CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA EN PLACAS

1.- INTRODUCCION

CROMATOGRAFIA

La cromatografía, como indica su nombre (proviene del griego χρῶμα chrōma y γράφω gráphō,
que significan respectivamente "color" y "escribir, registrar", literalmente "escritura de color", o
mejor "registro de color") , fue empleada originalmente con sustancias coloreadas.

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas,

la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; es un conjunto de técnicas basadas en el
principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una
mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias
sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado una retención
diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de los
tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la mezcla

entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias
que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil
puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser
usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.

2.- FUNDAMENTO TEORICO

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF)

La cromatografía en capa fina (CCF) es una técnica cromatográfica que utiliza una placa inmersa
verticalmente. Esta placa cromatográfica consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se
utiliza sílica gel) adherida a una superficie sólida. La fase estacionaria es una capa uniforme de un
absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte.

Está técnica deriva de los trabajos del farmacéutico alemán Egon Stahl (1924-1986), que la
presentó en 1956.

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la
acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima
saturación posible de la atmósfera de la cámara, las paredes se impregnan del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del desarrollo, para permitir
la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El
tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo
de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una línea
dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF.

Frecuentemente esta distancia es de 10 cm, ya que parece ser la más conveniente para medir
valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una corriente de
aire caliente.

La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente
del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor
velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Por medio se esta técnica se puede:

 Determinar el grado de pureza de un compuesto.

 Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas.
 Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.
 Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los
reactivos y cómo aparecen los productos finales.

3.- PROCEDIMIENTO

Aplicación de la muestra

Con la micropipeta o un capilar tipo gotero, tome una pequeña cantidad de la solución-problema y
aplique una gota sobre la celda cromatográfica, aproximadamente a 1 cm. del borde inferior de la
placa y se debe trazar una marca, con un lápiz fino, en el borde derecho, para no perder el punto
de aplicación.

Desarrollar el Cromatograma

Se debe introducir la placa en una cámara de elución, (que puede prepararse con un frasco de
tamaño apropiado), a la que previamente se le coloca por dentro un cuadro de papel filtro para
aumentar la saturación de los vapores del eluyente, luego se coloca unos 4 ml. del eluyente.
Sacar la placa de la Cámara de Elución

Una vez que la placa esté dentro de la cámara de elución, no debe moverse.

Cuando el frente del eluyente esté casi en el borde superior de la placa cromatografíca, se debe
abrir el frasco, retirar la placa y marcar el frente del eluyente con un lápiz fino. Luego colocamos la
placa en una hoja de papel, anotar los datos, y dejar secar al aire.

Vizualizar las manchas de la Placa

Para visualizar las manchas, se las debe revelar primero con la lámpara de luz UV, marcando el
contorno de cada una con un lápiz fino.

Concepto de RF (Relación de Frentes)

Para poder medir el desplazamiento alcanzado por cada componente de una mezcla de sustancias
se usa el RF:

Es la relación de frentes o cociente entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia

recorrida por el solvente.
  Este movimiento es constante y característico para cada sustancia en un sistema
cromatográfico determinado y a una Temperatura determinada.
 El RF, al ser un cociente, nos permite medir el desplazamiento de cada sustancia, con un
valor independiente del tiempo o las dimensiones de la placa o distancia de desarrollo.
 De la definición resulta que el valor de R F va de 0 a 1, siendo 0,5 un valor medio.
 A menor RF la sustancia queda más retenida en la FE (Fase Estacionaria).
 A mayor RF la sustancia no está unida con fuerza a la FE (Fase Estacionaria) y es arrastrada
por la FM (Fase Móvil).
 En los dos casos anteriores la muestra no establece equilibrios cromatográficos y por lo
tanto no se separa.
 Lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.

El valor nominal del RF no varía con la distancia de desarrollo, pero en la práctica si tengo una
mayor distancia de desarrollo, tendré mayor número de platos teóricos y más equilibrios
cromatográficos, que me darán una mayor separación de las sustancias.
El límite a la distancia de desarrollo está dado por la difusión de las sustancias con el tiempo y al
peso de la columna de solvente que deja de ascender y se estanca, favoreciendo también la
difusión de la muestra

La distancia de desarrollo es en general entre 5 y 10cm

4.- PRINCIPALES ADSORBENTES Y ELUYENTES UTILIZADOS EN LA CROMATOGRAFIA DE CAPA

FINA

ADSORBENTES

Cuando se va a iniciar el proceso de cromatografía en capa fina es importante hacer una selección
adecuada sobre los adsorbentes que se emplearán, se debe tener en cuenta el tamaño de las
partículas ya que esto indicará su adhesión al soporte.

Adsorbentes más comunes para cromatografía en capa fina.

 Gel de sílice (se utiliza en el 80% de las separaciones)

 Oxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra o básica)
 Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
 Poliamidas

Para la selección del adsorbente deber tomar las siguientes consideraciones:

 Polaridad
 Tamaño de partícula
 Diámetro
 Área Superficial
 Homogeneidad
 Pureza
ELUYENTES

La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la
separación se lleva a cabo. Un método que se emplea para la selección del eluyente es una
cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras patrón.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

 Éter de petróleo
 Éter dietílico
 Ciclohexano
 Tetracloruro de carbono†
 Acetato de etilo
 Piridina†
 Cloroformo†
 Diclorometano†
 Benceno†
 Etanol
 Metanol
 Agua
 Ácido acético

† Compuestos Cancerígenos.

En la elección del eluyente influyen varios factores:

 Precio.
 Pureza.
 No utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las proporciones de los
disolventes que conformen la mezcla (reproducibilidad).
 No utilizar compuestos muy volátiles.
 Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez más polares.

 Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

 Aplicando un eluyente poco polar.
 Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para
aplicar otros eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras
distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de
cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que
se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más eficaz.

5.- FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA

FINA.

Algunos de los factores que influyen en la cromatografía en capa fina son:

 La temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase

estacionaria.
 Las corrientes de aire: se debe tomar en cuenta que el lugar donde se realice la
cromatografía no esté en contacto con corrientes de aire ya que pueden dañar el estudio.
 La limpieza de las placas: Algunas de las placas tienden a estar contaminadas con grasa,
agentes plastificantes o adhesivos. Por esta razón se deben limpiar con una mezcla de
cloroformo y metanol para posteriormente dejar secar completamente antes de aplicar la
muestra.
 La pureza de los disolventes: Para que el estudio salga adecuadamente se debe de tener
una pureza en los disolventes que se le aplicarán, evitando agregar agentes externos.
6.- VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

VENTAJAS

 La forma en que se manejan los materiales y equipamiento es de manera más simple.

 El tiempo empleado para obtener las separaciones es menor. (30 min Aprox.)
 En la cromatografía en capa fina se puede utilizar reveladores corrosivos, que sobre papel
destruirían el cromatograma.
 Los resultados pueden ser reproducibles, lo que hace que sea un método apropiado para
fines analíticos.
 Gran variedad y libertad en la elección de las fases móvil y estacionaria.
 Pueden analizarse varias muestras simultáneamente en una placa.
 Se pueden correr sustancias auténticas puras (estándares) para la comparación de las
posiciones de las manchas.
 Pueden ser combinados métodos de detección físicos, microquímicos y/o biológicos entre
sí para incrementar la selectividad o detección.
 La detección no se encuentra directamente acoplada con la técnica de separación y puede
ser modificada ampliamente.
 El proceso cromatográfico puede ser seguido visualmente y evaluado globalmente.

DESVENTAJAS

 El relativamente bajo poder de resolución que es debido, no principalmente a la

relativamente baja eficiencia de la placa, sino más frecuentemente al restringido tamaño
físico de la placa lo que limita el número de manchas de muestras que pueden
acomodarse en una muestra dada.
 Así, muestras multi-componentes no son fácilmente separadas en una placa TLC (Thin
Layer Cromatography) debido a la capacidad restringida de la placa.
 Debe enfatizarse que en la (TLC o CCF) todos los solutos deben estar contenidos por la
placa, mientras que en la Cromatografía Líquida (LC, liquid cromatography) los solutos son
eluidos de la columna, la capacidad es mucho mayor.
  La masa mínima detectable (Límite de detección) de un soluto en TLC (la sensibilidad) es
mucho más grande que en la LC y, consecuentemente, la técnica no es aplicable para
análisis de trazas a menos que previamente se concentre la muestra.

 Hay que tener presente la volatilidad de los disolventes cuando se escojan sistemas de
disolventes para su uso en ciertos climas.
 Algunos disolventes son potencialmente peligrosos para la salud y el medio ambiente; así,
habrá de tenerse cuidado en su elección (por ejemplo, cloroformo, benceno, éter).

7.- CAMPOS DE APLICACIÓN

 En la industria farmacéutica

Separación y cuantificación de ingredientes activos.

 En la industria de alimentos

Cuantificación de edulcorantes, preservantes y vitaminas.

 Para las materias primas

En la cuantificación de pureza.

 Otras aplicaciones

En la separación de componentes en muestras botánicas, de productos naturales y

bioquímicos.

8.- BIBLIOGRAFIA

Sitios Web:

https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa

https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_capa_fina

http://profe-farmacognosia.blogspot.com/2009/05/cromatografia-rf-relacion-de-frentes.html

http://apps.who.int/medicinedocs/es/d/Jh1790s/24.7.html

https://es.wikipedia.org/wiki/Capilaridad