UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Facultad de Química
Laboratorio de Tecnología Enzimática.
“Estudio de las peroxidasas en distintas fuentes vegetales”
Briones Montiel Daniela Ixtzel
Chávez Rodriguez Ismael
Pérez Rayo Mariann Odali
➔ Objetivos
1. Obtener extractos de la enzima peroxidasa de una fuente vegetal (rábanos).
2. Caracterizar la enzima a través de sus parámetros cinéticos KM y Vmax
3. Determinar la especificidad de los extractos de peroxidasas con ácido
ferúlico, caféico, guayacol, hidroquinona y pirogalol.
4. Analizar el efecto de la inmovilización de la peroxidasa comparando
parámetros cinéticos
➔ Introducción
Las peroxidasas son un grupo de oxido-reductasas que catalizan la reducción de
peróxidos, como el peróxido de hidrógeno y la oxidación de una gran variedad de
productos orgánicos e inorgánicos. La actividad de peroxidasas ha sido identificada
en plantas, microorganismos y animales, en donde tienen papeles muy importantes.
En las plantas estas enzimas participan en los procesos de lignificación y en los
mecanismos de defensa en infecciones de tejidos y en daño físico.
Las peroxidasas se usan ampliamente en inmunoensayos y en bioquímica clínica.
Algunos usos recientes incluyen el tratamiento de agua que contienen compuestos
fenólicos, síntesis de varios químicos aromáticos y la remoción de peróxido de
hidrógeno de algunos alimentos y de desechos industriales.
La peroxidasa presente en el rabano (Raphanus sativus) tiene aplicación en
técnicas inmunoquímicas y de diagnóstico clínico, debido a su gran estabilidad,
facilidad de conjugación con las inmunoglobulinas y sencillez para detectarla por
métodos colorimétricos utilizando un gran número de reactivos
Estructura
Las hélices y los bucles se muestran en azul y amarillo, respectivamente; una región
corta de hojas de β se muestra en rosa. Los dos iones de calcio se muestran como
esferas verdes. El grupo hemo se muestra en rojo y se encuentra entre el dominio
distal y el proximal; el residuo proximal de His170 (azul claro) se coordina con el
hierro hemo.
La catálisis de la peroxidasa se puede describir como:
HRP, HRP-I y HRP-II representan la enzima en su estado de reposo, un primer
estado intermedio, compuesto I, y un segundo estado intermedio, compuesto II,
respectivamente. AH2 y AH son un sustrato reductor y sus especies radicales
oxidadas, respectivamente.
➔ Hipótesis
La afinidad de la enzima por el sustrato depende de la estructura química del mismo
La inmovilización de la enzima afecta las variables cinéticas de la enzima
➔ Resultados
Concentración de proteína
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 ( 𝑚𝐿 ) = 1. 55 𝐴280 − 0. 76𝐴260
𝐴280=0.7 𝐴260= 0.37
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎1:10 ( 𝑚𝐿 ) =0.0415
Medición de la actividad enzimática
La actividad enzimática se determinó por medio de un espectrofotómetro con el cual
se siguió la reacción durante 1 minuto
Considerando la ley de lambert-beer:
𝐴𝑏𝑠
𝐴𝑏𝑠 0.0125 1000000 μ𝑚𝑜𝑙 60 𝑠 μ𝑚𝑜𝑙
𝑈1:10 = ε𝑏
= 𝐿
𝑠
( 1 𝑚𝑜𝑙
)( 1 𝑚𝑖𝑛 )(0.003 L)= 0.085 𝑚𝑖𝑛
26 600 𝑐𝑚 𝑚𝑜𝑙
(1 𝑐𝑚)
Considerando el factor de dilución 1:10 la actividad total es
μ𝑚𝑜𝑙
𝑈𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 =0.85 𝑚𝑖𝑛
Determinación de la especificidad de la peroxidasa a diferentes sustratos
Muestras
Sustrato Guayacol Ácido ferúlico Hidroquinona Pirogalol Ácido
cafeico
Estructura
Tiempo s 15 80 7 70 21
Determinación de Km y Vmax
Cinética de Michaelis-Menten
Ecuación de la recta
1 1
𝑉𝑖
= 0. 066 [𝐺𝑢𝑎𝑦𝑎𝑐𝑜𝑙]
+ 0. 0008
Ecuación michaelis-menten
1 𝐾𝑚 1 1
𝑉𝑖
= 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝐺𝑢𝑎𝑦𝑎𝑐𝑜𝑙]
+ 𝑉𝑚𝑎𝑥
De tal manera que se obtuvieron los siguientes valores para 𝑉𝑚𝑎𝑥 y 𝐾𝑚
Vmax mM/min Km mM
1250 8.25
Inmovilización
Ensayo V (abs/s) Vi (mM/min) [Guayacol] mM 1/Vi min/Mm 1/[Guayacol] mM-1
1 0.0002 4.51 4 0.22167 0.250
3 0.0004 9.02 12 0.11083 0.083
5 0.0013 29.32 20 0.03410 0.050
Vmax mM/min 73.53 Km mM 62.48
➔ Análisis de resultados
Reacciones de especificidad de sustrato
Hidroquinona
Piragalol
Ácido ferúlico
Ácido cafeico
Los compuestos con capacidad antioxidante poseen una estructura química
apropiada para reaccionar fácilmente con un radical libre, tal que, como resultado de
dicha interacción, estos últimos pierden su reactividad y los antioxidantes se oxidan
convirtiéndose en moléculas notablemente “más estables” hacia su entorno
De acuerdo a la intensidad y los tiempos de reacción analizados se infiere que el
sustrato con mayor especificidad a la peroxidasa de rábano es el guayacol, seguido
del ácido cafeico, pirogalol, ácido ferúlico y por último la hidroquinona. Por lo tanto
tanto el ácido ferúlico como la hidroquinona tienen una mayor capacidad en
comparación a los otros sustratos para estabilizar los radicales libres formados por
el peróxido de hidrógeno con la peroxidasa de tal manera que la reacción se inhibe
por la estabilización de los radicales libres.
En cambio el guayacol, el ácido cafeico y el pirogalol no tienen una alta capacidad
de estabilización de los radicales libres lo cual permite la formación de los polimeros
coloreados que a mayor concentración muestran una mayor intensidad de color.
Inmovilización
Al comparar las variables cinéticas antes y después de la inmovilización.
Observamos que la inmovilización disminuye la velocidad máxima de 1250 a 73.53
mM/min. Lo cual indica que la enzima saturada en el caso de la inmovilización se
satura con menos sustrato que en el caso de la enzima sin tratamiento de
inmovilización.
Por otro lado al analizar las KM que cambian de 8.25 a 62.48 mM indica que el
guayacol se volvió menos afin a la enzima al incorporar el tratamiento de
inmovilización
➔ Conclusiones:
El sustrato con mayor especificidad hacia la peroxidasa de rábano rojo es el
guayacol
La inmovilización de la enzima dificulta el transporte de masa de la matriz
esfera hacia el medio, es decir, el producto no salía de la esfera lo cual
disminuyó la velocidad máxima y aumentó la KM.
μ𝑚𝑜𝑙
La actividad enzimática de la enzima fue de 0.85 𝑚𝑖𝑛
La concentración de la enzima dentro del extracto fue de 0.0415 mg/ml
➔ Comentarios
La peroxidasa no es una enzima que siga la cinética Michaelis Menten sin
embargo se utilizó este método debido a su sencillez de análisis para
comparar el fenómeno de inmovilización
➔ Referencias bibliográficas
Krainer, F. W., & Glieder, A. (2015). An updated view on horseradish peroxidases:
recombinant production and biotechnological applications. Applied microbiology and
biotechnology, 99(4), 1611-1625.
Wan, Xiang; Liu, Haili; Huang, Xuefeng; Luo, Jianguang; Kong, Lingyi (2008).
Biotransformation of caffeic acid by <i>Momordica charantia</i> peroxidase.
Canadian Journal of Chemistry, 86(8), 821–830. doi:10.1139/v08-090
Ou, L., Kong, L. Y., Zhang, X. M., & Niwa, M. (2003). Oxidation of ferulic acid by
Momordica charantia peroxidase and related anti-inflammation activity changes.
Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26(11), 1511-1516.
