CN108315319A - 一种cd138单抗靶向捕获的细胞融合方法 - Google Patents

Abstract

一种用于生物医学领域的CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法，其特征是将待融合的B细胞和骨髓瘤细胞置于含有能连接B细胞和骨髓瘤细胞的CD138单抗、能活化B细胞的IL‑3、IL‑6、SCF、能增强B细胞IgGFc受体活性的IFN‑γ、能与胞膜受体结合而易于膜融合的刀豆蛋白A的预融合剂中预处理，使骨髓瘤细胞表位CD138刚好被CD138单抗全部结合，通过CD138单抗的IgGFc段靶向捕获B细胞，形成骨髓瘤细胞‑CD138单抗‑B细胞的结合物，拉近细胞距离，易于胞膜接触和特异融合，增加骨髓瘤细胞与B细胞的特异融合率，减少了B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的无效融合。

Description

一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域CD138单抗靶向特异性捕获的细胞融合方法。

背景技术

细胞融合是20世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定条件诱导下使两个或多个 细胞(原生质体)相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，形成杂种细胞。

细胞融合所形成的新细胞(杂合细胞)得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有 新的遗传学或生物学特性。细胞融合已成为细胞工程的核心技术之一，它不仅为核质相互关 系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力的手段， 而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具 有广泛的应用价值，它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现 代生物医学研究中的一项关键技术。

人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细 胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融 合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌 细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种 属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。

1974年发现了聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子量的PEG时， 融合效率较病毒诱导法可提高1000倍以上，经过研究发现PEG在融合过程中起着稳定和诱 导凝集作用。后来人们又发现还有许多其他的化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级 脂肪酸衍生物、脂质体等，但以聚乙二醇的效果较好。所以1975年以后，利用PEG诱导细胞 融合逐渐发展成为一种重要的化学融合方法，PEG法一直沿用至今，即使到了近年来已不断 发展为电穿孔或电融合的电场诱导法、激光诱导法、微流控芯片法、高通量芯片法的今天， 因新方法的设备和实验费用昂贵等原因，PEG法依然以其低廉的实验成本和相对较高的融合 率而在许多实验中依然被大量应用，最常用的是淋巴细胞杂交瘤技术，又称为单克隆抗体技 术，是将特异抗原免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞株在含有PEG(1000-2000)的选择培养基 中进行融合，得到既能产生单克隆抗体又能在体外无限扩增的杂交瘤细胞株。以此制备的单 克隆抗体已经商品化，已广泛应用于研究许多疾病的诊断、治疗和预防。

纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒 到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在 新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、 电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、 简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展。

PEG有不同的聚合产物，其相对分子质量分别为1000/2000/4000/6000/12000及20000 等，相对分子质量为1000-6000的PEG均可用作促融剂。PEG处理时间越长，细胞融合效果越 好，但对细胞的毒害也就越大；PEG的分子量及其浓度与细胞融合效果成正比，但PEG的分 子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大.所以在实验时常采用的PEG分子量一般为 1000-4000，浓度一般为40-60％。如此有效融合剂量的PEG仍对细胞有很大的毒性作用。

发明内容

为了建立一种对被融合细胞无毒害、低费用的简便细胞免疫融合方法，提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法。

本发明的目的是这样实现的：将骨髓瘤细胞(SP2/0)免疫小鼠，获得小鼠致敏B细胞， 将致敏B细胞与其他具有骨髓瘤细胞特性的瘤细胞杂交，制备抗骨髓瘤细胞(SP2/0)单克隆 抗体(CD138单抗或CD138-IgG)，将该CD138-IgG作为B细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合的诱 导剂，以替代或减量使用传统B细胞杂交瘤技术中对细胞有毒性作用的诱导剂(PEG)，实施时 将待融合的B细胞和骨髓瘤细胞经含有CD138-IgG、IL-3、IL-6、SCF、IFN-γ、刀豆蛋白A的 预融合剂处理，使CD138-IgG的IgGFab段与骨髓瘤细胞结合，而IgGFc段与含有IgGFc受体的B 细胞结合，借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B细胞，选择性地拉近被融合细胞的距 离，在刀豆蛋白A或低浓度PEG的进一步作用下，易于胞膜的接触和融合。

本发明发现80％以上的B淋巴细胞表达IgGFc受体(能结合IgGFc段)、几乎所有的骨髓瘤细 胞表达CD138(能结合CD138单抗的IgGFab段)，所以将待融合的B细胞和骨髓瘤细胞置于含有 能连接B细胞IgGFc受体和骨髓瘤细胞CD138的CD138单抗、能活化B细胞的IL-3、IL-6、SCF、 能增强B细胞IgGFc受体活性的IFN-γ、能与胞膜受体结合而易于膜融合的刀豆蛋白A的预融合 剂中预处理，使骨髓瘤细胞CD138刚好被CD138单抗全部结合，通过CD138单抗的IgGFc段靶向 捕获、连接B细胞，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗-B细胞的结合物，拉近细胞距离，易于胞膜接 触和特异融合，增加骨髓瘤细胞与B细胞的有效融合率，减少了B细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与 骨髓瘤细胞的无效融合。

具体实施方式

图1是本发明的IgG助融示意图。

图2是本发明的细胞融合图。

在图1中，1为表达CD138的骨髓瘤细胞，2为CD138单克隆抗体(IgG)，3为表达IgGFc受体的B淋巴细胞。CD138单克隆抗体IgGFab端与骨髓瘤细胞的CD138受体结合，而IgGFc 端与B淋巴细胞结合，通过CD138单克隆抗体将待融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞连接在一起，有利于在PEG的作用下融合。

在图2中，融合细胞经HAT筛选2周，倒置显微镜下拍摄(40X)，得到杂交瘤细胞克隆。

下面结合图1和图2，对本发明的实施方案作具体的描述。

1、实验试剂

(1)预融合剂：在DMEM培养基中配入浓度为30ng/ml IL-3、45ng/ml IL-6、45ng/mlSCF、 3.6μg/L IFN-γ、与被融合骨髓瘤细胞等价CD138单抗(骨髓瘤细胞∶CD138-IgG＝1∶1)、 2.9μg/ml刀豆蛋白A。其中IL-3、IL-6、SCF能活化B细胞；IFN-γ能活化IgGFc受体、促细胞 融合；刀豆蛋白A能抑制细胞运动、促进细胞凝集和延长存活时间；CD138单抗可通过免疫动 物制备或商品购得，其IgGFab段与骨髓瘤细胞CD138结合、IgGFc段与B淋巴细胞结合。在融合 预处理中CD138单抗与骨髓瘤细胞以1∶1调配，使骨髓瘤细胞CD138刚好被CD138单抗全部结合， 通过CD138单抗的IgGFc段靶向捕获、连接B细胞，形成骨髓瘤细胞-CD138单抗(IgG)-B细胞 的结合物，拉近细胞距离，易于胞膜接触和特异融合，增加骨髓瘤细胞与B细胞的特异融合率。

(2)其他试剂：DMEM培养基、HAT选择培养基购自Sigma公司，优级胎牛血清(FBS)购白天 津市灏洋生物制品科技责任有限公司；DMSO(--甲基亚砜)为国产分析纯试剂；CD138单抗可通 过免疫动物制备或商品购得。

2、细胞融合方法

(1)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出一管冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)， 立即放入热水解冻(应用最多的是Sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌 任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h； 与人体相关的实际应用中考虑选择同源细胞株，如上海复祥生物科技有限公司向ATCC细胞库 引进的NCI-H929人骨髓瘤细胞株)。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重 复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代 或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时 将SP2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲 打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，按经验保证在融合时其密度为80％左右。

(2)B淋巴细胞的准备：B细胞以DMEM培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×10⁸～2 ×10⁸，用于细胞融合，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

(3)预融合处理：将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞以10∶1-5∶1的比例加入离心管中，混和均 匀，1000r/min离心5min，弃去上清，轻轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀，加入2ml预融合剂， 确保骨髓瘤细胞∶CD138单抗＝1∶1，37℃2-5小时，立即以1000r/min离心5min，弃去上清，轻 轻敲打管底至细胞无颗粒状沉淀。

(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后无菌条件下将预热的1000μL 的25％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25mL基础 培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静 置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，1500r/m离心5min， 弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％CO2培 养箱中培养。

(5)融合细胞的筛选：观察96孔板细胞生长情况，7-10天后仅有有效融合细胞能够生长， 此时弃去HAT培养基，更换完全培养基。细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去培养上清， 选择有生长状态良好的杂交瘤细胞株的培养孔，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使 用无菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释 到后面数孔，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待细胞克隆长 满至孔底面积1/10以上时，取细胞或培养上清检测融合细胞的特性。

(6)细胞融合效果比较：

(A)常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的预融合率(HAT选择培养前融合率)对 比：在细胞融合的过程中，除了B细胞与骨髓瘤细胞会发生融合外，还会发生B细胞与B细胞、 骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合，只有B细胞与骨髓瘤细胞的融合，才能获得既具有B细胞 产生抗体特性又具有骨髓瘤细胞无限增殖特性的B细胞杂交瘤细胞，才是有效的融合，而B 细胞与B细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合都是无效融合。为了比较常规化学剂诱导与 CD138单抗介导细胞融合的预融合率，取融合后但HAT培养前的细胞沉淀制片、染色、镜下 观察，计数100个细胞，计算双核或多核细胞数/总细胞数，换算成百分比(表1)，其中常规 化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的预融合率分别为为41％、47％，CD138单抗介导细胞 融合的预融合率高于常规化学剂诱导，但无显著性差异(p＞0.05)。

(B)常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合的有效融合率对比：经HAT选择培养10 天后，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合(有效融合)的杂交瘤细胞才能稳定生长，而B细胞与B 细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合(无效融合)以及未融合的细胞，均不能在HAT选择培 养基中生长。为了比较两者的有效融合率，分别计数融合后并在96孔板中经HAT选择培养10 天后仍能稳定生长的孔数/96孔，换算成百分比(表1)，其中常规化学剂诱导法在96孔中有26 孔的细胞仍能稳定生长，而CD138单抗介导细胞融合在96孔中有43孔的细胞仍能稳定生长，两 者的有效融合率各为为27.1％(26/96)、44.8％(43/96)，CD138单抗介导细胞融合的有效融合率 高于常规化学剂诱导，有显著性差异(＜0.05)。说明常规化学剂诱导法与CD138单抗介导细胞 融合的预融合率虽然基本一致，但常规化学剂诱导法的无效融合的比例较高，而CD138单抗介 导细胞融合因借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B细胞从而使两者融合，所以其有效 的融合率就高。

(C)化学诱导剂毒性对融合细胞传代的影响：将常规化学剂诱导与CD138单抗介导所获 的融合细胞首次接种在96孔板中经HAT选择培养10天后，当大多细胞克隆生长面积达到1/10 个细胞孔时，各选5个细胞孔，去培养上清，显微镜下标记细胞株生长的位置、大小，使用无 菌枪头在标注的位置吸取细胞克隆，置新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到 后面第10孔，37℃，5％CO2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况(待细胞克隆生 长达孔底面积1/10以上时，还可取细胞或培养上清检测融合细胞的其他生物学特性)，计数有 细胞生长孔与细胞接种总孔数(50孔)，换算成百分比，结果常规化学剂诱导法在50孔中有16 孔生长细胞，本发明在50孔中有26孔生长细胞，换算为百分比分别为32％和52％；按上法进而 做重复传代试验，其中第2代的结果分别为62％和78％；第3代的结果分别为82％和88％，从试验 结果(表2)可知，常规化学剂诱导法与CD138单抗介导的细胞融合在第1代和第2代的传代中， 两者的融合细胞传代生长率有显著性差异，在第3代的传代中，两者的的融合细胞传代生长率 无显著性差异，说明CD138单抗介导的细胞融合因借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B 细胞从而使两者融合，而且所含细胞毒性化学诱导剂(PEG)降为25％，对细胞毒性很低，所 以在传代初期死亡细胞较少。而在常规化学诱导剂诱导法的细胞融合中，所含细胞毒性化学 诱导剂(PEG)的浓度为50％，对细胞毒性作用较大，所以虽然细胞发生融合，但融合细胞因 受毒性作用而易于在传代初期死亡。

表1 常规化学剂诱导与CD138单抗介导的细胞融合率比较

表2 常规化学剂诱导与CD138单抗介导细胞融合PEG浓度对融合细胞传代的影响

Claims (4)

1.一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法，其特征在于，借助于CD138单抗特异性捕获骨髓瘤细胞与B细胞从而使两者融合。

2.根据权利要求1所述的一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法，其特征在于，预融合剂含有30ng/ml IL-3、45ng/ml IL-6、45ng/ml SCF、3.6μg/L IFN-γ、2.9μg/ml刀豆蛋白A、与被融合骨髓瘤细胞等价的CD138单抗。

3.根据权利要求1、2所述的一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法，其特征在于，所述与被融合骨髓瘤细胞等价的CD138单抗是指骨髓瘤细胞∶CD138单抗＝1∶1。

4.根据权利要求1所述的一种CD138单抗靶向捕获的细胞融合方法，其特征在于，细胞毒性化学诱导剂(PEG)降为25％。