La pressente invention se rapporte à la préparation par biosynthèse du pigment jaune appelé zéaxanthine ou 3,3'-dihydroxy-ss carotène par culture d'un microorganisme producteur de cette substance.
Elle concerne un procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment selon la revendication du brevet principal, caractérisé par le fait que ce microorganisme est la bactérie Flavobac teriunt aquatile ATCC N 11947 ou un mutant de cette bactérie.
Selon une forme d'exécution particuliere du procédé suivant l'inventiom on prépare une culture du microorganisme Flavobac- rerizml aquatile ATCC N" 11947, que l'on inocule ensuite à un milieu nutritif placé dans un fermenteur et contenant, à titre de sources principales de carbone et d'azote assimilables par le microorganisme. au moins un hydrate de carbone et au moins une substance contenant des acides aminés libres. On entretient la croissance de la bactérie dans le fermenteur en assurant une oxygénation suffisante du milieu de culture ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30 C, et d'un pH appro pne.
Lorsque les cellules bactériennes sont parvenues à un stade de croissance suffisant, de préférence lorsque la culture est dans la phase de croissance exponentielle, et quand les cellules ont atteint un stade de production de zéaxanthine, stade aisément décelable grâce à la coloration jaune de ce pigment, on poursuit la culture de ces cellules à une température comprise entre 22 et 25' C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg:
: ml, ainsi qu'une source d'azote amine assimilable contenant des acides aminés libres, en maintenant par addition progressive de ces deux substances dans le milieu de fermentation un rapport sensiblement constant entre leurs quantités respectives.
L'hydrate de carbone, constituant la source de carbone princi- pale assimilable par le microorganisme, peut être choisi parmi des substances telles que le glucose, le lactose ou le sucrose. Cette source principale de carbone assimilable peut également être constituée par un mélange de ces substances.
Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition de la source principale d'azote aminé, on peut citer par exemple la liqueur de trempage de maïs, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines, de soja ou d'arachide, et/ou l'hydrolysat de caséine ap pelte tryptone .
Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse récuperee à titre de sous-produit de la biosynthese d'un pigment caroténoide par culture d'une bactérie du genre Fla-
vohacler en particulier par hydrolyse d'une biomasse de Flavobac er cultivée pour préparer de la zéaxanthine et dont on a extrait le pigment.
On poursuit ensuite la culture dans ces conditions pendant un temps suffisant. pour obtenir dans le'milieu de culture une quantité substantielle de zéaxanthine, ce pigment étant présent dans les cellules. On peut également, à la fin de cette période, interrompre l'addition progressive des sources de carbone et d'azote et laisser la composition du milieu de culture en fonction de la consommation des substances nutritives par le microorganisme.
Les résultats expérimentaux ont montré que, lorsque la culture du microorganisme est effectuée selon ce procédé, la production de zéaxanthine est notablement supérieure a celle d'une culture de ce microorganisme effectuée dans les conditions pratiquées habituellement.
On peut ensuite, éventuellement après concentration du bouillon de culture, extraire la zéaxanthine des cellules à l'aide d'un solvant organique polaire tel que l'acétone, I'alcool éthylique ou
un solvant chloré comme le chloroforme.
Selon une variante on peut séparer la biomasse du milieu de culture, par exemple par centrifugation, décantation ou filtration.
La biomasse peut être utilisée telle quelle, par exemple Åa titre d'additif dans l'alimentation des poules, ou faire l'objet d'un traitement d'extraction à l'aide d'un solvant organique polaire.
Selon un mode d'exécution du procédé particulièrement avantageux, on prépare une culture de la bactérie Flavohacterium aqua- tille ATCC N 11947 que l'on inocule à un milieu nutritif aqueux placé dans un fermenteur et contenant une source principale de carbone constituée par un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone. de préférence à raison de 6 à 8% en poids, ainsi qu'une source principale d'azote amine assimilable.
On entretient la croissance du microorganisme en assurant une oxygénation suffisante du milieu. ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30 C et d'un pH approprié, compris entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5.
Lorsque la concentration du milieu en hydrate de carbone atteint, par valeurs décroissantes, une valeur comprise entre 15 et 35 mgíml. on ajuste la température du milieu entre 22 et 25 C et on introduit dans le fermenteur, de façon progressive, c'est-à-dire soit par une alimentation continue, soit par quantités successives, au moins un hydrate de carbone et au moins une source de carbone assimilables. On peut introduire ces substances dans le fermenteur soit séparément, soit mélangées pour constituer un substrat nutritif. Cette addition est effectuée à un débit tel que la teneur du milieu de culture en hydrate de carbone reste comprise entre 15 et 35 mg/ml et que les quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé soient dans un rapport constant.
A cet effet on introduit de préférence dans le f,enmenteur un substrat contenant ces substances, selon le débit voulu pour maintenir la teneur du milieu en hydrate de carbone entre 15 et 35 mgi'ml, la composition chimique du substrat étant telle que les quantités pondérales respectives d'hydrate de carbone et de substance aminée assimilables qu'il contient soient dans un rapport constant, de préférence compris entre 1,6 et 3,4.
Pendant cette fermentation. Ie pH du milieu de culture est ajusté entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5. L'ajustement du pH peut être effectué à l'aide de solutions alcalines telles que des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium ou d'ammoniaque ou à l'aide d'un courant d'ammoniac. On utilise de préférence ces deux dernières substances car elles constituent également des sources d'azote aminé assimilables par le microorganisme.
On poursuit ensuite cette culture pendant un temps suffisant pour obtenir dans le milieu une quantité substantielle de zéaxanthine. On peut également continuer la culture après arrêt des additions progressives de substances nutritives et laisser la composition du milieu évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le microorganisme.
Des résultats particulièrement intéressants ont été obtenus en cultivant, comme décrit précédemment, des cellules mutantes préparées par action de la l-méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, ci après dénommée NTG, sur la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N 11947 selon un procédé de mutation original remarquable par le fait que l'on fait agir la NTG sur la bactérie au sein d'un milieu solidifié.
Selon une forme d'exécution particulière de ce procédé de mutation. on prépare une culture de la bactérie, que l'on dilue dans une solution physiologique stérile. La solution obtenue est ensuite mélangée dans une boîte de Petri avec une solution aqueuse de NTG dans les proportions convenables, par exemple avec un volume équivalent d'une solution aqueuse de NTG contenant I à 10 mg de cette substance par ml. On verse ensuite sur la solution obtenue de L'aga fondu que l'on mélange soigneusement à la solution. Lorsque L'aga est solidifié on maintient le milieu solide obtenu à une température d'incubation convenable, par exemple entre 25 et 28 - C jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié.
Les colonies sont ensuite prélevées et repiquées plusieurs fois de suite sur des supports solides nutritifs.
Le microorganisme mutant obtenu peut ensuite faire l'objet d'un ou de plusieurs autres traitements de mutation ultérieurs en milieu solidifé.
Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant toutefois pas limitée aux conditions qui y sont décrites.
Dans ces exemples, les compositions des milieux nutritifs sont exprimées en pourcentages pondéraux.
Exemple I
On prépare une culture de la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N" 11947 que l'on inocule à raison de 5% en volume à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce mélange nutritif, préalablement stérilisé à 120 C C pendant 40 minutes et re- froidi à 28" C, et dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, présente la composition suivante:
:
glucose (stérilisé séparément
en solution concentrée) 7,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,6 %
hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
extrait de levure 1,8 %
sulfate de magnésium 0,5 Ó
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
Le microorganisme est cultivé dans le fermenteur à 28' C, sous aération et agitation énergiques, avec ajustement continu du pH du milieu entre 7,2 et 7,3 par addition automatique d'une solution aqueuse diluée d'ammoniaque.
La culture exécutée dans ces conditions présente une phase de latence de 6 à 7 heures, et la production de zéaxanthine commence aprés 14 heures de culture.
Lorsque la teneur en glucose du milieu de fermentation atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 24 heures aprés le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et on introduit de façon progressive dans le fermenteur, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé dans un réservoir séparé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
glucose 32 %
liqueur de trempage de mais 4,7%
hydrolysat de caséine (tryptone) 4,3%
extrait de levure 5,5%
eau du robinet balance à 100%
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 24 C.
Après une durée totale de culture de 50 heures, on mesure la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine par chromatographie en couche mince et par spectroscopie dans l'ultraviolet.
La teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine ainsi mesurée est de 16 ,ug/ml.
A titre de comparaison la bactérie est cultivée selon un procédé traditionnel. A cet effet elle est inoculée, à raison de 5% en volume, à une même quantité d'un milieu nutritif préalablement stérilisé et refroidi à 28" C, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1, et dont la composition est la suivante:
glucose 10,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,85%
hydrolysat de caséine (tryptone) 1,25%
extrait de levure 2,1 %
sulfate de magnésium 0,5 %
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
La culture est exécutée sous agitation et aération énergiques, avec ajustement continu du pH entre 7,2 et 7,3. La phase de latence observée est de 8 heures et la production de zéaxanthine commence après 15 heures de culture.
On ajuste la température du milieu à 24 C après 24 heures de culture. 55 heures après le début de la culture, la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine, déterminée comme décrit précédemment, est de 4 zg/ml.
Exemple 2
On prépare une culture de la bactérie Flavobacterium aquatile
ATCC N" 11947 dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est
ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
glucose 3,0%
extrait de levure 1,0%
hydrolysat de caséine (tryptone) 1,0%
sulfate de magnésium 0,5%
eau du robinet balance à 100%
Cette culture, qui contient S g de cellules du microorganisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:108 (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9% en poids de chlorure de sodium.
On mélange ensuite soigneusement I ml de cette solution avec 1 ml d'une solution aqueuse de NTG contenant S mg/ml de cette substance, dans une boîte de Petri. On ajoute ensuite 10 ml d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et l'on mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Petri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 28" C, jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié, c'est-àdire pendant 2 à 4 jours. On sépare ensuite les colonies de la boîte de Petri puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de NTG, en plusieurs opérations successives.
La souche mutante obtenue est ensuite inoculée à raison de 5% en volume à 100 ml d'un milieu nutritif stérile dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
glucose 3,0%
extrait de levure 1,0%
hydrolysat de caséine (trytone) 1,0%
sulfate de magnésium 0,5%
eau du robinet balance à 100%
Le microorganisme est cultivé dans ce milieu à 28' C et en conditions aérobies pendant 24 heures, puis cette culture est à nouveau inoculée à 2 litres d'un milieu nutritif de même composition.
Après 24 heures de fermentation dans les mêmes conditions, cette dernière culture est inoculée, à raison de 5% en volume, à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce milieu nutritif, préalablement stérilisé à 120"C pendant 40 minutes et refroidi à 28" C, présente un pH ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, et possède la composition suivante:
:
glucose (stérilisé séparément
en solution concentrée) 7,0 %
liqueur de trempage de maïs 1,6 %
hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 %
extrait de levure 1,8 %
sulfate de magnésium 0,5 %
huile de maïs 0,08%
eau du robinet balance à 100%
Lorsque la teneur en glucose du milieu de culture atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 22 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 24 C et l'on introduit, selon un débit tel que la teneur en glucose du mi lieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
:
glucose 32,0%
liqueur de trempage de maïs 4,7 /0
hydrolysat de caséine (tryptone) 4,30,o
extrait de levure 5,5 < )
eau du robinet balance à 100 /,
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures. la température du milieu étant maintenue à 24-C.
Après une durée totale de culture de 48 heures, la concentration du milieu en glucose a atteint 5 mg/ml, et sa teneur en zéaxanthine, mesurée comme décrit dans l'exemple 1, est de 40 ,ug/ml.
The present invention relates to the preparation by biosynthesis of the yellow pigment called zeaxanthin or 3,3'-dihydroxy-ss carotene by culturing a microorganism producing this substance.
It relates to a process for the manufacture of zeaxanthin by culturing a microorganism of the genus Flavobacter producing this pigment according to the claim of the main patent, characterized in that this microorganism is the bacterium Flavobac teriunt aquatile ATCC N 11947 or a mutant of this bacterium. .
According to a particular embodiment of the process according to the invention, a culture of the microorganism Flavobacrerizml aquatile ATCC N "11947 is prepared, which is then inoculated into a nutrient medium placed in a fermenter and containing, as main sources of carbon and nitrogen assimilable by the microorganism. at least one carbohydrate and at least one substance containing free amino acids. The growth of the bacteria is maintained in the fermenter by ensuring sufficient oxygenation of the culture medium as well as the maintaining an adequate temperature, of the order of 28 to 30 C, and an appro priate pH.
When the bacterial cells have reached a sufficient stage of growth, preferably when the culture is in the exponential growth phase, and when the cells have reached a stage of production of zeaxanthin, a stage easily detectable thanks to the yellow coloration of this pigment , the culture of these cells is continued at a temperature between 22 and 25 ° C., under sufficient oxygenation conditions, and in an aqueous nutrient medium containing at least one carbohydrate in an amount of 15 to 35 mg:
: ml, as well as a source of assimilable amine nitrogen containing free amino acids, while maintaining by gradual addition of these two substances in the fermentation medium a substantially constant ratio between their respective quantities.
The carbohydrate, constituting the main carbon source assimilable by the microorganism, can be chosen from substances such as glucose, lactose or sucrose. This main source of assimilable carbon can also consist of a mixture of these substances.
Among the substances capable of entering into the composition of the main source of amino nitrogen, mention may be made, for example, of corn steep liquor, yeast extracts, protein hydrolysates, in particular products obtained by acid hydrolysis or enzymatic of proteins of vegetable origin such as proteins, soya or peanuts, and / or hydrolyzate of casein suitable for tryptone.
This source of amino nitrogen can also contain a substance prepared by acid or enzymatic hydrolysis of a biomass recovered as a by-product of the biosynthesis of a carotenoid pigment by culturing a bacterium of the genus Fla-
vohacler in particular by hydrolysis of a Flavobac er biomass cultivated to prepare zeaxanthin and from which the pigment has been extracted.
Culture is then continued under these conditions for a sufficient time. to obtain a substantial amount of zeaxanthin in the culture medium, this pigment being present in the cells. It is also possible, at the end of this period, to interrupt the gradual addition of the carbon and nitrogen sources and to leave the composition of the culture medium according to the consumption of nutrients by the microorganism.
The experimental results have shown that, when the culture of the microorganism is carried out according to this method, the production of zeaxanthin is notably higher than that of a culture of this microorganism carried out under the conditions usually practiced.
It is then possible, optionally after concentration of the culture broth, to extract the zeaxanthin from the cells using a polar organic solvent such as acetone, ethyl alcohol or
a chlorinated solvent such as chloroform.
According to one variant, the biomass can be separated from the culture medium, for example by centrifugation, decantation or filtration.
The biomass can be used as it is, for example as an additive in the feed for chickens, or be the subject of an extraction treatment using a polar organic solvent.
According to a particularly advantageous embodiment of the process, a culture of the bacterium Flavohacterium aquatilla ATCC N 11947 is prepared which is inoculated into an aqueous nutrient medium placed in a fermenter and containing a main source of carbon consisting of a hydrate. of carbohydrates or a mixture of carbohydrates. preferably in an amount of 6 to 8% by weight, as well as a main source of assimilable nitrogen amine.
The growth of the microorganism is maintained by ensuring sufficient oxygenation of the medium. as well as maintaining an adequate temperature, of the order of 28 to 30 C and an appropriate pH, between 6.5 and 8.0, preferably between 7.0 and 7.5.
When the concentration of carbohydrate in the medium reaches, by decreasing values, a value between 15 and 35 mgíml. the temperature of the medium is adjusted between 22 and 25 ° C. and one introduces into the fermenter, gradually, that is to say either by a continuous supply or by successive quantities, at least one carbohydrate and at least one source of assimilable carbon. These substances can be introduced into the fermenter either separately or mixed together to form a nutrient substrate. This addition is carried out at a rate such that the carbohydrate content of the culture medium remains between 15 and 35 mg / ml and that the respective amounts of carbohydrate and of amino nitrogen source are in a constant ratio. .
For this purpose, a substrate containing these substances is preferably introduced into the f, enmentor, at the rate desired to maintain the carbohydrate content of the medium between 15 and 35 mg / ml, the chemical composition of the substrate being such that the quantities respective weight of carbohydrate and assimilable amino substance that it contains are in a constant ratio, preferably between 1.6 and 3.4.
During this fermentation. The pH of the culture medium is adjusted between 6.5 and 8.0, preferably between 7.0 and 7.5. Adjustment of the pH can be carried out using alkaline solutions such as aqueous sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia solutions or using a stream of ammonia. The latter two substances are preferably used because they also constitute sources of amino nitrogen which can be assimilated by the microorganism.
This culture is then continued for a time sufficient to obtain a substantial amount of zeaxanthin in the medium. It is also possible to continue the culture after stopping the progressive additions of nutrients and allow the composition of the medium to evolve according to the consumption of the nutrients by the microorganism.
Particularly interesting results were obtained by cultivating, as described above, mutant cells prepared by the action of l-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, hereinafter referred to as NTG, on the bacterium Flavobacterium aquatile.
ATCC N 11947 according to an original mutation process remarkable in that the NTG is made to act on the bacteria in a solidified medium.
According to a particular embodiment of this mutation process. a culture of the bacteria is prepared, which is diluted in sterile physiological solution. The solution obtained is then mixed in a Petri dish with an aqueous solution of NTG in the suitable proportions, for example with an equivalent volume of an aqueous solution of NTG containing 1 to 10 mg of this substance per ml. Then poured onto the resulting solution of molten aga which is carefully mixed with the solution. When the aga is solidified, the solid medium obtained is maintained at a suitable incubation temperature, for example between 25 and 28 -C until the appearance of colonies in the solidified medium.
The colonies are then picked and subcultured several times in a row on solid nutritive supports.
The mutant microorganism obtained can then be the subject of one or more other subsequent mutation treatments in a solidified medium.
The following examples illustrate the implementation of the method according to the invention, the latter not however being limited to the conditions which are described therein.
In these examples, the compositions of the nutrient media are expressed in percentages by weight.
Example I
A culture of the bacterium Flavobacterium aquatile is prepared
ATCC No. 11947 which is inoculated at a rate of 5% by volume into an aqueous nutrient medium contained in a fermenter. This nutrient mixture, previously sterilized at 120 ° C. for 40 minutes and cooled to 28 ° C., and whose pH is adjusted between 6.9 and 7.1 using ammonia, has the following composition:
:
glucose (sterilized separately
in concentrated solution) 7.0%
corn steep liquor 1.6%
casein hydrolyzate (tryptone) 0.8%
yeast extract 1.8%
magnesium sulfate 0.5 Ó
corn oil 0.08%
100% balance tap water
The microorganism is cultivated in the fermenter at 28 ° C., under vigorous aeration and stirring, with continuous adjustment of the pH of the medium between 7.2 and 7.3 by automatic addition of a dilute aqueous solution of ammonia.
Culture carried out under these conditions exhibits a lag phase of 6 to 7 hours, and the production of zeaxanthin begins after 14 hours of culture.
When the glucose content of the fermentation medium reaches, by decreasing values, 25 mg / ml, that is to say 24 hours after the start of the culture, the temperature of the medium is adjusted to 240 ° C. and the mixture is introduced so progressive in the fermenter, according to a flow rate such that the glucose content of the medium remains substantially constant, a nutrient substrate previously sterilized in a separate tank, the pH of which is adjusted to 7.2 and the composition of which is as follows:
glucose 32%
corn steep liquor 4.7%
casein hydrolyzate (tryptone) 4.3%
yeast extract 5.5%
100% balance tap water
This gradual addition is continued for 20 hours, the temperature of the medium being maintained at 24 ° C.
After a total culture period of 50 hours, the zeaxanthin content of the fermentation medium is measured by thin layer chromatography and by ultraviolet spectroscopy.
The zeaxanthin content of the fermentation medium thus measured is 16 .mu.g / ml.
By way of comparison, the bacterium is cultivated according to a traditional method. For this purpose it is inoculated, at a rate of 5% by volume, with the same quantity of a nutrient medium previously sterilized and cooled to 28 "C, the pH of which is adjusted between 6.9 and 7.1, and whose composition is as follows:
glucose 10.0%
corn steep liquor 1.85%
casein hydrolyzate (tryptone) 1.25%
yeast extract 2.1%
magnesium sulfate 0.5%
corn oil 0.08%
100% balance tap water
The culture is carried out with vigorous stirring and aeration, with continuous adjustment of the pH between 7.2 and 7.3. The latency phase observed is 8 hours and the production of zeaxanthin begins after 15 hours of culture.
The temperature of the medium is adjusted to 24 ° C. after 24 hours of culture. 55 hours after the start of the culture, the zeaxanthin content of the fermentation medium, determined as described above, is 4 μg / ml.
Example 2
A culture of the bacterium Flavobacterium aquatile is prepared
ATCC N "11947 in an aqueous nutrient medium with a pH of
adjusted to 6.5 and whose composition is as follows:
glucose 3.0%
yeast extract 1.0%
casein hydrolyzate (tryptone) 1.0%
magnesium sulfate 0.5%
100% balance tap water
This culture, which contains S g of cells of the microorganism per liter of nutrient medium, is then diluted in the ratio 1: 108 (by volume) by a series of successive operations in a sterile physiological solution containing 0.9% by weight of sodium chloride.
I ml of this solution is then mixed carefully with 1 ml of an aqueous solution of NTG containing 5 mg / ml of this substance, in a Petri dish. Then 10 ml of molten agar is added to the solution thus prepared and the agar and the solution are completely mixed. When the agar is solidified, the Petri dish is incubated at a temperature of the order of 25 to 28 "C, until the appearance of colonies in the solidified medium, that is to say for 2 to 4 days. The colonies are then separated from the Petri dish and then spread on nutrient agar supports in the absence of NTG, in several successive operations.
The mutant strain obtained is then inoculated at a rate of 5% by volume into 100 ml of a sterile nutrient medium whose pH is adjusted to 6.5 and whose composition is as follows:
glucose 3.0%
yeast extract 1.0%
casein hydrolyzate (trytone) 1.0%
magnesium sulfate 0.5%
100% balance tap water
The microorganism is cultivated in this medium at 28 ° C. and under aerobic conditions for 24 hours, then this culture is again inoculated with 2 liters of a nutrient medium of the same composition.
After 24 hours of fermentation under the same conditions, the latter culture is inoculated, at a rate of 5% by volume, into an aqueous nutrient medium contained in a fermenter. This nutrient medium, previously sterilized at 120 "C for 40 minutes and cooled to 28" C, has a pH adjusted between 6.9 and 7.1 using ammonia, and has the following composition:
:
glucose (sterilized separately
in concentrated solution) 7.0%
corn steep liquor 1.6%
casein hydrolyzate (tryptone) 0.8%
yeast extract 1.8%
magnesium sulfate 0.5%
corn oil 0.08%
100% balance tap water
When the glucose content of the culture medium reaches, by decreasing values, 25 mg / ml, that is to say 22 hours after the start of the culture, the temperature of the medium is adjusted to 24 ° C. and one introduces , according to a flow rate such that the glucose content of the medium remains substantially constant, a previously sterilized nutrient substrate, the pH of which is adjusted to 7.2 and the composition of which is as follows:
:
glucose 32.0%
corn steep liquor 4.7 / 0
casein hydrolyzate (tryptone) 4.30, o
yeast extract 5.5 <)
tap water balance at 100 /,
This gradual addition is continued for 20 hours. the temperature of the medium being maintained at 24-C.
After a total culture period of 48 hours, the glucose concentration of the medium has reached 5 mg / ml, and its zeaxanthin content, measured as described in Example 1, is 40 μg / ml.