Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis
de las proteínas de la leche
Autores: Melissa Ordoñez 1, Josep Vega 2
INTRODUCCIÓN:
La caseína es una proteína de alto valor biológico, que se encuentra en la leche
en forma de un complejo soluble de calcio y fósforo. Representa el 80% de las proteínas
de la leche de vaca, y es necesaria para la absorción de calcio y fosfato en el intestino.
Además, contiene aminoácidos esenciales con un alto porcentaje de glutamina, al que
se le atribuyen propiedades beneficiosas para la musculatura y para el sistema
inmunitario del organismo. Igualmente, la caseína también se utiliza en el sector de los
lácteos para elaborar quesos o en la industria del pan y cárnica, por sus excelentes
propiedades emulsionantes (Anónimo,2018).
Desde el punto de vista bioquímico, contienen una gran cantidad de secuencia
fosforilada y rica en Prolina y Glutamina. Las proteínas de caseína tienen por
característica en común que precipitan cuando se acidifica la leche a pH de 4.6; de aquí
la razón por la cual se les denomina proteínas insolubles de la leche (llegando a
corresponder cerca del 80% del contenido proteico total). Este tipo de precipitado
formado luego del cambio en el pH es conocido comúnmente como micela, la cual
presenta comportamientos diferentes dependiendo de condiciones fisiológicas, como
concentración de sales, iones, temperatura, entre otras (Bonilla, 2017). Comúnmente,
la caseína se encuentra en la mayoría de los suplementos para deportistas con el fin de
aumentar su masa muscular, debido a la caseína duplica el efecto muscular sobre las
piernas, el pecho e incluso la fuerza en los hombros. Algunos investigadores creen que
la razón de esto son conocidas capacidades anti catabólicas de la caseína. (Robledo,
2017)
METODOLOGÍA
● Aislamiento de la caseína:
Para este procedimiento se colocó a calentar en un vaso de precipitado 50
ml de leche, hasta que llegara a una temperatura de aproximadamente 38°C,
donde se le fue agregando gota a gota ácido acético 1N hasta que la leche se
cortara o se observara un precipitado blanco, esta solución fue separada en tres
tubos de ensayo de plástico donde se llevaron a centrifugar por 2 minutos,
después de esto se extrajo el sobrenadante para usarlo para la electroforesis,
este sobrenadante se le llamó solución A. Posteriormente, se lavó el precipitado
con etanol y se volvió a centrifugar a las mismas condiciones que la primera vez,
al igual que en el paso anterior se guardó el sobrenadante y se nombró como
solución B. Seguidamente, se le agregó éter etílico, se centrifugó y por último se
desechó el sobrenadante, el precipitado blanco que se obtuvo de este proceso es
conocido como la caseína, el cual fue puesto en la estufa y se dejó secar por un
dia, donde se peso una vez ya estaba seca.
● Preparación de la solución de caseína:
Se colocó 250 mg de caseína en un vaso de precipitado en el cual se le
agregó 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH, esta solución se colocó en
agitación hasta que estuviera lo más solubilizado posible, una vez ya solubilizado
se le colocó la solución en un matraz donde se le adiciono 5 ml ácido acético y se
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laboratorio Bioquímica, Universidad de la Sabana, Chía.
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completó aforo con agua destilada nuevamente. A esta se le colocó el nombre de
solución C.
● Determinación del punto isoeléctrico:
En este procedimiento se colocaron las siguientes sustancias con estas
proporciones:
Tabla 1: “Volúmenes a utilizar de cada uno de los reactivos para determinación del PI.”
Una vez adicionados estos reactivos se procedió a la toma de los pH los
cuales estuvieron en un rango de 3,0 y 6,5 como se esperaban. Se le adiciono un
1 ml de la solución de caseína en cada tubo de ensayo, donde posteriormente se
agitó y se llevó a medir la absorbancia pasado los 3 minutos de agitar,
finalmente se tomó los valores reportados por el espectrofotómetro.
● Cuantificación de las proteínas de la leche:
Se preparó las siguientes reacciones:
Tabla 2: “Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la cuantificación de
proteínas.”
Se agitó suavemente y se esperó en la oscuridad 15 minutos
aproximadamente para medir la absorbancia. Posteriormente con la ayuda del
profesor en planta se procedió a realizar el proceso de electroforesis para
determinar las proteínas de la leche debido a su peso molecular y la distancia
recorrida en los geles de electroforesis.
RESULTADO Y ANÁLISIS
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En la primera sesión del laboratorio se logró obtener el peso de la caseína
obtenido a partir de 50 ml de leche que correspondió a 0,8540 g, porcentaje razonable
con lo que se esperaba obtener a partir de lo proporcionado por la literatura que
correspondía a un valor de 25 g por litro de leche, lo que sería teóricamente para la
porción que extrajimos de la leche 1,2 g de caseína, valor relativamente cercano a lo
que se obtuvo en el laboratorio teniendo un rendimiento de:
Rendimiento real
%Rendimiento= ∗100
Rendimientoteórico
0,8540
%Rendimiento= ∗100
1,2 g
%Rendimiento=71,2
Lo cual es un rendimiento relativamente bueno considerando los procesos de
extracción utilizado en cada uno de los procesos, además el valor reportado por la
literatura corresponde a una marca diferente de leche a la que fue tratada en el
laboratorio, por lo que se establecido que la diferencia encontrada pudo ser causada
debido a la marca de leche utilizada y a las posibles pérdidas al momento de separar el
sobrenadante de la caseína establecida. Posteriormente, en la realización de la
electroforesis se obtuvo el siguiente desplazamiento por proteína en la solución A, B, C
y L (leche). Teniendo en cuenta que las soluciones A y B eran lactosuero, que es el
subproducto líquido que se obtuvo después de la precipitación de la caseína
durante la centrifugación, este suero contiene lactosa, proteínas, minerales,
vitaminas y grasa. (Parra R., 2019)
Unas de las proteínas que posee el lactosuero son la α-lactoalbúmina, que
tiene como propósito biológico la síntesis de la lactosa, la �-lactoglobulina, que
es una proteína que no está presente en los humanos, la Inmunoglobulinas, que
son proteínas que hacen parte del sistema de defensa contra microorganismos,
la lactoferrina que es fijadora de hierro, entre otras proteínas. Se debe tener en
cuenta que muchas de las proteínas dependen de la especie de donde proviene
el lactosuero. (Ramiro L., Chávez A., Rentería L. & Rodríguez J., 2017)
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Imagen 1: “Geles de electroforesis obtenidos”
De esta imagen se obtuvieron los siguientes datos para el marcador de peso utilizado
en la práctica (Tris-Glycine):
Desplazamiento (cm) Peso molecular (kDa)
0,5 130
0,9 95
1,3 70
1,6 62
2,0 51
2,5 42
3,5 29
4,5 22
5,6 10,5
Tabla 1: “Datos obtenidos para el marcador de peso”
A partir de estos datos se establecieron la ecuación que permitirá calcular el peso
molecular para las proteínas presentes en las soluciones, esta gráfica se comportaba
de la forma Y=A*Bx donde A = 136,523 y B= 0,6425, fórmula extraída a través de un
proceso matemático de regresión lineal realizado en la calculadora, por tanto, se
obtuvieron los siguientes datos, con los cuales se establecerá unas posibles proteínas
correspondiente para cada franja en el gel de electroforesis.
Desplazamiento Solución A Solución B Solución C Leche
1,20 -- -- -- 80,29
1,70 -- -- -- 64,36
3,10 -- -- 34,65 --
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3,60 -- -- -- 27,77
3,70 26,57 -- -- --
3,75 -- -- -- 25,99
3,80 -- -- 25,42 --
4,70 -- 17,07 -- --
4,80 -- -- -- 16,33
4,90 15,63 -- -- --
5,00 -- -- 14,95 --
5,10 -- -- -- 14,35
5,80 -- -- -- 10,62
5,90 10,17 -- -- --
6,00 -- -- -- 9,74
6,01 -- 9,33 -- --
Tabla 2: “Datos obtenidos para las proteínas en cada solución”
Realizando una investigación en la literatura para establecer las proteínas
presentes en la leche, correspondientes al peso molecular que fue reportado por la
electroforesis, se estableció según (Bravo,2012), (Sánchez,2012) y (Vicente,2002) lo
siguiente:
Proteína Peso molecular (kDa) Sln A Sln B Sln Lech
C e
�-Lactoalbúmina 14,2 X
Inmunoglobulina 15,0 X
�-Lactoglobulina 18,3 X
Caseína �2 25,0 X
Lipasa 27,0 X
Globulina 11s 34,0 X
Lactoperoxidasa 65,0 X
Lactoferrina 80,0 X
Tabla 3: “Posibles proteínas presentes en función del peso molecular”
Como se puedo observar el peso molecular no es el todo exacto lo cual
ser consecuencia del proceso de medición que se le realizó, ya que al medir el
desplazamiento la variación en los puntos eran de 0,1 cm, lo cual al calcular el
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peso molecular cambiaba considerablemente, a pesar de esta situación la
variación encontrada entre las posibles proteínas extraídas y los datos
obtenidos en el laboratorio no son muy grandes, por lo que existe una gran
posibilidad que sean las proteínas propuestas las que realmente se extrajeron
en la práctica.
Además, se obtuvo el pH y su correspondiente absorbancia a cada solución, los
datos se muestran a continuación:
absorbancia pH
0,042 3,32
0,078 3,54
0,132 3,88
0,21 4,16
0,237 4,33
0,208 4,45
0,179 4,96
0,023 5,27
0,032 5,26
0,026 5,40
Tabla 4: “Datos obtenidos para cada solución”
Teniendo en cuenta los datos anteriores se logró realizar un grafico que define el
punto isoeléctrico (absorbancia vs. pH).
PI (absorbancia vs pH)
0.25
0.2
absorbancia
0.15
0.1
0.05
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
pH
Gráfica 1: “Punto isoeléctrico a partir de absorbancia”
Con base en el grafico se puedo determinar que el punto isoeléctrico, teniendo
en cuenta que el punto isoeléctrico de la caseína con respecto a la absorbancia
corresponde a su valor máximo y, asimismo, corresponde a la solubilidad mínima de las
proteínas, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión
electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados. (Serpa A., Hincapié G.
& Álvarez A.,2014). Por lo cual se estimó un punto isoeléctrico igual a 4,33.
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Del mismo modo se buscó utilizar la transmitancia para la determinación del
punto isoeléctrico. Por medio de la ecuación A =- log (T), se logró determinar la
transmitancia, donde A es la absorbancia y T la transmitancia, los datos obtenidos se
muestran a continuación:
absorbancia transmitancia
0,042 1,0
0,078 0,9
0,132 0,9
0,21 0,8
0,237 0,8
0,208 0,8
0,179 0,8
0,023 1,0
0,032 1,0
0,026 1,0
Tabla 5: “Datos calculados para cada solución”
Teniendo en cuenta los datos se realizo la grafica transmitancia vs. pH, teniendo
en cuenta que el pH mínimo corresponde al punto isoeléctrico .
PI (transmitancia vs. pH)
1.2
1.0
0.8
transmitancia
0.6
0.4
0.2
0.0
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
pH
Gráfica 2: “Punto isoeléctrico a partir de transmitancia”
Al observar la gráfica, se determino que la transmitancia logra determinar el
mismo punto isoeléctrico mencionado anteriormente, 4,33. Por lo cual la transmitancia
y la absorbancia vs. el pH coinciden al determinar el punto isoeléctrico.
Posteriormente, se determinó la concentración de las proteínas presentes en la
solución de leche por medio de la siguiente ecuación:
C 1 V 1=C 2V 2
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Tomando C1 como la concentración inicial de albúmina que corresponde a 5
mg/ml, V1 como el volumen agregado de alúmina mostrado en la tabla 2 y V2 que
corresponde al volumen total de la solución.
C 2=(5 mg/ml∗0,2 ml) /3ml
C 2=0,33 mg/ml
Las concentraciones obtenidas y las respectivas absorbancias se muestran a
continuación:
concentración absorbancia
0.37 0.06
0.667 0.126
1 0.185
1.33 0.22
1.667 0.251
Tabla 7: “Datos calculados para las proteínas en cada solución”
Teniendo en cuenta los datos obtenidos se realizó la gráfica de concentración vs.
absorbancia que se presenta a continuación:
concentración vs. absorbancia
0.3
0.25 f(x) = 0.15x + 0.02
R² = 0.97
0.2
absorbancia
0.15
0.1
0.05
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
concentración
Gráfica 3: “concentración de las proteínas”
CONCLUSIONES
En conclusión, por medio de la centrifugación de la leche se logro obtener la
caseína y el lactosuero que dos subproductos de la leche con gran cantidad de
proteínas, y muy utilizados en la industria. Por medio de esto, se logro establecer ocho
candidatos a proteínas presente en la leche debido a su peso molecular como lo fueron
la �-Lactoalbúmina, Inmunoglobulina, �-Lactoglobulina, Caseína �2, Lipasa,
Globulina 11s, Lactoperoxidasa y Lactoferrina, las cuales son proteínas
importantes de la leche de bobino que fue analizada en el laboratorio a través
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de electroforesis. Además, por medio de espectrofotometría se logro establecer
las diferentes concentraciones de las proteínas por medio de la albumina,
asimismo, se determinó el punto isoeléctrico con el análisis de las graficas
teniendo en cuenta el pH y absorbancia por lo que se logró comprobar que por
medio de la transmitancia y el pH se obtiene el mismo resultado de punto
isoeléctrico.
Por otro lado, se determinó que la espectrofotometría permite el análisis de
propiedades como lo es el punto isoeléctrico y la concentración, por medio de los
volúmenes agregados y el pH; en cambio, la electroforesis permitió analizar las
proteínas presentes en la solución y el peso molecular de estas, por medio de la
distancia recorrida en los geles.
BIBLIOGRAFÍA
● Serpa A.,Hincapié G. & Álvarez A. (2014).Determinación del punto isoeléctrico de
las proteínas presentes en cuatro fuentes foliares. Tomado el 29 de febrero 2020,
de: http://www.scielo.org.co/pdf/prosp/v12n1/v12n1a04.pdf
● Parra R. (2019). Lactosuero: Importancia en la industria de alimentos. Tomado el
29 de febrero 2020, de:http://www.scielo.org.co/pdf/rfnam/v62n1/a21v62n1.pdf
● Ramiro L., Chávez A., Rentería L. & Rodríguez J. (2017). Proteínas del lactosuero:
usos, relación con la salud y bioactividades. Tomado el 29 de febrero 2020, de:
https://www.interciencia.net/wp-content/uploads/2017/11/712-CHAVEZ-42-11.pdf
● Anónimo (2018).Que es la caseína y para qué sirve. Tomado el 29 de febrero
2020, del sitio Web health keeper: https://www.axahealthkeeper.com/blog/que-
es-caseina-y-para-que-sirve-proteinas-absorcion-lenta/
● Bonilla, D.(2017). Propiedades de la caseína. Tomado el 29 de febrero 2020, del
sitio web G-SE: https://g-se.com/propiedades-de-la-caseina_1119-bp-
Z58cad9a356cfb
● Robledo, J. (2017). Cinco beneficios de la proteína de caseína para los
deportistas. Tomado el 29 de febrero 2020, del sitio Web Deporte y salud:
https://as.com/deporteyvida/2017/05/17/portada/1495018746_403678.html
● Bravo,I. (2012).ESTUDIO DE LA FRACCIÓN PROTEICA DE LECHE Y FÓRMULAS
INFANTILES SOMETIDAS A ALTAS PRESIONES. Tomado el 29 de febrero 2020 de:
http://digital.csic.es/bitstream/10261/101565/1/FRACCI%C3%93N%20PROTEICA
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laboratorio Bioquímica, Universidad de la Sabana, Chía.
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29 de febrero 2020 del sitio web Curso de introducción a la inmunología porcina:
http://apps.sanidadanimal.info/cursos/inmunologia/ca043.htm
● Vicente, J. (2002). DOCUMENTOS COTEC SOBRE NECESIDADES TECNOLÓGICAS.
Tomado el 29 de febrero 2020 de:
http://informecotec.es/media/M14_Prod_Lacteos.pdf
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