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WO2023140040A1 - アミダイトモノマー - Google Patents

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Publication number
WO2023140040A1
WO2023140040A1 PCT/JP2022/047371 JP2022047371W WO2023140040A1 WO 2023140040 A1 WO2023140040 A1 WO 2023140040A1 JP 2022047371 W JP2022047371 W JP 2022047371W WO 2023140040 A1 WO2023140040 A1 WO 2023140040A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
compound
general formula
mmol
hydrogen atom
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/047371
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩之 浅沼
神谷 由紀子 加藤
史経 佐藤
Original Assignee
国立大学法人東海国立大学機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東海国立大学機構 filed Critical 国立大学法人東海国立大学機構
Priority to EP22922190.8A priority Critical patent/EP4467644A4/en
Priority to CN202280089516.0A priority patent/CN118632854A/zh
Priority to JP2023575155A priority patent/JPWO2023140040A1/ja
Publication of WO2023140040A1 publication Critical patent/WO2023140040A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to amidite monomers and the like.
  • non-cyclic polynucleotide contains a palindromic structure represented by the general formula (2): A 1 -B-A 2 (wherein A 1 and A 2 represent nucleotide sequences complementary to each other, and B represents an arbitrary nucleotide sequence), there is a problem that even if there is some mismatch, it will form a self-duplex and cannot bind to the target polynucleotide (miRNA, mRNA, etc. in vivo).
  • Patent Document 1 describes that this problem can be solved by a single-stranded polynucleotide in which adenine in the palindromic structure is replaced with diaminopurine and thymine at the position complementary to the adenine is replaced with a thiouracil derivative (2-thiouracil, 2-thiothymine, etc.) in a single-stranded polynucleotide containing a palindromic structure containing acyclic polynucleotide constituent units.
  • Patent Document 1 in the case of synthesizing an acyclic single-stranded polynucleotide containing diaminopurine and/or thiouracil derivatives by the phosphoramidite method, the use of conventional amidite monomers of diaminopurine and thiouracil derivatives results in the problem that various impurities remain.
  • An object of the present invention is to provide a diaminopurine amidite monomer and/or a thiouracil derivative amidite monomer that can be suitably used for synthesizing an acyclic single-stranded polynucleotide containing diaminopurine and/or a thiouracil derivative by the phosphoramidite method.
  • the present inventor found that if the amidite monomer of a diaminopurine and/or the amidite monomer of a thiouracil derivative are protected with a specific base-removable protecting group, the deprotection of the base moiety can be carried out at a higher efficiency, and the target acyclic polynucleotide can be obtained at a higher yield.
  • the present inventor completed the present invention by further research based on this knowledge. That is, the present invention includes the following aspects.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom or an organic group.
  • R 3 and R 4 are the same or different and represent a hydroxyl-protecting group.
  • R5 and R6 are the same or different and represent an alkyl group.
  • R 7 , R 8 , R 9 , and R 10 are the same or different and represent a hydrogen atom or a base-removable protecting group (except when all of them are hydrogen atoms), and at least one of the base-removable protecting groups has the general formula (a):
  • R a represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • p represents an integer of 1 to 3.
  • R11 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • n is an integer of 1-3.
  • m represents an integer from 0 to 3.
  • Section 2 wherein at least one of R 7 and R 8 is a group represented by general formula (a), and at least one of R 9 and R 10 is a group represented by general formula (a).
  • Item 3. The compound, a salt thereof, or a solvate thereof according to item 1 or 2, wherein said n is 1, said m is 0, said R a is a hydrogen atom, and said p is 1.
  • R 3 is represented by general formula (b):
  • R 31 , R 32 and R 33 are the same or different and represent a hydrogen atom or an alkoxy group. ] said R 4 is -(CH 2 ) 2 -CN, and said R 5 and said R 6 are isopropyl groups, or a salt thereof, or a solvate thereof according to any one of Items 1 to 3.
  • Item 5 A reagent containing the compound according to any one of Items 1 to 4, a salt thereof, or a solvate thereof.
  • Item 6 which is a polynucleotide manufacturing reagent.
  • Item 7 A method for producing a single-stranded polynucleotide by the phosphoramidite method, using the compound according to any one of claims 1 to 4, a salt thereof, or a solvate thereof as an amidite monomer.
  • diaminopurine amidite monomers and/or thiouracil derivative amidite monomers that can be suitably used for synthesizing acyclic single-stranded polynucleotides containing diaminopurine and/or thiouracil derivatives by the phosphoramidite method.
  • deprotection of the base moiety can be performed with higher efficiency, and the desired acyclic polynucleotide can be obtained with a higher yield.
  • FIG. 4 shows a MALDI-TOF-MS chart of the crude SNA polynucleotide synthesized in Example 3.
  • FIG. 4 shows a MALDI-TOF-MS chart of the crude SNA polynucleotide synthesized in Example 4.
  • FIG. 4 shows a MALDI-TOF-MS chart of the crude SNA polynucleotide synthesized in Example 4.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom or an organic group.
  • the organic group represented by R 1 or R 2 is not particularly limited, and examples thereof include hydrocarbon groups.
  • the hydrocarbon group represented by R 1 or R 2 is preferably a chain hydrocarbon group.
  • chain hydrocarbon groups include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, etc. Among them, alkyl groups are preferred. Specific examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group and 3-methylpentyl group.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon group is not particularly limited.
  • the number of carbon atoms is preferably 1-8, more preferably 1-6, still more preferably 1-4, even more preferably 1-2, and particularly preferably 1. Further, an alkyl group containing an alkynyl group (--C.ident.C--, --C.ident.CH) at the terminal or inside thereof, which enables the introduction of various functional groups by a click reaction or the like, is more preferable.
  • a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom or functional group from various molecules such as molecules used for modifying polynucleotides
  • molecules include polyethylene glycol chains, dye molecules, polycations (spermine), groove binders, amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, metal ligands, photocleavable functional groups, sugar chains and the like.
  • a click reaction eg, the reaction of an alkyne and an azide described above
  • At least one of R 1 and R 2 is preferably a hydrogen atom.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom or a chain hydrocarbon group
  • R 2 is preferably a hydrogen atom, from the viewpoint of binding to target polynucleotides such as miRNA.
  • R 3 and R 4 are the same or different and represent a hydroxyl-protecting group.
  • R 3 any group capable of functioning as a hydroxyl-protecting group can be used without any particular limitation, and a wide range of known protecting groups used in amidite monomers can be used.
  • R 3 preferably includes a group represented by general formula (b).
  • R 31 , R 32 and R 33 are the same or different and represent a hydrogen atom or an alkoxy group.
  • R 31 , R 32 and R 33 is preferably hydrogen, and the remaining two are preferably alkoxy groups, and the alkoxy group is particularly preferably a methoxy group.
  • R 4 any group capable of functioning as a hydroxyl-protecting group can be used without particular limitation, and a wide range of known protecting groups used in amidite monomers can be used.
  • R 4 is preferably an alkyl group substituted with an electron-withdrawing group.
  • the electron-withdrawing group include a cyano group, a nitro group, an alkylsulfonyl group, a halogen, an arylsulfonyl group, a trihalomethyl group, a trialkylamino group, and the like, preferably a cyano group.
  • R 4 is particularly preferably -(CH 2 ) 2 -CN.
  • R5 and R6 are the same or different and represent an alkyl group.
  • the alkyl group represented by R 5 or R 6 may be linear or branched, preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl groups here also include alkyl moieties such as alkoxy groups.
  • R5 and R6 may combine with each other to form a cyclic structure.
  • Both R 5 and R 6 are particularly preferably isopropyl groups.
  • R 7 , R 8 , R 9 , and R 10 are the same or different and represent a hydrogen atom or a base-removable protecting group (except when all are hydrogen atoms), and at least one of the base-removable protecting groups represents a group represented by general formula (a).
  • Ra represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • p is an integer from 1 to 3;
  • the alkyl group represented by R a is linear or branched (preferably branched), more preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, still more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl group represented by Ra is particularly preferably isopropyl group.
  • Ra is particularly preferably a hydrogen atom.
  • p is particularly preferably 1.
  • At least one of R7 and R8 is a group represented by general formula (a), and at least one of R9 and R10 is a group represented by general formula (a).
  • the base-removable protecting group is not particularly limited except for the group represented by the general formula (a), but preferably includes an alkoxyacyl group (e.g., methoxyacetyl group, etc.), an alkanoyl group (e.g., isobutyryl group, pivaloyl group, etc.), benzoyl group, and the like.
  • an alkoxyacyl group e.g., methoxyacetyl group, etc.
  • an alkanoyl group e.g., isobutyryl group, pivaloyl group, etc.
  • benzoyl group e.g., benzoyl group, and the like.
  • R11 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • n is an integer of 1-3.
  • m represents an integer from 0 to 3.
  • the alkyl group represented by R 11 may be linear or branched, more preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, still more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl group represented by R a is particularly preferably a methyl group.
  • R 11 is preferably a hydrogen atom or a methyl group, more preferably a hydrogen atom.
  • n is particularly preferably 1.
  • n is particularly preferably 0.
  • R12 is a base-removable protecting group.
  • the base-removable protecting group is not particularly limited, and for example, the protecting groups described above can be employed.
  • R x1 , R x2 , R x3 and R x4 can be the same or different and can be hydrogen atoms or organic groups.
  • R x1 and R x4 can be the same or different and can be hydrogen atoms or electron donating groups
  • R x2 and R x3 can be the same or different and can be hydrogen atoms or electron withdrawing groups.
  • R y1 , R y2 , R y3 and R y4 can be the same or different and can be hydrogen atoms or organic groups.
  • R y1 and R y4 can be the same or different and can be hydrogen atoms or electron donating groups
  • R y2 and R y3 can be the same or different and can be hydrogen atoms or electron withdrawing groups.
  • the salt of the compound represented by general formula (1A) or (1B) is not particularly limited and includes, for example, salts with inorganic bases such as sodium salts, magnesium salts, potassium salts, calcium salts and aluminum salts; salts with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine; salts with basic amino acids such as lysine, ornithine and arginine, and ammonium salts.
  • inorganic bases such as sodium salts, magnesium salts, potassium salts, calcium salts and aluminum salts
  • salts with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine
  • salts with basic amino acids such as lysine, ornithine and arginine, and ammonium salts.
  • the salt may be an acid addition salt, and specific examples of such salts include mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, malic acid, tartaric acid, fumaric acid, succinic acid, lactic acid, maleic acid, citric acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, and ethanesulfonic acid; and acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid. Acid addition salts are included.
  • mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid
  • organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, malic acid, tartaric acid, fumaric acid, succ
  • the solvate of the compound represented by general formula (1A) or (1B) or a salt thereof is not particularly limited, and examples thereof include solvates with solvents such as water, ethanol, glycerol, and acetic acid.
  • the compounds of the present invention can be produced by a variety of methods.
  • An example of the compound represented by general formula (1A) can be produced, for example, using a protective group-added base produced according to or according to the following scheme, and then according to or according to the method described in Example 1.
  • An acid chloride eg, Phenoxyacetyl Chloride
  • an anhydride such as the compound represented by the general formula (1A2).
  • the amount of the compound represented by the general formula (1A2) to be used is usually preferably 1 to 3 mol, more preferably 1.5 to 2.5 mol, per 1 mol of the compound represented by the general formula (1A1), from the viewpoint of yield, ease of synthesis, etc.
  • reaction solvent examples include, but are not limited to, pyridine, dimethylformamide, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, acetone, toluene, ethanol and the like, preferably pyridine and the like.
  • a single solvent may be used, or a plurality of solvents may be used in combination.
  • This reaction can also be carried out in the presence of a base such as N,N-dimethylaminopyridine.
  • additives can be used as appropriate within a range that does not significantly impair the progress of the reaction.
  • the reaction temperature can be under heating, under normal temperature, or under cooling, and it is usually preferable to carry out at 10 to 100°C.
  • the reaction time is not particularly limited, and can usually be 30 minutes to 30 hours.
  • the progress of the reaction can be followed by conventional methods such as chromatography. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and the product can be isolated and purified by conventional methods such as chromatography and recrystallization. Also, the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (ESI-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR and the like.
  • An example of the compound represented by the general formula (1B) can be produced, for example, using a protecting group-added base produced according to or according to the following scheme (X is a halogen atom such as -Cl, -Br, -I; or an electron-withdrawing group such as -CF 3 , -CCl 3 , -NO 2 , -CN, -OTs), and then according to or according to the method described in Example 2.
  • X is a halogen atom such as -Cl, -Br, -I; or an electron-withdrawing group such as -CF 3 , -CCl 3 , -NO 2 , -CN, -OTs
  • the compound represented by the general formula (1B1) a commercially available compound can be used as it is, or a compound synthesized according to or according to a known method can be used as necessary.
  • the compound represented by the general formula (1B2) a commercially available compound can be used as it is, or a compound synthesized according to or according to a known method and/or according to or according to the method described in the Examples can be used as necessary.
  • the amount of the compound represented by the general formula (1B2) to be used is usually preferably 1 to 3 mol, more preferably 1.5 to 2.5 mol, per 1 mol of the compound represented by the general formula (1B1), from the viewpoint of yield, ease of synthesis, etc.
  • reaction is usually carried out in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent include, but are not limited to, ethanol, pyridine, dimethylformamide, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, acetone, and toluene, preferably ethanol.
  • a single solvent may be used, or a plurality of solvents may be used in combination.
  • This reaction is preferably carried out in the presence of a base such as potassium hydroxide and triethylamine.
  • a base such as potassium hydroxide and triethylamine.
  • additives can be used as appropriate within a range that does not significantly impair the progress of the reaction.
  • the reaction temperature can be under heating, under normal temperature, or under cooling, and it is usually preferable to carry out at 10-50°C.
  • the reaction time is not particularly limited, and can usually be 30 minutes to 30 hours.
  • the progress of the reaction can be followed by conventional methods such as chromatography. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and the product can be isolated and purified by conventional methods such as chromatography and recrystallization. Also, the structure of the product can be identified by elemental analysis, MS (ESI-MS) analysis, IR analysis, 1 H-NMR, 13 C-NMR and the like.
  • the present invention relates to a reagent (which may be referred to herein as "reagent of the present invention") containing the compound of the present invention. This will be explained below.
  • the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the compound of the present invention, and may contain other components as necessary.
  • Other ingredients are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable ingredients.
  • Other components include additives as well as components having pharmacological actions. Examples of additives include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, perfumes, chelating agents, and the like.
  • the content of the compound of the present invention in the reagent of the present invention is, for example, 0.001-100% by mass.
  • the mode of use of the reagent of the present invention is not particularly limited, and an appropriate mode of use can be adopted according to its type.
  • the reagents of the present invention can be, for example, polynucleotide-producing reagents.
  • kits may optionally include other reagents and instruments (eg, reagents and instruments used in the production of polynucleotides).
  • the present invention relates to a method for producing a single-stranded polynucleotide by the phosphoramidite method using the compound of the present invention (herein, referred to as "the production method of the present invention"). This will be explained below.
  • the phosphoramidite method can be performed according to a known method using, for example, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer. ⁇ (A)5' ⁇ ( ⁇ ) ⁇ ( ⁇ R 3 ⁇ ) ⁇ (B) ⁇ (C) ⁇ 5' ⁇ ( ⁇ ) ⁇ ( ⁇ (B) ⁇ R 3 ⁇ ) ⁇ (D) ⁇ (E) ⁇ ( ⁇ R 4 ) ⁇ ( ⁇ R 7 ⁇ R 10 ⁇ ) ⁇ (F)5' ⁇ ( ⁇ ) ⁇ ( ⁇ R 3 ⁇ ) ⁇ By repeating steps (A) to (D), a compound containing a polynucleotide backbone of desired chain length can be produced.
  • step (C) it is preferable to use a compound corresponding to the structure of the group represented by general formula (a) (the compound represented by general formula 1A2 above). This makes it possible to further suppress insufficient deprotection and poor synthesis in the step (E).
  • step (D) it is preferable to use a solution containing iodine/water as an oxidizing agent.
  • step (E) deprotection is performed with a base such as aqueous ammonia.
  • a base such as aqueous ammonia.
  • sodium hydrogen sulfide final concentration is preferably 20 to 100 mM, more preferably 40 to 60 mM.
  • step (E) does not include a deprotection step with an acid.
  • step (E) and before step (F) it is preferable to perform chromatographic purification (e.g., reverse-phase chromatographic purification) using the hydrophobicity of the 5'-protecting group (hydrophobic group). This can further increase the purity of the desired single-stranded polynucleotide.
  • chromatographic purification e.g., reverse-phase chromatographic purification
  • RNA can be isolated using methods of precipitation, extraction and purification. Specifically, a method of precipitating RNA by adding a solvent such as ethanol or isopropyl alcohol with low solubility for RNA to the solution after the reaction, or a method of adding a solution of phenol/chloroform/isoamyl alcohol to the reaction solution and extracting RNA into the aqueous layer is adopted. After that, it can be isolated and purified by known high performance liquid chromatography (HPLC) techniques such as reverse phase column chromatography, anion exchange column chromatography, affinity column chromatography, and the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the single-stranded polynucleotide to be produced by the production method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a palindromic structure containing non-cyclic polynucleotide constituent units and contains diaminopurine and/or thiouracil derivatives (2-thiouracil, 2-thiothymine, etc.) as bases.
  • the non-cyclic polynucleotide structural unit is not particularly limited as long as it is a structural unit corresponding to a nucleotide that constitutes a polynucleotide and does not contain a sugar backbone.
  • the non-cyclic polynucleotide structural unit typically, the general formula (1):
  • nucleic acid base any base that constitutes a nucleic acid can be used without any particular limitation.
  • Bases constituting nucleic acids include not only typical bases in natural nucleic acids such as RNA and DNA (adenine (A), thymine (T), uracil (U), guanine (G), cytosine (C), etc.), but also bases other than these, such as hypoxanthine (I), modified bases, and the like.
  • Modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (e.g., 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (e.g., 5-ethyluracil), 5-halouracil (5-bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl-2-thio Uracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2
  • *1 and *2 indicate directions in constructing a polynucleotide.
  • R 1 is an organic group and R 2 is a hydrogen atom
  • *1 is on the 3' side and *2 is on the 1' side.
  • R 1 is a hydrogen atom and R 2 is an organic group
  • *1 is on the 1' side and *2 is on the 3' side.
  • R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a hydrogen atom
  • *1 is the (S) side
  • *2 is the (R) side.
  • structural units other than non-cyclic polynucleotide structural units are not particularly limited, and structural units of various artificial nucleic acids including natural nucleic acids, aTNA and SNA can be employed.
  • Specific examples of usable nucleic acids include, in addition to DNA, RNA, etc., those subjected to known chemical modifications, as exemplified below.
  • the phosphate residue of each nucleotide can be replaced with chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, and phosphorodithionate.
  • the 2' hydroxyl group of the sugar (ribose) of each ribonucleotide may be substituted with -OR (R represents, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE ) , CH2CH2NHC (NH) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN , etc.).
  • R represents, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE ) , CH2CH2NHC (NH) NH2 , CH2CONHCH3 , CH2CH2CN , etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • the conformation of the sugar portion is fixed to the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar portion of a nucleotide, can also be preferably used.
  • the number of each of the diaminopurine and thiouracil derivatives is particularly preferably two or more.
  • the upper limit of the number is not particularly limited, and is 50, 20, 10, 5, for example.
  • the ratio of the total number of diaminopurine and thiouracil derivatives to 100% of the single-stranded polynucleotide base number is, for example, 10-90%, preferably 20-80%, more preferably 30-70%, and even more preferably 40-60%.
  • the ratio of non-cyclic polynucleotide constituent units to 100% of the polynucleotide constituent units (number of nucleotides) constituting the single-stranded polynucleotide is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and particularly preferably 100% (that is, the single-stranded polynucleotide of the present invention consists of non-cyclic polynucleotide constituent units).
  • the base length of the single-stranded polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 6-10000.
  • the base length is preferably 6 to 1000, more preferably 6 to 500, even more preferably 6 to 200, even more preferably 6 to 100, and particularly preferably 6 to 50, from the viewpoint of ease of synthesis and the like.
  • the purified product was dissolved in a small amount of CHCl 3 , and about 500 ml of n-hexane was added and well suspended. After suction filtration, the filter cake was washed with n-hexane and dried in a vacuum.
  • Compound 6 was obtained as a white solid, 2.34 g (2.22 mmol), 60% yield.
  • the purified product was dissolved in a small amount of CHCl 3 , and about 500 ml of n-hexane was added and well suspended. After suction filtration, the filter cake was washed with n-hexane and dried in a vacuum.
  • Compound 15 was obtained as a white solid, 3.5 g (3.79 mmol), 60% yield.
  • FIG. 1 shows the MALDI-TOF-MS chart of the crude product (before HPLC purification in the above scheme).
  • a peak of the desired sequence [M+H] + ) (including ionic coordination) was observed with high intensity, and other peaks only slightly confirmed insufficient deprotection. Regarding insufficient deprotection, it was speculated that deprotection would be completed without problems if the deprotection time was extended.
  • Example 4 Synthesis of single-stranded polynucleotides 2 According to the scheme of Example 3, using the amidite monomer (Pac 2 D-SNA amidite monomer, Compound 6) synthesized in Example 1 and the amidite monomer (4-AcetoxybenzylsU-SNA amidite monomer, Compound 15) synthesized in Example 2, an SNA polynucleotide containing 2,6-diaminopurine (D) and 2-thiouracil (sU) as bases (base sequence: (S)-CDD CDsU CD G TCsU G DsU DDG CTA-(R) (SEQ ID NO: 1)) was synthesized on a solid-phase synthesizer by the phosphoramidite method.
  • Phenoxyacetic anhydride was used instead of Acetic anhydride. After synthesis, it was cut out and deprotected at NH 3 aq (containing 50 mM sodium hydrogen sulfide) at 55°C for 3 h.
  • FIG. 2 shows a MALDI-TOF-MS chart of the crude product (before HPLC purification in the scheme of Example 3). A high intensity peak (including ion coordination) for the desired sequence ([M+H] + ) was observed.
  • an SNA polynucleotide containing 2,6-diaminopurine (D) as a base was synthesized by the phosphoramidite method in the same manner as in Example 3 using a solid-phase synthesizer. After synthesis, cleavage and deprotection treatment were performed at NH 3 aq at 55°C. At this time, the reaction was carried out for a long time (about 10 hours). When the crude product was subjected to MS analysis, a strong peak was observed indicating that the deprotection was an impurity or a peak presumed to be a reaction intermediate. If the reaction is carried out for a longer period of time, the hydrolysis of the SNA skeleton proceeds and the yield decreases.
  • D 2,6-diaminopurine
  • reaction conditions 1 3-Bromopropionitrile, Et3N , DMF 2: 3-Bromopropionitrile, NaH, DMF 3: 3 - Bromopropionitrile, K2CO3DMF 4: 3-Bromopropionitrile, KOH, H2O /EtOH (1:1)
  • Pac 2 DL-aTNA amidite monomer was obtained as a white solid, 1.65 g (1.56 mmol), 57% yield.
  • Example 2 The above compound (4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer) was synthesized in the same manner as compound 15 (4-AcetoxybenzylsU-SNA amidite monomer) in Example 2. Specifically, it was synthesized in the same manner as in Example 2, except that L-aTNA was used in place of SNA in (2) of Example 2-7.
  • Example 7 Synthesis of single-stranded polynucleotides 3 According to the scheme of Example 3, using the amidite monomer (Pac 2 DL-aTNA amidite monomer) synthesized in Example 5 and the amidite monomer (4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer) synthesized in Example 6, an L-aTNA polynucleotide containing 2,6-diaminopurine (D) and 2-thiouracil (sU) as bases was synthesized by a phosphoramidite method using a solid-phase synthesizer. . As a capping reagent, Phenoxyacetic anhydride was used instead of Acetic anhydride. After synthesis, it was cut out and deprotected at NH 3 aq (containing 50 mM sodium hydrogen sulfide) at 55°C for 3 h.
  • NH 3 aq containing 50 mM sodium hydrogen sulfide

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Abstract

ジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体を含む非環状型一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による合成に好適に使用することができる、ジアミノプリンのアミダイトモノマー及び／又はチオウラシル誘導体のアミダイトモノマーを提供することを課題とする。当該課題を、塩基で除去可能な特定の保護基で保護した、ジアミノプリンのアミダイトモノマー及び／又はチオウラシル誘導体のアミダイトモノマー、により解決する。

Description

アミダイトモノマー
　本発明は、アミダイトモノマー等に関する。
　SNA（serinol nucleic acid）、aTNA（acyclic threoninol nucleic acid）等の人工ポリヌクレオチドは、配列特異的にDNA及びRNAを認識することが報告されている。これらは、糖骨格を有さない非環状型ポリヌクレオチドであるので、生体内の酵素による分解に対して耐性が高い。また、合成が容易であるといわれている。このため、非環状型ポリヌクレオチドは、抗miRNA、抗mRNA、siRNA等、さらにはモレキュラービーコン等としての利用が期待されている。
国際公開第2021/153762号
　非環状型ポリヌクレオチドが一般式（2）：A1－B－A2（式中：A1及びA2は互いに相補的な塩基配列を示す。Bは任意の塩基配列を示す。）で示される回文構造を含む場合は、多少のミスマッチがあっても自己二重鎖を形成してしまい、対象ポリヌクレオチド（生体内のmiRNA、mRNA等）に結合できない、という問題が存在する。特許文献１では、この問題を、非環状型ポリヌクレオチド構成単位を含む回文構造を含む一本鎖ポリヌクレオチドにおいて、回文構造中のアデニンがジアミノプリンに置き換えられ且つ前記アデニンの相補位置のチミンがチオウラシル誘導体（2-チオウラシル、2-チオチミン等）に置き換えられてなる、一本鎖ポリヌクレオチド、により解決できることが記載されている。
　そして、特許文献１では、ジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体を含む非環状型一本鎖ポリヌクレオチドをホスホロアミダイト法により合成する場合において、ジアミノプリン及びチオウラシル誘導体の従来のアミダイトモノマーを使用すると、多種の不純物が残ってしまうという問題を見出し、ジアミノプリン及びチオウラシル誘導体の非環状型アミダイトモノマーにおける塩基の保護基として、酸で除去可能な保護基を採用することで、この問題を解決できることが記載されている。
　しかし、ジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体を含む非環状型一本鎖ポリヌクレオチドをホスホロアミダイト法により合成する場合において、酸で除去可能な保護基で保護されたジアミノプリン及びチオウラシル誘導体のアミダイトモノマーを使用すると、合成後の脱保護処理を酸、塩基それぞれで2段階の操作を必要とする。これにより、DMT基の疎水性を利用した精製が行えない、各操作における脱保護不良などにより、オリゴマーの収率が低下するという問題があった。
　本発明は、ジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体を含む非環状型一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による合成に好適に使用することができる、ジアミノプリンのアミダイトモノマー及び／又はチオウラシル誘導体のアミダイトモノマーを提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、塩基で除去可能な特定の保護基で保護した、ジアミノプリンのアミダイトモノマー及び／又はチオウラシル誘導体のアミダイトモノマー、であれば、塩基部分の脱保護をより高効率で行うことができ、目的の非環状型ポリヌクレオチドをより高収率で得ることができることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めることにより、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　一般式（1A）又は（1B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中：R1及びR2は同一又は異なって水素原子又は有機基を示す。R3及びR4は同一又は異なって水酸基の保護基を示す。R5及びR6は同一又は異なってアルキル基を示す。R7、R8、R9、及びR10は同一又は異なって水素原子又は塩基で除去可能な保護基を示し（但し、全てが水素原子である場合を除く）、前記塩基で除去可能な保護基の少なくとも1つが一般式（a）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中：Raは水素原子又はアルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。）
で表される基を示す。R11は水素原子又はアルキル基を示す。nは1～3の整数を示す。mは0～3の整数を示す。］
で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
　項２．　前記R7及び前記R8の少なくとも1つが一般式（a）で表される基であり、且つ前記R9及び前記R10の少なくとも1つが一般式（a）で表される基である、項１に記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
　項３．　前記nが1であり、前記mが0であり、前記Raが水素原子であり、且つ前記pが1である、項１又は２に記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
　項４．　前記R3が一般式（b）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中：R31、R32及びR33は同一又は異なって水素原子又はアルコキシ基を示す。］で表される基であり、前記R4が－（CH2）2－CNであり、前記R5及び前記R6がイソプロピル基である、項１～３のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
　項５．　項１～４のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含む、試薬。
　項６．　ポリヌクレオチド製造用試薬である、項５に記載の試薬。
　項７．　請求項１～４のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物をアミダイトモノマーとして使用する、一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による製造方法。
　本発明によれば、ジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体を含む非環状型一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による合成に好適に使用することができる、ジアミノプリンのアミダイトモノマー及び／又はチオウラシル誘導体のアミダイトモノマーを提供することができる。これを用いてホスホロアミダイト法により非環状型一本鎖ポリヌクレオチドを合成することにより、塩基部分の脱保護をより高効率で行うことができ、目的の非環状型ポリヌクレオチドをより高収率で得ることができる。
実施例3で合成したSNAポリヌクレオチドの粗生成物のMALDI-TOF-MSチャートを示す。 実施例4で合成したSNAポリヌクレオチドの粗生成物のMALDI-TOF-MSチャートを示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．アミダイトモノマー
　本発明は、その一態様において、一般式（1A）又は（1B）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物（本明細書において、これらをまとめて「本発明の化合物」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
　一般式（1A）は以下に示す式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　一般式（1B）は以下に示す式である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　R1及びR2は同一又は異なって水素原子又は有機基を示す。
　R1又はR2で示される有機基は、特に制限されず、例えば炭化水素基が挙げられる。
　R1又はR2で示される炭化水素基としては、好ましくは鎖状炭化水素基が挙げられる。鎖状炭化水素基としては、例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられ、中でも好ましくはアルキル基が挙げられる。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n－プロピル基、イソプロピル基、n－ブチル基、イソブチル基、tert－ブチル基、sec－ブチル基、n－ペンチル基、ネオペンチル基、n－ヘキシル基、3－メチルペンチル基等が挙げられる。炭化水素基の炭素原子数は、特に制限されない。該炭素原子数は、好ましくは1～8、より好ましくは1～6、さらに好ましくは1～4、よりさらに好ましくは1～2、特に好ましくは1である。またクリック反応などで様々な官能基の導入が可能となるアルキニル基（－C≡C－、－C≡CH）を末端あるいは内部に含むようなアルキル基は、さらに好ましい。
　R1又はR2で示される有機基としては、上記以外にも、各種分子、例えばポリヌクレオチドの修飾に使用される分子から1つの水素原子又は官能基を除いてなる一価の基を採用することができる。このような分子としては、例えばポリエチレングリコール鎖、色素分子、ポリカチオン（スペルミン）、グルーブバインダー、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、金属配位子、光開裂性官能基、糖鎖等が挙げられる。これらは、直接又は間接的に、上記構成単位の骨格に連結することができる。例えば、クリック反応（例えば上述のアルキンとアジドとの反応）を利用して、連結することができる。
　SNAやL-aTNA等の非環状型ポリヌクレオチドの分子モデリングにより、R1及びR2に比較的大きな有機基を採用しても、二重鎖形成能やその構造に影響が無いと考えられる。
　本発明の好ましい一態様において、R1及びR2の少なくとも一方が水素原子であることが好ましい。
　本発明の好ましい態様においては、miRNA等の対象ポリヌクレオチドに対する結合性の観点から、R1が水素原子又は鎖状炭化水素基であり、且つR2が水素原子であることが好ましい。
　R3及びR4は同一又は異なって水酸基の保護基を示す。
　R3としては、水酸基の保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイトモノマーで使用される公知の保護基を広く使用することができる。R3としては、好ましくは一般式（b）で表される基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　R31、R32及びR33は同一又は異なって水素原子又はアルコキシ基を示す。
　R31、R32及びR33は1つが水素であり、残りの2つがアルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
　R4としては、水酸基の保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイトモノマーで使用される公知の保護基を広く使用することができる。R4としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは電子求引基で置換されていてもよい。
　R4として、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、トリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。R4は、特に好ましくは－（CH2）2－CNである。
　R5及びR6は同一又は異なってアルキル基を示す。
　R5又はR6で示されるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数1～12のアルキル基、より好ましくは炭素数1～6のアルキル基である。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチル、イソブチル、tert－ブチル、n－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。ここでのアルキル基には、アルコキシ基などのアルキル部分も含まれる。R5及びR6は互いに結合して環状構造を形成していてもよい。
　R5及びR6は、特に好ましくは共にイソプロピル基である。
　R7、R8、R9、及びR10は同一又は異なって水素原子又は塩基で除去可能な保護基を示し（但し、全てが水素原子である場合を除く）、前記塩基で除去可能な保護基の少なくとも1つが一般式（a）で表される基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　Raは水素原子又はアルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。
　Raで示されるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状（好ましくは分岐鎖状）であり、より好ましくは炭素数1～12のアルキル基、さらに好ましくは炭素数1～6のアルキル基である。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチル、イソブチル、tert－ブチル、n－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。Raで示されるアルキル基は、特に好ましくはイソプロピル基である。
　Raは、特に好ましくは水素原子である。
　pは、特に好ましくは1である。
　本発明の好ましい一態様においては、R7及びR8の少なくとも1つが一般式（a）で表される基であり、且つR9及びR10の少なくとも1つが一般式（a）で表される基である。
　塩基で除去可能な保護基として、一般式（a）で表される基以外には、特に制限されないが、好ましくはアルコキシアシル基（例えばメトキシアセチル基等）、アルカノイル基（例えばイソブチリル基、ピバロイル基等）、ベンゾイル基等が挙げられる。
　R11は水素原子又はアルキル基を示す。nは1～3の整数を示す。mは0～3の整数を示す。
　R11で示されるアルキル基は、直鎖状及び分岐鎖状のいずれでもよく、より好ましくは炭素数1～12のアルキル基、さらに好ましくは炭素数1～6のアルキル基である。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチル、イソブチル、tert－ブチル、n－ペンチル、イソペンチル、及びヘキシルが挙げられる。Raで示されるアルキル基は、特に好ましくはメチル基である。
　R11は、好ましくは水素原子又はメチル基であり、より好ましくは水素原子である。
　nは、特に好ましくは1である。
　mは、特に好ましくは0である。
　一般式（1B）中、一般式（1Ba）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
で表される基に代えて、一般式（1Bax）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
で表される基を採用することも可能である。
　R12は塩基で除去可能な保護基である。塩基で除去可能な保護基としては、特に制限されないが、例えば上記の保護基を採用することができる。
　一態様において、Rx1、Rx2、Rx3及びRx4は同一又は異なって、水素原子又は有機基であることができる。
　別の一態様において、Rx1及びRx4は同一又は異なって、水素原子又は電子供与基であることができ、Rx2及びRx3は同一又は異なって、水素原子又は電子求引基であることができる。
　また、一般式（a）で表される基に代えて、一般式（ay）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表される基を採用することも可能である。
　一態様において、Ry1、Ry2、Ry3及びRy4は同一又は異なって、水素原子又は有機基であることができる。
　別の一態様において、Ry1及びRy4は同一又は異なって、水素原子又は電子供与基であることができ、Ry2及びRy3は同一又は異なって、水素原子又は電子求引基であることができる。
　一般式（1A）又は（1B）で表される化合物の塩としては、特に制限されず、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。
　一般式（1A）又は（1B）で表される化合物又はその塩の溶媒和物としては、特に制限されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等の溶媒との溶媒和物が挙げられる。
　2．アミダイトモノマーの製造方法
　本発明の化合物は、様々な方法で製造することができる。
　一般式（1A）で表される化合物の一例は、例えば、以下のスキームに従って又は準じて製造した保護基付加型塩基を用いて、その後は実施例1に記載の方法に従って又は準じて、製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　一般式（1A1）で表される化合物、一般式（1A2）で表される化合物としては、市販の化合物をそのまま使用することもできるし、必要に応じて公知の方法に従って又は準じて合成したものを使用することもできる。
　一般式（1A2）で表される化合物のような無水物に代えて、酸クロリド（例えば、Phenoxyacetyl Chloride）も使用することが可能である。
　一般式（1A2）で表される化合物の使用量は、収率、合成の容易さ等の観点から、通常、一般式（1A1）で表される化合物1モルに対して、1～3モルが好ましく、1.5～2.5モルがより好ましい。
　本反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。反応溶媒としては、特に制限されないが、例えばピリジン、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、エタノール等が挙げられ、好ましくはピリジン等が挙げられる。溶媒は単独で使用してもよく、また、複数併用してもよい。
　本反応は、N,N-ジメチルアミノピリジン等の塩基の存在下で行うことも可能である。
　本反応においては、上記成分以外にも、反応の進行を著しく損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。
　反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、10～100℃で行うことが好ましい。反応時間は特に制限されず、通常、30分間～30時間とすることができる。
　反応の進行は、クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することができる。反応終了後、溶媒を留去し、生成物はクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（ESI-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
　一般式（1B）で表される化合物の一例は、例えば、以下のスキーム（Xは、－Cl、－Br、－I等のハロゲン原子；　又は－CF3、－CCl3、－NO2、－CN、－OTs等の電子求引基を示す。）に従って又は準じて製造した保護基付加型塩基を用いて、その後は実施例2に記載の方法に従って又は準じて、製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　一般式（1B1）で表される化合物としては、市販の化合物をそのまま使用することもできるし、必要に応じて公知の方法に従って又は準じて合成したものを使用することもできる。
　一般式（1B2）で表される化合物としては、市販の化合物をそのまま使用することもできるし、必要に応じて公知の方法に従って又は準じて且つ／或いは実施例に記載の方法に従って又は準じて合成したものを使用することもできる。
　一般式（1B2）で表される化合物の使用量は、収率、合成の容易さ等の観点から、通常、一般式（1B1）で表される化合物1モルに対して、1～3モルが好ましく、1.5～2.5モルがより好ましい。
　本反応は、通常、反応溶媒の存在下で行われる。反応溶媒としては、特に制限されないが、例えばエタノール、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、トルエン等が挙げられ、好ましくはエタノール等が挙げられる。溶媒は単独で使用してもよく、また、複数併用してもよい。
　本反応は、水酸化カリウム、トリエチルアミン等の塩基の存在下で行うことが好ましい。
　本反応においては、上記成分以外にも、反応の進行を著しく損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することもできる。
　反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、10～50℃で行うことが好ましい。反応時間は特に制限されず、通常、30分間～30時間とすることができる。
　反応の進行は、クロマトグラフィーのような通常の方法で追跡することができる。反応終了後、溶媒を留去し、生成物はクロマトグラフィー法、再結晶法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（ESI-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
　3．試薬
　本発明は、その一態様において、本発明の化合物を含む、試薬（本明細書において、「本発明の試薬」と示すこともある。）に関する。以下にこれについて説明する。
　本発明の試薬は、本発明の化合物を含む限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の試薬中の本発明の化合物の含有量は、例えば0.001～100質量％である。
　本発明の試薬の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の試薬は、例えばポリヌクレオチド製造用試薬とすることができる。
　本発明の試薬は、キットの形態であることもできる。キットには、必要に応じて、他の試薬や器具（例えば、ポリヌクレオチドの製造に使用される試薬や器具）が含まれていてもよい。
　4．一本鎖ポリヌクレオチドの製造方法
　本発明は、その一態様において、本発明の化合物を使用する、一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある。）に関する。以下にこれについて説明する。
　ホスホロアミダイト法は、公知の方法に従って、例えば市販されている核酸の自動合成装置等を用いて実施することができる。具体的には、（A）5’位（或いはそれに相当する位置）の水酸基を脱保護（本発明の化合物の場合はR3の脱保護）する工程、（B）本発明の化合物を縮合させる工程、（C）未反応の化合物の5’位（或いはそれに相当する位置）の水酸基（本発明の化合物の場合は、（B）工程によりR3が水素原子となって構成された水酸基）をキャッピングする工程、（D）亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程、（E）得られた化合物を固相担体から切り出し、リン酸部分（本発明の化合物の場合はR4）及び核酸塩基（本発明の化合物の場合はR7～R10中の保護基）を脱保護する工程、（F）5’位（或いはそれに相当する位置）の水酸基を脱保護（本発明の化合物の場合はR3の脱保護）する工程などの工程を含む。（A）～（D）の工程を繰り返すことにより、所望の鎖長のポリヌクレオチド骨格を含有する化合物を製造することができる。
　（C）工程において使用するキャッピング試薬としては、一般式（a）で表される基の構造に対応する化合物（上記した一般式1A2で表される化合物）を使用することが好ましい。これにより、（E）工程における脱保護不足や合成不良をより抑制することができる。
　（D）工程においては、酸化剤として、ヨウ素/水を含む溶液を使用することが好ましい。
　（E）工程における脱保護においては、アンモニア水等の塩基による脱保護が行われる。この際、硫化水素ナトリウムを添加すること（終濃度は、好ましくは20～100mM、より好ましくは40～60mM）が好ましい。これにより、副反応（核酸塩基のチオカルボニル基のアミノ基への変換反応）をより抑制することができる。本発明の製造方法においては、（E）工程において酸による脱保護工程を含まない。
　（E）工程後は、（F）工程の前に、5’位の保護基（疎水基）の疎水性を利用してクロマトグラフィー精製（例えば、逆相クロマトグラフィー精製）を行うことが好ましい。これにより、目的の一本鎖ポリヌクレオチドの純度をより高めることができる。
　得られた一本鎖ポリヌクレオチドは、必要により単離及び精製を行い得る。通常、RNAを沈殿、抽出及び精製する方法を用いることで、単離することができる。具体的には、反応後の溶液にエタノール、イソプロピルアルコールなどのRNAに対して溶解性の低い溶媒を加えることでRNAを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの溶液を反応溶液に加え、RNAを水層に抽出させる方法が採用される。その後、逆相カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等の公知の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の手法などにより単離、精製することができる。
　本発明の製造方法の製造対象である一本鎖ポリヌクレオチドは、非環状型ポリヌクレオチド構成単位を含む回文構造を含み、且つ塩基としてジアミノプリン及び／又はチオウラシル誘導体（2-チオウラシル、2-チオチミン等）を含むものである限り、特に制限されない。
　非環状型ポリヌクレオチド構成単位は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに相当する構成単位であり、糖骨格を含まないものである限り、特に制限されない。非環状型ポリヌクレオチド構成単位として、代表的には、一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中：R1及びR2は前記に同じである。Baseは核酸塩基を示す。］
で表される構成単位が挙げられる。
　核酸塩基としては、核酸を構成する塩基を特に制限無く採用することができる。核酸を構成する塩基には、RNA、DNA等の天然核酸中の典型的な塩基（アデニン（A）、チミン（T）、ウラシル（U）、グアニン（G）、シトシン（C）等）のみならず、これ以外の塩基、例えばヒポキサンチン（I）、修飾塩基等も包含される。修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル、ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5’-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2，2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられる。
　一般式（1）中、*1及び*2は、ポリヌクレオチドを構成する際の方向を示す。R1が有機基でありR2が水素原子である場合は*1が3’側であり*2が1’側である。R1が水素原子でありR2が有機基である場合は*1が1’側であり*2が3’側である。R1が水素原子でありR2が水素原子である場合は*1が（S）側であり*2が（R）側である。
　一本鎖ポリヌクレオチドにおいて、非環状型ポリヌクレオチド構成単位以外の構成単位は、特に制限されず、天然核酸、aTNA及びSNAを含む各種人工核酸の構成単位を採用することができる。採用し得る核酸として、具体的には、DNA、RNA等の他にも、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものであってもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
　ジアミノプリン及びチオウラシル誘導体のそれぞれの数は、2つ以上であることが特に好ましい。該数の上限は特に制限されず、例えば50、20、10、5である。
　一本鎖ポリヌクレオチドの塩基数100％に対するジアミノプリン及びチオウラシル誘導体の合計数の割合は、例えば10～90％、好ましくは20～80％、より好ましくは30～70％、さらに好ましくは40～60％である。
　一本鎖ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチド構成単位（ヌクレオチド数）100％に対する、非環状型ポリヌクレオチド構成単位の割合は、例えば70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは100％（すなわち、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドが非環状型ポリヌクレオチド構成単位からなる）である。
　一本鎖ポリヌクレオチドの塩基長は、特に制限されず、例えば6～10000である。該塩基長は、合成容易性等の観点から、好ましくは6～1000、より好ましくは6～500、さらに好ましくは6～200、よりさらに好ましくは6～100、とりわけ好ましくは6～50である。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1．Pac 2 D-SNA amidite monomerの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　実施例1-1．Compound 2の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（1）2,6-Diaminopurine(6.00 g, 40.0 mmol) , Pac2O(25.0 g, 87.3 mmol, 2.2 eq)を500 ml二口フラスコに入れ、窒素置換した。
（2）Dry pyridine 250 mlを加え、90 ℃の湯浴上で終夜攪拌した（20 h程度）。
（3）反応溶液を室温に戻し、さらに4 ℃まで冷やした。
（4）反応溶液を吸引ろ過した。冷やしたPyridine, EtOH, Et2Oで洗浄し、濾物を真空乾燥した。
（5）Compound 2を白色固体で13.5 g (32.2 mmol), 80%の収率で得た。
　実施例1-2．Compound 3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（1）Compound 2 (13.5 g, 32.2 mmol)とK2CO3 (4.90g, 35.4 mmol, 1.10 eq)二口フラスコに入れ窒素置換した。
（2）Dry DMF 150 mlを加えよく攪拌した。
（3）室温でtert-Butyl Bromoacetate (5.20 ml, 35.4 mmol, 1.10 eq)を加えた。
（4）50 ℃の湯浴にて終夜攪拌した（実際には20 hくらい）。
（5）DMFをエバポレーターでdry upした（PhMe共沸）。
（6）100 ml程度のエタノールに懸濁し、反応溶液を冷やした後吸引ろ過した（冷やしたEtOHで洗う）。
（7）H2O, EtOH, Et2Oの順に洗浄し、濾物を真空乾燥した。
（8）Compound 3を白色固体で 12.8 g (24.0 mmol), 75%の収率で得た。
　実施例1-3．Compound 4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（1）Compound 3 ( 12.8 g, 24.0 mmol)をCH2Cl2 90 mlに懸濁した。
（2）Trifluoro acetic acid 180 mlを加え室温で2 h激しく攪拌した。
（3）反応溶液をエバポレーターで減圧濃縮した（CH3CNで共沸）
（4）Et2O 200 ml程度によく懸濁し、吸引ろ過した。
（5）Et2Oでよく洗浄し、濾物を真空乾燥した。
（6）Compound 4を白色固体で 12.7 g (quant., 92 wt%)得た。
　実施例1-4．Compound 5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（1）Compound 4 (4.53 g, 8.0 mmol, 1.1 eq)を30 ml程度のDMFに懸濁。Et3N (4.43 ml, 40 mmol, 3.0 eq)を加え氷浴に浸した。
（2）DMT-MM (11.2 mmol, 1.3 eq)を加え氷浴のまま激しく1 min程度攪拌した。
（3）SNA in DMF (8 mmol, 1.0 eq)を滴下し氷浴のまま30 min攪拌した。
（4）室温に戻しさらに30 min程度攪拌した。
（5）TLC（組成CHCl3: MeOH = 10: 1 ; Rf値= 0.5程度）で反応終了を確認後、CHCl3 100 ml程度加え、10 min攪拌した。
（6）H2O 150 ml x2, Brine 150 ml x1で洗浄した。
（7）有機層を減圧濃縮し（PhMe共沸）、真空乾燥した。
（8）シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3: MeOH = 30: 1 → CHCl3: MeOH = 20: 1, 常時1 % Et3N）にて精製した。
（9）CHCl3: CH3CN= 1: 1 x1, CHCl3 x1で共沸し、真空乾燥した。
（10）Compound 5 を白色固体で 3.59 g (4.21 mmol), 53%の収率で得た。
　実施例1-5．Compound 6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（1）Compound 5 (3.16 g, 3.70 mmol)を二口フラスコに入れ窒素置換した。（2）Dry CHCl3 40 ml程度によく懸濁（完全には溶けない）し、Et3N (2.1 ml, 15 mmol, 4.0 eq)を加え氷浴上で攪拌した。
（3）氷浴上でアミダイト化試薬(1.5 ml他の塩基よりも多め)を滴下し、室温で30 min程度攪拌した。
（4）反応終了を確認後、減圧濃縮し液量を10 ml~ 20 ml程度まで減らした。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（CHCl3: EtOAc =2: 1 → 1: 1, 2% TEA含有）。
（5）精製物を少量のCHCl3に溶かし、n-hexaneを500 ml程度加えよく懸濁した。吸引ろ過し、濾物をn-hexaneで洗浄し真空乾燥した。
（6）Compound 6 を白色固体で 2.34 g (2.22 mmol), 60%の収率で得た。1H-NMR [DMSO, 500 MHz] δ = 10.93 (s, 1H), 10.61 (s, 1H), 8.41-8.39 (m, 1H), 8.26 (d, 1H), 7.38-7.35 (m,2H), 7.31-7.19 (m, 11H), 6.97-6.85 (m, 10H), 5.22 (s, 2H), 5.07 (s, 2H), 4.96-4.88 (m, 2H), 4.20-4.10 (m, 1H), 3.76-3.55 (m, 10H), 3.53-3.44 (m, 2H), 3.11-3.00 (m, 2H), 2.96-2.65 (m, 2H), 1.10 (dd, 6H), 1.03 (t, 6H). 13C{1H} NMR [DMSO-d6, 125 MHz] δ 168.4, 165.9, 158.1, 157.97, 157.96, 152.9, 151.7, 148.8, 144.9, 144.6, 135.5, 129.72, 129.68, 129.42, 129.35, 127.8, 127.6, 126.7, 120.9, 120.7, 118.9, 118.1, 114.6, 114.4, 113.1, 85.38, 85.37, 67.8, 67.5, 61.9, 61.8, 61.7, 58.4, 58.33, 58.29, 58.2, 55.0, 50.2, 45.1, 42.5, 42.4, 24.3, 19.9, 19.8. 31P NMR [DMSO-d6, 202 MHz] δ 146.9, 146.6.. HRMS (FAB): Calcd for compound 6 (M+H+) 1052.4430; found 1052.4473.
　実施例2．4-AcetoxybenzylsU-SNA amidite monomerの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　実施例2-1．Compound 8の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（1）4-hydroxybenzaldehyde(12.2 g, 100 mmol)を二口フラスコに入れ窒素置換した。
（2）200 ml程度のCH2Cl2, Et3N(41.9 ml, 300 mmol, 3.0 eq)を加え氷浴に浸し攪拌した。
（3）Acetyl chloride(10.7 ml, 150 mmol, 1.5 eq)を滴下した。
（4）室温で >2 h攪拌した。
（5）1N HCl aq 50 mlを加え20 minほど攪拌しクエンチした。
（6）分液で有機層を分離し、1N HCl aq 50 ml x2で洗浄した。
（7）有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し吸引ろ過した。
（8）有機層を減圧濃縮し、真空乾燥した。
（9）Compound 8 を褐色の粘性液体で 21.6 g (quant.)得た。
　実施例2-2．Compound 9の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（1）Compound 8 (21.6 g)を500ml フラスコにいれ150 mlのTHFに溶かし、氷浴に浸した。
（2）NaBH4(1.5 eq)を加えそのまま1.5 h攪拌した。
（3）氷浴のまま150 mlのEtOAcを加えた。次いでsatd. aq. NH4Cl 100 mlをゆっくり注ぎ入れ5 min攪拌した。
（4）有機層をsatd. Aq. NH4Cl 100 ml x1で洗浄した。
（5）有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、吸引ろ過した。
（6）有機層を減圧濃縮し、真空乾燥した。
（7）Compound 9 を黄色粘性液体で16.0 g ( 97 mmol), 97%の収率で得た。
　実施例2-3．Compound 10の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（1）Compound 9 (16.03 g 96.5 mmol)を500 ml二口フラスコにいれ還流管を取り付け窒素置換した。
（2）Dry Toluene 100 ml, Dry pyridine 0.2 mlを加え80 ℃の湯浴に浸し攪拌した。
（3）Thionyl chloride(12 ml, 164 mmol, 1.7 eq)を滴下した。滴下後1 hそのまま攪拌した。
（4）還流管を取り外し、反応溶液を氷浴に浸し攪拌しながら、反応溶液にsatd. aq. NaHCO3200 ml を細かな氷とともにゆっくり注ぎ入れた。
（5）気泡の発生が止まったら有機層を分離しH2O 100 ml x2で洗浄した。
（6）有機層を硫酸マグネシウム乾燥し、吸引ろ過した。
（7）有機層を減圧濃縮し、真空乾燥した。
（8）Compound 10を褐色粘性液体として17.68 g (quant.)得た。
　実施例2-4．Compound 11の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（1）2-Thiouracil(6.34 g, 49.4 mmol)をEtOH 60 mlに懸濁した。
（2）>85% KOH(3.6 g, 54.7 mmol, in H2O 60 ml)溶液を（1）に加え、45 ℃に温め、超音波破砕し2-Thiouracilを溶かしきった。
（3）（2）を室温に戻し、攪拌。Compound 10(96.5 mmol, 1.95 eq)をパスツールを用いて滴下した。EtOH 6 ml程度で残ったCompound 10を洗浄し反応溶液に加えた。室温で終夜攪拌した。
（4）反応溶液を攪拌しながらNaHCO3 aq 50 ml, H2O 100 mlを順に加えた。
（5）吸引ろ過し、濾物を冷やしたH2O, 冷やしたEtOH, EtOAc, Et2Oで順に洗浄した。
（6）Compound 11を白色固体で10.52 g(38.1 mmol), 77%の収率で得た。
　実施例2-5．Compound 12の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（1）Compound 11を(10.5 g, 38.1 mmol)を二口フラスコに入れ、窒素置換した。
（2）Dry CH2Cl2 20 ml, DIPEA(7.12 ml, 41.9 mmol, 1.1 eq)を入れ懸濁。氷浴にひたし攪拌した。
（3）Tert-Butyl Bromoacetate(6.14 ml, 41.9 mmol, 1.1 eq)を滴下した。氷浴のまま10 min攪拌した。
（4）室温で16 h攪拌した。
（5）TLC(組成; CHCl3: MeOH= 10: 1, Rf値= 0.4~0.5)で反応の終了を確認した後、反応溶液にH2O 140 mlを加え10 min攪拌した。
（6）有機層を分離し、H2O, Brineで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し吸引ろ過した。
（7）有機層を減圧濃縮し、真空乾燥した。
（8）粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（組成; CHCl3: MeOH= 30: 1 → 20: 1）で精製した。
（9）Compound 12を白色固体で10.0 g (25.6 mmol), 67%の収率で得た。
　実施例2-6．Compound 13の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（1）Compound 11を(10.0 g, 25.6 mmol)をフラスコに入れ、CH2Cl2 60 ml, TFA 180 mlに溶かし室温で2 h攪拌した。
（2）減圧濃縮し、Et2Oに懸濁した。吸引ろ過し、真空乾燥した。
（3）Compound 13を白色固体で10.0 g (quant.)得た。
　実施例2-7．Compound 14の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（1）Compound 13 (2.94 g, 8.8 mmol, 1.1 eq)を10 ml程度のDMFに懸濁した。Et3N (5.54 ml, 40 mmol, 5.0 eq)を加え氷浴に浸した。
（2）DMT-MM (11.2 mmol, 1.4 eq)を加え氷浴のまま激しく1 min程度攪拌した。
（3）SNA in DMF (8 mmol, 1.0 eq)を滴下し氷浴のまま10 min攪拌した。
（4）室温に戻しさらに30 min程度攪拌した。
（5）TLC（組成CHCl3: MeOH = 5: 1 ; Rf値= 0.5程度）で反応終了を確認後、反応溶液を減圧濃縮した。
（6）CHCl3 100 ml程度に溶解及び／又は懸濁し、10 min攪拌した。
（7）NaHCO3 aq 150 ml x2, Brine 150 ml x1で洗浄した。
（8）有機層を減圧濃縮し、真空乾燥した。
（9）シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3: MeOH = 20: 1 → CHCl3: MeOH = 10: 1, 常時2 % Et3N）にて精製した。
（10）CH3CN= 1: 1 x1, CHCl3 x1で共沸し、真空乾燥した。
（11）Compound 5 を白色固体で 4.6 g (6.35 mmol), 79%の収率で得た。
　実施例2-8．Compound 15の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（1）Compound 5 (4.6 g, 6.35 mmol)を二口フラスコに入れ窒素置換した。
（2）Dry CH2Cl2 8 ml程度によく懸濁し、Et3N ( 2.1 ml, 15 mmol, 5.0 eq)を加え氷浴上で攪拌した。
（3）氷浴上でアミダイト化試薬(2.13 ml)を滴下した。30 min程度攪拌した。
（4）反応終了を確認後、減圧濃縮し液量を10 ml~ 20 ml程度まで減らした。反応溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（CHCl3: (CH3)2CO = 6: 1 → 4: 1 → 2: 1, 2% TEA含有）。
（5）精製物を少量のCHCl3に溶かし、n-hexaneを500 ml程度加えよく懸濁した。吸引ろ過し、濾物をn-hexaneで洗浄し真空乾燥した。
（6）Compound 15 を白色固体で 3.5 g (3.79 mmol), 60%の収率で得た。1H-NMR [CDCl3, 500 MHz] δ= 7.40 (d, 2H), 7.31-7.25 (m, 8H), 7.22-7.18 (m, 1H),  7.13 (dd, 1H), 6.98-6.95 (m, 2H), 6.84-6.80 (m, 4H), 6.44 (t, 1H), 6.05 (dd, 1H), 4.45-4.29 (m, 5H), 3.92-3.45 (m, 12H), 3.36-3.28 (m, 1H), 3.19-3.15 (m, 1H), 2.54-2.36 (m, 2H), 2.81 (d, 3H), 1.17-1.06 (m, 12H). 13C{1H} NMR [CDCl3, 125 MHz] δ 169.54, 169.51, 167.9, 164.4, 164.3, 162.81, 162.77, 158.7, 150.3, 144.8, 144.7, 144.3, 144.2, 135.94, 135.86, 135.8, 133.0, 133.0, 130.7, 130.21, 130.17, 128.2, 128.02, 128.00, 127.0, 123.0, 122.0, 118.9, 113.3, 110.1, 86.3, 62.6, 62.5, 61.8, 61.7, 58.6, 58.5, 58.43, 58.36, 55.38, 55.37, 54.3, 54.2, 50.63, 50.57, 50.5, 43.2, 43.1, 35.9, 24.8, 24.7, 21.3 20.80, 20.76, 20.73, 20.69. 31P NMR [CDCl3, 202 MHz] δ 147.9, 147.6. HRMS (FAB): Calcd for compound 6 (M+H+) 910.3609; found 910.3628.
　実施例3．一本鎖ポリヌクレオチドの合成1
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　上記スキームに準じて、実施例1で合成したアミダイトモノマー（Pac2D-SNA amidite monomer、Compound 6）を用いて、塩基として2,6-ジアミノプリン（D）を含むSNAポリヌクレオチド（塩基配列：(S)-TTTDTTDT-(R)）を、ホスホロアミダイト法により固相合成機で合成した。Capping試薬としては、Acetic anhydrideではなく、Phenoxyacetic anhydrideを使用した。合成後、NH3 aq, 55℃, 2 hで切り出し・脱保護処理を行った。
　図１に、粗生成物（上記スキーム中、HPLC purificationの前）のMALDI-TOF-MSチャートを示す。目的の配列（[M+H]+）のピーク（イオン配位を含む）が高強度で観測され、その他のピークとしては、脱保護不足がわずかに確認されるのみであった。脱保護不足に関しては、脱保護時間を延ばせば問題なく脱保護されると推測された。
　実施例4．一本鎖ポリヌクレオチドの合成2
　実施例3のスキームに準じて、実施例1で合成したアミダイトモノマー（Pac2D-SNA amidite monomer、Compound 6）及び実施例2で合成したアミダイトモノマー（4-AcetoxybenzylsU-SNA amidite monomer、Compound 15）を用いて、塩基として2,6-ジアミノプリン（D）及び2-チオウラシル（sU）を含むSNAポリヌクレオチド（塩基配列：(S)-CDD CDsU CDG TCsU G DsU DDG CTA-(R)（配列番号1））を、ホスホロアミダイト法により固相合成機で合成した。Capping試薬としては、Acetic anhydrideではなく、Phenoxyacetic anhydrideを使用した。合成後、NH3 aq（50 mMの硫化水素ナトリウムを含有）, 55℃, 3 hで切り出し・脱保護処理を行った。
　図２に、粗生成物（実施例3のスキーム中、HPLC purificationの前）のMALDI-TOF-MSチャートを示す。目的の配列（[M+H]+）のピーク（イオン配位を含む）が高強度で観測された。
　比較例1．他のアミダイトモノマーの検討1
　塩基部分が以下の基である以外は実施例1で合成したアミダイトモノマー（Compound 6）と同じ構造であるアミダイトモノマーを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　上記アミダイトモノマーを用いて、実施例3と同様にして、塩基として2,6-ジアミノプリン（D）を含むSNAポリヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法により固相合成機で合成した。合成後、NH3 aq, 55 ℃で切り出し・脱保護処理を行った。この際、長時間（10時間程度）反応させた。粗生成物についてMS解析したところ、脱保護が不純分であることを示すピーク、又は反応中間体と推察されるピークが強く観察された。さらに長時間の反応を行うと、SNA骨格の加水分解が進み、収率が低下してしまう。
　なお、塩基部分が以下の基である以外は実施例1で合成したアミダイトモノマー（Compound 6）と同じ構造であるアミダイトモノマーの合成も試みたが、アミダイトモノマーへと合成を進める際に、以下の基のアミノ基の保護基が脱保護されてしまい、合成できなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　比較例2．他のアミダイトモノマーの検討2
　以下の反応スキームに従い、チオウラシルのチオカルボニルに各種保護基を付加させることを検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　検討1．Cyanoethyl基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
反応条件
1: 3-Bromopropionitrile, Et3N, DMF
2: 3-Bromopropionitrile, NaH, DMF
3: 3-Bromopropionitrile, K2CO3 DMF
4: 3-Bromopropionitrile, KOH, H2O/EtOH(1: 1)
　いずれの条件でも、反応しない、あるいは反応後脱離（非常に外れやすい保護基であるため）するために、2-thiocarbonyl基にCyanoethyl基を付加させることはできなかった。
　検討2．Acetyl基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
1: Acetyl chloride, Et3N, DMF
2: Acetyl chloride, NaH, DMF
3: Acetyl chloride, KOH, H2O/EtOH(1: 1)
　いずれの条件でも、反応しない、あるいは反応後以下の副反応により脱離するため、2-thiocarbonyl基にAcetyl基を付加させた化合物を得ることはできなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　検討3．Triisopropylsilyl(TIPS)基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
1: TIPS-Cl, 1H-imidazole, DMF
2: TIPS-Cl, NaH, DMF
3: TIPS-Cl, KOH, H2O/EtOH(1: 1)
　いずれの条件でも、反応しない、あるいは反応後脱離するため、2-thiocarbonyl基にTIPS基を付加させた化合物を得ることはできなかった。
　実施例5．Pac 2 D-L-aTNA amidite monomerの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　実施例1の化合物6（Pac2D-SNA amidite monomer）と同様にして上記化合物（Pac2D-L-aTNA amidite monomer）を合成した。具体的には、実施例1-4の（2）におけるSNAに代えてL-aTNAを用いる以外は、実施例1と同様にして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　Pac2D-L-aTNA amidite monomerを白色固体で 1.65 g (1.56 mmol), 57%の収率で得た。1H NMR [DMSO-d6, 500 MHz] δ 10.93 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 8.32 (dd, 2H), 7.46 (dd, 2H), 7.36-7.24 (m, 10H), 7.12 (t, 1H), 6.98-6.85 (m, 10H), 5.23 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 5.02 (dd, 2H), 3.97-3.88 (m, 1H), 3.74-3.59 (m, 10H), 3.55-3.42 (m, 3H), 2.67 (dt, 2H), 1.12 (dd, 6H), 1.04 (dd, 6H), 0.70 (dd, 3H). 13C{1H} NMR [DMSO-d6, 125 MHz] δ 168.6, 166.7, 166.6, 158.5, 158.5, 158.4, 153.4, 152.1, 149.2, 147.0, 146.8, 145.2, 137.0, 136.9, 136.9, 130.54, 130.48, 129.9, 129.8, 128.3, 128.0, 127.02, 126.97, 121.3, 121.2, 119.4, 118.6, 115.0, 114.9, 113.4, 86.1, 86.0, 69.3, 68.9, 68.3, 68.0, 59.0, 58.9, 58.7, 55.5, 42.93, 42.90, 42.84, 42.80, 24.83, 24.78, 24.7, 20.3, 20.3, 18.1, 17.9. 31P NMR [DMSO-d6, 202 MHz] δ 147.0, 146.9. HRMS (FAB): Calcd for C57H65N9O10P (Pac2D-L-aTNA amidite monomer) [M + H]+, 1066.4587; found, 1066.4605.
　実施例6．4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomerの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　実施例2の化合物15（4-AcetoxybenzylsU-SNA amidite monomer）と同様にして上記化合物（4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer）を合成した。具体的には、実施例2-7の（2）におけるSNAに代えてL-aTNAを用いる以外は、実施例2と同様にして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer を白色固体で 7.01 g (7.59 mmol), 83%の収率で得た。1H NMR [CDCl3, 500 MHz] δ 7.44 (d, 2H), 7.36-7.30 (m, 6H), 7.22 (m, 2H), 7.18-7.12 (m, 2H), 6.97 (d, 2H), 6.82-6.73 (m, 5H), 6.04 (dd, 1H), 4.50-4.37 (m, 4H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.80-3.57 (m, 11H), 3.54-3.44 (m, 3H), 2.52-2.45 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 1.13 (dd, 6H), 1.06 (dd, 6H), 0.91 (dd, 3H). 13C{1H} NMR [CDCl3, 125 MHz] δ 169.4, 167.9, 164.6, 164.5, 162.7, 158.52, 158.49, 150.2, 146.3, 146.2, 144.54, 144.50, 136.8, 136.5, 132.8, 130.5, 130.42, 130.40, 130.3, 128.13, 128.11, 127.7, 126.8, 121.9, 121.8, 118.5, 113.04, 113.01, 109.9, 109.8, 86.3, 69.0, 68.9, 62.8, 62.63, 62.56, 62.45, 58.4, 58.34, 58.26, 58.2, 55.50, 55.45, 55.2, 54.3, 54.2, 43.0, 42.9, 35.8, 24.61, 24.59, 24.55, 21.1, 20.52, 20.48, 20.45, 18.7, 18.6. 31P NMR [CDCl3, 202 MHz] δ 147.9, 147.3. HRMS (FAB): Calcd for C49H59N5O9PS (4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer) [M + H]+, 924.3766; found, 924.3797.
　実施例7．一本鎖ポリヌクレオチドの合成3
　実施例3のスキームに準じて、実施例5で合成したアミダイトモノマー（Pac2D-L-aTNA amidite monomer）及び実施例6で合成したアミダイトモノマー（4-AcetoxybenzylsU-L-aTNA amidite monomer）を用いて、塩基として2,6-ジアミノプリン（D）及び2-チオウラシル（sU）を含むL-aTNAポリヌクレオチドを、ホスホロアミダイト法により固相合成機で合成した。Capping試薬としては、Acetic anhydrideではなく、Phenoxyacetic anhydrideを使用した。合成後、NH3 aq（50 mMの硫化水素ナトリウムを含有）, 55℃, 3 hで切り出し・脱保護処理を行った。
　実施例4のSNAポリヌクレオチドと同様にMALDI-TOF-MSチャートを確認したところ、目的の配列（[M+H]+）のピーク（イオン配位を含む）が高強度で観測された。

Claims (7)

  1. 一般式（1A）又は（1B）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中：R1及びR2は同一又は異なって水素原子又は有機基を示す。R3及びR4は同一又は異なって水酸基の保護基を示す。R5及びR6は同一又は異なってアルキル基を示す。R7、R8、R9、及びR10は同一又は異なって水素原子又は塩基で除去可能な保護基を示し（但し、全てが水素原子である場合を除く）、前記塩基で除去可能な保護基の少なくとも1つが一般式（a）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中：Raは水素原子又はアルキル基を示す。pは1～3の整数を示す。）
    で表される基を示す。R11は水素原子又はアルキル基を示す。nは1～3の整数を示す。mは0～3の整数を示す。］
    で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
  2. 前記R7及び前記R8の少なくとも1つが一般式（a）で表される基であり、且つ前記R9及び前記R10の少なくとも1つが一般式（a）で表される基である、請求項１に記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
  3. 前記nが1であり、前記mが0であり、前記Raが水素原子であり、且つ前記pが1である、請求項１又は２に記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
  4. 前記R3が一般式（b）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中：R31、R32及びR33は同一又は異なって水素原子又はアルコキシ基を示す。］で表される基であり、前記R4が－（CH2）2－CNであり、前記R5及び前記R6がイソプロピル基である、請求項１～３のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含む、試薬。
  6. ポリヌクレオチド製造用試薬である、請求項５に記載の試薬。
  7. 請求項１～４のいずれかに記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物をアミダイトモノマーとして使用する、一本鎖ポリヌクレオチドのホスホロアミダイト法による製造方法。
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