Biomédica
Biomédica2004;24:413-22
2004;24:413-22
LPS Y POLIMIXINA B EN CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS
COMUNICACIÓN BREVE
Efecto del lipopolisacárido en
cultivos de células dendríticas humanas y
su inhibición por la polimixina B
Adriana Cuéllar 1, Ángela Fonseca 1, Alberto Gómez
1
2
2
Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.
Instituto de Genética Humana, Facultad de Medicina; Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.
Algunos estímulos de maduración utilizados en cultivos de células dendríticas, como las
proteínas recombinantes obtenidas en sistemas bacterianos o los extractos proteicos de
ectoparásitos, contienen lipopolisacáridos (LPS) y su presencia afecta el comportamiento de
las células dendríticas en cultivo. En este trabajo se evaluó el efecto del LPS en un sistema de
cultivo de células dendríticas humanas y la actividad de la polimixina B como inhibidor del
efecto del LPS. Para esto, los monocitos obtenidos a partir de sangre periférica humana se
diferenciaron a células dendríticas con IL-4 y GM-CSF y como estímulo de maduración se
utilizó LPS o PGE2/FNTα. La expresión de marcadores y la secreción de citocinas se evaluaron
por citometría de flujo. Los resultados mostraron que la preexposición a endotoxina disminuyó
la expresión de CD83, inhibió la secreción de IL-12p70, FNTα e IL-10 y disminuyó la secreción
de IL-6 en células dendríticas. Además, la utilización de 10 mg/ml de polimixina B fue efectiva
en la inhibición de la actividad de 1 mg/ml de LPS y la máxima concentración de polimixina B
que no afectó la morfología de las células fue de 50 mg/ml. En conclusión, la polimixina B es
efectiva para inhibir la actividad del LPS en los cultivos de células dendríticas.
Palabras clave: células dendríticas, citocinas, LPS, linfocitos.
Effect of lipopolysaccharides on human dentritic cell cultures and its inhibition by
polymyxin B
Dendritic cells have been described as effective antigen presenting cells. Human dentritic cells
are highly susceptible to lipopolysaccharide (LPS) tolerance, consisting of a differential
deactivation state in which some cellular functions are impaired. LPS tolerance can be
experimentally induced in vitro, in which the presence of LPS strongly affects the behavior of
cultured dendritic cells. Recombinant proteins obtained from bacterial systems or protein extracts
of ectoparasites containing LPS can be used as stimuli to enhance maturation processes in
these cells. The present study evaluated the effect of LPS in human dendritic cell cultures, and
the activity of polymyxin B as an inhibitor of the LPS effect. Dendritic cells were obtained from
peripheral blood monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF, followed by exposure with
LPS and PGE2/TNFα. Surface markers and cytokine levels were evaluated by flow cytometry.
The dendritic cells pre-exposed to single doses of endotoxin demonstrated a reduced capacity
to mature, reduced CD83 expression, inhibited secretion of IL-12, TNFα, IL-10 and diminished
secretion of IL-6. Furthermore, polymyxin B at 10 mg/ml inhibits LPS activity at 1 mg/ml. The
maximum polymyxin B concentration with no effect on cellular morphology was 50 mg/ml.
Consequently, polymyxin B was determined to be an effective LPS inhibitor in dendritic cell
cultures.
Key words: dendritic cells, cytokines, LPS, lymphocytes.
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Las células dendríticas son las células
presentadoras de antígenos más potentes, no sólo
por su capacidad para estimular la activación de
los linfocitos T a través de la presentación de
antígenos en el contexto del complejo mayor de
histocompatibilidad y la expresión de moléculas
coestimuladoras (1-3), sino también por su
capacidad para secretar citocinas que regulan la
respuesta efectora Th1 o Th2 del linfocito T (4-7).
En los tejidos, las células dendríticas se
encuentran en un estado inmaduro, caracterizado
por una alta actividad fagocítica y su activación
induce un proceso de migración a los órganos
linfoides secundarios. Durante la migración, las
células dendríticas entran en un proceso de
maduración que involucra la pérdida de la
capacidad fagocítica y aumenta sus propiedades
estimuladoras para las células T CD4+ y CD8+
vírgenes (8,9). La capacidad de migración de las
células dendríticas se ha demostrado in vitro (10).
Se ha reportado, también, que los monocitos se
pueden diferenciar a células dendríticas in vivo
(11). Este proceso ha sido reproducido in vitro,
utilizando citocinas como IL-4 y GM-CSF como
inductores de diferenciación de monocitos a
células dendríticas inmaduras y múltiples factores
de maduración para obtener células dendríticas
maduras como LPS, CpG, citocinas, complejos
inmunes, proteínas de choque térmico y ARN de
doble cadena (2,12-16).
El lipopolisacárido (LPS) es un importante
componente de la membrana externa de las
bacterias Gram negativas y actúa como un
potente activador de las células del sistema
inmune. Sin embargo, se ha descrito una
insensibilidad temporal de las células humanas
de la inmunidad innata a retos continuos con LPS
en humanos. Este fenómeno conocido como
desensibilización a la endotoxina o tolerancia a
LPS, se asocia con alteraciones funcionales de
células del sistema monocito/macrófago y células
Correspondencia:
Adriana Cuéllar, Carrera 7a No. 43-82, oficina 608, Edificio
Carlos Ortiz, Bogotá, D.C.
Teléfono: 320 8320, ext. 4020; fax: 320 8320, ext. 4021
acuellar@javeriana.edu.co
Recibido: 28/06/04; aceptado: 21/09/04
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dendríticas in vivo y se puede demostrar en
células aisladas in vitro (6,17-20).
En varios modelos de cultivo de células dendríticas
se ha demostrado que dosis únicas de LPS desde
el inicio del cultivo inhiben de manera dosis
dependiente, la producción de citocinas
proinflamatorias y la expresión del marcador de
maduración CD83+, lo cual se asocia con la
disminución de su actividad endocítica. De igual
manera, se encontró que estas células se
comportan como fuertes estimuladores de la
proliferación de linfocitos T, pero pobres inductores
de INFγ en una reacción mixta de leucocitos
(21,22).
Teniendo en cuenta que muchos de los estímulos
de maduración utilizados para evaluar la actividad
funcional de las células dendríticas, como las
proteínas recombinantes obtenidas en sistemas
bacterianos o los extractos proteicos de
ectoparásitos contienen LPS y que la presencia
de LPS puede afectar el comportamiento de las
células en cultivo, en este trabajo se buscó
evaluar el efecto de LPS en un sistema de cultivo
de células dendríticas humanas y la actividad de
la polimixina B como inhibidor del efecto del LPS.
Materiales y métodos
Purificación de monocitos
Los monocitos de sangre periférica se obtuvieron
de voluntarios humanos sanos, previo
consentimiento escrito, a partir de 40 ml de sangre.
Se obtuvieron células mononucleares de sangre
periférica en gradientes de Ficoll y se realizó una
separación de monocitos con anticuerpos
monoclonales anti-CD14 acoplados a perlas
magnéticas, utilizando el sistema de MiniMaCs
(Miltenyi). Las células obtenidas se lavaron en
medio base (RPMI 1640) con 2% de suero bovino
fetal (SBF). La viabilidad se evaluó con azul tripano
y se realizó conteo celular. La pureza de la
población se evaluó por citometría de flujo
utilizando un anticuerpo anti-CD14.
Diferenciación de monocitos a
células dendríticas
Todos los reactivos fueron probados para la
presencia de LPS utilizando el sistema de lisado
de amebocitos de Lymulus spp. (Bio Whittaker),
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siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
incubaron células CD14+ en medio completo
(RPMI 1640, antibióticos, aminoácidos no
esenciales, piruvato de sodio y 10% SFB) en
placas de 24 pozos a una densidad de 8x105/ml
en presencia de 500 U/ml de IL-4 y 50 ng/ml de
GM-CSF (R&D system, USA) durante 5 días y se
verificó su morfología por microscopia de luz. El
día 5 se adicionaron 5.000 U/ml de FNTα (R&D
Systems) y 10 mM de PGE2 (Sigma Chemical
Company) o 1 mg/ml de LPS de Escherichia coli
(Sigma Chemical Company) durante 48 horas. Los
sobrenadantes de los cultivos se congelaron a
-70°C hasta la cuantificación de citocinas. La
recuperación de células dendríticas al final del
cultivo se evaluó mediante conteo en cámara de
Neubauer de las células no adherentes y el
porcentaje de expresión de CD83 se evaluó por
citometría de flujo en las células no adherentes.
Para evaluar el efecto de LPS se realizaron
cultivos de células dendríticas libres de
endotoxina, utilizando como estímulo de
maduración 1 mg/ml de LPS en ausencia o
presencia de sulfato de polimixina B (Merck) en
diferentes concentraciones (1, 10 y 100 mg/ml).
Se utilizaron varias condiciones de cultivo en
RPMI completo, para obtener al día 7 de cultivo
diferentes fenotipos: 1) para obtener monocitos
como control de diferenciación: cultivo en
ausencia de citocinas y estímulos de maduración;
2) para obtener células dendríticas inmaduras:
adición de IL-4 y GM-CSF el día 0 en ausencia de
estímulos de maduración, y 3) para obtener
células dendríticas maduras: cultivos en presencia
de IL-4 y GM-CSF desde el día 0 con adición de
LPS o PGE2 y FNTα el día 5 de cultivo como
estímulo de maduración. Para evaluar el efecto
del LPS en los cultivos de células dendríticas, se
adicionó 1 mg de LPS el día 0 de cultivo y,
posteriormente, utilizando LPS (LPS/LPS) o
PGE2 y FNTα LPS-PGE2/FNTα) como estímulos
de maduración en el día 5. Para determinar la
máxima concentración de polimixina B que no afecta
la morfología celular, se utilizaron concentraciones
de 10 a 100 mg/ml de polimixina B.
Teniendo en cuenta que una de las características
de las células dendríticas diferenciadas a partir
de monocitos es que pierden su capacidad de
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adherencia, para evaluar el porcentaje de
recuperación total de células al final del cultivo,
se realizó un recuento de las células no
adherentes con respecto al número de células
cultivadas al día 0 (8x105/ml) y para determinar el
porcentaje de recuperación de células dendríticas
maduras se evaluó la expresión del marcador de
maduración CD83+ en las células no adherentes.
Citometría de flujo
Para evaluar la expresión de marcadores de
superficie se utilizó citometría de flujo de cuatro
colores con anticuerpos anti CD14.APC (clon
MfP9,BD Biosciences), anti HLA-DR.PerC (clon
L243, BD Biosciences), anti CD86.PE (clon MO
41726, Pharmingen) y anti CD83.FITC (clon
HB15e, Pharmingen), con controles de isotipo para
HLA-DR (IgG2α.PerCP-BD Biosciences), CD86
(IgG2β.PE-Pharmingen) y CD83 (IgG1.FITCPharmingen).
En total se colocaron 1x105 células en tubos de
citometría y se incubaron por 30 minutos a 4°C
en oscuridad con las diferentes combinaciones
de anticuerpos. Se realizaron tres lavados con
PBS, pH 7,2 y azida de sodio 0,1% y se
resuspendieron en solución de fijación (PBS 1x,
paraformaldehído al 1%). La adquisición y el
análisis de los datos se realizó usando un
citómetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, USA).
La cuantificación de citocinas se realizó con un
estuche comercial para detección de citocinas en
sobrenadantes de cultivo por citometría de flujo
(BD Biosciences), en el cual se utilizan perlas de
diferentes intensidades de fluorescencia en FL3,
cubiertas con anticuerpos de captura. El sistema
se revela con anticuerpos anticitocinas
conjugados con PE para IL-8, IL-1b, IL-6, IL-10,
FNTα e IL-12p70. El cálculo de la concentración
se realizó utilizando patrones de las diferentes
citocinas en concentraciones conocidas. La
sensibilidad del ensayo para cada una de las
citocinas fue para IL-8 3,6 pg/ml, IL-1b 7,2 pg/ml,
IL-6 2,5 pg/ml, IL-10 3,3 pg/ml, TNFα 3,7 pg/ml e
IL-12p70 1,9 pg/ml.
Regulaciones éticas
Este estudio se realizó teniendo en cuenta la
resolución No. 008430 del Ministerio de Salud de
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la República de Colombia, como investigación con
riesgo mínimo. Los individuos participaron en el
proyecto previa firma del consentimiento escrito,
y el manejo de muestras se realizó bajo las normas
de seguridad (precauciones universales) en el
Laboratorio de Inmunobiología y Biología Celular
del Departamento de Microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana. Además, este proyecto fue
aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de
Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.
Análisis de los resultados
Los resultados se muestran como el promedio de
tres experimentos independientes para cada
condición con desviación estándar.
Resultados
Purificación de monocitos y obtención de
células dendríticas
La separación de células CD14+ mediante la
utilización de perlas magnéticas permitió obtener
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entre el 6% y el 8% de las células mononucleares
de sangre periférica con viabilidad mayor del
95%. En todos los casos, el porcentaje de
pureza de las células CD14+ fue mayor de 90%
(figura 1A).
De acuerdo con el análisis de la expresión de
marcadores, se obtuvieron células dendríticas
inmaduras que fueron CD14-, CD86+, HLA-DR+
y CD83- (figura 1B) y células dendríticas maduras
que fueron CD14-, aumentaron su nivel de
expresión de CD86 y HLA-DR con respecto a las
células dendríticas inmaduras y fueron positivas
para el marcador de maduración CD83 (figura 1C).
Además, la morfología celular evaluada por
microscopía de luz permitió observar células
grandes y con prolongaciones de la membrana,
características de células dendríticas.
Los resultados mostraron que la preexposición a
LPS disminuyó el porcentaje de recuperación tanto
de células totales no adherentes como de células
Figura 1. Dispersograma representativo de las células obtenidas de un individuo, que muestra la pureza de las células
CD14+ obtenida después de la separación con perlas magnéticas (A). El fenotipo de las células al final del cultivo (día 7) para
células dendríticas inmaduras (B) y células dendríticas maduras (C) evaluado mediante la expresión de CD14, HLA-DR,
CD86 y CD83.
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dendríticas CD83+, utilizando los dos estímulos
de maduración (figura 2).
Efecto de LPS en la expresión de marcadores
y secreción de citocinas
El marcador CD14 fue negativo en células
dendríticas inmaduras y maduras, y se mantuvo
positivo en los monocitos. Los marcadores HLADR y CD86 fueron positivos en todos los casos y
su expresión no fue alterada por la preexposición
a LPS. La expresión de CD83 disminuyó en el
cultivo que contenía LPS desde el día 0 y que fue
madurado con LPS al día 5. Este efecto no se
observó cuando se utilizó PGE2 y FNTα como
estímulo de maduración.
Utilizando citometría de flujo, se cuantificaron las
citocinas secretadas por las células al día 5 y 7
de cultivo. Al día 5 de cultivo, en condiciones libres
de endotoxina, las células dendríticas inmaduras
secretaron bajas cantidades de IL-8, con la adición
Figura 2. Porcentaje de recuperación total de células no
adherentes y de células dendríticas maduras CD83+ al final
del cultivo. La línea punteada muestra el porcentaje de
recuperación de las células no adherentes al final del cultivo
y las barras representan el porcentaje de recuperación de
células dendríticas CD83+. Estos valores se obtuvieron
con respecto al número de células cultivadas al día 0 (8x105).
de LPS en el día 0 de cultivo, se encontraron bajas
cantidades de IL-10 y altos niveles de IL-6, IL1β e IL-8 (cuadro 1).
Utilizando LPS como estímulo de maduración en
condiciones libres de LPS al día 0, se observó
producción de IL-12p70, FNTα, IL-10, IL-6, IL-8 y
baja secreción de IL-1β. La preexposición a LPS
inhibió la secreción de IL-12p70, FNTα e IL-10 y
disminuyó la secreción de IL-6. Los niveles de IL1b e IL-8 fueron mayores cuando se adicionó LPS
al día 0 (figura 3).
Utilizando PGE2 y FNTα como estímulo de
maduración en condiciones libres de LPS al día
0, se observó producción de FNTα e IL-8. La preexposición a LPS no alteró la secreción de FNTα,
se observó una baja secreción de IL-6 y
considerable aumento de IL-1b e IL-8 (figura 3).
Actividad inhibidora de polimixina B
Los resultados se muestran como el porcentaje
de inhibición con respecto al control de
estimulación con LPS, y se observa que la
inhibición en la expresión del marcador de
maduración CD83 aumenta de una manera dosis
dependiente (figura 4). La expresión de CD86 y
HLA-DR es inhibida con altas dosis de polimixina
(figura 4).
Teniendo en cuenta que en condiciones libres de
endotoxina se encuentra secreción de IL-12p70,
FNTα, IL-10, IL-6 e IL-8 al utilizar como estímulo
de maduración LPS al día 5 de cultivo, se procedió
a evaluar la secreción de estas citocinas en
presencia de polimixina B. La secreción de IL-10
fue completamente inhibida en más del 98% en
cada una de las diferentes concentraciones de
polimixina B. En presencia de 10 mg/ml de
polimixina B, IL-12p70 e IL-6 mostraron una
inhibición cercana al 80%; la secreción de IL-8 se
Cuadro 1. Citocinas secretadas por células dendríticas inmaduras (pg/ml).
PBS
LPS
IL-12 p70
FNTα
α
IL-10
IL-6
IL-1β
β
IL-8
0
0
0
<3,7
0
52,7 (18,1)
0
2.140 (289)
<7,2
171 (28)
101 (41)
8,310 (1.036)
Cuantificación de citocinas en el sobrenadante del cultivo al día 5 sin PBS o con LPS preexposición a endotoxina el primer
día de cultivo. Los resultados son el promedio de tres experimentos independientes; los valores en paréntesis corresponden
a la desviación estándar.
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Figura 3. Cuantificación de citocinas en sobrenadante de cultivo al día 7. Los datos representan el valor de citocinas en
pg/ml, cuantificadas en sobrenadante de cultivo realizado en las diferentes condiciones.
inhibió en 50%, aproximadamente, y el FNTα
mostró inhibición casi total. En presencia de 100
mg/ml de polimixina B se observó una inhibición
casi total de todas las citocinas (figura 5).
Al analizar la morfología de las células por tamaño
(FSC) y complejidad interna (SSC) por citometría
de flujo, se observó que la mayor concentración
de polimixina B utilizada (100 mg/ml) alteró la
morfología de las células, por lo cual se utilizaron
diferentes concentraciones de este inhibidor para
determinar la máxima concentración que no afecta
la morfología de las células. Se encontró una
distribución normal de las células en FSC y SSC
hasta una concentración de 50 mg/ml. A mayores
concentraciones, el dispersograma mostró
evidentes alteraciones morfológicas.
Discusión
La principal respuesta de los linfocitos T CD4+ es
la producción de citocinas, las cuales se encargan
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de regular el tipo de mecanismo efector generado
para un tipo de agresión en particular. Sin
embargo, no todas las células producen el mismo
patrón de citocinas. En general, los linfocitos T
CD4+ se pueden diferenciar hacia linfocitos Th1
o Th2 dependiendo del microambiente
encontrado en el momento de la activación
linfoide, el cual depende en gran medida de las
señales generadas por la célula presentadora de
antígenos.
Las células dendríticas han sido consideradas las
células presentadoras de antígenos por
excelencia; de ellas dependen las señales iniciales
inducidas por la expresión de moléculas
coestimuladoras y la secreción de citocinas. Los
estudios sobre fenómenos inmunes en
condiciones in vitro, no necesariamente reflejan
los eventos ocurridos in vivo, más aún cuando la
presencia de contaminantes como el LPS afectan
el comportamiento de las células en cultivo.
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LPS Y POLIMIXINA B EN CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS
Aunque los modelos descritos para la obtención
de células dendríticas varían en algunas
condiciones de cultivo, en general, se han utilizado
citocinas como IL-4 y GM-CSF para la
diferenciación de monocitos a células dendríticas
con diferentes estímulos de maduración para las
células, como LPS y la combinación de PGE2 y
FNTα, entre otros (21,23-27).
Con el sistema de cultivo utilizado en el presente
estudio se obtuvieron cultivos de células
dendríticas inmaduras y maduras, y se mostró
que la preexposición a LPS disminuyó el
porcentaje de recuperación de células dendríticas
maduras al final del cultivo. Datos similares se
han reportado previamente (22,28), aun cuando
las condiciones de cultivo se diferencian con el
presente estudio en cuanto a la adición de
citocinas los días 2 y 5 de cultivo y en cuanto a
que las concentraciones de LPS utilizadas fueron
menores (0,2 y 10 ng/ml).
En cuanto a la secreción de citocinas, en las
células dendríticas inmaduras obtenidas al día 5
de cultivo que han estado preexpuestas a
endotoxina no se encontró secreción de IL-12,
aunque en otro estudio se reportó secreción de
bajos niveles de IL-12 (3 pg/ml) (28). Al final del
cultivo, se observó que la preexposición a LPS
inhibió la secreción de IL-12, FNTα, IL-10 y
disminuyó de IL-6 (22,29). A diferencia de lo
previamente reportado (21), no se encontró
producción de IL-12 en células maduradas con
PGE2/FNTα. Teniendo en cuenta que existen
algunas diferencias en el sistema de cultivo, esto
podría indicar que la adición de citocinas a
diferentes días de cultivo afecta selectivamente
la capacidad funcional de las células.
La polimixina B actúa como un inhibidor de los
efectos de LPS como inducción de hemólisis (30),
efectos tóxicos en ratón (31), respuesta
mitogénica de células de bazo de ratón (32),
migración de macrófagos in vitro, liberación de IL1 por monocitos y activación policlonal de linfocitos
B (33).
De acuerdo con los resultados obtenidos con la
utilización de polimixina B, se puede afirmar que
hay un efecto inhibitorio de LPS dosis dependiente
en la maduración de las células dendríticas.
Figura 4. Inhibición de la expresión de marcadores de células
dendríticas en cultivos libres de endotoxina, al adicionar 1
mg de LPS como estímulo de maduración al día 5 de cultivo
en presencia o ausencia de polimixina B. Los resultados se
muestran como el porcentaje de inhibición de la expresión
del marcador en presencia de polimixina B, con respecto a
las células cultivadas en ausencia de polimixina B, en tres
experimentos independientes.
Utilizando 10 mg de polimixina B se logró una
inhibición de 70% en la expresión de marcadores
y secreción de citocinas, cuando se utilizó 1 mg/
ml de LPS. Además, se encontró que la máxima
concentración de polimixina B utilizada que no
afectó la morfología de las células en cuanto a
tamaño y complejidad interna fue de 50 mg/ml. La
concentración de 100 mg/ml de polimixina B se
utilizó para evaluar el efecto de un exceso de dicho
compuesto en la morfología de las células con
respecto a tamaño y complejidad interna, y se
observó una alteración en estos parámetros.
Los resultados obtenidos permiten concluir que
la presencia de LPS en los cultivos de células
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Figura 5. Inhibición de la secreción de citocinas inducidas por LPS, en presencia de polimixina B. Los resultados se
muestran como el porcentaje de inhibición de la concentración de citocinas, con respecto a las células cultivadas en
ausencia de polimixina B.
dendríticas humanas afecta la capacidad de
maduración de las mismas y de su actividad
funcional en términos de secreción de citocinas,
y que este efecto varía dependiendo del sistema
de cultivo utilizado de acuerdo con lo reportado
en la literatura. Además, la utilización de 10 mg/
ml de polimixina B es efectiva en la inhibición de
la actividad de 1 mg/mL de LPS. La utilización de
proteínas recombinantes obtenidas en sistemas
bacterianos o extractos proteicos de ectoparásitos
que contienen LPS como estímulos de
maduración requiere la estandarización de la
cantidad de polimixina B, utilizando un máximo
de 50 mg/ml, de acuerdo con la cantidad de LPS
que contengan dichos estímulos.
secreción de IL-12 podría desviar la respuesta
linfoide hacia Th1. Éste ocasionaría el
enmascaramiento de la respuesta que ocurre en
condiciones naturales frente a diferentes
estímulos. Así, en términos generales, la
determinación de las condiciones de cultivo
libres de LPS como la que se presenta en este
informe será fundamental para evitar los
sesgos en el análisis de la inmunidad innata
y adquirida.
Los cultivos de células dendríticas utilizadas en
estudios de maduración de las mismas o en
inducción de respuesta linfoide T requieren la
definición de las condiciones adecuadas para cada
sistema de cultivo, ya que la presencia de
contaminantes como el LPS que inducen la
Un especial agradecimiento a Manuel Franco y
Juanita Angel, profesores investigadores del
Instituto de Genética Humana de la Pontificia
Universidad Javeriana, por su colaboración en el
desarrollo de este trabajo, y por su lectura crítica
del manuscrito final.
420
Agradecimientos
El presente trabajo fue realizado gracias al apoyo
financiero de la Vicerrectoría Académica de la
Pontificia Universidad Javeriana.
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