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WO2021054448A1 - ペプチド並びにそれを含む細胞融合剤及びがん治療用医薬組成物 - Google Patents

ペプチド並びにそれを含む細胞融合剤及びがん治療用医薬組成物 Download PDF

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Publication number
WO2021054448A1
WO2021054448A1 PCT/JP2020/035491 JP2020035491W WO2021054448A1 WO 2021054448 A1 WO2021054448 A1 WO 2021054448A1 JP 2020035491 W JP2020035491 W JP 2020035491W WO 2021054448 A1 WO2021054448 A1 WO 2021054448A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
peptide
amino acid
polypeptide
cell fusion
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/035491
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English (en)
French (fr)
Inventor
美智子 甲賀
Original Assignee
美智子 甲賀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美智子 甲賀 filed Critical 美智子 甲賀
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Priority to AU2020349967A priority patent/AU2020349967A1/en
Priority to EP20865680.1A priority patent/EP4032589A4/en
Priority to US17/753,919 priority patent/US20230034205A1/en
Priority to KR1020227012189A priority patent/KR20220066309A/ko
Priority to CN202080065700.2A priority patent/CN114423778B/zh
Priority to CA3158336A priority patent/CA3158336A1/en
Publication of WO2021054448A1 publication Critical patent/WO2021054448A1/ja
Priority to JP2023127504A priority patent/JP2023133582A/ja

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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to peptides, cell fusion agents containing them, and pharmaceutical compositions for treating cancer. According to the present invention, cells can be efficiently fused.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Cell fusion is a phenomenon found because it has the effect of fusing cells to Sendai virus.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Currently, cell fusion is used for breeding or production of monoclonal antibodies. In addition to utilizing viruses, it is known that cell fusion also occurs by protoplast-PEG method or electrical stimulation.
  • an object of the present invention is to provide an efficient method of cell fusion. It is also to provide a method of killing cancer cells by cell fusion.
  • the present inventor has surprisingly found that a novel peptide having a specific amino acid sequence can efficiently fuse cells.
  • the present invention is based on these findings. Therefore, the present invention [1] In a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, or (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, 1 to 1 to A polypeptide containing an amino acid sequence in which 4 amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added, and which has cell fusion activity.
  • the pharmaceutical composition according to [8] which is used for cancer treatment.
  • a method for treating cancer which comprises a step of administering an effective amount of the polypeptide according to [1] or [2] to a subject in need of treatment.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer which comprises the polypeptide according to [1] or [2] and the polypeptide according to [12] [1] or [2], which is used for treating cancer. Use for manufacturing, Regarding.
  • polypeptide of the present invention cells can be efficiently fused.
  • the polypeptide of the present invention can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • 3 is a photomicrograph of weak enlargement (A and B) of RFL cells when peptide 1 is allowed to act on RFL cells and LCC cells. It is a micrograph of the strong enlargement (C) of the RFL cell and the micrograph of the LCC cell (D) when the peptide 1 was allowed to act on the RFL cell and the LCC cell. 3 is a photomicrograph of weak enlargement (A) and strong enlargement (B) of RFL cells when peptide 2 is allowed to act on RFL cells. 3 is a photomicrograph of a weakly enlarged RFL cell when peptide 3 is allowed to act on the RFL cell.
  • 3 is a photomicrograph of a weakly enlarged RFL cell when peptide 4 is allowed to act on the RFL cell.
  • 3 is a photomicrograph of a weakly enlarged RFL cell when peptide 5 is allowed to act on the RFL cell.
  • 3 is a photomicrograph of weak enlargement (A) and strong enlargement (B) of RFL cells when peptide 6 is allowed to act on RFL cells and RM-4 cells.
  • 3 is a photomicrograph of weak enlargement (C and D) of RM-4 cells when peptide 6 was allowed to act on RFL cells and RM-4 cells.
  • 3 is a photomicrograph of weak enlargement (A) and strong enlargement (B) of RFL cells when peptide 7 is allowed to act on RFL cells.
  • 3 is a photomicrograph of weak enlargement (A and B) of RFL cells when peptide 8 is allowed to act on RFL cells and LCC cells. It is a micrograph of the strong enlargement (C) of the RFL cell and the micrograph of the LCC cell (D) when the peptide 8 was allowed to act on the RFL cell and the LCC cell.
  • 6 is a photomicrograph of a weakly enlarged RFL cell when peptide 9 is allowed to act on the RFL cell.
  • 3 is a photomicrograph of a weakly enlarged RFL cell when peptide 10 is allowed to act on the RFL cell.
  • FIG. 6 is a graph in which peptide 1 was allowed to act on RM-4 cells, and the induction of apoptosis was measured by activation of Caspase-3 / 7 (A) and activation of Annexin V (B). It is a fluorescence micrograph which confirmed the activation of Caspase-3 / 7 (green fluorescence) and the activation of Annexin V (red fluorescence) after 18 hours by allowing peptide 1 to act on RM-4 cells. It is a fluorescence micrograph which confirmed the activation of Caspase-3 / 7 (green fluorescence) and the activation of Annexin V (red fluorescence) after 78 hours by allowing peptide 1 to act on RM-4 cells.
  • polypeptide of the present invention contains (1) an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8.
  • the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 are as follows. Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala (SEQ ID NO: 1) Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala (SEQ ID NO: 2) Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala (SEQ ID NO: 3) Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala (SEQ ID NO: 4) Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala (SEQ ID NO: 5) Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala (S
  • polypeptide of the present invention contains (2) an amino acid sequence in which amino acids 1 to 4 are deleted, substituted, inserted, and / or added in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, and cells. Has fusion activity.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by (1) SEQ ID NOs: 1 to 8 is selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by (1) SEQ ID NOs: 1 to 8.
  • the polypeptide of the present invention comprises a polypeptide consisting of an added amino acid sequence and having cell fusion activity.
  • the polypeptide of the present invention can exhibit cell fusion activity by the polypeptide consisting of the above 10 amino acid sequences such as the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, and the cells are contained in the 10 amino acid sequences. It has a specific structure that exhibits fusion activity. Therefore, as long as a specific structure showing cell fusion activity in the 10 amino acid sequence is not disrupted, even if another amino acid, polypeptide, or protein binds to the polypeptide of the present invention, the polypeptide of the present invention may be bound. Can exhibit cell fusion activity.
  • the functional equivalent variants are 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and most preferably 1 in one or more positions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 8. It is not particularly limited as long as the amino acid is a polypeptide containing a deleted, substituted, inserted, and / or added amino acid sequence and having cell fusion activity.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 is a functionally equivalent variant in which one amino acid is substituted with respect to the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the SEQ ID NO:
  • a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 is a functionally equivalent variant in which two amino acids are substituted
  • a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 7 is a three amino acid.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 is a functionally equivalent variant in which four amino acids are substituted.
  • “Deletion, substitution, insertion, and / or addition of amino acids 1 to 4" in the functionally equivalent variant is a conservative substitution that maintains the function of the polypeptide of the present invention.
  • “Conservative substitution” can be performed, for example, by substituting, but not limited to, an amino acid residue with another chemically similar amino acid residue. For example, there is a case where one hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue, a case where one polar residue is replaced with another polar residue having the same charge, and the like.
  • Functionally similar amino acids that can be made by making such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids examples include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like.
  • polar (neutral) amino acids examples include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged (basic) amino acids examples include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids examples include aspartic acid and glutamic acid.
  • the polypeptide of the present invention is not limited, but preferably N-terminal proline is methylated. That is, the N-terminal proline is preferably methylated proline. By methylating the N-terminal proline, but not limited to, even better cell fusion activity can be exhibited.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a method known in the art. For example, it can be obtained by culturing a transformant containing an expression vector described later, but it is preferably produced by a chemical synthesis method.
  • the polypeptide of the present invention has cell fusion activity.
  • cell fusion with the polypeptide of the present invention several cells are fused to form a fused cell having a plurality of nuclei.
  • apoptosis is induced after the cell fusion, and the cells die.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the term "polynucleotide” as used herein includes both DNA and RNA.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by a chemical synthesis method or the like.
  • the expression vector of the present invention is a vector containing the polynucleotide of the present invention. That is, the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention is used in a known expression vector appropriately selected according to the host cell used.
  • the vector obtained by insertion can be mentioned.
  • the expression vector exists as a self-replicating vector, that is, an extrachromosomal independent entity, and its replication does not depend on chromosomal replication, for example, it can be constructed on the basis of a plasmid.
  • the present expression vector may be one that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of the host cell and is replicated together with the chromosome into which the vector is integrated.
  • the procedure and method for constructing a vector according to the present invention those commonly used in the field of genetic engineering can be used.
  • ⁇ Transformant ⁇ cells transformed with the expression vector are provided.
  • This host-vector system is not particularly limited, and for example, a system using Escherichia coli, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, eukaryotic cells, etc., and a fusion protein expression system with other proteins using them, etc. Can be used.
  • transformation of cells with the expression vector can also be carried out according to a method commonly used in the art.
  • this transformant can be cultured in a suitable medium, and the above-mentioned polypeptide according to the present invention can be isolated and obtained from the culture. Therefore, according to another aspect of the present invention, the method for producing a novel polypeptide according to the present invention is provided.
  • the culture of the transformant and its conditions may be essentially equivalent to that for the cells used. Further, as a method for recovering the target protein after culturing the transformant, a method commonly used in this field can be used.
  • antibody An antibody that reacts with the protein of the present invention (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) can be obtained by directly administering the protein of the present invention or a fragment thereof to various animals.
  • DNA vaccine methods Rost, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; or Donnelly, It can also be obtained by JJ et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996).
  • the polyclonal antibody is, for example, an animal (for example, an animal (for example) that is immunized with an emulsion obtained by immunizing the protein of the present invention or a fragment thereof with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) into a peritoneal, subcutaneous, or vein.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • a polyclonal antibody can be separated and purified by a conventional protein isolation and purification method. Examples of such a separation and purification method include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, and the like.
  • Monoclonal antibodies can be readily produced by those skilled in the art, for example, by the Kohler-Milstein cell fusion method (Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975). That is, by repeatedly inoculating the abdominal cavity, subcutaneous, or vein of a mouse with an emulsion obtained by emulsifying the protein of the present invention or a fragment thereof with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) several times every few weeks. Immunize. After final immunization, spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce hybridomas.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • myeloma cells for obtaining hybridomas for example, myeloma cells having markers such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase deficiency or thymidine kinase deficiency (for example, mouse myeloma cell line P3X63Ag8.U1) can be used. .. Further, as the fusion agent, for example, polyethylene glycol can be used. Furthermore, as a medium for hybridoma production, 10 to 30% fetal bovine serum is appropriately added to a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, or RPMI-1640. In addition, it can be used.
  • the fusion strain can be selected by the HAT selection method.
  • the hybridoma screening can be performed by a well-known method such as ELISA method or immunohistochemical staining method using the culture supernatant, and a clone of the hybridoma secreting the target antibody can be selected.
  • the monoclonality of the hybridoma can be guaranteed by repeating the subcloning by the limiting dilution method.
  • the hybridoma thus obtained produces a purifying amount of antibody by culturing in a medium for 2 to 4 days or in the abdominal cavity of BALB / c-type mice pretreated with pristane for 10 to 20 days. can do.
  • the monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional polypeptide isolation and purification method.
  • a separation and purification method include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, and the like.
  • all or a part of the gene encoding the monoclonal antibody is incorporated into an expression vector and introduced into an appropriate host cell (for example, Escherichia coli, yeast, or animal cell). It can also be produced.
  • the antibody (including polyclonal antibody and monoclonal antibody) separated and purified as described above is digested with a polypeptide-degrading enzyme (for example, pepsin or papain) by a conventional method, and subsequently, the polypeptide is isolated by a conventional method.
  • a polypeptide-degrading enzyme for example, pepsin or papain
  • an antigen-binding fragment containing a part of an active antibody for example, F (ab) 2 , Fab, Fab, or Fv can be obtained.
  • the antibody that reacts with the protein of the present invention can be used in the method of Clackson et al. Or Zebede et al. (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; or Zebedee, S. et al., Proc. Natl. It is also possible to obtain it as a single chain Fv or ab by Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992). It is also possible to obtain human antibodies by immunizing transgenic mice (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994) in which the mouse antibody gene is replaced with a human antibody gene.
  • the cell fusion agent of the present invention contains the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • the cell fusion agent of the present invention may contain one kind of polypeptide alone, or may contain two or more kinds of polypeptides in combination.
  • the content of the polypeptide in the cell fusion agent is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 100% by weight, preferably 10 to 100% by weight, and more preferably 30 to 90% by weight. Is.
  • the cell fusion agent of the present invention may contain a carrier (for example, water or buffer), an excipient, a diluent, a preservative, a stabilizer, a preservative, an antioxidant and the like as components other than the polypeptide. Good.
  • the cell fusion agent of the present invention can be used for breeding plants or producing monoclonal antibodies. According to the cell fusion agent of the present invention, cells can be efficiently fused.
  • the cells fused by the cell fusion agent of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include microbial cells, plant cells, and animal cells.
  • Animal cells include nucleated cells (eg, blood cells, lymphoid cells, cells that make up the viscera) of vertebrates (eg, mammals) such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, goats, sheep, horses, and cows, and mammals. Examples include animal-derived cancer cells.
  • the temperature of cell fusion is not particularly limited as long as cell fusion occurs, but is, for example, 0 to 40 ° C, preferably 10 to 38 ° C.
  • the treatment time is not particularly limited, but is preferably 1 minute to 2 hours.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • Diseases that can be prevented or treated by the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, and for example, cancer cells can be fused, cancer cells can be killed, and cancer can be treated.
  • the peptides of the invention can induce apoptosis in cells by cell fusion. In the fused cells, Caspase-3 / 7 or Annexin V is activated and apoptosis is induced. Cancer cells can be killed by inducing apoptosis in the fused cells.
  • Cancers that can be treated by the pharmaceutical composition of the present invention include tongue cancer, gingival cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma, maxillary cancer, nasal cancer, nasal cavity cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, glioma, meningitis, and nerve.
  • Glioblastoma neuroblastoma, thyroid papillary adenocarcinoma, thyroid follicular cancer, thyroid medullary cancer, primary lung cancer, squamous epithelial cancer, adenocarcinoma, alveolar epithelial cancer, large cell undifferentiated cancer, small cell undifferentiated Cancer, cartinoid, testicle tumor, prostate cancer, breast cancer, breast paget disease, breast sarcoma, bone tumor, thyroid cancer, gastric cancer, liver cancer, acute myeloid leukemia, acute anterior medulla leukemia, acute myeloid monocytic leukemia, acute monocytosis Spherical leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute undifferentiated leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma, primary macroglobulinemia, childhood leukemia, Esophageal cancer, gastric cancer,
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a powder, a fine granule, a granule, a tablet, a capsule, a suspension, an emulsion, a syrup, an extract, or a pill.
  • Oral preparations such as, or parenteral preparations such as injections, external liquid preparations, ointments, suppositories, topically administered creams, and eye drops.
  • Oral preparations include, for example, gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannit, carboxymethyl cellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidene, crystalline cellulose, soy lecithin, sucrose, fatty acid ester, talc, magnesium stearate.
  • Polyethylene glycol, magnesium silicate, silicic anhydride, or synthetic aluminum silicate and other excipients, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity enhancers, diluents, preservatives, colorants , Fragrance, flavoring agent, stabilizer, moisturizing agent, preservative, antioxidant, etc., can be produced according to a conventional method.
  • parenteral preparations include injections.
  • a water-soluble solvent such as physiological saline or Ringer's solution
  • a water-insoluble solvent such as vegetable oil or fatty acid ester
  • an isotonic agent such as glucose or sodium chloride
  • a solubilizing agent for example, Stabilizers, preservatives, suspending agents, emulsifiers and the like can be optionally used.
  • the dose when using the pharmaceutical composition can be appropriately determined according to, for example, the type of active ingredient used, the type of disease, the age, sex, body weight, degree of life, or administration method of the patient. It can be administered orally or parenterally.
  • the amount of the polypeptide is preferably 0.01 to 100 mg / kg per day.
  • the above administration method is an example, and other administration methods may be used. It is desirable that the method of administration, dose, administration period, administration interval, etc. of the pharmaceutical composition to humans be determined by a controlled clinical trial.
  • the administration form is not limited to pharmaceutical products, and various forms, for example, functional foods, health foods (including beverages), or foods and drinks as feed can be given.
  • the method for producing a pharmaceutical composition containing a polypeptide can be produced using a known method for producing a pharmaceutical product, except that the polypeptide is contained as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain other ingredients.
  • the other components include edible oils and fats, water, glycerin fatty acid ester, sugar fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, glycerin organic acid fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, stearoyl calcium lactate, sodium stearoyl lactate, and the like.
  • Emulsifiers such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, thickening stabilizers such as locust bean gum, carrageenan, alginic acids, pectin, xanthan gum, crystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, agar, glucomannan, gelatin, starch, or chemical starch, Salt or salting agents such as potassium chloride, acidulants such as acetic acid, lactic acid, or gluconic acid, sweeteners such as sugars or sugar alcohols, stevia, or aspartame, coloring agents such as beta-carotene, caramel, or red koji pigment.
  • thickening stabilizers such as locust bean gum, carrageenan, alginic acids, pectin, xanthan gum, crystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, agar, glucomannan, gelatin, starch, or chemical starch
  • Salt or salting agents such as potassium chloride,
  • Antioxidants such as tocopherol or tea extract, flavoring agents, pH adjusters, food preservatives, or food materials and food additives such as shelf life improvers. It is also possible to contain various vitamins, coenzyme Q, plant sterols, and functional materials such as milk fat bolus membrane.
  • the total content of these other components in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 8% by mass or less, more preferably 40% by mass or less, still more preferably 20% by mass or less.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to humans, but the administration target may be animals other than humans, and pets such as dogs, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, and squirrels; cows and animals. Livestock such as pigs; experimental animals such as mice and rats; and animals bred in zoos and the like can be mentioned.
  • the method for treating cancer of the present invention includes a step of administering an effective amount of the polypeptide to a subject in need of treatment. That is, the polypeptide of the present invention can be used as a method for treating cancer. Cancer can be treated by administering an effective amount of the pharmaceutical composition to humans or animals.
  • polypeptides of the invention are for the treatment of cancer.
  • the polypeptide can be used in a method of treating cancer. That is, the present specification discloses polypeptides for the treatment of cancer.
  • the polypeptide can be used in the production of pharmaceutical compositions. That is, the present specification discloses the use of a polypeptide in the manufacture of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is, but is not limited to, a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • the mechanism by which the polypeptide of the present invention has cell fusion activity has not been completely elucidated, but it is presumed as follows. However, the present invention is not limited by the following presumptions.
  • the polypeptide of the present invention is considered to exhibit cell fusion activity due to the structure commonly present in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 8. Although not limited, the first proline is considered to be relatively important.
  • the 2nd and 9th leucine or isoleucine show cell fusion activity even if they are substituted with each other, the 2nd and 9th amino acids can be substituted, and by substitution with another amino acid (for example, valine). Is also likely to exhibit cell fusion activity.
  • the 5th and 6th threonines and glutamine also exhibit cell fusion activity even if they are mutually substituted, the 5th and 6th amino acids can be substituted, including the 4th serine and the 7th threonine.
  • the 8th and 10th alanines may also exhibit cell fusion activity even if they are replaced with amino acids having similar properties, such as glycine.
  • methylation of N-terminal proline is not essential for the cell fusion ability of each peptide and the induction of apoptosis of cancer cells.
  • peptides in which one or more amino acids are added to N-terminal proline can also exhibit cell fusion and apoptosis-inducing ability.
  • the mechanism by which the polypeptide of the present invention has an anticancer effect has not been completely elucidated, it is presumed as follows.
  • the present invention is not limited by the following presumptions. It is presumed that the polypeptide of the present invention can fuse cancer cells and induce apoptosis in the cells, thereby killing the cancer cells. In addition, the cell fusion is induced regardless of the type of cancer. Therefore, the polypeptides of the invention are considered to be effective against many types of cancer.
  • Example 1 In this synthesis example, the peptide in which the N-terminal proline of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 below is methylated, and the peptide of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (proline is not methylated). , And a peptide in which the N-terminal proline of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 was methylated was synthesized. Peptide synthesis was outsourced to Gleiner / Fasmax.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence in which threonine and alanine are added to the C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • peptide 1 CH 3- Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala
  • peptide 2 CH 3- Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala
  • peptide 3 CH 3- Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala
  • peptide 4 CH 3- Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala
  • peptide 5 SEQ ID NO: 5
  • Fmoc amino acids are activated with HBTU / HOBT solution (HBTU: 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniu Hexafluorophosphate; HOBT: 1-Hydroxybenzotriazole) and DIEA ( N, N'-Diisopropylethylamine) was added to condense the amino acids.
  • HBTU 2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniu Hexafluorophosphate
  • HOBT 1-Hydroxybenzotriazole
  • DIEA N, N'-Diisopropylethylamine
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Example 2 the peptide 1 obtained in Example 1 was allowed to act on RFL cells (rat lung fetal cells) or LLC cells (Lewis lung cancer-derived cells), and the cell fusion activity of the peptides was examined.
  • RFL cells or LLC cells (2 x 10 6 cells) were suspended in 6 mL of RPMI-1640 (Wako, 189-02025) medium supplemented with 5% FBS (Biosera, Cat No. 015BS493) and 24 well plate (Iwaki, 2820-). Each well of 024) was dispensed with 8 ⁇ 10 4 cells / 0.25 mL and cultured.
  • FIG. 1 shows micrographs of weakly enlarged (A and B) and strongly enlarged (C) of RFL cells and micrographs of LCC cells (D). In both RFL cells and LCC cells, the cells were fused and fusion cells having multiple nuclei were observed.
  • Example 3 the cell fusion activity of peptide 2 was examined. The procedure of Example 2 was repeated except that peptide 2 was used instead of peptide 1 and only RFL cells were used.
  • FIG. 2 shows micrographs of weakly enlarged (A) and strongly enlarged (B) of RFL cells. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Example 4 >> In this example, the cell fusion activity of peptide 3 was examined. The operation of Example 3 was repeated except that peptide 3 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 3 shows a micrograph of a weakly magnified RFL cell. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Example 5 the cell fusion activity of peptide 4 was examined. The operation of Example 3 was repeated except that peptide 4 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 4 shows a micrograph of a weakly magnified RFL cell. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Example 6 >> In this example, the cell fusion activity of peptide 5 was examined. The operation of Example 3 was repeated except that peptide 5 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 5 shows a micrograph of a weakly magnified RFL cell. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Example 7 the cell fusion activity of peptide 6 was examined. The procedure of Example 2 was repeated except that peptide 6 was used instead of peptide 1 and RM-4 cells were used instead of LLC cells.
  • RM-4 cells are cancer cells selected by infecting RFL cells with Moloney murine leukemia virus.
  • FIG. 6 shows photomicrographs of RFL cell weak enlargement (A) and strong enlargement (B), and weak enlargement of RM-4 cells (C and D). In RFL cells and RM-4 cells, the cells were fused and fused cells having multiple nuclei were observed.
  • Example 8 >> In this example, the cell fusion activity of peptide 7 was examined. The operation of Example 3 was repeated except that peptide 7 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 7 shows micrographs of weakly enlarged (A) and strongly enlarged (B) of RFL cells. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Example 9 the cell fusion activity of peptide 8 was examined. The procedure of Example 2 was repeated except that peptide 8 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 8 shows micrographs of RFL cells weakly enlarged (A and B) and strongly enlarged (C), and micrographs of LCC cells (D). In RFL cells and LCC cells, the cells were fused and fused cells having multiple nuclei were observed.
  • Example 10 the cell fusion activity of peptide 9 was examined. The procedure of Example 3 was repeated except that peptide 9 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 9 shows a micrograph of a weakly magnified RFL cell. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei.
  • Peptide 9 is a peptide in which threonine and alanine are added to the C-terminal side of peptide 1, but it has cell fusion activity, and the cell fusion activity is superior to that of peptide 1.
  • Example 11 the cell fusion activity of peptide 10 was examined. The procedure of Example 3 was repeated except that peptide 9 was used instead of peptide 2.
  • FIG. 10 shows a micrograph of a weakly magnified RFL cell. In RFL cells, fused cells were found in which the cells were fused and had multiple nuclei. That is, the N-terminal proline of peptide 1 was not N-methylated proline, and the peptide of normal proline also had cell fusion activity, but the cell fusion activity of peptide 1 seemed to be stronger.
  • Example 12 the apoptotic ability of peptide 1 was examined using RM-4 cells.
  • the activity of Caspase-3 / 7 is measured using an Inactive Non-Fluorescent (DEVD) substrate that can cross cell membranes.
  • DEVD Inactive Non-Fluorescent
  • the activity of Annexin V is measured using a photostable CF dye. When the CF dye binds to phosphatidylserine (PS), it emits a red fluorescent signal, and the activity of Annexin V is measured by the red fluorescent signal.
  • DEVD Inactive Non-Fluorescent
  • RM-4 cells were seeded on 96-well plates and Peptide 1 was added at 0.06 ⁇ g / mL.
  • Caspase-3 / 7 Green Reagent (Unit size: 20 ul, 5 mM / vial) was diluted 500-fold with Ham's F-12K and added, and Annexin V Red Reagent (Unit size: 100 tests / vial) was added to Ham's F-12K. It was diluted 100-fold at -12K and added.
  • IncuCyte S3 viable cell analysis system measurements were taken by continuous scanning every hour for 3 days with an objective lens magnification of 10 times and a field of view of 4. As a control, RM-4 cells not treated with peptide 1 were used.
  • FIG. 11 (A) shows the activity of Caspase-3 / 7
  • FIG. 11 (B) shows the activity of Annexin V.
  • Both Caspase-3 / 7 and Annexin V increased sharply between 10 and 20 hours, followed by a gradual increase in activity.
  • the activities of Caspase-3 / 7 and Annexin V were not increased.
  • 12 and 13 show fluorescence micrographs after 18 hours and 78 hours, respectively. It can be seen that treatment with peptide 1 induces apoptosis in RM-4 cells.
  • Example 13 the anticancer effect of peptide 6 on A549 cells (human alveolar epithelial adenocarcinoma cells) was examined in vivo.
  • the CAnN.Cg-Foxn1 nu / CrlCrlj nude mice were grouped 6 animals, the A549 cells suspended at a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells / mL in PBS, and transplanted into 0.1mL right flank subcutaneously.
  • Peptide 6 was intravenously administered from the tail vein at a dose of 25 mg / kg 14 days, 17 days, 21 days, 24 days, 28 days, 31 days, 35 days, and 38 days after tumor transplantation (peptide 6). group).
  • the control group received PBS only.
  • Tumor volume and body weight were measured every 3 or 4 days, and an autopsy was performed 38 days after tumor transplantation (28 days from the start of peptide administration) to remove the tumor.
  • FIG. 17A (x40) and B (x400) are photographs of tumor masses of A549 cells administered with peptide 6, and FIGS. 17C (x40) and D (x400) are controls.
  • the tumor tissue mass was filled with cells, but in the mice to which peptide 6 was administered, the inside of the tumor was necrotic, and it is considered that peptide 6 showed an antitumor effect.
  • the polypeptide of the present invention can be used for cell fusion of plant cells and animal cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of cancer.

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Abstract

本発明の目的は、効率的な細胞融合の方法を提供することである。また、細胞融合によって、がん細胞を死滅させる方法を提供することである。　前記課題は、本発明の（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は（２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有するポリペプチドによって解決することができる。

Description

ペプチド並びにそれを含む細胞融合剤及びがん治療用医薬組成物
　本発明は、ペプチド並びにそれを含む細胞融合剤及びがん治療用医薬組成物に関する。本発明によれば、細胞を効率的に融合させることができる。
　細胞融合は、センダイウイルスに細胞を融合させる作用があることから見出された現象である（非特許文献１及び２）。現在では、品種改良又はモノクローナル抗体の生産などに、細胞融合が利用されている。また、ウイルスを利用する以外に、プロトプラスト－ＰＥＧ法又は電気刺激によっても細胞融合が起こることが知られている。
Cell fusion, 1970, Harvard University Press, Mass. Cell Fusion and some subcellular Properties of heterokaryons and hybrids, Journal of Cell Biology, VOLUME 67, 1975, pages 257-280
　本発明者らは、効率的に細胞融合できる方法がないかと考えた。また、細胞融合により、がん細胞を死滅させることがきるのではないかと考えた。
　従って、本発明の目的は、効率的な細胞融合の方法を提供することである。また、細胞融合によって、がん細胞を死滅させる方法を提供することである。
　本発明者は、効率的な細胞融合方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定のアミノ酸配列を有する新規のペプチドにより、細胞を効率的に融合できることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は（２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有するポリペプチド、
［２］前記配列番号１～８で表されるアミノ酸配列が、Ｎ末端にメチル基を有する、［１］に記載のポリペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体、
［６］［１］又は［２］に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその抗原結合性断片、
［７］有効成分として、［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む細胞融合剤、
［８］有効成分として、［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物、
［９］がん治療用である、［８］に記載の医薬組成物、
［１０］［１］又は［２］に記載のポリペプチドの有効量を、治療が必要な対象に投与する工程を含む、がんの治療方法、
［１１］がんの治療用である、［１］又は［２］に記載のポリペプチド、及び
［１２］［１］又は［２］に記載のポリペプチドの、がん治療用医薬組成物の製造への使用、
に関する。
　本発明のポリペプチドによれば、細胞を効率的に融合させることができる。また、本発明のポリペプチドは、がん治療用医薬組成物の、有効成分として用いることができる。
[規則91に基づく訂正 06.10.2020]　
ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞にペプチド１を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ及びＢ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞にペプチド１を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の強拡大（Ｃ）の顕微鏡写真、及びＬＣＣ細胞（Ｄ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド２を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド３を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド４を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド５を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞及びＲＭ－４細胞にペプチド６を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞及びＲＭ－４細胞にペプチド６を作用させた場合の、ＲＭ－４細胞の弱拡大（Ｃ及びＤ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド７を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞にペプチド８を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ及びＢ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞にペプチド８を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の強拡大（Ｃ）の顕微鏡写真、及びＬＣＣ細胞（Ｄ）の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド９を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真である。 ＲＦＬ細胞にペプチド１０を作用させた場合の、ＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真である。 ＲＭ－４細胞にペプチド１を作用させ、アポトーシスの誘導を、Ｃａｓｐａｓｅ－３／７の活性化（Ａ）及びＡｎｎｅｘｉｎＶの活性化（Ｂ）により測定したグラフである。 ＲＭ－４細胞にペプチド１を作用させ、１８時間後のＣａｓｐａｓｅ－３／７の活性化（緑の蛍光）及びＡｎｎｅｘｉｎＶの活性化（赤の蛍光）を確認した蛍光顕微鏡写真である。 ＲＭ－４細胞にペプチド１を作用させ、７８時間後のＣａｓｐａｓｅ－３／７の活性化（緑の蛍光）及びＡｎｎｅｘｉｎＶの活性化（赤の蛍光）を確認した蛍光顕微鏡写真である。 マウスにがん細胞を移植し、ペプチド６を投与して２８日間の腫瘍体積の変化を示したグラフである。 マウスにがん細胞を移植し、ペプチド６を投与して２８日間の体重の変化を示したグラフである。 マウスにがん細胞を移植し、ペプチド６を投与した群とコントロール群の２８日後の腫瘍重量を示したグラフである。 ペプチド６を投与されたマウスの摘出された腫瘍塊の４０倍の写真（Ａ）及び４００倍の写真（Ｂ）、並びにコントロールのマウスの摘出された腫瘍塊の４０倍の写真（Ｃ）及び４００倍の写真（Ｄ）である。
［１］ポリペプチド
　本発明のポリペプチドは（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。配列番号１～８で表されるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（配列番号１）
Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（配列番号２）
Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（配列番号３）
Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（配列番号４）
Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（配列番号５）
Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（配列番号６）
Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（配列番号７）
Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（配列番号８）
　また、本発明のポリペプチドは（２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有する。
　前記（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、（２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有するポリペプチド（以下、「機能的等価改変体」と称することがある）は、（２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞融合活性を有するポリペプチドを含む。
　本発明のポリペプチドは、配列番号１～８で表されるアミノ酸配列などの前記１０個のアミノ酸配列からなるポリペプチドによって、細胞融合活性を示すことができ、１０個のアミノ酸配列中に、細胞融合活性を示す特定の構造を有している。従って、１０個のアミノ酸配列中の細胞融合活性を示す特定の構造が壊されない限りにおいて、他のアミノ酸、ポリペプチド、又はタンパク質が、本発明のポリペプチドに結合しても、本発明のポリペプチドは細胞融合化活性を示すことができる。
《機能的等価改変体》
　機能的等価改変体は、配列番号１～８で表されるアミノ酸配列における１又は複数の箇所において、１～４個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有するポリペプチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。
　例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、配列番号２又は配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１個のアミノ酸が置換された機能的等価改変体であり、配列番号３又は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、２個のアミノ酸が置換された機能的等価改変体であり、配列番号４又は配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、３個のアミノ酸が置換された機能的等価改変体であり、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、４個のアミノ酸が置換された機能的等価改変体である。
　機能的等価改変体における、「１～４のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加」は、本発明のポリペプチドの機能を維持する保存的置換である。「保存的置換」とは、限定されるものではないが、例えばアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることによって実施できる。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。限定されるものではないが、このような保存的置換により、細胞融合活性を有する機能的等価改変体を得ることができる。
　本発明のポリペプチドは、限定されるものではないが、好ましくはＮ末端のプロリンがメチル化されている。すなわち、Ｎ末端のプロリンは、好ましくはメチル化プロリンである。限定されるものではないが、Ｎ末端のプロリンがメチル化されていることによって、更に優れた細胞融合活性を示すことができる。
　本発明のポリペプチドは、本技術分野で公知の方法によって製造することができる。例えば、後述の発現ベクターを含む形質転換体を培養することによって得ることもできるが、化学合成法によって製造することが好ましい。
《細胞融合活性》
　本発明のポリペプチドは、細胞融合活性を有する。本発明のポリペプチドによる細胞融合は、いくつかの細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞を形成する。
　また、融合した細胞は、細胞融合の後にアポトーシスが誘導され、細胞が死滅する。
《ポリヌクレオチド》
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば化学合成法などによって製造することができる。
《発現ベクター》
　本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。すなわち、本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
《形質転換体》
　本発明によれば、前記発現ベクターによって形質転換された細胞が提供される。この宿主－ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、真核生物の細胞などを用いた系、及びそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
　また、前記発現ベクターによる細胞の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
　更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明によるポリペプチドを単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規ポリペプチドの製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
《抗体》
　本発明のタンパク質に反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、各種動物に本発明のタンパク質、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Raz, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994；又はDonnelly, J. J.ら, J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996）によっても得ることができる。
　ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のタンパク質単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ－セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
　モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Kohler, G.及びMilstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975）により、当業者が容易に製造することが可能である。
　すなわち、本発明のタンパク質又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
　ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ－１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０～３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行い、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２～４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０～２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
　このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ－セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
　また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
　以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行い、引き続き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗原結合性断片、例えば、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ、又はＦｖを得ることができる。
　更には、本発明のタンパク質に反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Clackson, T.ら, Nature, 352, 624-628, 1991；又はZebedee, S.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Lonberg, N.ら, Nature, 368, 856-859, 1994）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
［２］細胞融合剤
　本発明の細胞融合剤は、有効成分として、本発明の前記ポリペプチドを含む。本発明の細胞融合剤は、１種のポリペプチドを単独で含んでもよいが、２種以上のポリペプチドを組み合わせて含んでもよい。
　細胞融合剤における前記ポリペプチドの含有量は、特に限定されるものではないが、例えば０．１～１００重量％であり、好ましくは１０～１００重量％であり、より好ましくは３０～９０重量％である。本発明の細胞融合剤は、ポリペプチド以外の成分として、担体（例えば、水又は緩衝液）、賦形剤、希釈剤、保存剤、安定化剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を含んでもよい。
　本発明の細胞融合剤は、植物の品種改良又はモノクローナル抗体の生産などに用いることができる。本発明の細胞融合剤によれば、効率的に細胞を融合させることができる。
　本発明の細胞融合剤によって、融合される細胞としては、特に限定されるものではなく、微生物の細胞、植物細胞、又は動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどの脊椎動物（例えば哺乳動物）の有核細胞（例えば血液細胞、リンパ系細胞、内臓を構成する細胞）、哺乳動物由来の癌細胞などが挙げられる。
　細胞融合の温度は、細胞融合が起こる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば０～４０℃であり、好ましくは１０～３８℃である。処理時間は特に限定されるものではないが、好ましくは１分から２時間である。
［３］医薬組成物
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のポリペプチドを含む。本発明の医薬組成物が予防又は治療できる疾患は、特に限定されるものではないが、例えばがん細胞を融合させ、がん細胞を死滅させ、そしてがんを治療することができる。具体的には、本発明のペプチドは、細胞融合によって、細胞にアポトーシスを誘導することができる。融合した細胞は、Ｃａｓｐａｓｅ－３／７又はＡｎｎｅｘｉｎＶが活性し、アポトーシスが誘導される。融合細胞にアポトーシスが誘導されることによって、がん細胞を死滅させることができる。
　本発明の医薬組成物が治療できる癌としては、舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌、乳房ページェット病、乳房肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃・大腸平滑筋肉腫、胃・腸悪性リンパ腫、膵・胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、転移性扁平上皮癌、転移性肉腫および中皮腫が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼剤などの非経口剤を挙げることができる。
　経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリデン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
　非経口剤としては、例えば注射剤を挙げることができる。注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
　医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、生上の程度、又は投与方法に応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。例えば、本発明の医薬組成物を経口摂取する場合の摂取量は、例えば成人の場合、ポリペプチドとして１日当たり０．０１～１００ｍｇ／ｋｇが好ましい。なお、上記の投与法は一例であり、他の投与法であってもよい。ヒトへの医薬組成物の投与方法、投与量、投与期間、及び投与間隔等は、管理された臨床治験によって決定されることが望ましい。
　更に、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料も含む）、又は飼料として飲食物の形態で与えることも可能である。
　ポリペプチドを含有する医薬組成物の製造方法は、ポリペプチドを有効成分として含むこと以外は、公知の医薬品の製造方法を用いて製造することができる。
　本発明の医薬組成物は、その他の成分を含有することができる。前記その他の成分としては、例えば、食用油脂、水、グリセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン有機酸脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ステアロイル乳酸カルシウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の乳化剤、ローカストビーンガム、カラギーナン、アルギン酸類、ペクチン、キサンタンガム、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、寒天、グルコマンナン、ゼラチン、澱粉、又は化工澱粉等の増粘安定剤、食塩、又は塩化カリウム等の塩味剤、酢酸、乳酸、又はグルコン酸等の酸味料、糖類又は糖アルコール類、ステビア、又はアスパルテーム等の甘味料、ベータカロチン、カラメル、又は紅麹色素等の着色料、トコフェロール、又は茶抽出物等の酸化防止剤、着香料、ｐＨ調整剤、食品保存料、又は日持ち向上剤等の食品素材や食品添加物を挙げることができる。また、各種ビタミンやコエンザイムＱ、植物ステロール、又は乳脂坊球皮膜等の機能素材を含有させることも可能である。これらのその他の成分の含有量は、本発明の医薬組成物中、合計で好ましくは８質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下とする。
　本発明の医薬組成物は、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物であってもよく、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、及びリス等のペット；牛及び豚等の家畜；マウス、ラット等の実験動物；並びに、動物園等で飼育されている動物等が挙げられる。
《がんの治療方法》
　本発明のがんの治療方法は、前記ポリペプチドの有効量を、治療が必要な対象に投与する工程を含む。すなわち、本発明のポリペプチドは、がんの治療方法に用いることができる。前記医薬組成物の有効量を、ヒト又は動物に投与することにより、がんを治療することができる。
《がんの治療用であるポリペプチド》
　本発明のポリペプチドは、がんの治療用である。
　前記ポリペプチドは、がんの治療方法に使用することができる。すなわち、本明細書はがんの治療用であるポリペプチドを開示する。
《ポリペプチドの医薬組成物の製造への使用》
　前記ポリペプチドは、医薬組成物の製造に使用することができる。すなわち、本明細書は、ポリペプチドの医薬組成物の製造への使用を開示する。前記医薬組成物は限定されるものではないが、がん治療用医薬組成物である。
《作用》
　本発明のポリペプチドが、細胞融合活性を有するメカニズムは完全に解明されているわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。
　本発明のポリペプチドは、配列番号１～８のアミノ酸配列に共通して存在している構造により細胞融合活性を示すものと考えられる。限定されるものではないが、第１番目のプロリンは比較的重要であると考えられる。一方、２番目及び９番目のロイシン又はイソロイシンは、相互に置換されても細胞融合活性を示すため、２番目及び９番目のアミノ酸は置換可能であり、他のアミノ酸（例えばバリン）への置換によっても細胞融合活性を示す可能性が高いと考えられる。また、５番目及び６番目のトレオニンとグルタミンも相互に置換されても細胞融合活性を示すため、５番目及び６番目のアミノ酸は置換可能であり、４番目のセリン及び７番目のトレオニンを含めて、性質の似た他のアミノ酸への置換によっても細胞融合活性を示す可能性が高いと考えられる。更に、８番目及び１０番目のアラニンも性質の似たアミノ酸、例えばグリシンに置換されても細胞融合活性を示す可能性があると考えられる。また、Ｎ末端のプロリンのメチル化は、各ペプチドの細胞融合能、及びがん細胞のアポトーシスの誘導に必須ではない。従って、Ｎ末端のプロリンに１つ以上のアミノ酸が付加されたペプチドも、細胞融合及びアポトーシス誘導能を示すことができる。
　また、本発明のポリペプチドが、抗がん作用を有するメカニズムは完全に解明されているわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。
　本発明のポリペプチドは、がん細胞を融合させることができ、細胞にアポトーシスを誘導し、それによってがん細胞を死滅させることができると推定される。また、前記細胞融合は、がんの種類によらず誘導される。従って、本発明のポリペプチドは、多くの種類のがんに対して有効だと考えられる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
　本合成例では、下記の配列番号１～８で表されるアミノ酸配列のＮ末端のプロリンがメチル化されたペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列のペプチド（プロリンがメチル化されていない）、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端のプロリンがメチル化されたペプチドを合成した。ペプチド合成は、グライナー／ファスマックス社に委託した。なお、配列番号９で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＣ末側にスレオニン及びアラニンが付加されたアミノ酸配列である。
CH3-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（以下、ペプチド１と称する；配列番号１）
CH3-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（以下、ペプチド２と称する；配列番号２）
CH3-Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（以下、ペプチド３と称する；配列番号３）
CH3-Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（以下、ペプチド４と称する；配列番号４）
CH3-Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（以下、ペプチド５と称する；配列番号５）
CH3-Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（以下、ペプチド６と称する；配列番号６）
CH3-Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（以下、ペプチド７と称する；配列番号７）
CH3-Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（以下、ペプチド８と称する；配列番号８）
CH3-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala（以下、ペプチド９と称する；配列番号９）
Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（以下、ペプチド１０と称する；配列番号１）
　アミノ酸の合成は、standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) methodに従って行った。具体的には、Fmocアミノ酸をHBTU/HOBT溶液（HBTU:2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniu Hexafluorophosphate；HOBT:1-Hydroxybenzotriazole）で活性化し、DIEA（N,N'-Diisopropylethylamine）を添加してアミノ酸を縮合させた。
　合成されたアミノ酸のレジンからの切り出しは、以下のように実施した。TFA（trifluoroacetic acid）溶液（4.125 mL TFA, 0.25 mL H2O, 0.375 g phenol, 0.125 mL ethanedithiol and 0.25 mL thioanisole)）を作成し、レジンに加え、常温で2時間反応させて冷エーテルで沈殿させてCrudeペプチドを得た。
　得られた粗精製ペプチドをＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製し、凍結乾燥させた。精製の純度は、下記の条件のＨＰＬＣ及びＭＳで検討した。
・HPLC条件
　A Buffer：0.1％TFA/H2O、B Buffer：0.1％TFA/Acetonitrile
　Column：SunFire C18 Column, 5 μm, 4.6 x 150 mm
　Flow rate：1 mL/min
　Wavelength：220 nm
・MALDI-TOF-MS
《実施例２》
　本実施例では、ＲＦＬ細胞（ラット肺胎児由来細胞）又はＬＬＣ細胞（ルイス肺癌由来細胞）に、実施例１で得られたペプチド１を作用させ、ペプチドの細胞融合活性を検討した。
　ＲＦＬ細胞又はＬＬＣ細胞（２×１０６個）を５％ＦＢＳ（Biosera, Cat No. 015BS493）を添加したＲＰＭＩ－１６４０（Wako, 189-02025）培地６ｍＬに懸濁し、２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Iwaki, 2820-024）の各ｗｅｌｌに８×１０４個／０．２５ｍＬ分注し、培養した。培地を除去し、新たに培地（２０μＬ）及びペプチド１（１μｇ／ｍＬ）を分注し、さらに２４～３６時間培養した。培養終了後、メタノール（Ｗａｋｏ）にて固定し、ギムザ染色液（武藤化学　１５００３）にて核染色を行って検鏡した。
　図１にＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ及びＢ）及び強拡大（Ｃ）の顕微鏡写真、及びＬＣＣ細胞（Ｄ）の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞のいずれでも、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例３》
　本実施例では、ペプチド２の細胞融合活性を検討した。ペプチド１に代えてペプチド２を用いたこと、及びＲＦＬ細胞のみを使用したことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。
　図２にＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例４》
　本実施例では、ペプチド３の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド３を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。
　図３にＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例５》
　本実施例では、ペプチド４の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド４を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。
　図４にＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例６》
　本実施例では、ペプチド５の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド５を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。
　図５にＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例７》
　本実施例では、ペプチド６の細胞融合活性を検討した。ペプチド１に代えてペプチド６を用いたこと、及びＬＬＣ細胞に代えてＲＭ－４細胞を用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。なお、ＲＭ－４細胞は、ＲＦＬ細胞にモロニーマウス白血病ウイルスを感染させて、選択されたがん細胞である。
　図６にＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真、並びにＲＭ－４細胞の弱拡大（Ｃ及びＤ）を示す。ＲＦＬ細胞及びＲＭ－４細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例８》
　本実施例では、ペプチド７の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド７を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。
　図７にＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ）及び強拡大（Ｂ）の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例９》
　本実施例では、ペプチド８の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド８を用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。
　図８にＲＦＬ細胞の弱拡大（Ａ及びＢ）及び強拡大（Ｃ）の顕微鏡写真、並びにＬＣＣ細胞（Ｄ）の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞及びＬＣＣ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
《実施例１０》
　本実施例では、ペプチド９の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド９を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。図９にＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
　ペプチド９は、ペプチド１のＣ末側にスレオニン及びアラニンが付加されたペプチドであるが、細胞融合活性を有しており、その細胞融合活性はペプチド１よりも優れていた。
《実施例１１》
　本実施例では、ペプチド１０の細胞融合活性を検討した。ペプチド２に代えてペプチド９を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。図１０にＲＦＬ細胞の弱拡大の顕微鏡写真を示す。ＲＦＬ細胞において、細胞が融合し、複数の核を有する融合細胞が見られた。
　すなわち、ペプチド１のＮ末のプロリンが、Ｎメチル化プロリンでなく、通常のプロリンのペプチドも、細胞融合活性を有していたが、ペプチド１の細胞融合活性の方が強いようであった。
《実施例１２》
　本実施例では、ＲＭ－４細胞を用いて、ペプチド１のアポトーシス能を検討した。アポトーシスの指標であるＣａｓｐａｓｅ－３／７及びＡｎｎｅｘｉｎＶの活性を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３生細胞化解析システム（エッセンバイオサイエンス社）を用いて測定した。
　Ｃａｓｐａｓｅ－３／７の活性は、細胞膜を通過できる不活性非蛍光（ＤＥＶＤ）基質を用いて測定される。活性化Ｃａｓｐａｓｅ－３／７が基質を切断することによって、ＤＮＡ結合緑色蛍光ラベルが放出され、緑色蛍光の強度により、Ｃａｓｐａｓｅ－３／７の活性が測定される。
　ＡｎｎｅｘｉｎＶの活性は、光安定性のＣＦ色素を用いて測定される。ＣＦ色素は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合すると、赤色の蛍光シグナルを発し、赤色の蛍光シグナルにより、ＡｎｎｅｘｉｎＶの活性が測定される。
　ＲＭ－４細胞を９６ウェルプレートに播種し、ペプチド１を０．０６μｇ／ｍＬ添加した。Ｃａｓｐａｓｅ－３／７　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ：２０ｕｌ，５ｍＭ／ｖｉａｌ）をＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋで５００倍希釈し添加し、そしてＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ　Ｒｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ：１００ｔｅｓｔｓ／ｖｉａｌ）をＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋで１００倍希釈し添加した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ　Ｓ３生細胞化解析システムを用い、対物レンズ倍率１０倍、視野数４で、１時間おきに３日間連続スキャンし測定した。コントロールとして、ペプチド１を処理していないＲＭ－４細胞を用いた。
　図１１（Ａ）にＣａｓｐａｓｅ－３／７の活性を、図１１（Ｂ）にＡｎｎｅｘｉｎＶの活性を示す。Ｃａｓｐａｓｅ－３／７及びＡｎｎｅｘｉｎＶのいずれも、１０時間から２０時間の間に急激に上昇し、その後も徐々に活性が上昇した。一方、ペプチド１を処理しないＲＭ－４細胞では、Ｃａｓｐａｓｅ－３／７及びＡｎｎｅｘｉｎＶの活性は上昇しなかった。
　図１２及び図１３に、それぞれ１８時間後及び７８時間後の蛍光顕微鏡写真を示す。ペプチド１の処理によって、ＲＭ－４細胞にアポトーシスが誘導されることがわかる。
《実施例１３》
　本実施例では、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞上皮腺癌細胞）に対するペプチド６の抗癌作用をｉｎ　ｖｉｖｏで検討した。
　６匹ずつ群分けしたCAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrljヌードマウスに、ＰＢＳに４×１０６cells／ｍＬの濃度で懸濁したＡ５４９細胞を、０．１ｍＬ右腹側部皮下に移植した。腫瘍移植後１４日、１７日、２１日、２４日、２８日、３１日、３５日、及び３８日後に、ペプチド６を２５ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈から静脈内投与した（ペプチド６群）。コントロール群は、ＰＢＳのみを投与した。
　３日又は４日おきに、腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍移植３８日後（ペプチド投与開始から２８日）に剖検し、腫瘍を摘出した。腫瘍体積は、短径及び長径をノギスで測定し、「推定腫瘍体積＝（短径）２×（長径）÷２」の式から計算した。なお、コントロール群の１匹のマウスは腫瘍が過度に大きくなったため、腫瘍移植後３５日で、実験を中止し、５匹のマウスで評価した。
　図１４及び図１５に示すように、ペプチド６の投与により、腫瘍体積が減少し、抗癌作用があることが確認された。また、ペプチド６の投与は、マウスの体重に影響がなく、副作用等は見られなかった。
　摘出した腫瘍のＨＥ染色写真を図１７に示す。図１７Ａ（×４０）及びＢ（×４００）が、ペプチド６が投与されたＡ５４９細胞の腫瘍塊の写真であり、図１７Ｃ（×４０）及びＤ（×４００）がコントロールである。コントロールは腫瘍組織塊に細胞が充満しているが、ペプチド６を投与したマウスでは腫瘍内部が壊死を起こしており、ペプチド６が抗腫瘍効果を示したと考えられる。
　本発明のポリペプチドは、植物細胞及び動物細胞の細胞融合に用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、がんの治療に用いることができる。

Claims (12)

  1. 　（１）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
    （２）配列番号１～８で表されるアミノ酸配列において、１～４のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞融合活性を有するポリペプチド。
  2. 　前記配列番号１～８で表されるアミノ酸配列が、Ｎ末端にメチル基を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　請求項１又は２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  5. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
  6. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその抗原結合性断片。
  7. 　有効成分として、請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む細胞融合剤。
  8. 　有効成分として、請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
  9. 　がん治療用である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドの有効量を、治療が必要な対象に投与する工程を含む、がんの治療方法。
  11. 　がんの治療用である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  12. 　請求項１又は２に記載のポリペプチドの、がん治療用医薬組成物の製造への使用。
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