Procédé de préparation de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine La L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède des pro priétés tout à fait particulières, comme cela ressort de la description qui suit.
Ce composé contient seule ment les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et a la formule brute C6H@NsO'3. Il a un. poids moléculaire de 171 et peut être représenté par la for mule développée
EMI0001.0014
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine est relativement instable à la chaleur et se décompose avant de fondre. La décomposition ne se produit pas à une tempé rature spéciale et, par conséquent, les points de décomposition et de fusion varient entre de larges limites selon la méthode employée pour leur déter mination.
La décomposition commence en général à environ 1450 C et peut continuer jusqu'à ce qu'on atteigne 155,1 C. La L-6-diazo-5-oxo-norleucine se décompose dans les acides aqueux avec libération d'azote. Les courbes de liaison d'hydrogène montrent des valeurs pour peu dans l'eau de 2,1 et 8,95. Le pouvoir rotatoire spécifique [a]D de la Lr6-diazo-5- oxo-norleucine est -I- 210 (à 5,4'% dans l'eau).
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine est très soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organi ques non polaires ordinaires. Elle est seulement très légèrement soluble dans le méthanol absolu, Péthanol absolu ou l'acétone à froid,
mais est soluble dans les solutions aqueuses chaudes de ces solvants. Elle donne la coloration spécifique bleu pourpre dans l'essai à la ninhydrine. L'oxydation par l'acide pério- dique de la L-6-diazo-5-oxo-norleucine donne l'acide L-glutamique.
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine forme des .sels de métaux par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoyloxydes, amidures, etc., de métaux alcalins ou alcalino-terreux.
Dans un tampon de phosphate aqueux, à un pH de 7, les maxima caractéristiques d'absorption dans l'ultraviolet sont pour Ei #m de 683 à une longueur d'onde de 274 millimicrons et de 376 à une .longueur d'onde de 244 millimicrons.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de- la L-6-diazo-5-oxo-norleucine est remarquable. Quand on le détermine par la méthode au disque die bro mure de potassium, le spectre montre des sommets d'absorption aux longueurs d'onde suivantes : 3,19, 3,32, 3,78, 4,6.6,, 6;14, 6,30, 6,59, 6,90, 7,18, 7,39, 7,54, 8,33, 8,66, 8,98, 9,36; 9,71,- 10,08, 10,22, 10,59, 11,65, 12,08, 12,34 et 13,16 microns.
La L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède des pro priétés phytotoxiques bien marquées, et est particu lièrement utile comme herbicide, destructeur de mau vaises herbes et semblables. 5 Elle est également utile du fait qu'elle empêche la biosynthèse, dans les cellules vivantes,, d'acides nu cléiques essentiels et de précurseurs d'acides nucléi ques.
Le produit exerce une action inhibitrice sur le développement de néoplasmes, et pour cette raison est intéressant pour le traitement de maladies néo- plastiques chez l'homme et chez l'animal. La L-6- diazo-5-oxo-norleucine est particulièrement active contre les levures.. Grâce à cette particularité;
elle peut être utilisée pour l'isolement de bactéries, à par tir de populations, microbiennes mixtes dans lesquelles un ou plusieurs des composants est une levure.
Le procédé salon l'invention est caractérisé en ce que l'on inocule avec du Streptomyces C-2943 un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sources convenables de carbone, azote et sels minéraux, on soumet le mélange résul tant à l'incubation dans des conditions d'aérobie à une température entre environ 20 et 35o C,
on enlève les matières solides présentes dans le milieu de cul ture et isole la L-6-diazo-5-oxo-norleucine du liquide de culture aqueux.
Le Streptomyces C-2943 est un microorganisme inconnu jusqu'à présent, qui se trouve dans le sol. Il a été isolé pour la première fois d'un échantillon de terre pris à Chincha, Pérou.
Des cultures de cet or ganisme vivant ont été ajoutées aux collections per manentes du Bureau de Culture de Parke, Davis & Company, Detroit, Michigan, sous le No 04997, et aux collections de cultures du Département de d'Agri- culture des USA, Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch , Peoria, Illinois, USA.
On peut obtenir des cultures de ce microorga nisme en préparant une suspension dans de l'eau sté rile d'un échantillon de terre le contenant, en laissant les particules plus lourdes se déposer, en étendant la suspension surnageante résultant, en dilutions en sé rie, sur des plaques d'agar nutritif, en incubant les plaques à 24-28 C pour obtenir des croissances de microorganismes et en transplantant des croissances individuelles choisies, qui ressemblent au Streptomy ces C-2943 sur des plaques fraîches d'agar nutritif.
Par un sélectionnement répété et une transplantation sans contamination de croissances caractéristiques sur des plaques fraîches d'agar nutritif, on obtient des thalles, constituant dies cultures pures des mioroorga- nismes cherchés.
Le Streptomyces C-2943 est un membre aérobie et formant à l'air des spores, de l'ordre des Actinomy- cetes et appartient au genre Streptomyces tel qu'il est décrit à la sixième édition du Manual of Determi- native Bacteriology de Bergey. Cet organisme a la caractéristique suivante:
quand: il est cultivé sur des milieux glucose-tryptone ou agar nutritif, le myce- lium principal de fond est gris à blanc<B>;</B> sur des mi lieux asparagine-glycérol ou glucose synthétique-agar, ce mycelium est blanc ou légèrement gris à légère ment pourpre ou rouge clair à gris<B>;
</B> sur des milieux Czapek ou de malate de calcium-agar, il est blanc à jaune clair ou gris. Sur ces milieux, le mycelium aé rien est d'abord blanc, puis il passe au gris.
Quand cet organisme est cultivé sur des milieux glucose-tryp- tone ou agas nutritif, une coloration brun foncé ou noire apparaît dans la couche inférieure, mais quand il est cultivé dans des milieux glycérol-asparagine, de Czapek ou malate de calcium-agar, la couleur du milieu reste sensiblement inchangée.
Microscopique- ment, les hyphes aériens sont longs, d'une longueur d'environ 100 à 500 microns. Il se produit dies em branchements primaires et parfois: des secondaires, ainsi que des boucles et spirales terminales. Les spi rales varient de longueur et consistent en 2 à 15 tours.
Les spires sont souvent lâches et irrégulières. Les parties distales de ces hyphes se subdivisent en chaînes de spores.
Cet organisme liquéfie lentement la gélatine, en formant une couleur brun foncé dans le milieu, et ordinairement il ne peptonise pas le lait de tournesol.
En milieu synthétique [Pridham et al., J. Bacterio- logy, 58, 108 (1948)] cet organisme utilise de nom breuses sources de carbone, parmi lesquelles le L-ara- binose, la cellobiose, la dextrine, le glucose, le D-ga- lactose, le glycérol, l'i-.inosite, l'inuline,
le lactose, le lévulose, le maltose, la D-mannite, le D-mannose, le mélibiose, le raffinose, le rhamnose, l'amidon, le sucrose, le tétralose et le D-xylose ;
il utilise moins facilementl'adonite,l'aesculineet la salicine, et pas la dulcite, le melezitose, et la D-sorbite. Cet organisme uti lise les sources organiques et inorganiques. d'azote.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on inocule avec un champignon de l'espèce Streptomyces C-2943 un milieu nutritif aqueux sté rile ayant un pH de 5,0 à 8,5 et contenant des sour ces de carbone et d'azote et des sels minéraux, en ce qu'on soumet le mélange résultant à l'incubation dans des conditions d'aérobiose à une température entre 20 et 35,1 C,
en ce qu'on sépare les matières solides présentes dans le milieu de culture et isole la L-6 diazo-5-oxo-norleucine du liquide die culture aqueux.
Pour l'inoculation, on peut employer des, spores ou eonidies. de Streptomyces C-2943, ainsi que des suspensions aqueuses de ceux-ci contenant une faible quantité de savon ou autre agent mouillant. Pour des fermentations en grand, il est préférable d'utiliser des cultures jeunes et vigoureuses du Streptomyces C-2943, plutôt que des spores ou conidies ou des sus pensions aqueuses de ceux-ci.
Des milieux nutritifs aqueux qui conviennent sont ceux dont le pH est entre 5,0 et 8,5 et qui contien nent des sources de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques. Comme sources de carbone et d'azote, il y a entre autres la farine de tourteau de soya, la poudre de gluten de froment, la levure de brasserie, l'estomac de porc (extrait au sel), les hydrolysats de protéines de viande,
les produits solubles de distilleries et les corps solides de macération de grains. Diverses com binaisons de ces sources de carbone et d'azote avec d'autres matières azotées, telles qu'un mélange de farine de tourteau de soya, de caséine hydrolysée à l'acide et de levures débarrassées des substances amè res, un mélange d'estomac de porc (extrait au sel) et de peptone de soya,
et un mélange de farine de tour teau de soya et de caséine hydrolysée à -l'acide, ont été trouvées aussi propres à donner des résultats par ticulièrement bons. La concentration optimum de ces ingrédients est comprise entre 1,
5 et 2 % du poids total du milieu. La source de carbone peut n'être composée que des substances susmentionnées, mais les meilleurs résultats sont obtenus quand on ajoute au milieu du glucose ou du galactose. La concentra tion en glucose ou galactose peut varier de 0 à 2 %.
Des concentrations supérieures à 2 0/0 paraissent avoir un effet défavorable sur le rendement en le pro duit cherché. Comme sels inorganiques, on peut em ployer le chlorure de sodium, le chlorure d'ammo nium, le nitrate d'ammonium, le chlorure de potas- sium, le carbonate de calcium, etc. Les sels d'ammo nium tels que le chlorure et le nitrate d'ammonium sont des constituants particulièrement avantageux et conduisent à de hauts rendements en le produit cher ché.
La concentration maximum de ces sels. d7ammo- nium est entre 0,1 et 0,5 -% du milieu nutritif.
La culture du Streptomyces C-2943 en milieu nutritif aqueux peut être effectuée de diverses ma nières. Par exemple, le microorganisme peut être cul tivé dans des conditions d'aérobie à la surface d'a milieu, ou i1 peut être cultivé au-dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, à condition que l'on fournisse simultanément de l'oxygène.
Dans la méthode préférée pour produire la Lr6- diazo-5-oxo-norleucine par fermentation sur une large échelle, on emploie des cultures submergées ou en profondeur de Streptomyces C-2943.
Dans cette manière d'effectuer la fermentation, on inocule un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces C-2943 et le soumet à l'incubation avec agitation et aération à une température entre environ 20 et 35 C, de préférence au voisinage de 23-29 C, jusqu'à pro duction d'une concentration maximum de L-6-diazo- 5-oxo-norleucine dans le liquide de culture.
Le temps requis pour cette production maximum de L-6-diazo- 5-oxo-norleucinc varie avec les dimensions et le genre de l'équipement employé. Par exemple, dans les fer mentations industrielles sur une large échelle, telles qu'on les effectue dans les appareils de fermentation du genre à réservoir, la production maximum de L- 6-diazo-5-oxo-norleucine est atteinte en environ 32 heures ou moins.
Quand on emploie des ballons se- coueurs pour la culture, le temps de production maxi mum peut être plus long, soit de trois à huit jours, que celui requis pour les cuves de fermentation sur une grande échelle. Dans les conditions de culture submergée, le microorganisme se développe en parti cules plus ou moins séparées, dispersées dans tout le milieu nutritif,
ce qui contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu dans le procédé de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans le milieu, on peut cultiver en une seule fois de grands volumes du mi lieu nutritif inoculé dans les grands réservoirs ou cuves employés ordinairement dans l'industrie de la fermentation.
Des appareils de fermentation à cuve stationnaire, munis de dispositifs convenables d'agita tion et/ou d'aération, de même que des appareils à tambour horizontal, ont été trouvés particulièrement utilisables sous ce rapport. En revanche, pour la pré paration de faibles quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, le procédé par culture submergée peut être exécuté dans de petits ballons ou vases qui peuvent être -secoués ou agités par des moyens mécaniques. convenables. L'agitation et l'aération de la culture peuvent être réalisées de diverses manières.
L'agitation peut être produite par des turbines, des pales, des propulseurs ou autres dispositifs d'agitation mécaniques., en fai sant tourner ou en secouant le récipient de fermenta- tion lui-même, par divers dispositifs de pompage ou par passage d'air ou autre gaz contenant de l'oxygène à travers le milieu.
L'aération peut être effectuée en injectant de l'air ou autre gaz contenant de l'oxygène dans le mélange en fermentation par des tuyaux ouverts, par des. tuyaux perforés, à l'aide de moyens de diffusion poreux tels que des bougies de charbon, de carborundum, de verre aggloméré, etc. ; elle peut aussi être effectuée par projection ou écoulement de la masse dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Selon la méthode de culture en surface pour la production de L-6-diazo-5-oxo-norleucine, .on inocule une couche peu profonde, en général de moins de 2 cm, d'un milieu nutritif stérile aqueux, avec du Streptomyces C-2943 et soumet le mélange à l'incu bation dans des conditions d'aérobie à une tempéra ture d'environ 20-350 C, de préférence dans le voisi nage de 23-290 C.
Il faut en général un temps d7incu- bation plus long que pour la culture en profondeur pour obtenir la production maximum de L-6-d#iazo-5- oxo-norleucine. En. général, cette période d'incube tion dure environ trois à huit jours.
Lorsque la phase<B>de</B> fermentation est terminée, la matière solide est enlevée du liquide de culture, par exemple par filtratiôn, centrifugation, etc. Le liquide résultant qui contient la L-6-diazo-5-oxo-norleucine possède les propriétés désirées d'inhibition des néo plasmes..
Cependant, pour les résultats optimums, on traite le liquide pour isoler la L-6-diazo-5-oxo-nor- leucine sous forme concentrée ou cristalline. Une méthode qui convient pour isoler le produit consiste à concentrer à un faible volume le liquide de culture clarifié, par exemple jusqu'à 1/5 -1/2o de son volume original,
à ajouter environ 3 à 10 volumes d'un sol vant organique miscible à l'eau, tel que le méthanol ou l'éthanol, à séparer de la solution les impuretés qui ont précipité, à soumettre la solution purifiée à une adsorption et une élution avec un.
adsorbant pour la L,6-diazo-5-oxo-norleucine et à récupérer le produit de l'éluat. Scion une autre méthode qui con vient, on concentre à siccité le liquide de culture cla rifié, on extrait le produit résiduaire avec un solvant organique miscible à l'eau et contenant moins.
de 50 % d'eau, on soumet l'extrait à une adsorption et élution avec un adsorbant pour la L-6-diazo-5-oxo- norleucine et récupère le produit de l'éluat. L'adsorp tion est effectuée en faisant passer la solution diluée ou l'extrait mentionné à travers une colonne d'ad sorption
contenant un adsorbant neutre ayant un pH ou ajusté à un pH d'environ 5 à 8, de préférence 6 à 8. Des exemples d'un tel adsorbant sont l'alumine et l'alumine de Brockmann. Le produit est élué <B>da</B> l'adsorbant avec de l'eau ou une solution aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau.
L'éluat est recueilli en fractions, et les fractions montrant la plus forte absorption dans l'ultraviolet à une longueur d'onde de 275 millimicrons environ, sont séchées. Vu la nature instable du produit aux températures éle vées, il est préférable d'enlever le diluant en con gelant l'éluat et soumettant la masse congelée à un vide élevé. Le produit peut être encore purifié par adsorption et élution en employant du charbon activé.
A ces fins, le produit sec préparé comme décrit ci- dessus, est dissous dans une petite quantité d'eau contenant une faible proportion de solvant organique miscible à l'eau, le pH de la solution est ajusté à 6-7, si nécessaire, et on fait passer la solution à travers une colonne d'adsorption contenant du charbon ac tivé, et produit l'élution de la colonne avec de l'eau. contenant une faible proportion d'un solvant organi que miscible à l'eau, de préférence de l'acétone.
Pour faire la solution pour l'opération d'adsorption, on peut employer de l'eau contenant une faible propor tion d'un solvant organique tel que l'acétone, le méthanol, l'éthanol, le phénol et semblables.
De pré férence, on emploie de l'eau contenant environ 1 0/0 d'acétone, et utilise suffisamment de solvant pour avoir une solution contenant environ 2 à 10 mg de L-6-diazo-5-oxo-norleucine par millilitre. La quan tité de charbon activé nécessaire pour adsorber tout le produit cherché de la solution varie avec la con centration du produit sec en L-6-diazo-5-oxo-norleu- cine. Par exemple un produit donnant à l'essai 5 % de cette substance requiert environ 15 grammes de charbon activé par gramme. On obtient les meilleurs
résultats quand le charbon activé a été préalablement mélangé avec de la terre de diatomées, cette dernière aidant à maintenir une vitesse d'écoulement satisfai sante. Après l'adsorption, la colonne est éluée par lavage avec un éluant convenable tel que de l'eau contenant moins de 25 % d'un solvant organique miscible à l'eau.
Les meilleurs résultats sont obtenus en employant une solution aqueuse d'acétone à 1 u/o. L'éluat est recueilli en fractions et les fractions mon trant la plus forte absorption dans. l'ultraviolet à une longueur d'onde d'environ 275 millimicrons sont séchées à partir de l'état congelé. Si on le désire, le produit sec ainsi obtenu peut encore être traité par recristallisation dans un solvant convenable tel que le méthanol aqueux, l'éthanol aqueux et semblables.
Le produit est identique sous tous les rapports à la substance produite par synthèse chimique. <I>Exemple 1</I> On met 300 ml d'un milieu nutritif de la compo sition suivante
EMI0004.0049
Pour <SEP> cent
<tb> Maltose <SEP> ........................ <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> butanol-acétone <SEP> 0,5
<tb> Caséine <SEP> hydrolysée <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> <B>........</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>..............</B> <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> <B>.....</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 100,0 dans chacun de deux flacons d'Erlenmeyer de 1 litre, et le pH est ajusté à 7,5 avec de l'hydroxyde de so dium 6 N. Le milieu nutritif es stérilisé en chauffant les flacons à 1200 C pendant 25 minutes. On refroi dit le milieu et inocule chacun des deux flacons avec 2 ml d'une suspension, dans 40 ml d'une solution sté rile de savon de Castille à 0,01 /o de spores. de qua tre cultures en pente sur agar (glucose-tryptonessels minéraux) de Streptomyces C-2943.
Les flacons sont maintenus à la température ordinaire (24-26 C) pen dant 90 heures avec agitation produite par des se- coueurs mécaniques qui font tourner les flacons à 160 tours par minute dans un cercle de 6 cm de dia mètre.
Le liquide de culture contient alors approxi mativement 1 mg de L-6-diazo-5-oxo-norleucine, la détermination étant faite par des essais de diffusion sur plaques-disques d'agar, dans lesquels on mesure l'étendue de l'inhibition du développement de la le vure Torulopsis albida N R R L Y 1400. Le liquide de culture est filtré et le produit cherché, la L-6 diazo-5-oxo-norleucine, est isolé du filtrat par les méthodes d'adsorption et élution décrites en détail ci-après.
<I>Exemple 2</I> On place 12 litres d'un milieu ayant la composi tion suivante
EMI0004.0077
Pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>----- <SEP> ....</B> <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> de <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb> Estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> (extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> .
<SEP> <B>....</B> <SEP> 100,0
<tb> Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5 dans un récipient de fermentation en verre de 30 li tres, muni d'accessoires en acier inoxydable compre nant distributeur, propulseur, chicanes et tube de prise d'échantillons et le milieu est stérilisé par chauf fage à 1211, C pendant 2 heures. Le pH du milieu après stérilisation est de 7,8.
On refroidit le milieu et on l'inocule avec une suspension, dans 10 ml d'une solution stérile d'heptadécyl-sulfate de sodium à 0,1 % de spores d'une culture en pente sur agar (glu- cose-tryptone-sels minéraux)
<B>de</B> StreptomycesC-2943. Le milieu inoculé est incubé à 25-260 C pendant 72 heures pendant lesquelles le milieu est agité à 225 tours par minute et pendant lesquels on fait passer de l'air stérile à travers le milieu à raison de 12 litres par minute. Pendant l'incubation, on ajoute pour contrôler la formation de mousse, 98 ml d'un mé lange stérilisé de graisse de porc crue et d'huiles minérales contenant des mono- et diglycérides. La culture incubée ainsi obtenue est employée pour ino culer les cultures en grand, comme décrit ci-après.
Quatre récipients de fermentation de 30 litres, contenant chacun 16 litres du milieu décrit ci-dessus, sont stérilisés à 1211, C pendant 2 heures, :le pH après stérilisation étant de 7,6.<I>On</I> laisse refroidir à la température ordinaire les récipients contenant le mi lieu stérile puis on introduit dans chaque récipient une portion de 800 ml de la culture incubée d'écrite ci-dessus, et on soumet les milieux inoculés à l'incu bation à 25-260 C pendant 40 heures.
Pendant cette période d'incubation, on fait arriver de l'air par un distributeur à raison de 16 litres à la minute et pro duit une agitation par un propulseur tournant à 200 tours par minute. Durant l'incubation, on ajoute 30 ml du mélange stérilisé de graisse de porc et d'hui les minérales mentionné ci-dessus, à chaque récipient de fermentation, selon besoin pour contrôler la for mation de mousse.
La concentration en L-6-diazo-5- oxo-norleucine dans les milieux de fermentation après incubation est d'approximativement 37 micro- grammes par ml.
Les matières solides présentes dans les milieux de fermentation incubés, sont enlevées par mélange avec 1 % de terre de diatomées et filtration. La matière filtrée possède l'activité biologique désirée ;
ainsi, une injection intrapéritonéale journalière de 0,1 ml de ce filtrat pendant cinq jours inhibe totalement la crois sance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans des souris.
Le gâteau de filtre est lavé avec de l'eau et le filtrat et les eaux de lavage sont combines (41,5 litres) et concentrés dans le vide à un volume de 1920 ml. On ajoute de l'éthanol au concentrai <B>da</B> façon à porter le volume à 19,2 litres; le précipité qui se forme est enlevé par filtration et le gâteau de filtre est lavé avec de l'éthanol. Le filtrat -alcoolique (pH 6,5) est fait passer à travers une colonne d7ad- sorption préparée comme décrit ci-dessous.
2,3 kg d'alumine sont agités avec de l'acide chlor hydrique dilué de telle sorbe que le pH reste constant à 6,4. L'alumine est retirée, lavée avec de l'eau et activée par chauffage à 200 C pendant 4 heures.. L'alumine est remuée avec de l'éthanol aqueux à 90 % et entassée dans une colonne de 10 cm de dia- mètre (volume. retenu 2300 ml;
taux d'écoulement par gravité 5 litres à l'heure).
On fait passer le filtrat alcoolique préparé ci dessus dans la colonne d'adsorption, puis la colonne est lavée successivement avec 1,9 litre d"éthanol aqueux à 90 % et 12,1 litres d'éthanol aqueux à 75 0/0. Le percolatum est mis de côté.
La colonne est alors éluée avec 18 litres d'éthanol aqueux à 25 % et l'éluat est recueilli en fractions de 1 litre. Les cinq premières fractions d'éluat sont concentrées d'ans le vide et le concentre est séché à l'état con gelé sous un vide poussé.
Le produit séché possède l'activité biologique cherchée ; par exemple l'injection intrapéritonéale deux fois par jour pendant cinq jours, de 0,5 ml d'une solution aqueuse de ce produit (300 gamma par ml) empêche totalement la croissance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans des souris.
8,5 grammes de cette substance sèche, donnant à l'essai approximativement 4'% de L-6-diazo-5-oxo- norleucine, sont dissous dans 120 ml d'acétone aqueuse à 1 % (pH 6,2). On prépare une colonne d'adsorption en ajoutant un mélange de 125 g de charbon activé et 125 g de terre de diatomées,
dans une solution à 1 % d'acétone dans l'eau, le diamètre de la colonne étant de 6,5 cm (volume retenu 800 ml ; taux d'écoulement par gravité, 750 ml par heure).
On fait passer la solution aqueuse contenant la L-6-diazo-5-oxo-norleucine à travers la colonne, puis on lave celle-ci avec 4,8 litres d'une solution d'acétone à 1%. L'éluat est recueilli en fractions de 100 ml. Les fractions de la quinzième à la vingt- troisième inclusivement sont concentrées et le con centrai est séché à l'état congelé sous un vide poussé.
Lamatière sèche est dissoute dans du méthanol aqueux chaud à 90'0/0 et la solution est maintenue à 50 C pendant plusieurs heures. La L-6-diazo-5-oxo-norleu- cine qui se sépare en cristaux est recueillie et séchée dans le vide ;
El @m = 643 à 274,5 millimicrons. <I>Exemple 3:</I> a) On introduit 150 ml d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
EMI0005.0132
Pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> <B>............</B> <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> tourteau <SEP> <B>d</B>e <SEP> soya <SEP> <B>........</B> <SEP> 1,0
<tb> Extrait <SEP> salin <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> <B>....</B> <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ..........
<SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>............</B> <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> en <SEP> suffisance <SEP> pour <SEP> donner <SEP> <B>....</B> <SEP> 100;0
<tb> Hydroxyde <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> en <SEP> suf fisance <SEP> pour <SEP> porter <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,5 dans un flacon d'Erlenmeyer de 1 litre.
Ce milieu nutritif est alors stérilisé en chauffant le flacon à 1210 C pendant 1/2 heure, puis il est refroidi et inoculé avec 5 ml d'une suspension, dans 10 ml d'une solution stérile de heptadécyl-sulfate de sodium à 0,
1 % de spores provenant d'une culture en pente sur agar (glucose-tryptone-sels minéraux)
de Strepto- mycesC-2943. Le flacon est soumis à l'incubation à 26 C pendant 72 heures en l'agitant au moyen d'un secoueur mécanique le faisant tourner à 160 tours par minute dans. un cercle de 60 mm<B>de</B> .diamètre. La culture incubée ainsi obtenue est utilisée pour inocu ler le milieu de 67,5 litres décrit en b) ci-après.
b) 67,5 litres d'un milieu nutritif ayant la compo sition ci-dessus indiquée en a) sont placés dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 135 litres, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,9. Le milieu est refroidi et inoculé avec 90m1 de la culture incubée décrite ci-dessus.
Le milieu ino culé est soumis à l'incubation à 260 C pendant 24 heures. Pendant ce temps, on introduit de l'air stérile dans ce milieu à travers un distributeur à raison de 96 litres.
par minute, et le mélange est agité à l'aide d'un propulseur à 200 tours par minute. La culture incubée de Streptomyces C-2943 ainsi obtenue est utilisée pour inoculer 675 litres du milieu décrit en c) ci-dessous. c) 675 litres d'un milieu nutritif ayant la compo sition décrite en a) ci-dessus sont placés dans un réci pient de fermentation de 900 litres, en acier inoxyda ble,
et sont stérilisés par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. Le pH du milieu après stérilisation est de 6,7. Le milieu est refroidi et inoculé avec 67,5 litres de la culture incubée décrite en b) ci-dessus.
Le mi lieu de culture est incubé à 27() C pendant 27 heures durant lesquelles on introduit de l'air stérile dans le mélange à travers un distributeur à raison de 700 litres à la minute, tout en agitant le mélange à l'aide d'un propulseur tournant à 200 tours par minute. En vue de contrôler la formation de mousse, on ajoute de temps en temps, selon besoin, 2,4 litres d'un mé lange stérile de graisse de porc brute et d'huiles miné rales contenant des mono- et diglycérides.
Les-matières solides contenues dans le mélange incubé sont enlevées par filtration à travers un filtre- presse à plateaux et châssis revêtu préalablement de terre de diatomées, puis le filtrat est concentré sous pression réduite à un volume d'environ 36 litres,. Le concentrat est mélangé avec 324 litres d'éthanol, et le précipité qui se forme est enlevé par filtration et rejeté.
d) On fait passer une portion (214 litres) du fil trat éthanolique (volume total 344 litres ; pH 5,9) à travers une colonne d'adsorption préparée de la ma nière su ivan:te : on agite avec de l'acide chlorhydri que dilué 6,75 kg d'alumine, de telle manière que le pH reste constant à 6,0. L'alumine est filtrée, lavée avec de l'eau déionisée, puis activée par chauffage à 2000 C pendant 4 heures.
L'alumine est remuée avec de l'éthanol aqueux à 90 p/o et entassée dans une colonne de 1,8 m ayant un diamètre de 15 cm (vo lume retenu 21,15 litres : vitesse d'écoulement 40,5 litres à l'heure sous une pression de 845 g/cm2).
Le filtrat alcoolique préparé ci-dessus est percolé à travers la colonne d'adsorption sous une pression absolue de 845g/cmY, puis la colonne est lavéesucces- sivement avec 21,15 litres d'éthanol aqueux à 90 % et 142,6 litres d'éthanol aqueux à 75 0/0.
La colonne est ensuite éluée avec 128,2 litres d'éthanol aqueux à 25 %, et l'éluat est recueilli en fractions de 10a8 li- tres. Les quatrième, cinquième et sixième fractions sont combinées, concentrées dans le vide à 350 C, et le concentrai est séché à l'état congelé sous un vide poussé.
e) La portion restante <B>(130</B> litres) dû filtrat étha- nolique de c) est chromatographiée sur 13 kg d'alu mine, de la façon décrite en d) ci-dessus, et l'éluat est concentré et séché à l'état congelé.
Les poudres sèches de d) et e) sont combinées. Le produit ainsi obtenu contient 2,16 g de L-6-diazo- 5-oxo-norleucine. Ce produit est purifié par adsorp tion et élution de la façon suivante : une boue de 780 g de charbon activé et 780 g de terre de diato- mées dans une solution aqueuse d'acétone à 1% est placée dans une colonne de 1,5 m, ayant un diamètre de 10 cm. Le lit formé d'adsorbant a 55 cm de hau teur ;
il a un volume retenu de 4 litres, et un taux d'écoulement par gravité de 1,75 litre à l'heure avec une pression de 950 mm. Le produit est dissous dans 858 ml de solution aqueuse d'acétone à 1 0/0, et on fait passer la solution à travers la colonne. Celle-ci est éluée avec 20 litres d'une solution à 1 % d'acé- tone dans l'eau. On recueille des fractions de 500 ml chacune.
Les fractions de la 17f'me à la 20Ème inclu sivement sont combinées et concentrées dans le vide. Le concentrat est congelé et la glace en est sublimée sous un vide poussé. Le produit, la L-6-diazo-5-oxo- norleucine, est recristallisé dans du méthanol aqueux à 90'% ; Ei l-rl = 676 à 274 millimicrons. Le pro- duit cristallin possède l'activité biologique désirée ;
par exemple une injection journalière intrapéritonéale d'une solution aqueuse du produit (0,25 mg/kg) pen dant cinq jours inhibe complètement le développe ment de tumeurs de Sarcoma 180 implantées dans les souris.
Process for the preparation of L-6-diazo-5-oxo-norleucine L-6-diazo-5-oxo-norleucine has quite particular properties, as emerges from the description which follows.
This compound contains only the elements carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen and has the molecular formula C6H @ NsO'3. He has one. molecular weight of 171 and can be represented by the structural formula
EMI0001.0014
L-6-diazo-5-oxo-norleucine is relatively unstable in heat and decomposes before melting. Decomposition does not occur at a special temperature and, therefore, the decomposition and melting points vary within wide limits depending on the method employed for their determination.
Decomposition generally begins at about 1450 C and can continue until reaching 155.1 C. L-6-diazo-5-oxo-norleucine decomposes in aqueous acids with the release of nitrogen. The hydrogen bond curves show values for bit in water of 2.1 and 8.95. The specific optical rotation [a] D of Lr6-diazo-5-oxo-norleucine is -I-210 (at 5.4% in water).
L-6-diazo-5-oxo-norleucine is very soluble in water, but insoluble in ordinary nonpolar organic solvents. It is only very slightly soluble in absolute methanol, absolute ethanol or cold acetone,
but is soluble in hot aqueous solutions of these solvents. It gives the specific blue-purple stain in the ninhydrin test. Periodic acid oxidation of L-6-diazo-5-oxo-norleucine gives L-glutamic acid.
L-6-diazo-5-oxo-norleucine forms metal salts by reaction with hydroxides, carbonates, bicarbonates, oxides, alkyloxides, amides, etc., of alkali or alkaline earth metals.
In aqueous phosphate buffer, at pH 7, the characteristic ultraviolet absorption maxima for Ei #m are 683 at a wavelength of 274 millimicrons and 376 at a wavelength of. 244 millimicrons.
The infrared absorption spectrum of L-6-diazo-5-oxo-norleucine is remarkable. When determined by the potassium die bride disc method, the spectrum shows absorption peaks at the following wavelengths: 3.19, 3.32, 3.78, 4.6.6 ,, 6; 14 , 6.30, 6.59, 6.90, 7.18, 7.39, 7.54, 8.33, 8.66, 8.98, 9.36; 9.71, - 10.08, 10.22, 10.59, 11.65, 12.08, 12.34 and 13.16 microns.
L-6-diazo-5-oxo-norleucine possesses strong phytotoxic properties, and is particularly useful as a herbicide, weed killer and the like. It is also useful in that it prevents the biosynthesis, in living cells, of essential key naked acids and nucleic acid precursors.
The product exerts an inhibitory action on the development of neoplasms, and for this reason is of interest for the treatment of neoplastic diseases in man and in animals. L-6-diazo-5-oxo-norleucine is particularly active against yeasts. Thanks to this feature;
it can be used for the isolation of bacteria, by shooting mixed microbial populations in which one or more of the components is a yeast.
The method according to the invention is characterized by inoculating with Streptomyces C-2943 a sterile aqueous nutrient medium having a pH of 5.0 to 8.5 and containing suitable sources of carbon, nitrogen and mineral salts, the resulting mixture is subjected to incubation under aerobic conditions at a temperature between about 20 and 35o C,
the solids present in the culture medium are removed and the L-6-diazo-5-oxo-norleucine is isolated from the aqueous culture liquid.
Streptomyces C-2943 is a heretofore unknown microorganism found in soil. It was first isolated from a soil sample taken in Chincha, Peru.
Cultures of this living organism have been added to the permanent collections of the Bureau of Culture of Parke, Davis & Company, Detroit, Michigan, as No. 04997, and to the culture collections of the US Department of Agriculture, Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch, Peoria, Illinois, USA.
Cultures of this microorganism can be obtained by preparing a suspension in sterile water of a sample of soil containing it, allowing the heavier particles to settle, spreading the resulting supernatant suspension, in serial dilutions. , on nutrient agar plates, incubating the plates at 24-28 C to obtain growths of microorganisms and transplanting selected individual growths, which resemble Streptomy ces C-2943 on fresh nutrient agar plates.
By repeated selection and contamination-free transplantation of characteristic growths onto fresh plates of nutrient agar, thalli are obtained, constituting pure cultures of the miororganisms sought.
Streptomyces C-2943 is an aerobic, air-forming, spore-forming member of the order Actinomyces and belongs to the genus Streptomyces as described in the Sixth Edition of Bergey's Manual of Determi- native Bacteriology. . This organism has the following characteristic:
when: it is cultured on glucose-tryptone or nutrient agar media, the main background mycelium is gray to white <B>; </B> on asparagine-glycerol or synthetic glucose-agar media, this mycelium is white or slightly gray to slightly purple or light red to gray <B>;
</B> on Czapek or calcium-agar malate media it is white to light yellow or gray. On these media, the mycelium aé rien is first white, then it turns gray.
When this organism is grown on glucose-tryp- tone or nutrient agas media, a dark brown or black coloration appears in the lower layer, but when grown in glycerol-asparagine, Czapek or calcium malate-agar media, the color of the middle remains substantially unchanged.
Microscopically, the aerial hyphae are long, about 100 to 500 microns long. There are primary branches and sometimes secondary ones, as well as terminal loops and spirals. The spirals vary in length and consist of 2 to 15 turns.
The turns are often loose and irregular. The distal parts of these hyphae subdivide into chains of spores.
This organism slowly liquefies gelatin, forming a dark brown color in the medium, and usually does not peptonize sunflower milk.
In a synthetic medium [Pridham et al., J. Bacteriology, 58, 108 (1948)] this organism uses many carbon sources, including L-arabinose, cellobiose, dextrin, glucose, D-galactose, glycerol, i-.inosite, inulin,
lactose, levulose, maltose, D-mannite, D-mannose, melibiose, raffinose, rhamnose, starch, sucrose, tetralose and D-xylose;
it uses adonite, aesculin, and salicin less readily, and not dulcite, melezitosis, and D-sorbitis. This organism uses both organic and inorganic sources. nitrogen.
The process according to the invention is characterized in that a sterile aqueous nutrient medium having a pH of 5.0 to 8.5 and containing carbon sources is inoculated with a fungus of the species Streptomyces C-2943. and nitrogen and mineral salts, in that the resulting mixture is subjected to incubation under aerobic conditions at a temperature between 20 and 35.1 C,
in that the solids present in the culture medium are separated and the L-6 diazo-5-oxo-norleucine isolated from the aqueous culture liquid.
For inoculation, spores or eonidia can be used. of Streptomyces C-2943, as well as aqueous suspensions thereof containing a small amount of soap or other wetting agent. For large fermentations, it is preferable to use young and vigorous cultures of Streptomyces C-2943, rather than spores or conidia or aqueous suspensions thereof.
Suitable aqueous nutrient media are those with a pH between 5.0 and 8.5 and which contain sources of carbon and nitrogen, as well as inorganic salts. As sources of carbon and nitrogen, there are among others soybean meal flour, wheat gluten powder, brewer's yeast, pork stomach (salt extract), meat protein hydrolysates ,
soluble products from distilleries and solids from maceration of grains. Various combinations of these carbon and nitrogen sources with other nitrogenous materials, such as a mixture of soybean meal flour, acid hydrolyzed casein and bitter-free yeasts, a mixture of pork stomach (salt extract) and soy peptone,
and a mixture of soybean meal and acid hydrolyzed casein have also been found to give particularly good results. The optimum concentration of these ingredients is between 1,
5 and 2% of the total weight of the medium. The carbon source may consist only of the substances mentioned above, but the best results are obtained when glucose or galactose is added to the medium. The concentration of glucose or galactose can vary from 0 to 2%.
Concentrations greater than 2% appear to have an unfavorable effect on the yield of the desired product. As the inorganic salts, sodium chloride, ammonium chloride, ammonium nitrate, potassium chloride, calcium carbonate, etc. can be employed. Ammonium salts such as ammonium chloride and nitrate are particularly advantageous constituents and lead to high yields of the expensive product.
The maximum concentration of these salts. ammonium is between 0.1 and 0.5 -% of the nutrient medium.
Cultivation of Streptomyces C-2943 in an aqueous nutrient medium can be carried out in various ways. For example, the microorganism can be grown under aerobic conditions on the surface of the medium, or it can be cultivated below the surface of the medium, i.e. in the submerged state, provided that oxygen is simultaneously supplied.
In the preferred method of producing Lr6-diazo-5-oxo-norleucine by fermentation on a large scale, submerged or deep cultures of Streptomyces C-2943 are employed.
In this manner of carrying out the fermentation, a sterile aqueous nutrient medium is inoculated with Streptomyces C-2943 and subjected to incubation with agitation and aeration at a temperature between about 20 and 35 C, preferably in the region of 23- 29 C, until a maximum concentration of L-6-diazo- 5-oxo-norleucine is produced in the culture fluid.
The time required for this maximum production of L-6-diazo-5-oxo-norleucinc varies with the size and type of equipment employed. For example, in large-scale industrial fermentations, as performed in tank-type fermentation apparatus, the maximum production of L-6-diazo-5-oxo-norleucine is reached in about 32 hours. or less.
When using secondary flasks for culture, the maximum production time may be longer, three to eight days, than that required for large-scale fermentation tanks. Under the conditions of submerged culture, the microorganism develops in more or less separate particles, dispersed throughout the nutrient medium,
this contrasts with the more or less continuous film present on the surface of the medium in the surface cultivation process. Thanks to this distribution of the organism in the medium, large volumes of the nutrient medium inoculated in the large reservoirs or vats ordinarily employed in the fermentation industry can be cultivated at one time.
Stationary tank fermentation apparatus, provided with suitable agitation and / or aeration devices, as well as horizontal drum apparatus, have been found particularly useful in this connection. In contrast, for the preparation of small amounts of the antibiotic or cultures of the microorganism, the submerged culture method can be performed in small flasks or vessels which can be shaken or stirred by mechanical means. suitable. Agitation and aeration of the culture can be accomplished in various ways.
Agitation can be produced by turbines, blades, propellants or other mechanical agitation devices, by rotating or shaking the fermentation vessel itself, by various pumping devices or by passing it through. air or other gas containing oxygen through the medium.
Aeration can be done by injecting air or other oxygen-containing gas into the fermenting mixture through open pipes, through. perforated pipes, with the help of porous diffusion means such as candles of coal, carborundum, sintered glass, etc. ; it can also be carried out by projection or flow of the mass in or through an atmosphere containing oxygen.
According to the surface culture method for the production of L-6-diazo-5-oxo-norleucine, a shallow layer, usually less than 2 cm, of a sterile aqueous nutrient medium is inoculated with Streptomyces C-2943 and subject the mixture to incubation under aerobic conditions at a temperature of about 20-350 C, preferably in the vicinity of 23-290 C.
In general, a longer incubation time is required than for deep cultivation to achieve maximum production of L-6-d # iazo-5-oxo-norleucine. In. Generally, this incubation period lasts about three to eight days.
When the <B> fermentation </B> phase is complete, the solid matter is removed from the culture liquid, for example by filtration, centrifugation, etc. The resulting liquid which contains L-6-diazo-5-oxo-norleucine possesses the desired properties of inhibiting neoplasms.
However, for optimum results, the liquid is processed to isolate L-6-diazo-5-oxo-nor-leucine in concentrated or crystalline form. A suitable method of isolating the product is to concentrate the clarified culture liquid to a small volume, for example to 1/5 -1 / 2o of its original volume,
adding about 3 to 10 volumes of a water-miscible organic solvent, such as methanol or ethanol, separating the impurities which have precipitated from the solution, subjecting the purified solution to adsorption and elution with a.
adsorbent for L, 6-diazo-5-oxo-norleucine and recovering the product from the eluate. As another suitable method, the clarified culture liquid is concentrated to dryness, the waste product is extracted with an organic solvent miscible with water and containing less.
of 50% water, the extract is subjected to adsorption and elution with an adsorbent for L-6-diazo-5-oxonorleucine and the product of the eluate is recovered. The adsorption is carried out by passing the diluted solution or the extract mentioned through an adsorption column
containing a neutral adsorbent having a pH or adjusted to a pH of about 5 to 8, preferably 6 to 8. Examples of such an adsorbent are alumina and Brockmann alumina. The product is eluted <B> da </B> the adsorbent with water or an aqueous solution of an organic solvent miscible with water.
The eluate is collected in fractions, and the fractions showing the highest absorption in the ultraviolet at a wavelength of about 275 millimicrons, are dried. Due to the unstable nature of the product at high temperatures, it is preferable to remove the diluent by freezing the eluate and subjecting the frozen mass to a high vacuum. The product can be further purified by adsorption and elution using activated charcoal.
For these purposes, the dry product prepared as described above, is dissolved in a small amount of water containing a small proportion of organic solvent miscible with water, the pH of the solution is adjusted to 6-7, if necessary. , and the solution is passed through an adsorption column containing activated charcoal, and the column elutes with water. containing a small proportion of an organic solvent miscible with water, preferably acetone.
To make the solution for the adsorption operation, water containing a small proportion of an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, phenol and the like can be employed.
Preferably, water containing about 1% acetone is used, and enough solvent is used to have a solution containing about 2 to 10 mg of L-6-diazo-5-oxo-norleucine per milliliter. The amount of activated charcoal required to adsorb all of the desired product from the solution varies with the concentration of the dry product in L-6-diazo-5-oxo-norleucine. For example, a test product giving 5% of this substance requires about 15 grams of activated charcoal per gram. We get the best
results when activated charcoal has been pre-mixed with diatomaceous earth, the latter helping to maintain a satisfactory flow rate. After adsorption, the column is eluted by washing with a suitable eluent such as water containing less than 25% of a water-miscible organic solvent.
Best results are obtained by using a 1 u / o aqueous acetone solution. The eluate is collected in fractions and the fractions show the highest absorption in. Ultraviolet at a wavelength of about 275 millimicrons are dried from the frozen state. If desired, the dry product thus obtained can be further processed by recrystallization from a suitable solvent such as aqueous methanol, aqueous ethanol and the like.
The product is identical in all respects to the substance produced by chemical synthesis. <I> Example 1 </I> 300 ml of a nutrient medium of the following composition are added
EMI0004.0049
For <SEP> hundred
<tb> Maltose <SEP> ........................ <SEP> 1.0
<tb> Residue <SEP> from <SEP> fermentation <SEP> butanol-acetone <SEP> 0.5
<tb> Casein <SEP> hydrolyzed <SEP> with <SEP> acid <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> <B> ............ </B> <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.1
<tb> <SEP> sodium chloride <SEP> <B> .............. </B> <SEP> 0.5
<tb> Water <SEP> in <SEP> sufficiency <SEP> for <SEP> to make <SEP> <B> ..... </B> <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 100.0 in each of two 1 liter Erlenmeyer flasks, and the pH is adjusted to 7.5 with 6N sodium hydroxide. The nutrient medium is sterilized by heating the flasks to 1200 C for 25 minutes. The medium is cooled and each of the two flasks is inoculated with 2 ml of a suspension in 40 ml of a sterile solution of Castile soap containing 0.01% of spores. of four slant cultures on agar (glucose-tryptone minerals) of Streptomyces C-2943.
The vials are kept at room temperature (24-26 ° C) for 90 hours with agitation produced by mechanical shakers which rotate the vials at 160 revolutions per minute in a 6 cm diameter circle.
The culture liquid then contains approximately 1 mg of L-6-diazo-5-oxo-norleucine, the determination being made by diffusion tests on agar plate-discs, in which the extent of the reaction is measured. inhibition of the development of the strain Torulopsis albida NRRLY 1400. The culture liquid is filtered and the desired product, L-6 diazo-5-oxo-norleucine, is isolated from the filtrate by the adsorption and elution methods described in detail. below.
<I> Example 2 </I> 12 liters of a medium having the following composition are placed
EMI0004.0077
For <SEP> hundred
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> <B> ----- <SEP> .... </B> <SEP> 2.0
<tb> Soybean <SEP> <SEP> <SEP> meal <SEP> <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 1.0
<tb> Stomach <SEP> of <SEP> pig <SEP> (extract <SEP> to <SEP> salt <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> .......... <SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> <B> ...... </B> <SEP>. <SEP> <B> ... </B> <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.5
<tb> Water <SEP> in <SEP> sufficiency <SEP> for <SEP> to make <SEP>. <SEP>.
<SEP> <B> .... </B> <SEP> 100.0
<tb> Sodium <SEP> hydroxide <SEP> <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> in <SEP> sufficient <SEP> to <SEP> bring <SEP> the <SEP> pH <SEP> at <SEP> 7.5 in a 30 liter glass fermentation vessel, fitted with stainless steel accessories including dispenser, propellant, baffles and sampling tube and the medium is sterilized by heating at 1211 , C for 2 hours. The pH of the medium after sterilization is 7.8.
The medium is cooled and inoculated with a suspension in 10 ml of a sterile 0.1% sodium heptadecyl sulfate solution of spores from slant culture on agar (glucose-tryptone- mineral salts)
<B> of </B> StreptomycesC-2943. The inoculated medium is incubated at 25-260 C for 72 hours during which the medium is stirred at 225 revolutions per minute and during which sterile air is passed through the medium at a rate of 12 liters per minute. During the incubation, 98 ml of a sterilized mixture of raw pork fat and mineral oils containing mono- and diglycerides are added to control foaming. The incubated culture thus obtained is used to inoculate the cultures in bulk, as described below.
Four 30-liter fermentation vessels, each containing 16 liters of the medium described above, are sterilized at 1211 ° C. for 2 hours: the pH after sterilization being 7.6. <I> On </I> allowed to cool at ordinary temperature, the containers containing the sterile medium are then introduced into each container a portion of 800 ml of the incubated culture described above, and the inoculated medium is subjected to incubation at 25-260 C for 40 hours.
During this incubation period, air is supplied through a distributor at a rate of 16 liters per minute and agitation is produced by a propellant rotating at 200 revolutions per minute. During the incubation, 30 ml of the sterilized mixture of pork fat and mineral oils mentioned above is added to each fermentation vessel as needed to control foam formation.
The concentration of L-6-diazo-5-oxo-norleucine in the fermentation media after incubation is approximately 37 micrograms per ml.
The solids present in the incubated fermentation media are removed by mixing with 1% diatomaceous earth and filtration. The filtered material has the desired biological activity;
thus, a daily intraperitoneal injection of 0.1 ml of this filtrate for five days completely inhibits the growth of Sarcoma 180 tumors implanted in mice.
The filter cake is washed with water and the filtrate and washings are combined (41.5 liters) and concentrated in vacuo to a volume of 1920 ml. Ethanol is added to the concentrate <B> da </B> so as to bring the volume to 19.2 liters; the precipitate which forms is removed by filtration and the filter cake is washed with ethanol. The alcoholic filtrate (pH 6.5) is passed through an adsorption column prepared as described below.
2.3 kg of alumina are stirred with dilute hydrochloric acid of such a sorb that the pH remains constant at 6.4. The alumina is removed, washed with water and activated by heating at 200 ° C. for 4 hours. The alumina is stirred with 90% aqueous ethanol and packed into a column 10 cm in diameter. (retained volume 2300 ml;
gravity flow rate 5 liters per hour).
The alcoholic filtrate prepared above is passed through the adsorption column, then the column is washed successively with 1.9 liters of 90% aqueous ethanol and 12.1 liters of 75% aqueous ethanol. percolatum is set aside.
The column is then eluted with 18 liters of 25% aqueous ethanol and the eluate is collected in fractions of 1 liter. The first five eluate fractions are concentrated in vacuo and the concentrate is dried frozen under high vacuum.
The dried product has the desired biological activity; for example the intraperitoneal injection twice a day for five days, of 0.5 ml of an aqueous solution of this product (300 gamma per ml) completely prevents the growth of Sarcoma 180 tumors implanted in mice.
8.5 grams of this dry substance, yielding approximately 4% L-6-diazo-5-oxonorleucine in the test, are dissolved in 120 ml of 1% aqueous acetone (pH 6.2). An adsorption column is prepared by adding a mixture of 125 g of activated carbon and 125 g of diatomaceous earth,
in a 1% solution of acetone in water, the diameter of the column being 6.5 cm (retained volume 800 ml; flow rate by gravity, 750 ml per hour).
The aqueous solution containing L-6-diazo-5-oxo-norleucine is passed through the column, and then washed with 4.8 liters of a 1% acetone solution. The eluate is collected in fractions of 100 ml. Fractions from the fifteenth to the twenty-third inclusive are concentrated and the concentrate is dried frozen under high vacuum.
The dry matter is dissolved in hot 90% aqueous methanol and the solution is maintained at 50 ° C. for several hours. The crystallized L-6-diazo-5-oxo-norleucine is collected and dried in vacuo;
El @m = 643 to 274.5 millimicrons. <I> Example 3: </I> a) 150 ml of a nutrient medium having the following composition are introduced
EMI0005.0132
For <SEP> hundred
<tb> Glucose <SEP> monohydrate <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 2.0
<tb> <SEP> meal <SEP> <SEP> <B> d </B> e <SEP> soya <SEP> <B> ........ </B> <SEP> 1 , 0
<tb> Saline <SEP> <SEP> <SEP> extract of <SEP> pig <SEP> <B> .... </B> <SEP> 0.5
<tb> Ammonium <SEP> <SEP> ..........
<SEP> 0.167
<tb> <SEP> sodium <SEP> <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 0.5
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> <B> ............ </B> <SEP> 0.5
<tb> Water <SEP> in <SEP> sufficiency <SEP> for <SEP> to give <SEP> <B> .... </B> <SEP> 100; 0
<tb> Sodium <SEP> hydroxide <SEP> <SEP> (10 <SEP> N) <SEP> in <SEP> sufficient <SEP> to <SEP> bring <SEP> the <SEP> pH <SEP> at <SEP> 7.5 in a 1 liter Erlenmeyer flask.
This nutrient medium is then sterilized by heating the flask at 1210 C for 1/2 hour, then it is cooled and inoculated with 5 ml of a suspension, in 10 ml of a sterile solution of sodium heptadecyl sulfate at 0,
1% spores from slant culture on agar (glucose-tryptone-mineral salts)
of Streptomyces C-2943. The flask is incubated at 26 ° C for 72 hours while shaking it with a mechanical shaker rotating it at 160 revolutions per minute in. a circle of 60 mm <B> of </B>. diameter. The incubated culture thus obtained is used to inoculate the 67.5 liter medium described in b) below.
b) 67.5 liters of a nutrient medium having the above composition indicated in a) are placed in a 135 liter stainless steel fermentation vessel, and the medium is sterilized by heating at 1210 C for 1 hour. The pH of the medium after sterilization is 6.9. The medium is cooled and inoculated with 90 ml of the incubated culture described above.
The inoculated medium is incubated at 260 ° C. for 24 hours. During this time, sterile air is introduced into this medium through a distributor at the rate of 96 liters.
per minute, and the mixture is stirred using a propellant at 200 revolutions per minute. The incubated culture of Streptomyces C-2943 thus obtained is used to inoculate 675 liters of the medium described in c) below. c) 675 liters of a nutrient medium having the composition described in a) above are placed in a 900-liter fermentation vessel, made of stainless steel,
and are sterilized by heating at 1210 C for 1 hour. The pH of the medium after sterilization is 6.7. The medium is cooled and inoculated with 67.5 liters of the incubated culture described in b) above.
The culture medium is incubated at 27 () C for 27 hours during which sterile air is introduced into the mixture through a distributor at a rate of 700 liters per minute, while stirring the mixture with the aid of 'a thruster rotating at 200 revolutions per minute. In order to control foaming, 2.4 liters of a sterile mixture of crude pork fat and mineral oils containing mono- and diglycerides are added from time to time, as needed.
The solids contained in the incubated mixture are removed by filtration through a plate and frame filter press pre-coated with diatomaceous earth, then the filtrate is concentrated under reduced pressure to a volume of about 36 liters. The concentrate is mixed with 324 liters of ethanol, and the precipitate which forms is removed by filtration and discarded.
d) A portion (214 liters) of the ethanolic trate (total volume 344 liters; pH 5.9) is passed through an adsorption column prepared as follows: stirred with acid hydrochloride diluted 6.75 kg of alumina, so that the pH remains constant at 6.0. The alumina is filtered, washed with deionized water, then activated by heating at 2000 ° C. for 4 hours.
The alumina is stirred with 90 p / o aqueous ethanol and packed into a 1.8 m column having a diameter of 15 cm (retained volume 21.15 liters: flow rate 40.5 liters at per hour under a pressure of 845 g / cm2).
The alcoholic filtrate prepared above is percolated through the adsorption column under an absolute pressure of 845 g / cmY, then the column is washed successively with 21.15 liters of 90% aqueous ethanol and 142.6 liters of water. 75% aqueous ethanol.
The column is then eluted with 128.2 liters of 25% aqueous ethanol, and the eluate is collected in fractions of 10-18 liters. The fourth, fifth and sixth fractions are combined, concentrated in vacuum at 350 ° C., and the concentrate is dried frozen under high vacuum.
e) The remaining portion <B> (130 </B> liters) of the ethanol filtrate from c) is chromatographed on 13 kg of alumina, as described in d) above, and the eluate is concentrated and dried in the frozen state.
The dry powders of d) and e) are combined. The product thus obtained contains 2.16 g of L-6-diazo-5-oxo-norleucine. This product is purified by adsorption and elution as follows: a slurry of 780 g of activated carbon and 780 g of diatomaceous earth in a 1% aqueous acetone solution is placed in a 1.5 column. m, having a diameter of 10 cm. The bed formed of adsorbent is 55 cm high;
it has a retained volume of 4 liters, and a gravity flow rate of 1.75 liters per hour with a pressure of 950 mm. The product is dissolved in 858 ml of a 1% acetone aqueous solution, and the solution is passed through the column. This is eluted with 20 liters of a 1% solution of acetone in water. Fractions of 500 ml each are collected.
Fractions from 17th to 20th inclusive are combined and concentrated in vacuum. The concentrate is frozen and the ice is sublimated from it under a high vacuum. The product, L-6-diazo-5-oxonorleucine, is recrystallized from 90% aqueous methanol; Ei l-rl = 676 to 274 millimicrons. The crystalline product possesses the desired biological activity;
for example a daily intraperitoneal injection of an aqueous solution of the product (0.25 mg / kg) for five days completely inhibits the development of Sarcoma 180 tumors implanted in mice.