number 14>
sous forme de produit cristallin incolore, qui fond à 233-235 C, en se décomposant.
EXEMPLE
On répète le procédé' décrit dans l'exemple 1 excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24 % en poids/volume de nitrate .d'ammonium par 20% en poids/ volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium. Au cours du stade de production d'acide gibbérellique , de la fermentation, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif est épuisé et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 154 heures et ensuite, de 12 en 12 heures, .afin de maintenir une concentration d'environ 1 à 4% 'en poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation.
Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction de la concentration' en glucose à mesure que la fermentation progresse.
EMI14.1
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Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucr<
<tb> l'inoculation.. <SEP> mg/litre <SEP> % <SEP> en <SEP> poids/volume
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<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb> Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> suer'
<tb> 1/ <SEP> inoculation <SEP> mg.litre <SEP> % <SEP> en <SEP> poids/volume
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<tb> 250 <SEP> 427 <SEP> 3,86
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<tb>
<tb> 274 <SEP> 452 <SEP> 3,4
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<tb> 286 <SEP> 486 <SEP> 3,31
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<SEP> 3,13
<tb>
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<tb>
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<tb>
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<tb>
<tb> 358 <SEP> 623 <SEP> 2,07
<tb>
<tb> 370 <SEP> 645 <SEP> 1,88
<tb>
<tb> 382 <SEP> 639 <SEP> 3,3
<tb>
<tb> 394 <SEP> 660 <SEP> 1,5
<tb>
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<tb> 466 <SEP> .
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<tb> 562 <SEP> 809
<tb>
<tb> 586 <SEP> 812 <SEP> -
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
EXEMPLE 6
On répète le procédé de l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et les 0,24% en poids/ volume de nitrate d'ammonium par 10% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
Au cours du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif est éprise et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 60,5 heures, et ensuite à des intervalles de 12-24 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 2-4% de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation. Le tableau ci-après donne la concentra- -tion en acide gibbérellique dans le milieu, en fonction de la concentration en glucose à mesure que la fermentation progresse.
EMI16.1
<tb>
Age <SEP> (heures <SEP> -après <SEP> .Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucre
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<tb> 93 <SEP> 154 <SEP> 2,83
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<tb> 160 <SEP> ,, <SEP> 323 <SEP> 2,95
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<tb> 232 <SEP> 500 <SEP> 4,52
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb> Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en.
<SEP> sucre <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> l'inoculation <SEP> mg/litre <SEP> % <SEP> 'Poids/volume
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<tb> 256 <SEP> 569 <SEP> 4,6
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<tb> 280 <SEP> 590 <SEP> 4,04
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<tb> 304 <SEP> - <SEP> 3,96
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<tb> 328 <SEP> 698 <SEP> 2,79
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<tb> 376 <SEP> 825 <SEP> 2,41
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<tb> 400 <SEP> 901 <SEP> 2,16
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<tb> 448 <SEP> 973 <SEP> ' <SEP> 0,33 <SEP>
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<tb> 472 <SEP> 1002 <SEP> 0,22
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<tb> 496 <SEP> 989 <SEP> 0,26
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 520 <SEP> - <SEP> 0,21
<tb>
On sépare l'acide gibbérellique par des moyens connus par filtration du milieu de fermentation et passage du filtrat (60 litres)
à travers du carbone, On sépare l' acide gibbérellique adsorbé par élutriation, puis on le récupère et on le purifie par cristallisation. On obtient ainsi 63,6 g d'acide gibbérellique sous forme d'un solide cristallin incolore, qui fond à 233-235 C, en se décomposant .
REVENDICATIONS
EMI17.2
--------------------------- l.- Procédé métabolique de production d'acide gibbérellique par culture d'une souche active de Gibberella funjikuroi et arrêt de la croissance active pour promouvoir la production d'acide gib- bérellique, caractérisé en ce qu'on maintient la quantité de carbone disponible au cours du stade de production de l'acide gibbérellique en ajoutant au milieu une source de carbone.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to improved metabolic methods, in particular metabolic methods applied to the production of gibberellic acid.
Gibberellic acid is a plant growth stimulant which can be extracted from the filtrates of cultivation of certain active strains of the me s issure Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme). It is known to prepare gibberellic acid by culturing an active strain of Gibberella fujikuroi in a suitable, stirred and aerated nutrient medium containing a carbon source, for example glucose, a nitrogen source, for example. ammonium nitrate, certain metal salts, for example sulphate of
<Desc / Clms Page number 2>
magnesium and monpotassium phosphate, and traces of metals such as iron, copper, zinc, manganese and molybdenum.
A feature of this metabolic process is that most of the acid is produced when the proper synthesis of the protein or the active growth of the mold is stopped.
This cessation of active growth may be the result of the depletion of one of the essential constituents of the nutrient solution, for example nitrogen or carbon.
If the active growth of the month is stopped by depletion of an essential component of the medium, it is preferable that this essential component is not the carbon source.
It is preferable, in fact, that carbon remains available to meet the needs of the m issure during the stage of production of gibberellic acid. Within certain limits, the more carbon available during the acid production stage, the more the production of gibberellic acid tends to increase.However, a high carbon concentration, especially when it exists as sugar, in the initial stage of the metabolic process, tends to decrease the growth rate of the molecule, and therefore has a deleterious effect on the overall efficiency of the process.
According to the present invention, in a metabolic process for preparing gibberellic acid by cultivating an active strain of Gibberella fujikuroi and stopping active growth to promote production of gibberellic acid, the amount of carbon is maintained. available during the gibberellic acid production stage, by adding a carbon source to the medium.
The carbon source can be added continuously or in spaced batches and a suitable carbon source can be a sugar, for example sucrose or glucose, a polyhydric alcohol, for example glycerin or its esters, or a sugar. vegetable oil
<Desc / Clms Page number 3>
The source of nitrogen used in the medium can be ammonium salt, nitrate, corn maceration liquor or a protein decoction, such as peptone, or other sources containing a. assimilable nitrogen *
The present invention allows for the initiation of highly active growth of the moiety while meeting its carbon requirements during the stage of gibberellic acid production.
The invention is illustrated by the following example.
Two fermenters A and B are used, each of 30 liters of a medium containing:
EMI3.1
<tb> Fermenter <SEP> A <SEP> Fermenter <SEP> B
<tb>, <SEP> Weight <SEP> by <SEP> volume <SEP> weight <SEP> by <SEP> volume
<tb> Glucose <SEP> <SEP> <SEP> <SEP> 10% <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> Ammonium <SEP> nitrate <SEP> 0.48% <SEP> 0.24%
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassium <SEP> 0.5% <SEP> 0.5%
<tb>
<tb> Magnesium <SEP> <SEP> <SEP> heptahydrate <SEP> 0.1% <SEP> 0.1%
<tb>
<tb> Concentrate <SEP> of minor <SEP> elements <SEP> 0.2% <SEP> vol / vol <SEP> 0.2% <SEP> vol / vo
<tb>
The composition of the concentrate of minor elements being as follows:
EMI3.2
<tb> Ferrous <SEP> sulphate <SEP> heptahydrate <SEP> 0.1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> copper <SEP> pentahydrate <SEP> 0.015 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> of <SEP> zinc <SEP> heptahydrate <SEP> 0.1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulphate <SEP> of <SEP> manganese <SEP> heptahydrate <SEP> 0.01 <SEP> g
<tb>
<tb> Molybdate <SEP> of <SEP> potassium <SEP> K2Mo04 <SEP> 0.01.g
<tb>
<tb> Water <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
The media are inoculated with an active strain of Gibberella fujikuroi, samples of which are deposited in the culture collections of the "Commonwealth Mycological Institute", Kew, the "Central Bureau vo @ Schimmelcultures" at Baarn and the "Northern Utilization Research". and Development Division of the United States Department of Agriculture "in Peoria, Illinois, USA;
these media are maintained at 26.2 C, and air is blown into them at a rate of 15 liters / minute. After 118 hours of fermentation, after which active growth is practically stopped, by] - 'depletion of nitrogen' contained in the
<Desc / Clms Page number 4>
media, glucose monohydrate in aseptic form is added in portions of 15 g, to maintain the sugar concentration of the media above 2-la by weight per volume.
The table below gives the total amount of sugar consumed by the protein and the concentration of gibberellic acid in both media as the culture progresses.
EMI4.1
<tb>
Gibberellious <SEP> <SEP> mg / 1 <SEP> Sugar <SEP> used <SEP> g / 1
<tb>
<tb>
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<tb> Duration <SEP> (hours <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> 'Fermenta- *
<tb>
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<tb> after <SEP> 1-lino- <SEP> tor <SEP> A <SEP> tor <SEP> B <SEP> tor <SEP> A <SEP> their <SEP> B
<tb>
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<tb> culation)
<tb>
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<tb> 48 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP>
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<tb>
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<tb> 119 <SEP> 98 <SEP> 56
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<tb> 124 <SEP> 106 <SEP> 56
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<tb> 148 <SEP> 135 <SEP> 69
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<tb> 166 <SEP> 48 <SEP> 153 <SEP> 78
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The medium used in fermenter A is practically balanced with regard to carbon and nitrogen,
that is, it contains these two nutrients in the approximate proportions in
<Desc / Clms Page number 5>
which they are absorbed by the body during its active growth. Consequently, the carbon would be depleted-substantially at the same time as the nitrogen, and in the absence of additions of nutrients, the quantity of gibberellic acid cannot be expected produced thereafter, exceeds 120 ml / liter.
However, the table shows that if additions of a carbon source, glucose monohydrate, after cessation of active growth are made, the production of gibberellic acid can be maintained at least until its concentration is reduced. increases to 324 mg / liter.
In the case of fermenter B, the medium initially contains an excess of carbon which remains available when the nitrogen contained is exhausted, and normal production of gibberellic diacid can be expected to reach up to 240 mg / liter. .
However, the additions of sugar aim to conserve available carbon., A. Result in an acid concentration of up to 409 mg / liter.
The medium used during the active growth stage of the moiety is a so-called balanced medium, in which the nitrogen concentration can be in the range of 0.017 to 0.26% w / v, for example in the form of 0.05 to 0.75% w / v ammonium nitrate and preferably in the range 0.07 to 017% w / v nitrogen, e.g. scias form 0.2 to 0.5 % w / v ammonium nitrate.
The carbon concentration is then chosen, for example under,. form of sucrose, glucose or glycerin, so as to provide a medium in which the supply of carbon to nitrogen is preferably between the values of 10: 1 and 25: 1. A typical balanced medium, suitable for active growth, may for example contain 0.24% w / v ammonium nitrate and 3.18% w / v glycose monohydrate, i.e. have a C: N ratio of 14: 1 or it may contain 0.48% w / v ammonium nitrate and 10% w / v glucose
<Desc / Clms Page number 6>
monohydrate, i.e. having a C: N ratio of 21: 5.
When active growth is practically stopped by nitrogen depletion in a balanced medium, little or no excess carbon remains in the medium, and thus little or no carbon is present in the medium. from which mold can produce gibberellic acid. It is at this stage that an additional source of carbon is added to the medium in order to support the production of gibberellic acid.
The amount of carbon source added in the middle to the end of the active growth stage is controlled in order to avoid inhibition of mold for the production of gibberellic acid. A large excess of carbon source is disadvantageous at the acid production stage, and a reasonable excess may for example exist in the form of 0.1 to 10% w / v glucose, and more particularly as forms from 1 to 4% w / v glucose.
The process of the invention can be applied in combination with a multi-stage process for the production of acid, gibberelliqüe, as described in the patent of the same date of the
Applicant entitled "Improvements aside to metabolic processes".
Thus, the cultivation of the active strain of Cibberela fujikuroi can be carried out in two or more stages, the first stage of which is a stage of active growth of the mold in an approximately balanced medium, i.e. in which the C: N ratio is between 10: 1 25: 1 the second stage being a stage around which active growth continues in a medium having a high C: N ratio, for example between about 30: 1 about 55:
1, and active growth is stopped by depletion of nitrogen, retaining an excess of the carbon source, and the third stage being a stage in which additional amounts of the carbon source are introduced into the medium, in maintaining an approximately constant concentration of the carbon source in the medium, until ceased
<Desc / Clms Page number 7>
production of gibberellic acid.
Thus, for example, the first stage can be carried out in a medium which contains 3.18% w / v glucose monohydrate and 0.24% w / v nitratedammonium, i.e. having a ratio C: N of about 14: 1, and the second stage can then be carried out in a non-equilibrium medium having a higher C: N ratio, for example a medium which contains respectively 16% w / v or 10%. w / v glucose monohydrate and 0.4% w / v ummonium nitrate, i.e. having a C: N ratio of 41: 1 or 26: 1 respectively. Mold growth continues until the nitrogen source is completely depleted then an excess of the carbon source remains and gibberellic acid production begins.
During this gibberellic resolves production, the excess carbon source is continuously depleted, and when this source reaches a concentration of about 0.5 to 10% w / v of the medium, one begins to add new amounts of a carbon source, which may or may not be the same as that used in the previous steps, in order to maintain a constant carbon concentration in the medium and thus maintain the continued production of acid Gibberellic with yields that have not yet been achieved.
The preferred source of carbon is a sugar, for example sucrose or glucose, and the preferred constant concentration of this sugar during continuous production of gibberellic acid is in the range of from about 1% to about 4% by weight. medium weight / volume. The preferred constant concentration can be achieved by adding quantities of sugar to the medium at intervals during the final stage of gibberellic acid production, for example at 12 to 24 hour intervals. In this way, a culture medium is obtained which contains up to about 1,000 mg of gibberellic acid per liter of medium, and this acid can be separated from the medium by known means.
<Desc / Clms Page number 8>
The invention is further illustrated by the following examples: EXAMPLE 1
EMI8.1
Prenaration of the inoculum.
5 liters of a nutrient mixture containing 8% w / v glucose monohydrate, 0.4% ammonium nitrate (w / v), 0.5% w / v monopotassium phosphate, 0 are inoculated. , 1% w / v magnesium sulfate heptahydrate, and 0.2% w / v of a minor element concentrate, the composition of which is described above, at a pH of 3.47 at using a culture
EMI8.2
on Gibberella fujikuroi agar. Keep the medium at bzz and stir and aerate at 2.5 liters of air per minute.
Production fermentation.
After 80 hours, 5 liters of the above culture are inoculated into a 100-liter fermenter, containing a nutrition medium prepared as follows:
EMI8.3
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> 8% <SEP> in <SEP> weight / volume
<tb>
EMI8.4
Nitratedëmmonium bzz "
EMI8.5
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<tb> Concentrate <SEP> of minor <SEP> element <SEP> 0.2% <SEP> in <SEP> volume / volume
<tb>
Water to perfect to 75 liters.
The composition of the concentrate of minor elements is that given above. The medium is sterilized, then cooled and linoculated with 5 liters of the inoculum described above. The medium is stirred, maintained at a temperature of 26 ° C., and aerated with an air stream of 0.5 volume of air per volume of culture medium and per minute.
When the active growth of mold has ceased i.e. when the nitrogen source is completely exhausted, the production of gibberellic acid begins, and the concentration of the remaining carbon source (glucose) decreases rapidly. 39 hours after the onset of gibber acid formation
<Desc / Clms Page number 9>
rellic during the acid production stage, the glucose concentration is approximately 0.9% w / v and additional amounts of sugar are then added to the nutrient medium of 12 in 12 hours, in order to maintain a concentration of about 2% glucose in weight / volume in the nutrient medium, during the remainder of the stage of diacid formation during fermentation. The following table gives the concentration of gibberellic acid in the medium.
depending on glucose consumption, as fermentation progresses.
EMI9.1
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Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Sugar <SEP> consumed
<tb> inoculation) <SEP> g / liter <SEP>% <SEP> weight / volume
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<tb> 359 <SEP> 618 <SEP> 17.1
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The contents of the fermenters are then filtered, and a 58 liter sample of the filtrate is extracted with ethyl acetate to separate the gibberellic acid, which is then obtained by known means. In this way 33.48 g of gibberellic acid is obtained in the form of a colorless crystalline powder which melts at 233-235 ° C. while decomposing.
A second portion of gibberellic acid can be obtained from the crystallization filtrate.
EXAMPLE 2
The process described in Example 1 is repeated, except that the 8% w / v glucose monohydrate and 0.24% w / v ammonium nitrate are replaced in the nutrient medium used in step for production of gibberellic acid from fermentation, by 20% w / v glucose monohydrate and 0.4% w / v ammonium nitrate.
At the stage of gibberellic acid production, the excess glucose existing
<Desc / Clms Page number 10>
in the nutrient medium is rapidly consumed, and additional amounts of glucose monohydrate are added at 12 hour intervals, after about 74 hours, to maintain a concentration of about 4% w / v glucose in the nutrient medium during the remainder of the gibberellic acid production stage of fermentation. The table below gives the concentration of gibberellic acid in the medium as a function of the glucose consumed, as the fermentation progresses.
EMI10.1
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Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Sugar <SEP> used
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4
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<Desc / Clms Page number 11>
EXAMPLE
The process described in Example 1 is repeated except that the 8% w / v glucose monohydrate and 0.24% w / v ammonium nitrate are replaced in the nutrient medium used in the productive fermentation. , by 20% w / v
EMI11.1
<t glucose monohydrate and 0% w / v nitrate .d'rmmon.im During the stage of production of gibberellic acid, the excess of glucose existing in the nutrient medium is rapidly depleted and 12 in 12 hours of additional amounts of glucose monohydrate after about 26 hours,
- in order to maintain a concentration of approximately 10% by weight / volume of glucose throughout the remainder of the stage of production of 1,1 gibberellic acid of the fermentation The table below gives the concentration of gibberellic acid in: medium, depending on the glucose consumed as fermentation progresses.
EMI11.2
.Age (hours after -Gi'biberiic acid Sugar consumes 1 -9 ino c., TLia-t mg ± y ± re 'Lep-: Q01d: YIQ
EMI11.3
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6
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<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> harsh <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Sugar <SEP> consumed
<tb>
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<tb> the inoculation) <SEP> mg / liter <SEP>% <SEP> in <SEP> weight / volume
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.
EXAMPLE 4
The process described in Example 1 is repeated, except that the 8% w / v glucose monohydrate and 0.24% w / v ammonium nitrate are replaced by 16.0% w / v. lume of glucos, e monohydrate and 0.4% w / v ammonium nitrate. During the gibberellic acid production stage of fermentation, excess glucose present in the nutrient medium is depleted - and additional amounts of glucose monohydrate are added after 162 hours and then at 12 to 24 hour intervals, in order to maintain a concentration of about 1 to 3% w / v glucose in the nutrient medium throughout the remainder of the acid production stage of the fermentation.
The table below gives the concentration of gibberellic acid in the medium as a function of the concentration of glucose as the fermentation progresses.
EMI12.2
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Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in <SEP> sugar
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<Desc / Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in <SEP> sugar
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<tb> inoculation) <SEP> mg / liter <SEP>% ¯en <SEP> weight / volume
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Gibberellic acid is separated by known means, by filtering the fermentation mixture and passing the filtrate (63 liters) through carbon. The gibberellic acid absorbed is separated by elutriation, then it is obtained and purified by crystallization. 63.0 g of glbberellic acid are thus obtained,
<Desc / Clms Page number 14>
as a colorless crystalline product, which melts at 233-235 C, decomposing.
EXAMPLE
The process described in Example 1 is repeated except that the 8% w / v glucose monohydrate and 0.24% w / v ammonium nitrate are replaced by 20% w / v glucose. monohydrate and 0.4% w / v ammonium nitrate. During the gibberellic acid production stage of fermentation, the excess glucose existing in the nutrient medium is depleted and additional amounts of glucose monohydrate are added after 154 hours and then, from 12 to 12 hours,. to maintain a concentration of about 1 to 4% w / v glucose in the nutrient medium throughout the remainder of the acid production stage of the fermentation.
The table below gives the concentration of gibberellic acid in the medium as a function of the concentration of glucose as the fermentation progresses.
EMI14.1
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Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in <SEP> sucr <
<tb> inoculation .. <SEP> mg / liter <SEP>% <SEP> in <SEP> weight / volume
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<tb> 106 <SEP> 46 <SEP> 8.73
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<tb> 118 <SEP> 79 <SEP> 6.86
<tb>
<tb> 130 <SEP> 133 <SEP> 5.76
<tb>
<tb> 142 <SEP> 138 <SEP> 4.6
<tb>
<tb> 154 <SEP> 229 <SEP> 3.84
<tb>
<tb> 166 <SEP> 245 <SEP> 4.23
<tb>
<tb> 178 <SEP> ..
<SEP> 291 <SEP> 4.07
<tb>
<tb> 19 <SEP> 305 <SEP> 4.09
<tb>
<Desc / Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in <SEP> sweat '
<tb> 1 / <SEP> inoculation <SEP> mg.litre <SEP>% <SEP> in <SEP> weight / volume
<tb>
<tb> 202 <SEP> - <SEP> 4.06
<tb>
<tb> 214 <SEP> 4.14
<tb>
<tb> 226 <SEP> - <SEP> 4.09
<tb>
<tb> 238 <SEP> 350 <SEP> 3.82
<tb>
<tb> 250 <SEP> 427 <SEP> 3.86
<tb>
<tb> 262 <SEP> 427 <SEP> 3.68
<tb>
<tb> 274 <SEP> 452 <SEP> 3,4
<tb>
<tb> 286 <SEP> 486 <SEP> 3.31
<tb>
<tb> 298 <SEP> 519 <SEP>.
<SEP> 3.13
<tb>
<tb> 310 <SEP> 558 <SEP> 3.05
<tb>
<tb> 322 <SEP> 591 <SEP> 2.79
<tb>
<tb> 335 <SEP> 634 <SEP> 2.46
<tb>
<tb> 347 <SEP> 623 <SEP> 2.54
<tb>
<tb> 358 <SEP> 623 <SEP> 2.07
<tb>
<tb> 370 <SEP> 645 <SEP> 1.88
<tb>
<tb> 382 <SEP> 639 <SEP> 3.3
<tb>
<tb> 394 <SEP> 660 <SEP> 1.5
<tb>
<tb> 406 <SEP> 669 <SEP> 1.35
<tb>
<tb> 418 <SEP> 669 <SEP> 0.21
<tb>
<tb> 430 <SEP> 669 <SEP> 1.12
<tb>
<tb> 442 <SEP> 669 <SEP> 0.84
<tb>
<tb> 466 <SEP>.
<SEP> 940 <SEP> 0.8
<tb>
<tb> 490 <SEP> 792 <SEP> 0.13
<tb>
<tb> 514 <SEP> 825 <SEP> -
<tb>
<tb> 538
<tb>
<tb> 562 <SEP> 809
<tb>
<tb> 586 <SEP> 812 <SEP> -
<tb>
<Desc / Clms Page number 16>
EXAMPLE 6
The process of Example 1 is repeated, except that the 8% w / v glucose monohydrate and the 0.24% w / v ammonium nitrate are replaced by 10% w / v glucose monohydrate. and 0.4% w / v ammonium nitrate.
During the gibberellic acid production stage of fermentation, excess glucose existing in the nutrient medium is removed and additional amounts of glucose monohydrate are added after 60.5 hours, and then at 12-24 hour intervals. hours, to maintain a concentration of about 2-4% glucose in the nutrient medium throughout the remainder of the acid production stage of the fermentation. The table below gives the concentration of gibberellic acid in the medium, as a function of the glucose concentration as the fermentation progresses.
EMI16.1
<tb>
Age <SEP> (hours <SEP> -after <SEP> .Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in <SEP> sugar
<tb>
EMI16.2
inoculation --- mg / liter ¯¯¯¯% w / v
EMI16.3
<tb> 16 <SEP> 10.58
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40 <SEP> 8.39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 46 <SEP> 6.9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 52 <SEP> 5 <SEP> 5.44
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 60 <SEP> 14 <SEP> 3.58
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 64 <SEP> 29 <SEP> 4.87
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 69 <SEP> 65 <SEP>. <SEP> 3.67 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75 <SEP> 93 <SEP> 2.86
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 88 <SEP> 128 <SEP> 3.69
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 93 <SEP> 154 <SEP> 2.83
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 100 <SEP> 174 <SEP> 2.49
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 111 <SEP> 195 <SEP> 2.54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 124 <SEP>.
<SEP> 225 <SEP> z, <SEP> 54 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 136 <SEP> 276 <SEP> 2.54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 148 <SEP> 293 <SEP> 2.76
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 160 <SEP> ,, <SEP> 323 <SEP> 2.95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 184 <SEP> 406 <SEP> 3.18
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 208 <SEP> 491 <SEP> 3.77
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 232 <SEP> 500 <SEP> 4.52
<tb>
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb> Age <SEP> (hours <SEP> after <SEP> Gibberellic acid <SEP> <SEP> Concentration <SEP> in.
<SEP> sugar <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> inoculation <SEP> mg / liter <SEP>% <SEP> 'Weight / volume
<tb>
<tb>
<tb> 256 <SEP> 569 <SEP> 4.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 280 <SEP> 590 <SEP> 4.04
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 304 <SEP> - <SEP> 3.96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 328 <SEP> 698 <SEP> 2.79
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 352 <SEP> 762 <SEP> 2.84
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 376 <SEP> 825 <SEP> 2.41
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 400 <SEP> 901 <SEP> 2.16
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 424 <SEP> - <SEP> 0.84
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 448 <SEP> 973 <SEP> '<SEP> 0.33 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 472 <SEP> 1002 <SEP> 0.22
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 496 <SEP> 989 <SEP> 0.26
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 520 <SEP> - <SEP> 0.21
<tb>
Gibberellic acid is separated by known means by filtration of the fermentation medium and passage of the filtrate (60 liters)
The adsorbed gibberellic acid is separated by elutriation through carbon, then recovered and purified by crystallization. 63.6 g of gibberellic acid are thus obtained in the form of a colorless crystalline solid, which melts at 233-235 C, on decomposition.
CLAIMS
EMI17.2
--------------------------- l.- Metabolic process for the production of gibberellic acid by culturing an active strain of Gibberella funjikuroi and stopping active growth to promote the production of gibberellic acid, characterized in that the amount of carbon available during the gibberellic acid production stage is maintained by adding a carbon source to the medium.