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WO2020111171A1 - 血管新生促進用組成物 - Google Patents

血管新生促進用組成物 Download PDF

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Publication number
WO2020111171A1
WO2020111171A1 PCT/JP2019/046524 JP2019046524W WO2020111171A1 WO 2020111171 A1 WO2020111171 A1 WO 2020111171A1 JP 2019046524 W JP2019046524 W JP 2019046524W WO 2020111171 A1 WO2020111171 A1 WO 2020111171A1
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WO
WIPO (PCT)
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angiogenesis
promoting
composition
promoting angiogenesis
peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/046524
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
高野　義彦
彩加 宮本
拓 中埜
Original Assignee
雪印メグミルク株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 雪印メグミルク株式会社 filed Critical 雪印メグミルク株式会社
Priority to JP2020557814A priority Critical patent/JPWO2020111171A1/ja
Publication of WO2020111171A1 publication Critical patent/WO2020111171A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting angiogenesis, a skin care agent, a food/beverage product for promoting angiogenesis, a supplement for promoting angiogenesis, and a cosmetic composition for promoting angiogenesis, which are useful for preventing aging of blood vessel function and the like.
  • Angiogenesis (regeneration) is important for the healthy maintenance of various organs.
  • Angiogenesis is the formation of new blood vessels from existing blood vessels, the process of which is initiated by the regulation of pericyte (mural cell) detachment from the vessel wall by Ang-2 (angiopoietin-2).
  • Ang-2 angiopoietin-2
  • VEGF vascular endothermic growth factor
  • VEGF has the functions of inducing proliferation and maintenance of survival of vascular endothelial cells, enhancing vascular permeability, regulating blood pressure, migration by platelets, chemotaxis to macrophages and the like.
  • a substance that enhances VEGF expression in vascular endothelial cells can be expected as a composition for promoting angiogenesis to prevent or improve skin aging, hair growth, myocardial function improvement, bone/cartilage function improvement, and brain function improvement.
  • substances that enhance the expression of VEGF soybean-derived preparations, extracts from plants and the like (Patent Document 1), and peptides (Patent Document 2) have been found.
  • As components contained in milk that promote angiogenesis Angiogenin-2 and Lactadherin have been reported (Non-Patent Document 1). However, there is no report as a peptide.
  • the object of the present invention is to provide an unprecedented composition for promoting angiogenesis.
  • Another object of the present invention is to provide a skin care agent, a food or drink for promoting angiogenesis, a supplement for promoting angiogenesis, and a cosmetic for promoting angiogenesis, which contain such a substance.
  • the inventors of the present invention have eagerly searched for a substance which is widely contained in food materials and has an action of promoting angiogenesis. Then, they found that the peptide consisting of LSFNPTQLEEQCHI (SEQ ID NO: 1) and its degradation product in the amino acid sequence of ⁇ -lactoglobulin promote angiogenesis, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • a composition for promoting angiogenesis which comprises, as an active ingredient, a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and/or its degradation product having angiogenic activity.
  • composition for promoting angiogenesis according to ⁇ 1>, wherein the degradation product is obtained by degrading a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with a protease. .. ⁇ 3>
  • the proteolytic enzyme is one or more selected from the group consisting of trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, and V8 protease ⁇ 2>, A composition for promoting angiogenesis.
  • angiogenesis promoting supplement, an angiogenesis promoting food or drink, or an angiogenesis promoting cosmetic comprising the angiogenesis promoting composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • the cosmetic for promoting angiogenesis according to ⁇ 4> which is a skin care agent to be applied to the skin surface.
  • the skin care agent according to ⁇ 5> wherein the skin care is prevention and/or improvement of rough skin.
  • the skin care agent according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7> which is a face cleanser, a cream, an emulsion, a beauty essence, or a lotion.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter, may be referred to as a peptide of SEQ ID NO: 1) and/or an angiogenesis-promoting substance containing a decomposition product thereof having an angiogenesis-promoting activity as an active ingredient
  • Compositions, foods and drinks for promoting angiogenesis, supplements for promoting angiogenesis, and cosmetics for promoting angiogenesis are provided.
  • the composition for promoting angiogenesis of the present invention has an action of promoting angiogenesis. Therefore, it is useful for dryness, rough skin, wrinkles, and sagging.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of a gel filtration fraction of a tryptic digest of ⁇ -lactoglobulin ( ⁇ -LgT) on VEGF mRNA expression.
  • FIG. 3 shows the results of reverse phase chromatography of the gel filtration activity fraction of a tryptic digest of ⁇ -lactoglobulin. It is a graph which shows the influence on the VEGF mRNA expression by the sample A corresponding to the peptide of SEQ ID NO: 1 separated by reverse phase chromatography. It is a graph which shows the influence on the VEGF mRNA expression by sample B corresponding to the peptide of SEQ ID NO: 1 and sample C which is a degradation product thereof. It is a figure which shows the measurement result of the angiogenesis promotion activity of the sample B corresponding to the peptide of sequence number 1.
  • the inventors of the present invention have eagerly searched for a substance which is widely contained in food materials and has an action of promoting angiogenesis.
  • the present invention found that the peptide of SEQ ID NO: 1 and its degradation product in the amino acid sequence of ⁇ -lactoglobulin promote angiogenesis by promoting the expression of mRNA of VEGF which is an angiogenesis regulator. Has been completed.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 used in the present invention has angiogenesis promoting activity.
  • the peptides used in the present invention may be of any origin.
  • ⁇ -lactoglobulin derived from human and bovine can be used as a raw material for obtaining the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the gene sequence of ⁇ -lactoglobulin has already been elucidated. Therefore, it can be produced by gene recombination, and cells derived from cells recovered from the cell culture medium can also be used.
  • ⁇ -lactoglobulin can be processed from raw milk, milk powder, skim milk, reduced milk, etc. by heat treatment, salting treatment, ethanol treatment, various chromatographic treatments such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, and ultrafiltration treatment. It is also possible to obtain.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 can be obtained by treating ⁇ -lactoglobulin with a protease.
  • proteolytic enzymes include trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, or V8 protease. Moreover, you may use 1 or more types of these proteolytic enzymes.
  • the proteolytic enzyme degradation product of ⁇ -lactoglobulin itself containing the peptide of SEQ ID NO: 1 can also be used as the composition for promoting angiogenesis of the present invention.
  • the fraction containing the peptide of SEQ ID NO: 1 can be used as the composition for promoting angiogenesis of the present invention.
  • the fraction containing the peptide of SEQ ID NO: 1 in the proteolytic enzyme degradation product of ⁇ -lactoglobulin is, for example, a Superdex peptide HR10/30 gel filtration column (GE Healthcare Japan KK) and an AKTA chromatography system (GE Healthcare). Care Japan Co., Ltd.).
  • a degradation product of the peptide of SEQ ID NO: 1 having angiogenesis promoting activity can be obtained by treating the peptide of SEQ ID NO: 1 with a protease.
  • proteolytic enzymes include trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, or V8 protease.
  • the degradation product of the peptide of SEQ ID NO: 1 having angiogenic activity can be prepared, for example, by the following procedure.
  • protease A one or more selected from the group consisting of trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, cathepsin, thermolysin, and V8 protease may be used.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 may be chemically synthesized by a commercially available peptide synthesizer.
  • the degradation product of the peptide of SEQ ID NO: 1 having angiogenesis promoting activity can be a peptide fragment or partial peptide of the peptide of SEQ ID NO: 1 having angiogenesis promoting activity.
  • the degradation product of the peptide of SEQ ID NO: 1 having angiogenesis promoting activity is a polypeptide having one or several amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having angiogenesis promoting activity. You can
  • the composition for promoting angiogenesis of the present invention exerts an effect of promoting angiogenesis by, for example, oral administration or application.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 which is an active ingredient and/or its degradation product having angiogenesis promoting activity can be used as it is, but the conventional method is used. According to the above, it can be used by formulating into foods and drinks, powders, granules, tablets, capsules, drinks and the like.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or its degradation product having angiogenesis-promoting activity is relatively stable to heat. Therefore, it is also possible to heat sterilize the raw material containing the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or its degradation product having angiogenesis-promoting activity under the conditions that are usually performed.
  • composition for promoting angiogenesis of the present invention can be incorporated into an oral preparation.
  • oral agents such as powders, granules, tablets and capsules are prepared by a conventional method using excipients such as starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch and inorganic salts. Is possible.
  • excipients such as starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch and inorganic salts.
  • a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a colorant, a fragrance and the like may be appropriately used in this type of formulation.
  • binder examples include starch, dextrin, gum arabic, gelatin, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, crystalline cellulose, ethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include starch, hydroxypropyl starch, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, crosslinked sodium carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose and the like.
  • surfactant soybean lecithin, sucrose fatty acid ester, etc.
  • talc wax, sucrose fatty acid ester, hydrogenated vegetable oil, etc.
  • silicic acid as a fluidity promoter, dry aluminum hydroxide, Magnesium silicate etc. are mentioned.
  • the composition for promoting angiogenesis of the present invention can be incorporated into cosmetics for application on the skin surface.
  • the composition for promoting angiogenesis of the present invention is applied, it is prepared into various dosage forms such as a liquid agent, a solid agent, a semi-solid agent, etc. by blending it with a commonly used known component depending on the purpose of use. It is possible.
  • Preferred forms of the composition include ointments, gels, creams, sprays, patches, lotions and powders.
  • the composition for promoting angiogenesis of the present invention comprises a hydrocarbon such as petrolatum; a higher fatty acid lower alkyl ester such as stearyl alcohol and isopropyl myristate; an animal oil and fat such as lanolin; a polyhydric alcohol such as glycerin; a glycerin fatty acid ester; A surfactant such as monostearic acid or polyethylene glycol; a preservative such as methyl paraoxybenzoate or butyl paraoxybenzoate; an inorganic salt; a wax; a cosmetic or a pharmaceutical agent for promoting angiogenesis by mixing with a resin or the like be able to.
  • a hydrocarbon such as petrolatum
  • a higher fatty acid lower alkyl ester such as stearyl alcohol and isopropyl myristate
  • an animal oil and fat such as lanolin
  • a polyhydric alcohol such as glycerin
  • a glycerin fatty acid ester
  • the effective dose by oral administration of the composition for promoting angiogenesis of the present invention is, for example, 10 ⁇ g or more per adult per day. It is preferable to mix it in food or drink so as to ensure this required amount, or to administer it as a medicine. The administration can be divided into several times a day if necessary.
  • the effective amount of the composition for promoting angiogenesis of the present invention applied varies depending on the dosage form, but is preferably 0.001 to 2% by weight, more preferably 0.005 to 2% by weight based on the total amount of the composition to be applied.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 is used in an amount of 0.01% by weight, more preferably 0.01 to 1.5% by weight, further preferably 0.03 to 1% by weight, further preferably 0.03 to 0.8% by weight. It should be mixed. However, a compound such as a bath agent that is diluted at the time of use can be further added.
  • angiogenesis means forming a new blood vessel from an existing blood vessel.
  • promoting angiogenesis can include increasing the activity of forming a new blood vessel from an existing blood vessel in vitro or in vivo.
  • Promoter angiogenesis can include promoting the activity of expression and/or function of VEGF, which is a pro-angiogenic factor, and forming a capillary-like structure.
  • the VEGF expression-enhancing activity can be evaluated using the real-time PCR method, for example, in the following procedure. HUVEC cells are seeded on a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells/ml and cultured in Humedia-EG2 medium at 37° C. in a 5% CO 2 environment for 1 week.
  • the sample to be evaluated is dissolved in Humedia-EG2 medium (KURABO) and added to HUVEC cells.
  • Humedia-EG2 medium Humedia-EG2 medium
  • ISOGEN Natural Gene
  • the cell solution solubilized by pipetting is collected in a 1.5 ml tube.
  • 0.1 ml of chloroform is added to the collected cell liquid, and after sufficiently stirring, the upper layer (aqueous layer) separated into two layers is collected in a new 1.5 ml tube.
  • 0.25 ml of 2-propyl alcohol is added to the recovered liquid, and the mixture is left standing for 10 minutes. Then, it is centrifuged at 15,000 rpm and 4° C.
  • RNA solution is synthesized from 1 ⁇ g of RNA using the trade name “Takara PrimeScript TM RT reagent kit”.
  • Real-time PCR using SYBR Green (Takara SYBR Prime Ex Taq II) is performed using the obtained cDNA as a template.
  • the reaction conditions include initial denaturation at 95° C. for 30 seconds, denaturation at 95° C. for 5 seconds, annealing at 57° C. for 15 seconds, extension at 72° C. for 20 seconds, and a total of 40 cycles of reaction.
  • the primer the VEGF gene expression confirmation primer described in Table 1 is used.
  • the “skin care agent” means a drug or cosmetic that can maintain and/or improve the health condition of the skin by directly or indirectly applying to the skin surface using gauze or the like.
  • the skin care agent of the present invention is preferably liquid or gel, but for example, a solid one containing the composition for promoting angiogenesis of the present invention, such as a gauze, a mask, and a pack is also a skin care agent. included.
  • the skin care agent of the present invention preferably improves one or more of dryness, rough skin, wrinkles, and sagging of the target.
  • the skin care agent of the present invention is preferably a face wash, a cream, an emulsion, a beauty essence, or a lotion, more preferably a cream or a lotion.
  • the skin care agent of the present invention can be applied to the skin of the subject twice a day for 10 days or more.
  • the subject of administration of the skin care agent and the cosmetic for promoting angiogenesis of the present invention is not particularly limited, but it is intended for subjects having one or more symptoms selected from the group consisting of dry feeling, rough skin, wrinkles, and sagging. It is preferable to administer.
  • Another aspect of the present invention is to prepare a composition for promoting angiogenesis, which comprises the peptide of SEQ ID NO: 1 and/or its degradation product having angiogenic activity as an active ingredient, and the composition for promoting angiogenesis. It may be a cosmetic method for applying to the skin, preferably one or more improving methods selected from the group consisting of dry feeling, rough skin, wrinkles, and sagging of the target.
  • the skin care agent, angiogenesis-promoting supplement, angiogenesis-promoting food or drink, or angiogenesis-promoting cosmetic composition of the present invention can be filled in any container or can be packaged in any packaging material.
  • the angiogenesis-promoting effect of the peptide of SEQ ID NO: 1 and its degradation product can be evaluated by examining the effect of the addition of the peptide or its degradation product on mRNA expression of VEGF, which is an angiogenesis-promoting factor.
  • VEGF which is an angiogenesis-promoting factor
  • the effect of VEGF, which is an angiogenesis-promoting factor, on mRNA expression can be confirmed by a cell experiment using HUVEC which is a normal human umbilical vein vascular endothelial cell and a real-time PCR method.
  • Example 1 (Preparation of tryptic digest) A tryptic digest of ⁇ -lactoglobulin was prepared. ⁇ -lactoglobulin was dissolved in Mili-Q water to 30 mg/ml, and trypsin (Sigma-Aldrich Japan) was added to 0.1 mg/ml. After adjusting the pH to 8.0 with 1N NaOH, the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour. Then, the pH was adjusted to 8.0 again with 1N NaOH, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour. After further adjusting the pH to 8.0 with 1N NaOH, the mixture was reacted at 37° C.
  • this active fraction 1 ( ⁇ -LgTGF frac.1) was subjected to reverse phase chromatography using Proteonavi (OSAKASODA 4.6 ⁇ 250 mm) to obtain a peak as shown in FIG.
  • the peak corresponding to the peptide of No. 1 was collected and used as sample A.
  • the thus obtained peptide having an angiogenesis promoting action can be directly used as the angiogenesis promoting composition of the present invention.
  • RNA was synthesized from 1 ⁇ g of RNA using the trade name “Takara PrimeScript TM RT reagent kit”.
  • Real-time PCR using SYBR Green was performed using the obtained cDNA as a template.
  • the reaction conditions were 95° C. for 30 seconds for initial denaturation, 95° C. for 5 seconds for denaturation, 57° C. for 15 seconds for annealing, 72° C. for 20 seconds for extension, and a total of 40 cycles of reaction were performed.
  • Test Example 2 The effect of the peptide of SEQ ID NO: 1 (Sample B), which is a synthetic peptide purchased from GenScript, and the degradation product, Sample C, on mRNA expression of angiogenesis promoting factor was examined using a real-time PCR method. The method was based on the method described in Test Example 1.
  • sample C sample B was dissolved in Mili-Q water so as to have a concentration of 10 mg/ml, and protease A (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was added so as to have a concentration of 0.1 mg/ml on the basis of the sample B solution, and the mixture was mixed at 37° C. After reacting for a time and deactivating the enzyme at 95° C.
  • Example 3 (Measurement of peptide angiogenic activity)
  • the angiogenesis-promoting activity of the synthetic peptide (Sample B) was measured using the Angiogenesis Assay Kit (PromoKine).
  • RGF BME PathClear (Cultrex) was placed in advance at 4° C. from the previous day, and the solution was thawed.
  • the Staining Dye Solution attached to the Angiogenesis Assay Kit (PromKine) was thawed at 4° C.
  • the Wash Buffer attached to the Angiogenesis Assay Kit was thawed at 37° C. Kept warm.
  • the thawed RGF BME PathClear was ice-cooled, and 100 ⁇ l/well was poured into a 96-well plate that was also cooled on ice, taking care not to let the temperature rise above 4°C. Then, the gel was solidified by incubating at 37° C. for 1 hour. On a solidified gel, 50 ⁇ g/ml ascorbic acid, 1 ⁇ g/ml hydrocortisone, 0.75 U/ml heparin, 10 mM L-glutamine, 5 ng/ml hEGF, 5 ng/ml hFGF-b were added to HuMedia EG2 medium (KURABO).
  • FIG. 5 what appears to be granular is the stained HUVEC cells. If formation of a capillary-like structure can be confirmed between HUVEC cells, it can be evaluated that the added component has angiogenic activity. As shown in FIG. 5, more initial capillary-like structure formation was observed when Sample B was added to HUVEC cells than in the control where Sample B was not added. Therefore, the synthetic peptide (Sample B) was found to have angiogenic activity.
  • Example 2 Beverages for promoting angiogenesis having the formulations shown in Table 2 were produced by a conventional method. The produced beverage had a good flavor and there was no problem such as precipitation.
  • Example 3 A dough having the composition shown in Table 3 was prepared by a conventional method, molded, and then baked to produce a biscuit for promoting angiogenesis.
  • Example 4 The angiogenesis promoter having the composition shown in Table 4 was produced by a conventional method.
  • Example 5 A lotion having the composition shown in Table 5 was produced by a conventional method.
  • Example 6 Creams having the formulations shown in Table 6 were produced by a conventional method.
  • Test Example 4 A practical use test was conducted using the lotion obtained in Example 5 and the cream obtained in Example 6.
  • the same formulation as in Examples 5 and 6 was used except that the peptide having the amino acid sequence LSFNPTQLEEQCHI (SEQ ID NO: 1) and its degradation product were removed. Twenty adult women with slackness and wrinkles on the face and a feeling of dryness were randomly assigned to two groups (groups A and B) and 20 women with rough skin on their hands.
  • the lotion of the present invention markedly improved the feeling of dryness as compared with the lotion of the comparative product, and the effects of improving rough skin, wrinkles and sagging were also confirmed. Therefore, it was demonstrated that the lotion of the product of the present invention is excellent in the effect of promoting angiogenesis. Further, the cream of the present invention also showed a remarkable improvement in dry feeling as compared with the cream of the comparative product, and it was clarified that it has an effect of suppressing natural deterioration such as rough skin.
  • angiogenesis promoters it is possible to provide angiogenesis promoters, angiogenesis promotion supplements, foods and drinks, and angiogenesis promotion cosmetics that are useful for preventing skin roughness, wrinkles, elasticity reduction, and the like. ..

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Abstract

安全性の点で問題のない血管新生促進用組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合した血管新生促進用サプリメント、飲食品及び血管新生促進用化粧料を提供することを課題とする。　配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび／又は血管新生促進活性を有するその分解物を有効成分とする血管新生促進用組成物、又は前記血管新生促進用組成物を含む、スキンケア剤、血管新生促進用サプリメント、飲食品、もしくは血管新生促進用化粧料により前記課題を解決することができる。

Description

血管新生促進用組成物
　本発明は、血管機能老化等を防止するのに有用な血管新生促進用組成物、スキンケア剤、血管新生促進用飲食品、血管新生促進用サプリメント、及び血管新生促進用化粧料に関する。
　様々な臓器が健全に維持される上で、血管新生(再生)が重要である。血管新生は、既存の血管から新たな血管を形成させることであり、その過程は、ペリサイト(壁細胞)がＡｎｇ－２(アンジオポエチン－２)により血管壁からの離脱が調節されることにより開始される。その後、血管新生促進因子であるＶＥＧＦ(ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ)が中心的因子として機能して、血管新生は制御され、最終的にはＡｎｇ－１により安定化、成熟化される。
　ＶＥＧＦは、血管内皮細胞の増殖誘導と生存維持、血管透過性の亢進、血圧の調整、血小板による遊走、マクロファージに対する走化性等の機能を有している。血管内皮細胞におけるＶＥＧＦの発現を亢進する物質は、血管新生促進用組成物として皮膚老化の予防又は改善、育毛、心筋機能改善、骨・軟骨機能改善、脳機能改善等の作用が期待できる。
　ＶＥＧＦの発現を亢進する物質としては、大豆由来調整物や植物などからの抽出物(特許文献１)、ペプチド(特許文献２)が見出されている。また、血管新生を促進する牛乳中に含まれる成分としては、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ－２やＬａｃｔａｄｈｅｒｉｎが報告されている(非特許文献１)。しかしながら、ペプチドとしての報告は無い。
特許第５７３２２０７号 特許第５３３７８６８号
Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，第６巻,　３７１頁, ２０１４年
　本発明は、これまでにない血管新生促進用組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合したスキンケア剤、血管新生促進用飲食品、血管新生促進用サプリメント、及び血管新生促進用化粧料を提供することを課題とする。
　本発明者らは、これらの課題を解決するために、広く食品素材に含まれている血管新生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めた。そして、β-ラクトグロブリンのアミノ酸配列のうち、ＬＳＦＮＰＴＱＬＥＥＱＣＨＩ(配列番号１)からなるペプチドおよびその分解物が、血管新生を促進させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
＜１＞配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または血管新生促進活性を有するその分解物を有効成分とする血管新生促進用組成物。
＜２＞前記分解物が、配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする＜１＞記載の血管新生促進用組成物。
＜３＞前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、及びＶ８プロテアーゼから成る群から選択される１種以上であることを特徴とする＜２＞記載の血管新生促進用組成物。
＜４＞＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の血管新生促進用組成物を含む、血管新生促進用サプリメント、血管新生促進用飲食品、又は血管新生促進用化粧料。
＜５＞皮膚表面に塗布するためのスキンケア剤である、＜４＞に記載の血管新生促進用化粧料。
＜６＞前記スキンケアが、肌荒れの予防及び／又は改善であることを特徴とする＜５＞記載のスキンケア剤。
＜７＞＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の血管新生促進用組成物を、スキンケア剤全量基準で０．０３～１重量％含む、＜５＞又は＜６＞に記載のスキンケア剤。
＜８＞洗顔料、クリーム、乳液、美容液、又は化粧水である、＜５＞～＜７＞のいずれかに記載のスキンケア剤。
　本発明により、配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、配列番号１のペプチドと称することがある）および／または血管新生促進活性を有するその分解物を有効成分とする血管新生促進用組成物、血管新生促進用飲食品、血管新生促進用サプリメント、及び血管新生促進用化粧料が提供される。本発明の血管新生促進用組成物等は、血管新生を促進させる作用を有する。したがって、乾燥、肌荒れや皮膚のしわ、たるみに有用である。
β-ラクトグロブリンのトリプシン消化物(β－ＬｇＴ)のゲルろ過画分によるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。 β－ラクトグロブリンのトリプシン消化物のゲルろ過活性画分の逆相クロマトグラフィーの結果を示す図である。 逆相クロマトグラフィーにより分離した、配列番号１のペプチドに該当する試料ＡによるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。 配列番号１のペプチドに該当する試料Ｂ及びその分解物である試料ＣによるＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現への影響を示すグラフである。 配列番号１のペプチドに該当する試料Ｂの血管新生促進活性の測定結果を示す図である。
　本発明者らは、上述の課題を解決するために、広く食品素材に含まれている血管新生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めた。そして、β-ラクトグロブリンのアミノ酸配列のうち、配列番号１のペプチドおよびその分解物が、血管新生制御因子であるＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現を促進することにより血管新生を促進させることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明において使用される配列番号１のペプチドは、血管新生促進活性を有する。本発明において使用される前記ペプチドはどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、配列番号１のペプチドを得るための原料として、ヒト及びウシ由来のβ-ラクトグロブリンを用いることができる。
　β-ラクトグロブリンはすでにその遺伝子配列が明らかになっている。したがって、遺伝子組換えによる生産が可能であり、細胞培養の培養液から回収した細胞由来のものも使用可能である。また、β-ラクトグロブリンは、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等によって取得することも可能である。
　配列番号１のペプチドは、β-ラクトグロブリンをタンパク質分解酵素で処理して得ることができる。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、又はＶ８プロテアーゼをあげることが出来る。また、これらのタンパク質分解酵素を１種以上使用してもよい。配列番号１のペプチドを含有する、β-ラクトグロブリンのタンパク質分解酵素分解物それ自体を本発明の血管新生促進用組成物として使用することもできる。あるいは、β-ラクトグロブリンのタンパク質分解酵素分解物において、配列番号１のペプチドを含有する画分を本発明の血管新生促進用組成物として使用することもできる。β-ラクトグロブリンのタンパク質分解酵素分解物における、配列番号１のペプチドを含有する画分は、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０ゲルろ過カラム(ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社)およびＡＫＴＡ クロマトグラフィシステム(ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いて分離することができる。
　また、配列番号１のペプチドの血管新生促進活性を有する分解物は、配列番号１のペプチドをタンパク質分解酵素で処理して得ることができる。タンパク質分解酵素としては、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、又はＶ８プロテアーゼをあげることが出来る。また、これらタンパク質分解酵素を１種以上使用してもよい。
　配列番号１のペプチドの血管新生促進活性を有する分解物は、例えば、以下の手順で調製することができる。
・配列番号１のペプチドを１０ｍｇ/ｍｌになるようにＭｉｌｉ－Ｑ水に溶解し、ペプチド溶液を調製する。
・プロテアーゼＡ(アマノ製薬社)を前記ペプチド溶液基準で０．１ｍｇ/ｍｌになるよう添加し、３７℃で６時間反応させる。
・反応後、９５℃、５分間で酵素の失活処理を行い、反応物を凍結乾燥する。
　なお、前記プロテアーゼＡの代わりに、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、及びＶ８プロテアーゼから成る群から選択される１種以上を用いてもよい。
　さらに、配列番号１のペプチドは、市販のペプチド合成装置により化学合成してもよい。
　配列番号１のペプチドの血管新生促進活性を有する分解物は、配列番号１のペプチドの、血管新生促進活性を有するペプチド断片又は部分ペプチドであることができる。配列番号１のペプチドの血管新生促進活性を有する分解物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失し、かつ、血管新生促進活性を有するポリペプチドであることができる。
　本発明の血管新生促進用組成物は、例えば、経口投与あるいは塗布することにより、血管新生促進効果を発揮する。本発明の血管新生促進用組成物を経口投与するに際しては、有効成分である配列番号１のペプチドおよび／または血管新生促進活性を有するその分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、飲食品や粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。なお、配列番号１のペプチドおよび／または血管新生促進活性を有するその分解物は、比較的熱に対して安定である。したがって、配列番号１のペプチドおよび／または血管新生促進活性を有するその分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
　本発明の血管新生促進用組成物は、経口剤に配合することができる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用してもよい。
　結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。また、界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
　本発明の血管新生促進用組成物は、皮膚表面に塗布するために化粧料に配合することができる。本発明の血管新生促進用組成物を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能である。好ましい組成物の形態としては、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の血管新生促進用組成物をワセリン等の炭化水素；ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル；ラノリン等の動物性油脂；グリセリン等の多価アルコール；グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料；無機塩；ロウ；樹脂等に混合することによって、血管新生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
　本発明の血管新生促進用組成物の経口投与による有効量は、例えば、成人一人当たり一日１０μｇ以上である。この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与することが好ましい。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。
　本発明の血管新生促進用組成物の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１～２重量％、より好ましくは０．００５～２重量％、さらに好ましくは０．０１～１．５重量％、さらに好ましくは０．０３～１重量％、さらに好ましくは０．０３～０．８重量％となるように、配列番号１のペプチドを配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
　本明細書において「血管新生」とは、既存の血管から新たな血管を形成させることを意味する。本明細書において「血管新生促進」は、インビトロ又はインビボにおいて既存の血管から新たな血管を形成させる活性を増大させることを含むことができる。「血管新生促進」は、血管新生促進因子であるＶＥＧＦの発現及び／又は機能の活性促進、及び毛細管様構造形成を含むことができる。ＶＥＧＦの発現亢進活性は、例えば以下のような手順でリアルタイムＰＣＲ法を用いて評価することができる。
　ＨＵＶＥＣ細胞を２４穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍｌになる様に播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＥＧ２培地にて３７℃、５％　ＣＯ２環境下にて１週間培養する。１週間の培養期間の最終の８時間について、評価対象試料をＨｕｍｅｄｉａ－ＥＧ２培地(ＫＵＲＡＢＯ社)に溶解し、ＨＵＶＥＣ細胞に添加する。ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン)を、０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容チューブに回収する。回収した細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層(水層)を新たな１．５ｍｌ容チューブに回収する。回収液に０．２５ｍｌの２－プロピルアルコールを添加し、１０分間静置する。その後、１５,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得る。得られた沈殿物を、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とする。１μg分のＲＮＡから商品名「Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ」を用いてｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ(Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｅ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ)を使用したリアルタイムＰＣＲを行う。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張で行い、合計４０サイクル反応させる。プライマーは表１に記載のＶＥＧＦ遺伝子発現確認用プライマーを使用する。
　本明細書において「スキンケア剤」とは、皮膚表面に直接的に又はガーゼ等を用いて間接的に塗布することによって、皮膚の健康状態を保持及び／又は改善できる薬剤又は化粧料を意味する。本発明のスキンケア剤は、液状又はゲル状であることが好ましいが、例えば、本発明の血管新生促進用組成物を含有させた固体状のもの、例えばガーゼ、マスク、及びパック等もスキンケア剤に含まれる。本発明のスキンケア剤は、好ましくは対象の乾燥感、肌荒れ、シワ、及びたるみのうちの一種以上を改善するものである。本発明のスキンケア剤は、好ましくは洗顔料、クリーム、乳液、美容液、又は化粧水であり、より好ましくはクリーム又は化粧水である。本発明のスキンケア剤は、１日二回、１０日間以上、対象の皮膚に塗布するためのものであることができる。
　本発明のスキンケア剤及び血管新生促進用化粧料の投与対象は特に限定されることはないが、乾燥感、肌荒れ、シワ、及びたるみからなる群から選択される１種以上の症状を有する対象に投与することが好ましい。本発明の別の観点として、配列番号１のペプチドおよび／又は血管新生促進活性を有するその分解物を有効成分とする血管新生促進用組成物を調製すること、及び該血管新生促進用組成物を皮膚に塗布する対象の美容方法、好ましくは対象の乾燥感、肌荒れ、シワ、及びたるみからなる群から選択される一種以上の改善方法であることができる。
　本発明のスキンケア剤、血管新生促進用サプリメント、血管新生促進用飲食品、又は血管新生促進用化粧料は、任意の容器に充填することができ、又は任意の包装材料で包装することができる。
（評価方法）
　配列番号１のペプチド及びその分解物の血管新生促進効果は、前記ペプチド又はその分解物の添加が血管新生促進因子であるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響を調べることで評価することができる。血管新生促進因子であるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響は、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣを用いた細胞実験及びリアルタイムＰＣＲ法を用いて確認することができる。
（実施例１）
　(トリプシン消化物の調製)
　β-ラクトグロブリンのトリプシン消化物を調製した。
　β-ラクトグロブリンを３０ｍｇ/ｍｌになるようにＭｉｌｉ－Ｑ水に溶解し、トリプシン(シグマアルドリッチジャパン社)を０．１ｍｇ/ｍｌになるよう添加した。１Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ８．０に調整した後、３７℃で１時間反応させた。その後、再度、１Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ８．０に調整し、３７℃で１時間反応させた。さらに１Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ８.０に調整した後、３７℃で一晩反応させ、反応物を凍結乾燥しトリプシン消化物を得た。
　このトリプシン消化物をＭｉｌｉ－Ｑ水で溶解した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０ゲルろ過カラム(ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社)およびＡＫＴＡ クロマトグラフィシステム(ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いて分画を行った。その後、試験例１に示す手順により各画分のＶＥＧＦ発現亢進活性を調査した結果、画分１（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１）が、ＶＥＧＦ発現亢進活性を有することが分かった(図１)。さらにこの活性画分１（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１）をＰｒｏｔｅｏｎａｖｉ(ＯＳＡＫＡＳＯＤＡ社４．６φｘ　２５０ｍｍ)を用いた逆相クロマトグラフィーに供し、図２に示すようなピークを得て、試験例１により配列番号１のペプチドに相当するピークを回収し、試料Ａとした。
　このようにして得られた血管新生促進作用を持つペプチドは、そのまま本発明の血管新生促進用組成物として利用可能である。
（試験例１）
(ペプチドのＶＥＧＦ発現亢進活性測定)
　実施例１で得られたトリプシン消化物の分画物である画分１～５（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１～５）及び画分１に含まれるペプチド(試料Ａ)について、リアルタイムＰＣＲ法を用いてＶＥＧＦ発現亢進活性を測定した。
　ＨＵＶＥＣ細胞を２４穴プレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍｌになる様に播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＥＧ２培地にて３７℃、５％　ＣＯ２環境下にて１週間培養した。１週間の培養期間の最終の８時間について、トリプシン消化物の分画物（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１～５）又は試料ＡをそれぞれＨｕｍｅｄｉａ－ＥＧ２培地(ＫＵＲＡＢＯ社)に溶解し、細胞に添加した。その後さらに、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン)を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容チューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層(水層)を新たな１．５ｍｌ容チューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２－プロピルアルコールを添加し、１０分間静置した。その後、１５,０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得た。得られた沈殿物は、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とした。１μg分のＲＮＡから商品名「Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ　ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ」を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ(Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｉｍｅ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ)を使用したリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張であり、合計４０サイクル反応させた。プライマーは表１に記載のＶＥＧＦ遺伝子発現確認用プライマーを使用した。画分１～５（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１～５）の結果は、実施例１に記載の通り図１に示している。配列番号１のペプチド(試料Ａ)の結果を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１及び３に示すように、試料Ａを含む画分１（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１）又は試料ＡをＨＵＶＥＣ細胞に添加した時に、ＶＥＧＦ遺伝子の発現量は、試料Ａを含む画分１（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．１）及びペプチド(試料Ａ)のいずれも有意に亢進した。試料Ａを含まない画分２～５（β－ＬｇＴＧＦ　ｆｒａｃ．２－５）を添加したサンプルにおいては、トリプシン消化物の分画物を添加していないコントロールとの有意差は見られなかった。
（試験例２）
　ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社より購入した合成ペプチドである配列番号１のペプチド(試料Ｂ)、およびその分解物である試料Ｃによる血管新生促進因子のｍＲＮＡ発現への影響についてリアルタイムＰＣＲ方法を用いて検討した。方法は試験例１に記載の方法に準じた。試料Ｃは、試料Ｂを１０ｍｇ/ｍｌになるようにＭｉｌｉ－Ｑ水に溶解し、プロテアーゼＡ(アマノ製薬社)を試料Ｂ溶液基準で０．１ｍｇ/ｍｌになるよう添加し、３７℃で６時間反応させ、９５℃、５分間で酵素の失活処理をした後、反応物を凍結乾燥し調製した。試料Ｂ及びその分解物である試料Ｃを８時間、ＨＵＶＥＣ細胞に添加した後、ｔｏｔａｌＲＮＡを回収してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲを行った。結果を図４に示す。
　図４に示すように、試料Ｂである合成ペプチドおよびその分解物（試料Ｃ)の添加により、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現は、有意に亢進した。
（試験例３）
(ペプチドの血管新生活性測定)
　合成ペプチド(試料Ｂ)について、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社）を用いて血管新生促進活性を測定した。
　ＲＧＦ　ＢＭＥ　ＰａｔｈＣｌｅａｒ（Ｃｕｌｔｒｅｘ社）を予め前日から４℃下に置き、溶液を解凍した。また、試験日当日は、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＰｒｏｍＫｉｎｅ社）に添付されているＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｄｙｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを４℃下にて解凍しておき、さらにＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに添付されているＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒを３７℃にて解凍、保温した。解凍したＲＧＦ　ＢＭＥ　ＰａｔｈＣｌｅａｒを氷冷し、４℃以上にさせないよう注意しながら、同じく氷上にて冷却させた９６穴プレートに１００μｌ/ｗｅｌｌ注いだ。その後、３７℃にて1時間保温し、ゲルを固化させた。固化したゲル上に、ＨｕＭｅｄｉａ　ＥＧ２培地(ＫＵＲＡＢＯ社)に５０μｇ/ｍｌアスコルビン酸、１μｇ/ｍｌハイドロコーチゾン、０．７５Ｕ/ｍｌヘパリン、１０ｍＭ Ｌ－グルタミン、５ｎｇ/ｍｌ ｈＥＧＦ、５ｎｇ/ｍｌ ｈＦＧＦ－ｂおよび試料Ｂを添加したものに、ＨＵＶＥＣ細胞を０．５×１０５　ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるようにけん濁した細胞液を１００μｌ分注させた。その後、一定時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内にて培養した。その後、ゲル上にて培養した細胞の培養液を注意深く除き、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに添付されているＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｄｙｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、３７℃に保温したＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒに対して１０００倍希釈して細胞染色液を作製した。細胞染色液を細胞上に１００μｌ添加した。３７℃、３０分間保温し細胞を染色した後、４７２．５／５２０ｎｍの励起/蛍光波長条件下で、蛍光顕微鏡(ＫＥＹＥＮＣＥ社)にて細胞の血管新生を観察した。結果を図５に示す。
　図５において、粒状に見えるのは染色されたＨＵＶＥＣ細胞である。ＨＵＶＥＣ細胞間において毛細管様構造形成が確認できれば、添加した成分が血管新生活性を有すると評価することができる。
　図５に示すように、試料Ｂを添加していないコントロールよりも、試料ＢをＨＵＶＥＣ細胞に添加した時の方が、初期の毛細管様構造形成が多く観察された。したがって、合成ペプチド(試料Ｂ)に血管新生促進活性が認められた。
（実施例２）
　表２に示す配合の血管新生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で沈殿等の問題もなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）
　表３に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼して血管新生促進用ビスケットを製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例４）
　　表４に示す配合の血管新生促進剤を常法により製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例５）
　表５に示す配合の化粧水を常法により製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例６）
　表６に示す配合のクリームを常法により製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（試験例４）
　実施例５で得られた化粧水及び実施例６で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、アミノ酸配列ＬＳＦＮＰＴＱＬＥＥＱＣＨＩ(配列番号１)からなるペプチドおよびその分解物を除いた以外は実施例５及び６と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められ、なおかつ乾燥感を有する成人女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布し、乾燥感等の改善を評価した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善が顕著であり、肌荒れ、しわ、たるみの改善効果も確認された。したがって、本発明品の化粧水は、血管新生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善に顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。
　本発明によれば、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下等を防止するのに有用な血管新生促進剤、血管新生促進用サプリメント、飲食品及び血管新生促進用化粧料を提供することが可能である。

Claims (8)

  1. 　配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または血管新生促進活性を有するその分解物を有効成分とする血管新生促進用組成物。
  2. 　前記分解物が、配列番号１により表されるアミノ酸配列からなるペプチドをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項１記載の血管新生促進用組成物。
  3. 　前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、及びＶ８プロテアーゼから成る群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項２記載の血管新生促進用組成物。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載の血管新生促進用組成物を含む、血管新生促進用サプリメント、血管新生促進用飲食品、又は血管新生促進用化粧料。
  5. 　皮膚表面に塗布するためのスキンケア剤である、請求項４に記載の血管新生促進用化粧料。
  6. 　前記スキンケアが、肌荒れの予防及び／又は改善であることを特徴とする請求項５記載のスキンケア剤。
  7. 請求項１～３のいずれかに記載の血管新生促進用組成物を、スキンケア剤全量基準で０．０３～１重量％含む、請求項５又は６に記載のスキンケア剤。
  8. 洗顔料、クリーム、乳液、美容液、又は化粧水である、請求項５～７のいずれかに記載のスキンケア剤。
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