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WO2017183732A1 - 網膜組織の製造法 - Google Patents

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WO2017183732A1
WO2017183732A1 PCT/JP2017/016120 JP2017016120W WO2017183732A1 WO 2017183732 A1 WO2017183732 A1 WO 2017183732A1 JP 2017016120 W JP2017016120 W JP 2017016120W WO 2017183732 A1 WO2017183732 A1 WO 2017183732A1
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WO
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cells
medium
retinal
cell
signaling pathway
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/016120
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English (en)
French (fr)
Inventor
篤 桑原
優 山▲崎▼
政代 高橋
Yoshiki Sasai (笹井 芳樹)
Original Assignee
大日本住友製薬株式会社
国立研究開発法人理化学研究所
住友化学株式会社
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Publication date
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Priority to CA3021828A priority patent/CA3021828A1/en
Priority to US16/095,339 priority patent/US11371016B2/en
Priority to EP17786064.0A priority patent/EP3447129B1/en
Priority to JP2018513236A priority patent/JP6995314B2/ja
Priority to CN201780036967.7A priority patent/CN109312306B/zh
Priority to KR1020187033745A priority patent/KR102388863B1/ko
Priority to ES17786064T priority patent/ES2928213T3/es
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    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing retinal cells or retinal tissue from pluripotent stem cells.
  • Non-patent Document 2 and Patent Document 2 For example, a method of obtaining multi-layered retinal tissue from pluripotent stem cells (Non-patent Document 2 and Patent Document 2), forming uniform pluripotent stem cell aggregates in a serum-free medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor And then culturing in suspension in the presence of a basement membrane preparation, followed by suspension culture in serum medium to obtain a multilayer retinal tissue (Non-patent Document 3 and Patent Document 3), or pluripotency
  • Patent Document 5 and Non-Patent Document 10 for obtaining retinal tissue by suspension culture of stem cell aggregates in a medium containing a substance acting on a BMP signal transduction pathway.
  • Non-Patent Document 4 a method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to hypothalamic tissue
  • Non-Patent Documents 5 and 6 a method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to neural progenitor cells
  • primate pluripotent stem cells can be cultured while maintaining the undifferentiated state in the presence of feeder cells and under the conditions for adding undifferentiated maintenance factors. It was.
  • Non-patent Document 7 Non-patent Document 7
  • 8 and 9 There has been a strong demand for a method for stably producing neural cells or neural tissues such as the retina using pluripotent stem cells cultured in a feeder-free manner by this technique as a starting material.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing retinal cells or retinal tissue from pluripotent stem cells cultured in the absence of feeder cells while maintaining an undifferentiated state.
  • pluripotent stem cells can be transformed into TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors and / or sonic It is possible to form cell aggregates that maintain undifferentiation with high efficiency by culturing in a medium containing a hedgehog signaling pathway agonist and then floating culture in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor. I found. And when this high quality cell aggregate was used, it discovered that nerve tissue, such as a retinal tissue, and a nervous system cell could be induced
  • a method for producing retinal cells or retinal tissue comprising the following steps (1) to (3); (1) Pluripotent stem cells in the absence of feeder cells in a medium containing 1) a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or sonic hedgehog signaling pathway agonist, and 2) an undifferentiated maintenance factor
  • the first step of culturing (2) The cell obtained in the first step was suspended in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor and the cell was formed in the second step, and (3) the cell was obtained in the second step.
  • a third step of obtaining an aggregate containing retinal cells or retinal tissue by subjecting the aggregate to suspension culture in a medium containing a BMP signaling pathway agent in the presence or absence of a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • the medium used for suspension culture further contains a sonic hedgehog signal transduction pathway agent.
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell, and the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agent in the medium in the second step is equivalent to the sonic hedgehog signaling activity of SAG10nM to 700nM.
  • the aggregate is cultured in a medium in which the concentration of the sonic hedgehog signal transduction pathway agent in the medium is equal to or less than the concentration corresponding to the sonic hedgehog signal transduction effect of SAG700nM.
  • the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agonist in the medium in the third step is equal to or lower than the concentration corresponding to the sonic hedgehog signaling activity of SAG700nM The manufacturing method as described.
  • the third step includes the following steps: (I) The aggregate obtained in the second step is suspended and cultured in a medium containing a BMP signal transduction pathway agent in the presence or absence of a Wnt signal transduction pathway inhibitor, and a retinal cell or retinal tissue And a step of obtaining a cell aggregate in which the presence ratio of Chx10 positive cells is 20% or more and 100% or less; (Ii) A cell that expresses the RPE65 gene in the serum-free medium or serum medium containing a Wnt signal transduction pathway agent and / or an FGF signal transduction pathway inhibitor in the cell aggregate obtained in step (i) Culturing only during the period until it appears; (iii) A step of culturing the cell aggregate obtained in step (ii) in which no cell expressing the RPE65 gene has appeared in a serum-free medium or serum medium not containing a Wnt signal transduction pathway agent.
  • the aggregate obtained in the third step is a retinal progenitor cell, a neural retinal progenitor cell, a photoreceptor progenitor cell, a photoreceptor cell, a rod photoreceptor cell, a cone photoreceptor cell, a horizontal cell, an amacrine cell, an interneuron cell, Any one of [1] to [22], which is an aggregate containing one or more cells selected from the group consisting of ganglion cells, bipolar cells, retinal pigment epithelial cells, and ciliary marginal cells. Manufacturing method. [24] The production method according to any one of [1] to [23], wherein the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • a test substance is brought into contact with a retinal cell or retinal tissue produced by the method according to any one of [1] to [27], and the effect of the substance on the cell or the tissue is assayed.
  • a method for evaluating toxicity and drug efficacy of the substance [30] A therapeutic agent for a disease based on a disorder of a retinal system cell or retinal tissue, comprising the retinal system cell or retinal tissue produced by the method according to any one of [1] to [27].
  • the therapeutic agent according to [30] wherein the retinal system cell or retinal tissue is a retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell, or retinal tissue.
  • a retinal system cell or retina comprising transplanting an effective amount of a retinal system cell or retinal tissue produced by the method according to any one of [1] to [27] into a subject in need of transplantation
  • a method for treating diseases based on tissue disorders A retinal cell or retinal tissue produced by the method according to any one of [1] to [27] for use in the treatment of a disease based on a disorder of retinal system cells or retinal tissue.
  • a pharmaceutical composition comprising a retinal cell or retinal tissue produced by the method according to any one of [1] to [27] as an active ingredient.
  • high-quality cell aggregates and retinal cells or retinal tissue can be efficiently produced from pluripotent stem cells cultured in the absence of feeder cells.
  • the results of comparing the expression of Rx (A-D in the figure) and Chx10 (E-H in the figure) in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining are shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown. Counterstained with DAPI.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown. Counterstained with DAPI.
  • Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells (A, B in the figure: TFH-R1-10-2 strain, C, D in the figure: TFH-R2-10-F8 strain) under various culture conditions The results of comparing the expression of A, C) and Rx (B, D in the figure) by immunohistochemical staining are shown.
  • the result of bright-field observation of photoreceptor-containing retinal tissue derived from human iPS cells is shown (A in the figure).
  • the results of observing the expression of Rx, Chx10 and Crx in the photoreceptor cell-containing retinal tissue by immunohistochemical staining (B-E in the figure) are shown.
  • Counterstained with DAPI (E in the figure).
  • Chx10 A, D, G in the figure
  • Rx B, E, H in the figure
  • Pax6 C, F, I in the figure
  • Chx10 (A, D, G in the figure), Rx (B, E, H in the figure), and Pax6 (C, F, I in the figure) in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions
  • the result of having compared expression by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of bright-field observation of photoreceptor-containing retinal tissue derived from human iPS cells is shown (A in the figure).
  • the results of observing the expression of Crx, Chx10, Rx, Recoverin, NRL, RXRG, N-cadherin and Aqp1 in the photoreceptor cell-containing retinal tissue by immunohistochemical staining (BE in the figure) are shown. Counterstained with DAPI (BE in the figure).
  • the result of bright-field observation of photoreceptor-containing retinal tissue derived from human iPS cells is shown (A in the figure).
  • the results of observing the expression of Crx, Chx10, Rx, Recoverin, NRL, RXRG, N-cadherin and Aqp1 in the photoreceptor cell-containing retinal tissue by immunohistochemical staining (BE in the figure) are shown.
  • Counterstained with DAPI (BE in the figure).
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 in cell aggregates formed from human iPS cells under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of having compared the expression of Chx10 and Rx in the cell aggregate formed from the human iPS cell under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of having compared the expression of Chx10, Rx, Crx, and Brn3b in the cell aggregate formed from the human iPS cell under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of having compared the expression of Chx10 and Rx in the cell aggregate formed from the human iPS cell under various culture conditions by immunohistochemical staining is shown.
  • the result of comparing the expression of Chx10 and Rx in cell aggregates formed from human iPS cells by immunohistochemical staining is shown.
  • stem cell means an undifferentiated cell having differentiation ability and proliferation ability (particularly self-renewal ability) while maintaining differentiation ability.
  • the stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, unipotent stem cells, etc., depending on the differentiation ability.
  • a pluripotent stem cell can be cultured in vitro, and has the ability to differentiate into all cell lineages belonging to the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm) and / or extraembryonic tissues (differentiated pluripotency)
  • a stem cell having pluripotency A stem cell having pluripotency.
  • Multipotent stem cells mean stem cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a stem cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, reproductive stem cells, stem cells in tissues, somatic cells, and the like.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells: Embryonic cells), EG cells (Embryonic cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced cells).
  • Muse cells multi-lineage ⁇ differentiating stress enduring cells obtained from mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cell; MSC) and GS cells prepared from germ cells (eg, testis) are also included in the pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells were established for the first time in 1981, and have been applied to the production of knockout mice since 1989.
  • ES cells In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing LIF. Methods for producing ES cells are described in, for example, WO96 / 22362, WO02 / 101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like.
  • Embryonic stem cells can be obtained from a predetermined institution or a commercial product can be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • the Rx GFP strain (derived from KhES-1) which is a human embryonic stem cell is available from RIKEN.
  • EB5 cells, both mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
  • ntES cells Nuclear transfer ES cells
  • ntES cells which is one of ES cells, can be established from cloned embryos made by transplanting somatic cell nuclei into eggs from which nuclei have been removed.
  • EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF and bFGF (Cell, 70: 841-847, 1992).
  • the “artificial pluripotent stem cell” in the present invention is a cell in which pluripotency is induced by reprogramming somatic cells by a known method or the like.
  • differentiated somatic cells such as fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells are Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28.
  • Preferred reprogramming factor combinations include (1) Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc (c-Myc or L-Myc), (2) Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Lin28 and L-Myc (Stem Cells, 2013; 31: 458-466).
  • Induced pluripotent stem cells were established in 2006 by mouse cells by Yamanaka et al. (Cell, 2006, 126 (4), pp.663-676).
  • Artificial pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007 and have pluripotency and self-renewal ability similar to embryonic stem cells (Cell, 2007, 131 (5), pp.861-872; Science , 2007, 318 (5858), pp.1917-1920; Nat.
  • induced pluripotent stem cells can also be induced from somatic cells by adding compounds (Science, 2013, 341, pp. 651- 654). It is also possible to obtain established artificial pluripotent stem cells, such as 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells established at Kyoto University Human artificial pluripotent cell lines such as 1231A3 cells are available from Kyoto University and iPS Academia Japan. As the established artificial pluripotent stem cells, for example, Ff-I01 cells, Ff-I14 cells and QHJI01s04 cells established at Kyoto University are available from Kyoto University.
  • tissue-derived fibroblasts tissue-derived fibroblasts, blood cells (eg, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and T cells), liver Examples include cells, pancreatic cells, intestinal epithelial cells, and smooth muscle cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • T cells liver-derived fibroblasts
  • liver-derived fibroblasts include cells, pancreatic cells, intestinal epithelial cells, and smooth muscle cells.
  • the means for expressing the gene is not particularly limited when it is initialized by the expression of several types of genes.
  • infection methods using viral vectors for example, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors that are cytoplasmic RNA vectors
  • viral vectors for example, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors that are cytoplasmic RNA vectors
  • plasmid vectors that are non-viral vectors Eg, plasmid vector, episomal vector
  • gene transfer method eg, calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, electroporation method
  • gene transfer method using RNA vector eg, calcium phosphate method, Lipofection method, electroporation method
  • direct protein injection method for example, a method using a needle, lipofection method, electroporation method
  • Artificial pluripotent stem cells can be produced in the presence of feeder cells or in the absence of feeder cells (feeder-free).
  • the induced pluripotent stem cell can be produced in the presence of an undifferentiated maintenance factor by a known method.
  • the medium used for producing induced pluripotent stem cells in the absence of feeder cells that is, a medium containing an undifferentiated maintenance factor (undifferentiated maintenance medium) is not particularly limited, but known embryonic stem cells and / or Alternatively, a culture medium known to those skilled in the art can be used as a maintenance medium for induced pluripotent stem cells and a medium for establishing feeder-free induced pluripotent stem cells.
  • Essential 8 manufactured by Life Technologies
  • Essential 8 medium is added to DMEM / F12 medium as an additive, L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg / l), sodium selenite (14 ⁇ g / 1), insulin (19.4mg / l), NaHCO3 ( 543 mg / l), transferrin (10.7 mg / l), bFGF (100 ng / mL), and TGF ⁇ family signaling pathway agonist (TGF ⁇ 1 (2 ng / mL) or Nodal (100 ng / mL)) (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)).
  • feeder-free media include, for example, Essential 6 medium (Life Technologies), Stabilized Essential 8 medium (Life Technologies), S-medium (DS Pharma Biomedical) , StemPro (manufactured by Life Technologies), hESF9 (Proc / Natl / Acad / Sci / U / S / A. / 2008 / Sep / 9; 105 (36): 13409-14), TeSR medium (manufactured by STEMCELL / Technologies), mTeSR1 (manufactured by STEMCELL / Technologies), mTeSR2 (manufactured by STEMCELL Technologies), TeSR-E8 (manufactured by STEMCELL Technologies) can be mentioned.
  • Essential 6 medium Life Technologies
  • Stabilized Essential 8 medium Life Technologies
  • S-medium DS Pharma Biomedical
  • StemPro manufactured by Life Technologies
  • hESF9 Proc / Natl / Acad / Sci / U / S / A. / 2008 / Sep
  • StemFit registered trademark
  • Pluripotent stem cells can be generated.
  • the pluripotent stem cell used in the present invention is preferably an ES cell or an induced pluripotent stem cell, more preferably an induced pluripotent stem cell.
  • multipotent stem cells include hematopoietic stem cells, neural stem cells, retinal stem cells, mesenchymal stem cells and other tissue stem cells (also called tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells).
  • a genetically modified pluripotent stem cell can be prepared, for example, by using a homologous recombination technique.
  • genes on the chromosome to be modified include cell marker genes, histocompatibility antigen genes, and disease-related genes based on nervous system cell disorders. Modifications of target genes on chromosomes include Manipulating Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); 8. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, methods described in Yodosha (1995) and the like can be used.
  • genomic DNA containing a target gene to be modified (for example, cell marker gene, histocompatibility antigen gene, disease-related gene, etc.) is isolated, and the target gene is identified using the isolated genomic DNA.
  • a targeting vector for homologous recombination is prepared. By introducing the prepared target vector into a stem cell and selecting a cell that has undergone homologous recombination between the target gene and the targeting vector, a stem cell in which the gene on the chromosome has been modified can be prepared.
  • Genomic DNA containing the target gene can be isolated by using a genomic DNA library screening system (Genome® Systems), Universal® Genome Walker® Kits (CLONTECH), or the like.
  • genomic DNA a polynucleotide encoding the target protein can also be used.
  • the polynucleotide can be obtained by amplifying the corresponding polynucleotide by PCR.
  • the target vector can be either a replacement type or an insertion type.
  • methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, or poly A selection can be used. Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell line include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
  • genetically modified pluripotent stem cells can be produced by genome editing.
  • Genome editing is a gene modification technique that performs gene-specific disruption, knock-in of a reporter gene, and the like using techniques such as the Zinc Finger system, CRISPR / Cas9 system, Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN), and the like.
  • an expression vector or mRNA of Cas9 DNA cleavage enzyme
  • an expression vector or guide RNA that expresses guide RNA under the control of a polymerase III promoter or the like are contained in a cell.
  • the guide RNA can be a fusion RNA of RNA ⁇ ⁇ (crRNA) complementary to the target genomic sequence and tracrRNA.
  • crRNA RNA ⁇ ⁇
  • a protospacer proximity motif PAM-sequence NGG
  • Cas9 dissociates the DNA double strand, recognizes the target sequence with the guide RNA, and cleaves both strands. Mutations are introduced in the process of repair.
  • Transcription activator-like effector nuclease is a system using TAL effector produced by the plant pathogen Xanthomonasspp.
  • TALEN® is generally an artificial nuclease fused with the DNA binding domain of TAL® effector and the DNA cleavage domain of FokI nuclease.
  • the DNA binding domain consists of 34 amino acid repeats, and one repeat recognizes one base of the target DNA.
  • the 12th and 13th amino acids in the repetitive sequence are called repeat variable di-residues (RVD), and the target base is determined by this sequence.
  • RVD repeat variable di-residues
  • the FokI domain dimerizes on the target sequence and exhibits nuclease activity.
  • the cleaved DNA duplex is repaired by a cellular mechanism, and a mutation is introduced in the process.
  • a TALEN expression vector or mRNA is introduced into the cell.
  • the “mammal” in the present invention includes rodents, ungulates, felines, primates and the like. Rodents include mice, rats, hamsters, guinea pigs and the like. Hoofed animals include pigs, cows, goats, horses, sheep and the like. Cat eyes include dogs, cats and the like.
  • the “primate” in the present invention refers to a mammal animal belonging to the primate, and examples of the primate include apes of primates such as lemurs, loris, and tsubai, and apes of primates such as monkeys, apes and humans.
  • the pluripotent stem cell used in the present invention is a mammalian pluripotent stem cell, preferably a rodent (eg, mouse, rat) or primate (eg, human, monkey) pluripotent stem cell, More preferred are human pluripotent stem cells, still more preferred are human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human embryonic stem cells (ES cells).
  • rodent eg, mouse, rat
  • primate eg, human, monkey
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • ES cells human embryonic stem cells
  • the “floating culture” or “floating culture method” refers to a method of culturing while maintaining a state in which cells or cell aggregates are suspended in a medium, and a method of performing the culturing.
  • suspension culture is performed under conditions that do not allow cells or cell aggregates to adhere to culture equipment, etc.
  • culture adheres
  • the term “cell adheres” means that a strong cell-substratum junction is formed between the cell or the cell aggregate and the culture equipment.
  • suspension culture refers to culture under conditions that do not allow a strong cell-substrate bond to be formed between cells or cell aggregates and culture equipment
  • adhesion culture refers to cells or cells. Culturing under the condition that a strong cell-substrate bond is formed between the aggregate and the culture equipment.
  • the cells adhere to each other.
  • cell-matrix bonds are hardly formed between the culture equipment and the like, or even if formed, the contribution is small.
  • the intrinsic cell-substrate bond is present inside the aggregate, but the cell-substrate bond is hardly formed between the culture apparatus and the like. Even if it is formed, its contribution is small.
  • plane attachment means that the cells adhere to each other on the surface. More specifically, the cell-cell adhesion means that the proportion of the surface area of one cell that adheres to the surface of another cell is, for example, 1% or more, preferably 3% or more, more preferably 5%. That's it.
  • the surface of the cell can be observed by staining with a reagent that stains the membrane (eg, DiI) or immunostaining of a cell adhesion factor (eg, E-cadherin or N-cadherin).
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can perform “suspension culture”, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Examples of such an incubator include a flask, a tissue culture flask, a culture dish (dish), a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a micropore, a multiplate, and a multiwell plate.
  • These incubators are preferably non-cell-adhesive in order to enable suspension culture.
  • the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving cell adhesion (for example, extracellular matrix such as basement membrane preparation, laminin, entactin, collagen, gelatin, etc.) Etc., or those that have not been subjected to coating treatment with a polymer such as polylysine or polyornithine, or surface treatment such as positive charge treatment) can be used.
  • cell adhesion for example, extracellular matrix such as basement membrane preparation, laminin, entactin, collagen, gelatin, etc.
  • a polymer such as polylysine or polyornithine, or surface treatment such as positive charge treatment
  • the surface of the incubator was artificially treated (for example, super hydrophilic treatment such as MPC polymer, low protein adsorption treatment, etc.) for the purpose of reducing the adhesion to cells. Things can be used. You may carry out rotation culture using a spinner flask, a roller bottle, etc. The culture surface of the incubator may be flat bottom or uneven.
  • the incubator used for the adhesion culture is not particularly limited as long as it can “adherently culture”, and a person skilled in the art can appropriately incubate according to the culture scale, culture conditions, and culture period. Can be selected.
  • Examples of such an incubator include a flask, a tissue culture flask, a culture dish (dish), a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, a multiwell plate, a chamber slide, a petri dish, Examples include tubes, trays, culture bags, microcarriers, beads, stack plates, spinner flasks or roller bottles.
  • These incubators are preferably cell adhesive in order to enable adhesion culture.
  • Examples of the cell-adhesive incubator include an incubator in which the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving adhesion with cells, specifically, a surface-treated incubator, or An incubator whose inside is coated with a coating agent can be mentioned.
  • Examples of the coating agent include laminin [including laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as laminin 111), and laminin fragments (such as laminin 511E8), entactin, collagen, gelatin, vitronectin (Vitronectin), Examples include an extracellular matrix such as Synthemax (Corning) and Matrigel, or a polymer such as polylysine and polyornithine.
  • Examples of the surface-treated incubator include a surface-treated culture vessel such as a positive charge treatment.
  • the “medium” used for cell culture can be prepared using a medium usually used for animal cell culture as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, FMEM -12 medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium thereof can be used.
  • BME medium BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, FMEM -12 medium, DMEM / F12 medium, IMDM / F12 medium, ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's
  • serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components is also included in the serum-free medium unless it contains unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a serum replacement.
  • serum substitutes include those appropriately containing albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiolglycerol, or equivalents thereof.
  • Such serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product may be used as a serum substitute.
  • examples of such commercially available serum substitutes include Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Life Technologies; currently ThermoFisher: hereinafter referred to as KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Life Technologies), Glutamax TM ( Life Technologies), B27 (Life Technologies), N2 supplement (Life Technologies), ITS supplement (Life Technologies).
  • the serum-free medium used in suspension culture contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. You may contain.
  • an appropriate amount for example, about 0.5% to about 30%, preferably about 1% to about 20%
  • a serum-free medium eg, medium supplemented with 10% KSR, Chemically-defined Lipid concentrated, and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium
  • serum-free medium eg, medium supplemented with 10% KSR, Chemically-defined Lipid concentrated, and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium
  • the culture medium disclosed by the special table 2001-508302 as a KSR equivalent product is mentioned.
  • serum medium means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. May be.
  • the culture in the present invention may be preferably performed under xenofree conditions.
  • “Zeno-free” means a condition in which a component derived from a biological species different from the biological species of the cell to be cultured is excluded.
  • a medium containing substance X and “in the presence of substance X” means a medium added with exogenous substance X, a medium containing exogenous substance X, or exogenous substance X. Means in the presence of That is, when cells or tissues present in the medium express, secrete or produce the substance X endogenously, the endogenous substance X is distinguished from the foreign substance X, and the foreign substance It is understood that a medium not containing X does not fall under the category of “medium containing substance X” even if it contains endogenous substance X.
  • a medium containing a TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is a medium containing an exogenous TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor or a medium containing an exogenous TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor.
  • a “feeder cell” is a cell other than the stem cell that coexists when the stem cell is cultured.
  • feeder cells used for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells include mouse fibroblasts (MEF, etc.), human fibroblasts, SNL cells and the like.
  • a feeder cell subjected to growth inhibition treatment is preferable.
  • the growth inhibitory treatment include treatment of a growth inhibitor (for example, mitomycin C), gamma irradiation or UV irradiation.
  • Feeder cells used for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells can produce pluripotent stem cells by secreting humoral factors (preferably undifferentiated maintenance factors) and by preparing scaffolds for cell adhesion (extracellular matrix). Contributes to maintaining undifferentiation.
  • humoral factors preferably undifferentiated maintenance factors
  • extracellular matrix extracellular matrix
  • “in the absence of feeder cells (feeder-free)” means culturing in the absence of feeder cells.
  • absence of feeder cells for example, conditions where no feeder cells are added, or substantially no feeder cells (for example, the ratio of the number of feeder cells to the total number of cells is 3% or less, preferably 0.5% The following conditions are listed.
  • an “aggregate” of cells is a mass formed by aggregation of cells dispersed in a medium, and the cells are adhered to each other.
  • Cell aggregates, embryoid bodies, spheres, and spheroids are also included in cell aggregates.
  • the cells adhere to each other.
  • cells form cell-cell junctions and / or cell adhesions, eg, adhesion bonds, in some or all of the aggregates. There may be.
  • An aggregate containing retinal cells differentiated from pluripotent stem cells generated in the third step can be mentioned, and the “aggregate” is used at the start of suspension culture in the second step of the present invention [1]. Aggregates that have already been formed are also included.
  • the aggregate of cells generated in the second step includes an “embryoid body” (EB).
  • uniform aggregate means that the size of each aggregate is constant when culturing a plurality of aggregates, and the size of the aggregate is evaluated by the length of the maximum diameter.
  • the uniform aggregate means that the dispersion of the maximum diameter length is small. More specifically, an aggregate of 75% or more of the entire aggregate population has an average value of the maximum diameter in the aggregate population of ⁇ 100%, preferably within an average value of ⁇ 50%, more preferably Means within an average value of ⁇ 20%.
  • to form a uniform aggregate means that “a certain number of dispersed cells are rapidly aggregated” when cells are aggregated to form cell aggregates and suspended in culture. Is to form a uniform cell aggregate.
  • Dispersion means that cells and tissues are separated into small cell pieces (2 cells or more and 100 cells or less, preferably 50 cells or less) or single cells by dispersion treatment such as enzyme treatment or physical treatment.
  • a certain number of dispersed cells refers to a collection of a certain number of cell pieces or single cells.
  • Examples of the method for dispersing pluripotent stem cells include mechanical dispersion treatment, cell dispersion treatment, and cytoprotective agent addition treatment. You may perform combining these processes. Preferably, cell dispersion treatment is performed, followed by mechanical dispersion treatment.
  • Examples of the cell dispersion used for the cell dispersion treatment include a solution containing any of enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain, and a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid. Can do. Commercially available cell dispersions such as TrypLE Select (Life Technologies) or TrypLE Express (Life Technologies) can also be used.
  • cytoprotective agent used for the cytoprotective agent treatment include FGF signal transduction pathway agonists, heparin, IGF signal transduction pathway agonists, serum, and serum substitutes.
  • cytoprotective agent used for the cytoprotective agent treatment include FGF signal transduction pathway agonists, heparin, IGF signal transduction pathway agonists, serum, and serum substitutes.
  • an inhibitor of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) or an inhibitor of Myosin during dispersion May be added.
  • ROCK inhibitors include Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152, and the like. Blebbistatin can be mentioned as an inhibitor of Myosin.
  • Preferred cytoprotective agents include ROCK inhibitors.
  • pluripotent stem cells can be dispersed by treating colonies of pluripotent stem cells with a cell dispersion (TrypLE ⁇ Select) in the presence of a ROCK inhibitor as a cytoprotective agent and further dispersing by pipetting. Can be mentioned.
  • a cell is placed in a small space using a small well plate (for example, a plate having a well bottom area of about 0.1 to 2.0 cm 2 in terms of flat bottom) or a micropore.
  • a small well plate for example, a plate having a well bottom area of about 0.1 to 2.0 cm 2 in terms of flat bottom
  • a micropore A method of confinement and a method of aggregating cells by centrifuging for a short time using a small centrifuge tube can be mentioned.
  • a 24-well plate (area is about 1.88 cm 2 in terms of flat bottom), 48-well plate (area is about 1.0 cm 2 in terms of flat bottom), 96-well plate (area is about 0.35 cm 2 in terms of flat bottom) , An inner diameter of about 6 to 8 mm), and a 384 well plate.
  • a 96 well plate is used.
  • the shape of the small plate of the well the shape of the bottom surface when the well is viewed from the top includes a polygon, a rectangle, an ellipse, and a perfect circle, and preferably a perfect circle.
  • the shape of the bottom surface when the well is viewed from the side may be a flat bottom structure or a structure in which the outer peripheral portion is high and the inner concave portion is low.
  • Examples of the shape of the bottom include U bottom, V bottom, and M bottom, and preferably include M bottom or V bottom.
  • a plate having a small well a plate having an unevenness or a depression on the bottom surface of a cell culture dish (for example, a 60 mm to 150 mm dish, a culture flask) may be used.
  • the bottom surface of the plate having small wells is preferably a non-cell-adhesive bottom surface, preferably the cell-non-adhesive coated bottom surface.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells, or cell populations containing pluripotent stem cells, and their homogeneity depends on the size and number of the aggregates, macroscopic morphology, microscopic morphology by tissue staining analysis and It is possible to make a judgment based on the uniformity.
  • the formation of epithelial-like structures in the aggregates, and the uniformity thereof are the macroscopic morphology of the aggregates, the microscopic morphology and homogeneity by tissue staining analysis, the expression of the differentiation and undifferentiation markers, and the homogeneity thereof. It is possible to make a judgment based on sex, differentiation marker expression control and synchronization, and reproducibility of the differentiation efficiency between aggregates.
  • the “tissue” in the present invention is a structure of a cell population having a structure in which one type of cells having a uniform form or property, or a plurality of types of cells having different forms or properties are arranged in a three-dimensional pattern. Point.
  • neural tissue refers to nerves such as cerebral, midbrain, cerebellum, spinal cord, retina, peripheral nerve, forebrain, hindbrain, telencephalon, diencephalon, etc. It means a tissue composed of cell lines. Nerve tissue in cell aggregates is expressed with a microscope using a light microscope (for example, bright field microscope, phase contrast microscope, differential interference microscope, stereomicroscope, etc.) and expression of neural tissue markers such as PSA-NCAM and N-cadherin. It can be confirmed by using an index.
  • a light microscope for example, bright field microscope, phase contrast microscope, differential interference microscope, stereomicroscope, etc.
  • Neural tissue can form “neuroepithelial tissue” (epithelial structure having a layer structure).
  • the characteristics of the neuroepithelial tissue can be determined by indicators such as the morphology of cells contained in the tissue, the orientation of cell bodies in the tissue, the transparency of the entire tissue, and the macroscopic morphology.
  • the abundance of the neuroepithelial tissue in the cell aggregate can be evaluated by bright field observation using an optical microscope.
  • neural cells refers to cells other than epidermal cells in the ectoderm-derived tissue. That is, it includes cells such as neural progenitor cells, neurons (neural cells), glia, neural stem cells, neuronal progenitor cells, and glial progenitor cells. Nervous cells can be identified using Nestin, TuJ1, PSA-NCAM, N-cadherin and the like as markers. Neurons (Neuron / Neuronal cell) are functional cells that form neural circuits and contribute to information transmission. Tumor markers such as TuJ1, Dcx, HuC / D, and / or Map2, NeuN, etc. The expression of the mature neuron marker can be identified using the index.
  • Neural cells include the retinal cells described below.
  • “Retinal cell” in the present invention means a cell constituting each retinal layer or a progenitor cell thereof in a living retina, and includes a retinal progenitor cell, a neural retinal progenitor cell, a photoreceptor progenitor cell, a photoreceptor cell, Rod photoreceptors, cone photoreceptors, horizontal cells, amacrine cells, interneurons, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells, retinal pigment epithelial cells (RPE), ciliary marginal cells, these Cells such as progenitor cells are included, but are not limited to these.
  • the “retinal tissue” in the present invention means a tissue in which the cells constituting each retinal layer in a living retina are one-type or at least a plurality of types and are arranged in a three-dimensional manner. Whether each cell constitutes which retinal layer can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of the expression of a cell marker or the degree thereof.
  • the “retinal layer” in the present invention means each layer constituting the retina. Specifically, the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer boundary membrane, outer granular layer, outer reticulated layer, inner granular layer, inner granular layer, Mention may be made of the reticular layer, the ganglion cell layer, the nerve fiber layer and the inner limiting membrane.
  • retinal progenitor cell in the present invention refers to any mature retinal layer such as photoreceptor cells, rod photoreceptor cells, cone photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, retinal pigment epithelial cells and the like. Progenitor cells that can also differentiate into specific neurons.
  • neural retinal progenitor cell in the present invention can differentiate into any one or a plurality of mature retinal layer-specific neurons such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, and the like.
  • a progenitor cell In general, neural retinal progenitor cells do not differentiate into retinal pigment epithelial cells.
  • Visual cell progenitor cells are photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cell progenitor cells, retinal ganglion cell progenitor cells, and retinal pigment epithelial progenitor cells, respectively, are photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retina This refers to progenitor cells that have been determined to differentiate into ganglion cells and retinal pigment epithelial cells.
  • retinal layer-specific neural cell in the present invention means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
  • Examples of retinal layer-specific neurons include bipolar cells, retinal ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells, photoreceptor cells, retinal pigment epithelial cells, rod photoreceptor cells, and cone photoreceptor cells.
  • Rx also called Rax
  • PAX6 and Chx10 expressed in retinal progenitor cells
  • hypothalamic neuroepithelium examples include Sox1 that is not expressed in the retina, Crx that is expressed in progenitor cells of the photoreceptor, and Blimp1.
  • Chx10, PKC ⁇ and L7 expressed in bipolar cells As markers for retinal layer-specific neurons, Chx10, PKC ⁇ and L7 expressed in bipolar cells, TuJ1 and Brn3 expressed in retinal ganglion cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, mature photoreceptor cells Rhodopsin and Recoverin expressed in rods, Nrl and Rhodopsin expressed in rod photoreceptors, Rxr-gamma expressed in cone photoreceptors, S-Opsin and M / L-Opsin, RPE65 and Mitf expressed in retinal pigment epithelial cells, Examples include Rdh10 and SSEA1 expressed in ciliary peripheral cells.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing retinal cells or retinal tissue, comprising the following steps (1) to (3): (1) Pluripotent stem cells in the absence of feeder cells in a medium containing 1) a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or sonic hedgehog signaling pathway agonist, and 2) an undifferentiated maintenance factor
  • the first step of culturing (2) The cell obtained in the first step was suspended in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor and the cell was formed in the second step, and (3) the cell was obtained in the second step.
  • a third step of obtaining an aggregate containing retinal cells or retinal tissue by subjecting the aggregate to suspension culture in a medium containing a BMP signaling pathway agent in the presence or absence of a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • Step (1) pluripotent stem cells are removed in the absence of feeder cells, 1) TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or sonic hedgehog signaling pathway agonist And 2) culturing in a medium containing an undifferentiated maintenance factor.
  • Preferred pluripotent stem cells in step (1) include induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells (ES cells), more preferably human induced pluripotent stem cells or human embryonic stem cells (ES cells).
  • ES cells induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells
  • ES cells human induced pluripotent stem cells or human embryonic stem cells (ES cells).
  • the method for producing induced pluripotent stem cells is not particularly limited, and can be produced by a method well known to those skilled in the art as described above. However, the method for producing induced pluripotent stem cells (that is, initializing somatic cells). It is desirable that the step of establishing pluripotent stem cells is also performed feeder-free.
  • the production method of embryonic stem cells is not particularly limited, and can be produced by a method well known to those skilled in the art as described above.
  • the embryonic stem cells (ES cells) production process is also feeder-free. It is desirable to do.
  • Maintenance and expansion of pluripotent stem cells used in step (1) can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • the maintenance / expansion culture of pluripotent stem cells can be performed by adhesion culture or suspension culture, but is preferably performed by adhesion culture.
  • Maintenance culture / expansion culture of pluripotent stem cells may be performed in the presence of a feeder or feeder-free, but is preferably performed feeder-free.
  • feeder-free in the absence of feeder cells (feeder-free) in maintenance culture and expansion culture of pluripotent stem cells is a condition that does not substantially contain feeder cells (for example, the ratio of the number of feeder cells to the total number of cells is 3% or less) Means.
  • maintenance culture and expansion culture of pluripotent stem cells are performed under conditions that do not include feeder cells.
  • the absence of feeder cells means a condition that substantially does not contain feeder cells (for example, the ratio of the number of feeder cells to the total number of cells is 3% or less).
  • step (1) is performed under conditions that do not include feeder cells.
  • the medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is a medium (feeder-free medium) that enables undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells under feeder-free conditions. Therefore, an undifferentiated maintenance factor is included.
  • the undifferentiation maintenance factor is not particularly limited as long as it is a substance having an action of suppressing differentiation of pluripotent stem cells.
  • undifferentiated maintenance factors widely used by those skilled in the art include FGF signaling pathway agents, TGF ⁇ family signaling Pathway action substances, insulin and the like.
  • FGF signal transduction pathway agent include fibroblast growth factors (for example, bFGF, FGF4 and FGF8).
  • TGF ⁇ family signal transduction pathway agonist include TGF ⁇ signal transduction pathway agonist and Nodal / Activin signal transduction pathway agonist.
  • TGF ⁇ signal transduction pathway agonists examples include Nodal, ActivinA, and ActivinB. One or two or more of these may be included as an undifferentiated maintenance factor.
  • the medium in step (1) preferably contains bFGF as an undifferentiation maintenance factor.
  • the undifferentiation maintenance factor used in the present invention is usually a mammalian undifferentiation maintenance factor.
  • mammals include those described above. Since an undifferentiated maintenance factor can have cross-reactivity between mammalian species, any mammalian undifferentiated maintenance factor can be used as long as the undifferentiated state of the pluripotent stem cells to be cultured can be maintained. However, preferably, an undifferentiated maintenance factor of a mammal of the same species as the cell to be cultured is used.
  • human undifferentiated maintenance factors eg, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, ActivinA, ActivinB, TGF ⁇ 1, TGF ⁇ 2, etc.
  • human protein X means that protein X has the amino acid sequence of protein X that is naturally expressed in the human body.
  • the undifferentiation maintenance factor used in the present invention is preferably isolated.
  • isolated protein X means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed. Therefore, “isolated protein X” does not include endogenous protein X produced from cells or tissues to be cultured and contained in the cells, tissues, or medium.
  • the purity of “isolated protein X” (percentage of the weight of protein X in the total protein weight) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, More preferably, it is 100%. Accordingly, in one aspect, the present invention includes providing an isolated undifferentiated maintenance factor.
  • the process of adding the isolated undifferentiation maintenance factor exogenously (or exogenous) to the culture medium used for a process (1) is included.
  • the undifferentiation maintenance factor may be added to the culture medium used for a process (1) previously.
  • the undifferentiated maintenance factor concentration in the medium used in step (1) is a concentration capable of maintaining the undifferentiated state of the pluripotent stem cells to be cultured, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • concentration is usually about 4 to 500 to ng / mL, preferably about 10 to 200 to ng / mL.
  • concentration is about 30 ng to 150 ng / mL.
  • a feeder-free medium that is, an undifferentiated maintenance medium
  • many synthetic media have been developed and marketed, for example, Essential 8 (Life Technologies) medium.
  • Essential 8 medium was added to DMEM / F12 medium with L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg / l), sodium selenite (14 ⁇ g / 1), insulin (19.4 mg / l), NaHCO 3 (543 mg / l), transferrin (10.7 mg / l), bFGF (100 ng / mL), and TGF ⁇ family signaling pathway agonist (TGF ⁇ 1 (2 ng / mL) or Nodal (100 ng / mL)) (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)).
  • feeder-free media include, for example, Essential 6 medium (Life Technologies), Stabilized Essential 8 medium (Life Technologies), S-medium (DS Pharma Biomedical) , StemPro (Life Technologies), hESF9 (Proc Natl Acad Sci US A. 2008 Sep 9; 105 (36): 13409-14), TeSR medium (STEMCELL Technologies), mTeSR1 (STEMCELL Technologies), mTeSR2 (STEMCELL Technologies), TeSR-E8 (STEMCELL Technologies).
  • StemFit registered trademark
  • the present invention can be easily carried out.
  • the pluripotent stem cell culture in the step (1) may be performed under any conditions of suspension culture and adhesion culture, but is preferably performed by adhesion culture.
  • the incubator used for the adhesion culture is not particularly limited as long as it can be “adherently cultured”, but a cell adhesive incubator is preferable.
  • the cell-adhesive incubator include an incubator in which the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving the adhesion to cells. Specifically, the inside described above is coated with a coating agent. Incubator.
  • laminin 511 examples include laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter referred to as laminin 111), and laminin fragments (such as laminin 511E8), entactin, collagen, gelatin, vitronectin (Vitronectin), Examples include an extracellular matrix such as Synthemax (Corning) and Matrigel, or a polymer such as polylysine and polyornithine.
  • a culture vessel having a surface processed such as a positive charge treatment can also be used.
  • laminin is mentioned, More preferably, laminin 511E-8 is mentioned.
  • Laminin 511E-8 can be purchased commercially (eg, iMatrix-511, Nippi).
  • the medium used in step (1) contains a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agonist.
  • a TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signal transduction pathway agent can be added to the aforementioned undifferentiated maintenance medium.
  • pluripotent stem cells are treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent and then subjected to suspension culture in the second step.
  • the cell aggregate obtained in this way can be expected to exhibit, for example, the characteristics that it is round, the surface is smooth, and the inside of the aggregate is dense.
  • TGF ⁇ family signal transduction pathway ie, TGF ⁇ superfamily signal transduction pathway
  • TGF ⁇ TGF ⁇ superfamily signal transduction pathway
  • BMP BMP
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor refers to a TGF ⁇ family signaling pathway, that is, a substance that inhibits the signaling pathway transmitted by the Smad family. Specifically, a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, Nodal / Activin signaling pathway Inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors may be mentioned.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway caused by TGF ⁇ , and may be any of nucleic acid, protein, and low molecular weight organic compound.
  • examples of such substances include substances that directly act on TGF ⁇ (eg, proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding TGF ⁇ (eg, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), TGF ⁇ receptors and TGF ⁇
  • examples include substances that inhibit binding, and substances that inhibit physiological activity resulting from signal transduction by the TGF ⁇ receptor (for example, inhibitors of TGF ⁇ receptor, inhibitors of Smad, etc.).
  • TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitors examples include Lefty and the like.
  • TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor compounds well known to those skilled in the art can be used, and specific examples include SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 and the like.
  • SB431542 (4- (5-Benzol [1,3] dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl) -benzamide) and A-83-01 (3- ( 6-methyl-2-pyridinyl) -N-phenyl-4- (4-quinolinyl) -1H-pyrazole-1-carbothioamide) is an inhibitor of TGF ⁇ receptor (ALK5) and Activin receptor (ALK4 / 7) (Ie, a compound known as a TGF ⁇ R inhibitor). One or more of these may be contained as a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is preferably SB431542 or A-83-01.
  • the Nodal / Activin signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway caused by Nodal or Activin, and may be any of nucleic acid, protein, and low molecular weight organic compound.
  • examples of such substances include substances that directly act on Nodal or Activin (for example, antibodies, aptamers), substances that suppress the expression of genes encoding Nodal or Activin (for example, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), Nodal / Activin receptors And a substance that inhibits the binding between Nodal / Activin and a substance that inhibits physiological activity resulting from signal transduction by the Nodal / Activin receptor.
  • Nodal / Activin signal transduction pathway inhibitor compounds well known to those skilled in the art can be used, and specific examples include SB431542, A-83-01 and the like.
  • proteins known as Nodal / Activin signal transduction pathway inhibitors may be used. One or two or more of these may be included as Nodal / Activin signaling pathway inhibitors.
  • the Nodal / Activin signaling pathway inhibitor is preferably SB431542, A-83-01 or Lefty.
  • the BMP signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway caused by BMP, and may be any of nucleic acid, protein, and low molecular organic compound.
  • BMP include BMP2, BMP4, BMP7, and GDF7.
  • examples of such substances include substances that directly act on BMP (eg, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding BMP (eg, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), BMP receptors (BMPR) and BMP Examples include substances that inhibit binding, and substances that inhibit physiological activity resulting from signal transduction by the BMP receptor.
  • BMPR include ALK2 and ALK3.
  • BMP signal transduction pathway inhibitors compounds well known to those skilled in the art can be used, and specific examples include LDN193189, Dorsomorphin and the like.
  • LDN193189 (4- [6- (4-piperazin-1-ylphenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] quinoline) is a known BMPR (ALK2 / 3) inhibitor (hereinafter, BMPR inhibitors) and are usually marketed in the form of hydrochloride.
  • proteins known as BMP signaling pathway inhibitors Choordin, Noggin, etc.
  • the BMP signaling pathway inhibitor is preferably LDN193189.
  • the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is preferably Lefty, SB431542, A-83-01 or LDN193189.
  • TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitors with different action points may be used in combination.
  • the combination is expected to enhance the effect of improving the quality of the aggregate.
  • a combination of a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a BMP signaling pathway inhibitor a combination of a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a Nodal / Activin signaling pathway inhibitor, a BMP signaling pathway inhibitor and a Nodal / Activin signaling
  • a combination with a pathway inhibitor is mentioned, and preferably a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is used in combination with a BMP signaling pathway inhibitor.
  • a specific preferred combination is a combination of SB431542 and LDN193189.
  • Sonic hedgehog signal (hereinafter sometimes referred to as Shh) transmission pathway agent is a substance that can enhance signal transmission mediated by Shh.
  • substances that act on the Shh signal transduction pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (eg, Shh and Ihh), Shh receptors, Shh receptor agonists, PMA (Purmorphamine; 9-cyclohexyl-N- [4- (4-morpholinyl) ) Phenyl] -2- (1-naphthalenyloxy) -9H-purin-6-amine), or SAG (Smoothened Agonist; N-methyl-N '-(3-pyridinylbenzyl) -N'-( 3-chlorobenzo [b] thiophene-2-carbonyl) -1,4-diaminocyclohexane) and the like.
  • Shh signal transduction pathway agent is preferably Shh protein (Gen
  • a combination of a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and a Shh signaling pathway agonist may be used. By combining, the effect of improving the quality of the aggregate is enhanced.
  • the cells may be cultured in a medium containing both the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and the Shh signaling pathway agonist.
  • the cells After treating the cells with one of the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and the Shh signaling pathway agonist, the cells may be subsequently treated with either or both. Alternatively, after the cells are treated with both the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and the Shh signaling pathway agonist, the cells may be subsequently treated with either one.
  • the concentration of the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor and the sonic hedgehog signal transduction pathway agonist can be appropriately set within the range where the above-described effects can be achieved.
  • SB431542 is usually used at a concentration of 0.1 to 200 ⁇ M, preferably 2 to 50 ⁇ M.
  • A-83-01 is usually used at a concentration of 0.05 to 50 ⁇ M, preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • LDN193189 is usually used at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 300 nM.
  • Lefty is usually used at a concentration of 5 to 200 ng / ml, preferably 10 to 50 ng / ml.
  • Shh protein is usually used at a concentration of 20 to 1000 ng / ml, preferably 50 to 300 ng / ml.
  • SAG is usually used at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 700 nM, more preferably 30 to 600 nM.
  • PMA is usually used at a concentration of 0.002 to 20 ⁇ M, preferably 0.02 to 2 ⁇ M.
  • the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor can be appropriately used in an amount having TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitory activity equivalent to that of SB43154 at the above concentration.
  • the sonic hedgehog signal transduction pathway agent can be appropriately used in an amount having Shh signal transduction promoting activity equivalent to the above-mentioned concentration of SAG.
  • TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitory activity such as SB431542 and LDN193189 can be determined by methods well known to those skilled in the art, for example, by detecting phosphorylation of Smad by Western blotting (Mol Cancer Ther. (2004) 3, 737 -45.)
  • Sonic hedgehog signal transduction promoting activity such as SAG can be determined by a method well known to those skilled in the art, for example, a reporter gene assay focusing on the expression of the Gli1 gene (Oncogene (2007) 26, 5163-5168).
  • the medium used in step (1) may be a serum medium or a serum-free medium, but is preferably a serum-free medium from the viewpoint of avoiding contamination with chemically undecided components.
  • the medium used in step (1) may be a medium in which the contained components are chemically determined from the viewpoint of avoiding contamination of chemically undecided components.
  • the feeder-free medium that is, the undifferentiated maintenance medium
  • the feeder-free medium may be used as the medium.
  • feeder-free media undifferentiation maintenance media
  • an appropriate matrix may be used as the scaffold in order to provide a scaffold instead of feeder cells for pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells are adhered and cultured in a cell container whose surface is coated with a matrix as a scaffold.
  • the matrix that can be used as a scaffold includes laminin (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), laminin fragment (NatNCommun 3, 1236 (2012)), basement membrane preparation (Nat Biotechnol 19, 971-974 ( 2001)), gelatin, collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, vitronectin and the like.
  • laminin is a heterotrimeric molecule composed of ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, and is an extracellular matrix protein in which isoforms having different subunit chain compositions exist. Specifically, laminin has about 15 isoforms in a combination of 5 ⁇ chains, 4 ⁇ chains, and 3 ⁇ chain heterotrimers.
  • the name of laminin is determined by combining the numbers of ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 5), ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 4) and ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 3).
  • laminin obtained by combining ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain, and ⁇ 1 chain is referred to as laminin 511.
  • laminin 511 is preferably used (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
  • the laminin used in the present invention is usually a mammalian laminin.
  • mammals include those described above.
  • mammalian laminin of the same species as the cells to be cultured is preferably used.
  • human laminin preferably human laminin 511 is used for culturing human pluripotent stem cells.
  • the laminin fragment used in the present invention is not particularly limited as long as it has adhesion to pluripotent stem cells and enables maintenance culture of pluripotent stem cells under feeder-free conditions.
  • the laminin E8 fragment was identified as a fragment having strong cell adhesion activity among fragments obtained by digesting laminin 511 with elastase (EMBO J., 3: 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987).
  • an E8 fragment of laminin 511 is preferably used (NatCommun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)).
  • the laminin E8 fragment used in the present invention does not need to be a laminin elastase digestion product, and may be a recombinant. From the viewpoint of avoiding contamination with unidentified components, a recombinant laminin fragment is preferably used in the present invention.
  • the E8 fragment of laminin 511 is commercially available and can be purchased from, for example, Nippi Corporation.
  • the laminin or laminin fragment used in the present invention is preferably isolated.
  • the “basement membrane preparation” refers to epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, movement, functional expression, etc., when desired cells having basement membrane forming ability are seeded and cultured thereon.
  • the “basement membrane component” refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule that exists between an epithelial cell layer and a stromal cell layer in an animal tissue.
  • a basement membrane preparation removes cells having a basement membrane-forming ability adhered to a support through a basement membrane from the support using a solution or an alkaline solution having lipid-dissolving ability of the cells.
  • Basement membrane preparations include products that are commercially available as basement membrane preparations (for example, Matrigel TM (manufactured by Corning: hereinafter referred to as “Matrigel”)), Geltrex TM (manufactured by Life Technologies), and basement membrane components. And those containing known extracellular matrix molecules (for example, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin and the like).
  • Matrigel TM is a basement membrane preparation extracted from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma.
  • the main components of Matrigel TM are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin.
  • TGF ⁇ , FGF, tissue plasminogen activator, and growth factors naturally produced by EHS tumors are included.
  • Matrigel TM “growth factor reduced products” have lower growth factor concentrations than normal Matrigel TM , with standard concentrations of ⁇ 0.5 ng / ml for EGF, ⁇ 0.2 ng / ml for NGF, and ⁇ 5 for PDGF.
  • IGF1 is 5 ng / ml
  • TGF ⁇ is 1.7 ng / ml.
  • isolated laminin or laminin fragments are preferably used in the present invention.
  • the surface is coated with isolated laminin 511 or an E8 fragment of laminin 511 (more preferably, an E8 fragment of laminin 511).
  • pluripotent stem cells are cultured for adhesion.
  • the culture time of pluripotent stem cells in step (1) is not particularly limited as long as the effect of improving the quality of aggregates formed in step (2) can be achieved, but is usually 0.5 to 144 hours. .
  • the culture time of pluripotent stem cells in step (1) is preferably 1 hour or more, 2 hours or more, 6 hours or more, 12 hours or more, 18 hours or more, 20 hours or more, or 24 hours or more.
  • the culture time of pluripotent stem cells in step (1) is preferably within 96 hours, within 72 hours, within 60 hours, within 48 hours, or within 28 hours.
  • the range of culture time of pluripotent stem cells in step (1) is preferably 2 to 96 hours, 6 to 72 hours, 6 to 60 hours, 12 to 60 hours, 18 to 60 hours, 18 to 48 hours.
  • step (2) is started 0.5 to 144 hours (preferably 12 to 60 hours, 18 to 48 hours, or 18 to 28 hours) before the start of suspension culture in step (2), and step (1) is completed. After that, step (2) is continued.
  • each treatment time is independently within the above culture time range. Can be inside.
  • the treatment time can be independently within the above-described culture time range.
  • the TGF ⁇ family is cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) with either a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542 or LDN193189) and a Shh signaling pathway agonist (eg, SAG).
  • a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, SB431542 or LDN193189
  • a Shh signaling pathway agonist eg, SAG
  • Either a signaling pathway inhibitor (eg, SB431542 or LDN193189) and an Shh signaling pathway agonist (eg, SAG) can be cultured for an additional 18 to 28 hours (eg, 24 hours).
  • the concentration of the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is 3 ⁇ M to 10 ⁇ M that exhibits the same TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitory activity as SB431542, or the BMP signal transduction pathway inhibition equivalent to 50 ⁇ M to 200 ⁇ M LDN193189.
  • concentration of the Shh signal transduction pathway agent include a concentration exhibiting Shh signal transduction promoting activity equivalent to SAG of 100 to 500 nM.
  • the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor (eg, SB431542 or LDN193189) and Shh signal transduction pathway agent (eg, SAG) are cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) Either a transmission pathway inhibitor (eg, SB431542 or LDN193189) and a Shh signaling pathway agonist (eg, SAG) can be cultured for an additional 18 to 28 hours (eg, 24 hours).
  • the concentration of the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is 3 ⁇ M to 10 ⁇ M that exhibits the same TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitory activity as SB431542, or the BMP signal transduction pathway inhibition equivalent to 50 ⁇ M to 200 ⁇ M LDN193189.
  • the concentration of the Shh signal transduction pathway agent include a concentration exhibiting Shh signal transduction promoting activity equivalent to SAG of 100 to 500 nM.
  • a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, SB431542 or LDN193189
  • a Shh signaling pathway agonist eg, SAG
  • TGF ⁇ is cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours)
  • TGF ⁇ is cultured. It can be further cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) with both a family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542 or LDN193189) and an Shh signaling pathway agonist (eg, SAG).
  • the concentration of the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is 3 ⁇ M to 10 ⁇ M that exhibits the same TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitory activity as SB431542, or the BMP signal transduction pathway inhibition equivalent to 50 ⁇ M to 200 ⁇ M LDN193189.
  • concentration of the Shh signal transduction pathway agent include a concentration exhibiting Shh signal transduction promoting activity equivalent to SAG of 100 to 500 nM.
  • the culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (1) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • human pluripotent stem cells are adherently cultured in a serum-free medium (undifferentiated maintenance medium) containing bFGF in the absence of feeder cells.
  • the adhesion culture is preferably performed in a cell container whose surface is coated with laminin 511, an E8 fragment of laminin 511 or vitronectin.
  • the adhesion culture is preferably Essential 8, TeSR medium, mTeSR medium, mTeSR-E8 medium, or StemFit (registered trademark) medium as a feeder-free medium (undifferentiation maintenance medium), more preferably Essential 8 or StemFit (registered trademark). ) Performed using medium.
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • human iPS cells are cultured in suspension in a serum-free medium containing bFGF in the absence of feeder cells.
  • human pluripotent stem cells may form aggregates of human pluripotent stem cells.
  • the cell obtained by the step (1) is a cell in which the pluripotent-like state is maintained, and the pluripotent-like property is maintained through the step (1).
  • a pluripotent-like property means a state in which at least a part of a trait peculiar to pluripotent stem cells common to pluripotent stem cells, including pluripotency, is maintained. The pluripotency-like nature does not require strict pluripotency. Specifically, a state in which all or part of a marker serving as an index of pluripotent state is expressed as “pluripotent-like property”. Markers of pluripotency-like properties include Oct3 / 4 positive, alkaline phosphatase positive and the like. In one embodiment, cells that retain pluripotent-like properties are Oct3 / 4 positive. Even when the expression level of Nanog is lower than that of ES cells or iPS cells, it falls under “cells exhibiting pluripotency-like properties”.
  • the cells obtained by the step (1) are stem cells having the ability to differentiate into at least retinal cells or retinal tissues (preferably retinal tissues, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells). In one embodiment, the cells obtained by step (1) have the ability to differentiate into at least retinal cells or retinal tissue (preferably retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells), Oct3 / 4 Positive stem cells. As one embodiment, the cells obtained by the step (1) include Oct3 / 4 positive stem cells of 60% or more, for example, 90% or more.
  • human pluripotent stem cells eg, iPS cells, ES cells
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors and / or sonic hedgehog signaling pathways in the absence of feeder cells.
  • Adhesive culture is performed in a serum-free medium containing the active substance and bFGF.
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors are preferably TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, SB431542, A-83-01, Lefty), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83- 01), a BMP signaling pathway inhibitor (eg, LDN193189, Chordin, Noggin), or a combination thereof (eg, SB431542 and LDN193189).
  • the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is more preferably Lefty, SB431542, A-83-01, or LDN193189, or a combination thereof (eg, SB431542 and LDN193189).
  • the sonic hedgehog signaling pathway agent is preferably Shh protein, SAG or Purmorphamine (PMA), more preferably SAG.
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • sonic hedgehog signaling pathway agents eg, Shh protein, SAG, PMA
  • the culture time is 0.5 to 144 hours (preferably 2 to 96 hours, 6 to 72 hours, 6 to 60 hours, 12 to 60 hours, 18 to 60 hours, 18 to 48 hours, or 18 to 28 hours (eg, 24 hours)).
  • change the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Shh signaling pathway agonist eg, Shh protein, SAG, PMA
  • TGF ⁇ family signaling pathway is cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) in both TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors (eg, SB431542, LDN193189) and Shh signaling pathway agonists (eg, SAG).
  • Either of the pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and the Shh signaling pathway agonist (eg, SAG) can be further cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours).
  • the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and Shh signaling pathway agonist (eg, SAG) are cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours), and TGF ⁇ is cultured. It is possible to further culture for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) with and / or either a family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and / or an Shh signaling pathway agonist (eg, SAG).
  • step (1) pluripotent stem cells are maintained and cultured in a medium containing an undifferentiated maintenance factor in the absence of feeder cells, into which TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and Step (1) is performed by adding a sonic hedgehog signal transduction pathway agent and continuing the culture.
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and Step (1) is performed by adding a sonic hedgehog signal transduction pathway agent and continuing the culture.
  • step (1) when the step (1) is started after completion of maintenance culture, addition of an undifferentiated maintenance medium supplemented with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agonist Alternatively, some or all of the medium is replaced with the undifferentiated maintenance medium, and the culture is continued.
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • the maintenance culture is preferably performed by adhesion culture.
  • the adhesion culture is preferably performed in a cell container whose surface is coated with vitronectin, laminin 511 or E8 fragment of laminin 511.
  • the period for the maintenance culture is not particularly limited.
  • Pluripotent stem cells are cells that can proliferate (preferably self-replicate) while maintaining differentiation potential, and maintenance culture is a culture method that can maintain pluripotency. It is possible to make it.
  • pluripotent stem cells can be frozen to produce a frozen cell stock, and the frozen cell stock can be asleep and maintenance culture can be continued.
  • the culture period after sleeping is not particularly limited, and examples thereof include about 1 to 1000 days, preferably about 7 to 150 days, and more preferably about 10 to 90 days.
  • cells can be passaged during maintenance culture.
  • a TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signal transduction pathway agent is added to a medium containing human pluripotent stem cells maintained and cultured as described above, and the culture is continued.
  • the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor is preferably a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, A-83-01, Lefty), a Nodal / Activin signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, A-83-01, Lefty), a BMP signaling pathway inhibitor (eg, LDN193189), or a combination thereof (eg, SB431542 and LDN193189).
  • the TGF ⁇ family signal transduction pathway inhibitor is more preferably Lefty, SB431542, A-83-01, or LDN193189, or a combination thereof (eg, SB431542 and LDN193189).
  • the sonic hedgehog signaling pathway agent is preferably Shh protein, SAG or PMA.
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • sonic hedgehog signaling pathway agents eg, Shh protein, SAG, PMA
  • 0.5-144 hours after addition preferably 2-96 hours, 6-72 hours, 6-60 hours, 12-60 hours, 18-60 hours, 18-48 hours, or 18-28 hours (eg, 24 Time)
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Shh signaling pathway agonist eg, Shh protein, SAG, PMA
  • TGF ⁇ family signaling pathway is cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) in both TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors (eg, SB431542, LDN193189) and Shh signaling pathway agonists (eg, SAG).
  • Either of the pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and the Shh signaling pathway agonist eg, SAG
  • the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and Shh signaling pathway agonist (eg, SAG) are cultured for 18 to 28 hours (eg, 24 hours), and TGF ⁇ is cultured. It is possible to further culture for 18 to 28 hours (eg, 24 hours) with and / or either a family signaling pathway inhibitor (eg, SB431542, LDN193189) and / or an Shh signaling pathway agonist (eg, SAG).
  • a family signaling pathway inhibitor eg, SB431542, LDN193189
  • Shh signaling pathway agonist eg, SAG
  • Step (2) The step (2) of forming a cell aggregate by suspension culture of the cells obtained in the step (1) in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor will be described.
  • the suspension culture start time in step (2) in the present invention is a time point at which the following operation is performed.
  • -Operation From the undifferentiated maintenance medium used in step (1) (ie, medium containing 1) a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or sonic hedgehog signaling pathway agonist, and 2) an undifferentiated maintenance factor) Operation to change medium and shift to suspension culture.
  • the medium exchange in the above operation is a medium exchange other than an undifferentiated maintenance medium, and is not particularly limited as long as it is a medium capable of inducing differentiation into the retinal system cell and / or retinal tissue of the present invention or an intermediate thereof.
  • a medium containing no “undifferentiation maintenance factor” such as a basal medium described later can be mentioned.
  • At the start of step (2) that is, at the time of medium exchange, it may or may not contain a Wnt signal transduction pathway inhibitor. Good.
  • the medium (basal medium) used in step (2) is not particularly limited, and the basal medium described in the above definition can be appropriately selected.
  • the medium used in step (2) can be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination of chemically undecided components, a serum-free medium is preferably used in the present invention.
  • a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a commercially available serum substitute such as KSR (for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1 in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12) It is preferable to use a medium supplemented with monothioglycerol and 1 Chemically Defined Lipid Concentrate, or a medium supplemented with 5-20% KSR, NEAA, pyruvate, 2-mercaptoethanol in GMEM).
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 30%, preferably about 2% to about 20% (eg, about 5%, about 10%).
  • the medium used in step (2) contains a Wnt signal transduction pathway inhibitor.
  • pluripotent stem cells are treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent, and in step (2), the cells obtained in step (1)
  • the aggregate quality was further improved and the undifferentiated state was maintained by subjecting the suspension to suspension culture in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor (preferably a serum-free medium) to form aggregates.
  • a Wnt signaling pathway inhibitor preferably a serum-free medium
  • Cell aggregates and aggregates suitable for differentiation into retinal cells can be formed with high efficiency.
  • the cell aggregate obtained in this way can be expected to exhibit, for example, the characteristics that it is round, has a smooth surface, does not lose its shape, and the inside of the aggregate is dense.
  • the Wnt signal transduction pathway inhibitor used in step (2) is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Wnt, and may be any protein, nucleic acid, low molecular weight compound, etc. Good. Signals mediated by Wnt are transmitted through Wnt receptors that exist as heterodimers of Frizzled (Fz) and LRP5 / 6 (low-densitylowlipoprotein receptor-related protein 5/6). Examples of Wnt signal transduction pathway inhibitors include substances that directly act on Wnt or Wnt receptors (anti-Wnt neutralizing antibodies, anti-Wnt receptor neutralizing antibodies, etc.), and expression of genes encoding Wnt or Wnt receptors.
  • Substances to suppress for example, antisense oligonucleotides, siRNA, etc.
  • substances that inhibit Wnt receptor-Wnt binding soluble Wnt receptor, dominant negative Wnt receptor, Wnt antagonist, Dkk1, Cerberus protein, etc.
  • Wnt receptors [CKI-7 (N- (2-aminoethyl) -5-chloroisoquinoline-8-sulfonamide), D4476 (4- [4- (2, 3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl) -5- (2-pyridinyl) -1H-imidazol-2-yl] benzamide
  • IWR-1-endo IWR1e
  • IWR1e (4-[(3aR, 4S, 7R, 7aS) -1,3,3a, 4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2
  • Wnt signal transduction pathway inhibitor CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2, and the like are known Wnt signal transduction pathway inhibitors, and commercially available products can be appropriately obtained.
  • IWR1e is preferably used as a Wnt signal transduction pathway inhibitor.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor may be any concentration that can induce the formation of favorable cell aggregates.
  • the concentration is about 0.1 to about 100 ⁇ M, preferably about 0.3 to about 30 ⁇ M, more preferably about 1 to about 10 ⁇ M, and more preferably about 3 to about ⁇ M.
  • Add to medium When a Wnt signal transduction pathway inhibitor other than IWR-1-endo is used, it is desirable to use it at a concentration exhibiting Wnt signal transduction pathway inhibitory activity equivalent to the concentration of IWR-1-endo.
  • the timing of adding the Wnt signal transduction pathway inhibitor to the medium is not particularly limited as long as the above effect can be achieved, but the earlier the higher the effect.
  • the Wnt signaling pathway inhibitor is usually within 6 days, preferably within 3 days, more preferably within 1 day, more preferably within 12 hours from the start of suspension culture in step (2), more preferably within step (2). Is added to the medium at the start of suspension culture. Specifically, for example, the addition of a basal medium to which a Wnt signal transduction pathway inhibitor is added, or a part or all of the medium can be changed to the basal medium.
  • the period during which the cells obtained in step (1) are allowed to act on the Wnt signaling pathway inhibitor in step (2) is not particularly limited as long as the above effect can be achieved, but preferably suspension culture in step (2) After adding to the culture medium at the beginning, it is allowed to act until the end of the step (2) (immediately before the addition of the substance acting on the BMP signal transduction pathway). More preferably, as described later, after the completion of the step (2) (that is, during the period of the step (3)), the Wnt signaling pathway inhibitor is continuously exposed. As one embodiment, as described later, after the completion of step (2) (that is, during the period of step (3)), it is allowed to continuously act on a Wnt signal transduction pathway inhibitor to form neuroepithelial tissue and / or neural tissue. You may make it act until it is done. The formation of neuroepithelial tissue and / or neural tissue can be confirmed by the method described above.
  • dispersed cells are prepared by the cell dispersing operation obtained in step (1).
  • the “dispersed cells” obtained by the dispersing operation include a state in which 70% or more is a single cell and a mass of 2 to 50 cells is present in 30% or less.
  • the dispersed cells preferably include a state in which 80% or more is a single cell and a mass of 2 to 50 cells is present in 20% or less.
  • the dispersed cells include a state where adhesion between cells (for example, surface adhesion) is almost lost.
  • dispersed cells include those in which cell-cell junctions (eg, adhesive junctions) are almost lost.
  • the cell dispersion operation obtained in step (1) may include the mechanical dispersion treatment, cell dispersion treatment, and cytoprotective agent treatment described above. You may perform combining these processes. Preferably, the cell dispersion treatment is performed simultaneously with the cytoprotective agent treatment, and then the mechanical dispersion treatment is performed.
  • cytoprotective agent used for the cytoprotective agent treatment examples include FGF signaling pathway acting substances, heparin, IGF signaling pathway acting substances, serum, and serum substitutes.
  • an inhibitor of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) or inhibition of Myosin An agent may be added.
  • ROCK inhibitors examples include Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152, and the like. Blebbistatin can be mentioned as an inhibitor of Myosin.
  • Examples of the cell dispersion used in the cell dispersion treatment include solutions containing any of enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase or papain, and a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
  • enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase or papain
  • a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
  • Commercially available cell dispersions such as TrypLE Select (Life Technologies) or TrypLE Express (Life Technologies) can also be used.
  • Dispersed cells are suspended in the above medium.
  • suspension of dispersed cells in a serum-free medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor (and a cytoprotective agent such as a ROCK inhibitor, if necessary) starts suspension culture in step (2). From time to time, treatment with inhibitors of the Wnt signaling pathway is possible.
  • the dispersed cell suspension is seeded in the incubator, and the dispersed cells are cultured on the incubator under non-adhesive conditions to assemble a plurality of cells. Aggregates are formed.
  • the dispersed cells may be seeded in a relatively large incubator such as a 10 cm dish to simultaneously form an aggregate of a plurality of cells in one incubator. Variation occurs in the size of each lump. Therefore, for example, when a certain number of dispersed stem cells are placed in each well of a multi-well plate (U bottom, V bottom, M bottom) such as a 96-well microplate, Aggregation forms one aggregate in each well. By collecting the aggregates from a plurality of wells, a uniform aggregate population can be obtained.
  • a multi-well plate U bottom, V bottom, M bottom
  • the concentration of the cells in the step (2) can be appropriately set so that cell aggregates can be formed more uniformly and efficiently.
  • concentration of the cells in the step (2) can be appropriately set so that cell aggregates can be formed more uniformly and efficiently.
  • suspension culture of human cells eg, cells obtained from human iPS cells in step (1)
  • a solution prepared to be about 8 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 cells is added to the well, and the plate is allowed to stand to form an aggregate.
  • the culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (2) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is for example about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • step (2) when the medium is exchanged, for example, an operation of adding a new medium without discarding the original medium (medium addition operation), about half of the original medium (30 to 90 of the volume of the original medium) % (For example, about 40-60%) discarding and adding about half of the new medium (30-90% of the original medium volume, for example, about 40-60%) (half-volume medium replacement operation)
  • Examples include an operation (total medium replacement operation) of discarding the whole amount (90% or more of the volume of the original medium) and adding a new medium (about 90% or more of the volume of the original medium).
  • a specific component for example, differentiation-inducing factor
  • the medium exchange operation is performed several times a day, preferably several times within one hour (for example, 2 to 3 times). Also good.
  • the cells or aggregates may be transferred to another culture vessel.
  • the tool used for the medium exchange operation is not particularly limited, and examples thereof include a pipetter, a micropipette, a multichannel micropipette, and a continuous dispenser.
  • a pipetter a pipetter
  • a micropipette a micropipette
  • a multichannel micropipette a continuous dispenser.
  • a pipetter a pipetter
  • a micropipette a multichannel micropipette
  • a continuous dispenser for example, when a 96-well plate is used as a culture container, a multichannel micropipette may be used.
  • the suspension culture time required to form cell aggregates can be determined appropriately according to the cells used so that the cells can be uniformly aggregated. A short time is desirable.
  • the process until the dispersed cells reach the formation of cell aggregates is divided into a process in which cells aggregate and a process in which the aggregated cells form cell aggregates. From the time of seeding the dispersed cells (ie, at the start of suspension culture) to the time of cell assembly, for example, in the case of human cells (eg, stem cells obtained from human iPS cells in step (1)), it is preferable Form aggregated cells within about 24 hours, more preferably within about 12 hours.
  • the time from seeding of dispersed cells (ie, at the start of suspension culture) to the formation of cell aggregates is preferably about Within 72 hours, more preferably within about 48 hours.
  • the time until the formation of the aggregates can be appropriately adjusted by adjusting tools for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
  • the formation of the aggregates of cells and the uniformity thereof were determined by the size and number of the aggregates, the macroscopic morphology, the microscopic morphology by tissue staining analysis and the uniformity thereof, the expression of differentiation and undifferentiation markers and the It is possible to make a judgment based on homogeneity, differentiation marker expression control and synchronization, reproducibility between aggregates of differentiation efficiency, and the like.
  • the suspension culture time in step (2) is usually about 24 hours to 6 days, preferably about 24 hours to 3 days, and more preferably about 24 hours to 48 hours.
  • the medium used in step (2) may further contain a sonic hedgehog signal transduction pathway agent.
  • pluripotent stem cells are treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent, and in step (2), the cells obtained in step (1) ,
  • a medium preferably a serum-free medium
  • a Wnt signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agent to form aggregates.
  • undifferentiated cell aggregates for example, round, smooth, non-destructed aggregates of cells that are dense inside and maintain undifferentiated cells
  • the sonic hedgehog signal transduction pathway agent As the sonic hedgehog signal transduction pathway agent, those described above can be used.
  • the sonic hedgehog signaling pathway agent is SAG, Purmorphamine (PMA) or Shh protein.
  • the same type of sonic hedgehog signaling pathway agent as used in step (1) can be used in step (2).
  • the concentration of the sonic hedgehog signal transduction pathway agent in the medium can be appropriately set within a range where the above-described effect can be achieved.
  • the SAG used in step (2) is usually from 1 to 2000 nM, preferably from 10 nM to 1000 nM, more preferably from 10 nM to 700 nM, still more preferably from 50 nM to 700 nM, more preferably from 100 nM to 600.
  • the SAG used in step (2) is usually at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 3 to nM to 100 nM, more preferably 5 to 50 nM, and even more preferably 10 to 30 nM. used.
  • the PMA used in the step (2) is usually used at a concentration of 0.002 to 20 ⁇ M, preferably 0.02 to 2 ⁇ M.
  • the Shh protein used in step (2) is usually used at a concentration of 20 to 1000 ng / ml, preferably 50 to 300 ng / ml.
  • the concentration of sonic hedgehog signal transduction that is equivalent to the above SAG concentration (for example, 5 ⁇ nM to 50 M nM) It is desirable to be used in.
  • the timing of adding the sonic hedgehog signal transduction pathway agent to the medium is not particularly limited as long as the above effect can be achieved, but the earlier the higher the effect.
  • the sonic hedgehog signal transduction pathway agent is usually within 6 days, preferably within 3 days, more preferably within 1 day, more preferably within 12 hours from the start of suspension culture in step (2), more preferably within step It is added to the medium at the start of suspension culture in (2).
  • Sonic hedgehog signaling pathway agonists can be used for any period of time until the end of step (2) (immediately before the addition of BMP signaling pathway agonist) (eg, about 24 hours, about 48 hours, until the end of step (2)) ) May be included in the medium.
  • the sonic hedgehog signaling pathway agent is added at the same time as the Wnt signaling pathway inhibitor and is included in the medium in the step (2) for the same period (eg, until the end of step (2)).
  • the medium used in step (2) may further contain a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor.
  • pluripotent stem cells are treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent, and in the second step, the cells obtained in the first step are treated with Wnt.
  • a signal transduction pathway inhibitor and a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor preferably a serum-free medium
  • a Wnt signal transduction pathway inhibitor, a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist, and a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor By subjecting the cells to suspension culture in a medium (preferably a serum-free medium) to form aggregates, the quality of the aggregates is further improved and aggregates of cells that remain undifferentiated (eg, rounded, It can be expected to form a cell aggregate having a smooth surface, an unbroken shape, a dense aggregate inside and an undifferentiated cell) with high efficiency.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is SB431542 or A83-01.
  • the same type of TGF ⁇ signaling pathway inhibitor as that used in the step (1) can be used.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in the medium can be appropriately set as long as the above-described effect can be achieved.
  • SB431542 is usually used at a concentration of 0.1 to 200 ⁇ M, preferably 2 to 50 ⁇ M, more preferably 3 to 10 ⁇ M.
  • A-83-01 is usually used at a concentration of 0.05 to 50 ⁇ M, preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the timing of adding the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor to the medium is not particularly limited as long as the above effect can be achieved, but the earlier the higher the effect.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is usually within 6 days, preferably within 3 days, more preferably within 1 day, more preferably within 12 hours from the start of suspension culture in step (2), more preferably within step (2). Is added to the medium at the start of suspension culture.
  • the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor can be added at any time (eg, about 24 hours, about 48 hours, step (2) until the end of step (2) (immediately before the addition of the BMP signal transduction pathway agonist). Contained in the medium).
  • the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is added at the same time as the Wnt signaling pathway inhibitor and is included in the medium for the same period (eg, until the end of step (2)).
  • the medium used in step (2) may be substantially free of a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor.
  • the TGF ⁇ signal carried over from step (1) to step (2) when the medium is changed (for example, about the entire amount).
  • TGF ⁇ signaling when the concentration of the pathway inhibitor is suppressed to a level where its biological activity (ie, TGF ⁇ signaling pathway inhibitory activity) is not expressed (for example, SB431542, 5 nM or less) It can be regarded as a medium substantially free of pathway inhibitory substances.
  • substances other than the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor are also interpreted in the same manner.
  • the carryover of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor (eg, SB431542) from step (1) is changed to TGF ⁇ in the medium used in step (1).
  • TGF ⁇ signaling in the medium is suppressed to 3% or less, preferably 1% or less, 0.3% or less, 0.1% or less, 0.03% or less, or 0.01% or less of the concentration of a signal transduction pathway inhibitor (eg, SB431542) TGF ⁇ signaling pathway inhibitor by suppressing the concentration of pathway inhibitor to a level where its biological activity (ie, TGF ⁇ signaling pathway inhibitory activity) is not expressed (for example, 5 nM or less for SB431542) Can be obtained.
  • a signal transduction pathway inhibitor eg, SB431542
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitor by suppressing the concentration of pathway inhibitor to a level where its biological activity (ie, TGF ⁇ signaling pathway inhibitory activity) is not expressed (for example, 5 nM or less for SB431542) Can be obtained.
  • the medium and the container are removed once or several times with the fresh medium after the old medium is removed during medium exchange (for example, medium exchange of the whole amount). By washing together, it can be minimized.
  • the medium used in the step (2) may not substantially contain a sonic hedgehog signal transduction pathway agent.
  • the medium used in step (1) contains a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, it is carried over from step (1) to step (2) during medium replacement (for example, medium replacement of the entire amount).
  • the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agent to the extent that its biological activity (ie, sonic hedgehog signaling pathway activation) is not expressed eg, 0.03 nM or less for SAG
  • it can be considered a medium that is substantially free of sonic hedgehog signaling pathway agents.
  • the carryover of the sonic hedgehog signaling pathway agent from step (1) 3% or less, preferably 1% or less, 0.3% or less, 0.1% or less, 0.03% or less, or 0.01% or less of the concentration of a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, SAG) in the medium used in Suppress the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agent in the medium to the extent that its biological activity (ie, sonic hedgehog signaling pathway activation) is not expressed (for example, 0.03 for SAG
  • the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agent in the medium used in Suppress the concentration of the sonic hedgehog signaling pathway agent in the medium to the extent that its biological activity (ie, sonic hedgehog signaling pathway activation) is not expressed (for example, 0.03 for SAG
  • step (2) the human cells obtained in step (1) (eg, cells obtained from human iPS cells in step (1)) are treated with Wnt signaling pathway inhibitors (eg, CKI). -7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2) is subjected to suspension culture in a serum-free medium to form aggregates.
  • the medium may further contain a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, SAG, PMA, Shh protein) and / or a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (eg, Lefty, SB431542, A-83-01). Good.
  • the addition timing of the Wnt signaling pathway inhibitor and the addition timing of the sonic hedgehog signaling pathway agonist and / or the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor may be the same or different.
  • the Wnt signaling pathway inhibitor, the sonic hedgehog signaling pathway agonist and / or the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor are both contained in the medium from the start of suspension culture.
  • a ROCK inhibitor eg, Y-27632
  • the culture time in step (2) is 24 hours to 6 days, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the aggregate formed is preferably a uniform aggregate.
  • the human cells obtained in step (1) are collected, and the Wnt signal is transferred to a single cell or a state close thereto.
  • Transmission pathway inhibitors eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2
  • Sonic hedgehog signaling pathway agents eg, SAG, PMA, Shh protein
  • a serum-free medium containing a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (eg, Lefty, SB431542, A-83-01) and subject to suspension culture.
  • the serum-free medium may contain a ROCK inhibitor (eg, Y-27632).
  • a suspension of human pluripotent stem cells (eg, human iPS cells) is seeded in the above-mentioned incubator, and the dispersed pluripotent stem cells are cultured under non-adhesive conditions in the incubator.
  • a plurality of pluripotent stem cells are aggregated to form an aggregate.
  • the culture time in step (2) is 24 hours to 6 days, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the aggregate formed is preferably a uniform aggregate.
  • the pluripotent stem cell contains a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist (eg, SAG, PMA, Shh protein).
  • a sonic hedgehog signaling pathway agonist eg, SAG, PMA, Shh protein
  • a Wnt signaling pathway inhibitor eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP- 2
  • sonic hedgehog signaling pathway agonists eg, SAG, PMA, Shh protein
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01
  • suspension culture of the cells obtained in step (1) is carried out in a medium not containing them.
  • SB431542 can be used as a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor.
  • the culture time in step (2) is 24 hours to 6 days, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the aggregate formed is preferably a uniform aggregate.
  • the pluripotent stem cell contains a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, SAG, PMA, Shh protein).
  • a BMP signaling pathway inhibitor eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP- 2
  • sonic hedgehog signaling pathway agonists eg, SAG, PMA, Shh protein
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01
  • suspension culture of the cells obtained in step (1) is carried out in a medium not containing them.
  • LDN193189 or Dorsomorphin more preferably LDN193189 can be used as a BMP signal transduction pathway inhibitor.
  • the culture time in step (2) is 24 hours to 6 days, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the aggregate formed is preferably a uniform aggregate.
  • the pluripotent stem cell contains a sonic hedgehog signaling pathway agent, and contains or contains a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and / or a BMP signaling pathway inhibitor Cultured in a non-culture medium (preferably adhesion culture), and in step (2), a Wnt signaling pathway inhibitor (eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2) Containing sonic hedgehog signaling pathway agonists (eg, SAG, PMA, Shh protein) and / or TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01) Suspension culture of the cells obtained in step (1) is carried out in a medium that does not.
  • SAG can be used as a sonic hedgehog signal transduction pathway agent.
  • the culture time in step (2) is 24 hours to 6 days, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the aggregate formed is preferably a uniform aggregate.
  • pluripotent stem cells eg, human pluripotent stem cells
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors eg, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A- 83-01), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP signaling pathway inhibitors (eg, LDN193189), or combinations thereof (eg, SB431542 and LDN193189), etc.
  • Sonic hedgehog signaling pathway agonist eg, Shh protein, SAG, PMA
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Sonic hedgehog Culturing preferably adhesion culture
  • a medium containing a combination with a signal transduction pathway agent eg, Shh protein, SAG, PMA
  • Wnt signal transduction pathway Medium in one embodiment, substances (eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2) and sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, SAG, PMA, Shh proteins)
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitor eg, SB431542, A-83-01, Lefty
  • Wnt signaling pathway inhibitor eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2
  • sonic hedgehog signaling pathway agonist e
  • pluripotent stem cells eg, human pluripotent stem cells
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors eg, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A- 83-01), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP signaling pathway inhibitors (eg, LDN193189), or combinations thereof (eg, SB431542 and LDN193189), etc.
  • Sonic hedgehog signaling pathway agonist eg, Shh protein, SAG, PMA
  • TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Sonic hedgehog Culturing preferably adhesion culture
  • a medium containing a combination with a signal transduction pathway agent eg, Shh protein, SAG, PMA
  • sonic hedgehog sig Media that contain Wnt signaling pathway inhibitors (eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2)
  • Sonic hedgehog signaling pathway agonists eg, SAG, PMA, Shh proteins
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, SB431542, A-83-01, Lefty
  • Wnt signaling pathway inhibitors Medium eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2): or does not contain sonic hedgehog signaling pathway agents (e
  • a pluripotent stem cell eg, a human pluripotent stem cell
  • a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Sonic Cultivate preferably adherent culture
  • 18 to 30 hours eg, about 24 hours
  • a medium containing a combination of agents acting on hedgehog signaling pathway eg, Shh protein, SAG, PMA
  • Sonic Culturing preferably adhesion culture
  • a medium containing a hedgehog signaling pathway agent eg, Shh protein, SAG, PMA
  • step (2) Does not contain sonic hedgehog signaling pathway agonists (eg, SAG, PMA, Shh protein), Wnt signaling pathway inhibitors (eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP) -2) medium containing: Sonic He Does
  • a pluripotent stem cell eg, a human pluripotent stem cell
  • a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • Sonic Cultivate preferably adherent culture
  • 18 to 30 hours eg, about 24 hours
  • a medium containing a combination of agents acting on hedgehog signaling pathway eg, Shh protein, SAG, PMA
  • Sonic Culturing preferably adhesion culture
  • a Wnt signaling pathway inhibitor eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2
  • a sonic hedgehog signaling pathway agent eg, SAG, PMA, Shh protein
  • the medium in step (2) preferably contains a ROCK inhibitor (eg, Y-27632).
  • the cells obtained in the step (1) or an aggregate of cells derived therefrom are formed.
  • the present invention also provides a method for producing such an aggregate.
  • the aggregate obtained in step (2) has a higher quality than in the case where it is not treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step (1). .
  • the ratio of aggregates that have not collapsed and / or the ratio of aggregates that have not become cysts Is, for example, 70% or more, preferably 80% or more.
  • the aggregate obtained in step (2) has the ability to differentiate into retinal cells and retinal tissue (eg, retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells).
  • retinal tissue eg, retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells.
  • the stem cell (preferably at least) obtained in step (1) has the ability to differentiate into at least retinal cells or retinal tissue (eg, retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells).
  • retinal cells or retinal tissue eg, retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells
  • retinal cells or retinal tissue eg, Oct3 / 4-positive stem cells capable of differentiating into retinal tissue, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific neurons
  • Aggregates containing stem cells (preferably Oct3 / 4 positive stem cells) having the ability to differentiate into systemic cells and retinal tissues (eg, retinal tissues, retinal progenitor cells, or retinal layer-specific nerve cells) can be obtained.
  • stem cells and retinal tissue can be induced with high efficiency.
  • the aggregate obtained in step (2) includes cells that retain the pluripotent-like properties obtained at the end of step (1) (specifically, expressing Oct3 / 4), Cells corresponding to intermediate-stage cells between retinal cells and retinal tissue are included.
  • the cells include (i) pluripotency marker Oct3 / 4, and (ii) ⁇ retinal cell markers (Rx, PAX6, Chx10, Crx, Blimp1) and / or retinal layer-specific neuronal markers. Either is expressed.
  • the aggregate obtained in step (2) includes (i) pluripotency property marker Oct3 / 4, and (ii) ⁇ retinal cell markers (Rx, PAX6, Chx10, Crx, Blimp1 And / or a mixture of cells expressing any of the aforementioned retinal layer-specific neuronal markers. That is, the aggregate obtained in the step (2) includes at least stem cells having the ability to differentiate into retinal cells or retinal tissues and / or progenitor cells of retinal cells or retinal tissues. The progenitor cells are characterized by having the ability to express the above-mentioned retinal cells or retinal layer-specific neuronal markers when cultured under known appropriate culture conditions.
  • the aggregate obtained in step (2) includes Oct3 / 4-positive stem cells having the ability to differentiate into at least retinal cells or retinal tissues, and / or progenitors of retinal cells or retinal tissues. Contains cells. A part of the cells contained in the aggregate obtained in the step (2) may express the above-mentioned retinal layer-specific cell marker. In one embodiment, the ratio of Oct3 / 4 positive in the total cells contained in the aggregate obtained in step (2) may be 50% or more, for example 70% or more.
  • Step (3) The step (3) of inducing an aggregate containing retinal cells or retinal tissue from the aggregate obtained in the step (2) will be described.
  • the medium (basal medium) used in step (3) is not particularly limited, and the basal medium described in the above definition can be appropriately selected.
  • the medium used in step (3) is, for example, a serum-free medium or a serum medium (preferably a serum-free medium) to which a BMP signal transduction pathway agent is added.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a commercially available serum substitute such as KSR for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1 in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12
  • KSR for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1 in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12
  • monothioglycerol and 1 x Chemically Lipid Concentrate for example, in the case of human pluripotent stem cells (eg, iPS cells), the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%. .
  • the medium used in step (3) can be used as it is, or a new medium (preferably, no serum-free medium) can be used. Serum medium) can also be substituted.
  • the BMP signal transduction pathway agent may be added to the medium.
  • BMP signal transduction pathway agonists used in step (3) include BMP proteins such as BMP2, BMP4 or BMP7, GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, or BMP partial peptides.
  • BMP2 protein, BMP4 protein and BMP7 protein are available from, for example, R & D® Systems, and GDF7 protein is available from, for example, Wako Pure Chemical Industries.
  • the BMP signaling pathway agent is preferably BMP4.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agonist may be any concentration that can induce differentiation of cells forming pluripotent stem cell aggregates into retinal cells.
  • a concentration of about 0.01 nM to about 1 nM, preferably about 0.1 nM to about 100 nM, more preferably about 1 nM to about 10 nM, more preferably about 1.5 nM (55 ng / mL) Add to the medium so that When using a BMP signal transduction pathway agent other than BMP4, it is desirable to use it at a concentration that exhibits BMP signal transduction promoting activity equivalent to the concentration of BMP4.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent in the medium may be varied during the step (3).
  • the BMP signaling pathway agonist may be within the above range, and the concentration may be decreased gradually or stepwise at a rate of 40-60% reduction every 2-4 days. Good.
  • concentration may be decreased gradually or stepwise at a rate of ⁇ 60% reduction.
  • the BMP signal transduction pathway agent may be added after about 24 hours from the start of suspension culture in step (2), and should be added to the medium within several days (for example, within 15 days) after the start of suspension culture. Also good.
  • the substance acting on the BMP signaling pathway is from 1st to 15th day after the start of suspension culture in step (2), preferably from 1st to 9th day, from 1st to 8th day, Add from day 1 to day 7, day 1 to day 6, day 1 to day 5, or day 1 to day 4, more preferably day 1 to day 3.
  • “N days after the start of suspension culture in step (2)” means N + 1 days ((N + 1) from N days (N ⁇ 24 hours later) after the start of suspension culture in step (2). ⁇ 24 hours) Means the period until just before the lapse.
  • the second day after the start of the step (2) means from 48 hours after the start of suspension culture in the step (2) until just before 72 hours.
  • a part or all of the medium is replaced with a medium containing BMP4, and the end of BMP4 is completed.
  • the concentration can be adjusted to about 1 to 10 nM and cultured in the presence of BMP4, for example, for 1 to 12 days, preferably 2 to 9 days, more preferably 2 to 5 days.
  • a part or all of the medium can be replaced with a medium containing BMP4 about once or twice.
  • concentration of BMP4 can also be reduced in steps.
  • the BMP signal transduction pathway agent is added to the medium and the differentiation induction of the cells forming the aggregate into the retinal cells is started, it is not necessary to add the BMP signal transduction pathway agent to the medium.
  • Medium exchange may be performed using a serum-free medium or serum medium that does not contain a substance acting on the transmission pathway.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent in the medium is changed by medium exchange with a serum-free medium or serum medium not containing the BMP signal transduction pathway agent. Decrease gradually or stepwise at a rate of 40-60% reduction for ⁇ 4 days.
  • retinal progenitor cell marker genes eg, Rx gene (aka Rax), Pax6 gene, Chx10 gene
  • BMP signaling pathway at a concentration necessary for inducing differentiation into retinal cells using aggregates formed in step (2) using pluripotent stem cells in which a fluorescent reporter protein gene such as GFP is knocked into the Rx locus It is also possible to confirm the time when differentiation induction into retinal cells was initiated by suspension culture in the presence of an agent and detecting fluorescence emitted from the expressed fluorescent reporter protein.
  • the aggregate formed in the step (2) is used until a cell expressing a retinal progenitor cell marker gene (eg, Rx gene, Pax6 gene, Chx10 gene) begins to appear.
  • an operation of adding a new medium without discarding the original medium for example, an operation of adding a new medium without discarding the original medium (medium addition operation), about half of the original medium (40-80 of the volume of the original medium) Discard and discard about half the amount of new medium (40-80% of the original medium volume) (half-volume medium replacement operation), about the entire original medium (90% or more of the original medium volume)
  • an operation (total medium replacement operation) of discarding and adding a new medium to the entire amount (90% or more of the volume of the original medium) can be given.
  • a specific component for example, BMP4
  • discard about half of the original medium and concentrate the specific component at a concentration higher than the final concentration specifically, An operation of adding about a half amount of a new medium containing 1.5 to 3.0 times the final concentration (for example, a concentration about twice the final concentration) (half-volume medium replacement operation, half-volume medium exchange) may be performed.
  • the medium exchange operation is performed several times a day, preferably several times within one hour (for example, 2 to 3 times). Also good.
  • the cells or aggregates may be transferred to another culture vessel.
  • the tool used for the medium exchange operation is not particularly limited, and examples thereof include a pipetter, a micropipette, a multichannel micropipette, and a continuous dispenser.
  • a pipetter a pipetter
  • a micropipette a micropipette
  • a multichannel micropipette a continuous dispenser.
  • a pipetter a pipetter
  • a micropipette a multichannel micropipette
  • a continuous dispenser for example, when a 96-well plate is used as a culture container, a multichannel micropipette may be used.
  • the concentration of the Shh signal transduction pathway agent added to the medium in step (2) is relatively low (for example, SAG is 300 nM or less, preferably 30 nM or less, more preferably 3 nM or less, other For Shh signal transduction pathway agonists, it is not necessary to change the medium in the case of Shh signal transduction activity equal to or lower than the above-mentioned concentration of SAG, and BMP signal transduction in the medium used in step (2) Substances (eg BMP4) may be added.
  • SAG is 300 nM or less, preferably 30 nM or less, more preferably 3 nM or less
  • BMP signal transduction in the medium used in step (2) Substances (eg BMP4) may be added.
  • the concentration of the substance acting on the Shh signal transduction pathway is relatively high (for example, more than 700 nM for SAG or 1000 nM or more, and for other substances acting on the Shh signal transduction pathway, the Shh signal is equivalent to the SAG at the above concentration.
  • the Bhh signaling acting substance eg, BMP4
  • the Shh signal It is desirable to replace the medium with a fresh medium that does not contain a transmission pathway agent.
  • the concentration of the Shh signaling pathway agent in the medium used in step (3) is not more than a concentration that does not adversely affect selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue.
  • a concentration that does not adversely affect selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue is not more than a concentration that does not adversely affect selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue.
  • the Shh signal transduction promoting activity of SAG 700 nM or less, preferably 300 nM or less, more preferably 10 nM or less, still more preferably 0.1 nM or less, and even more preferably, an Shh signal transduction pathway agent. It does not contain substantially.
  • a medium that does not substantially contain an Shh signaling pathway agent means that the concentration of the Shh signaling pathway agent in the medium expresses its biological activity (ie, activation of the sonic hedgehog signaling pathway) It means a medium that has been suppressed to a level that does not (for example, 0.03 nM or less in the case of SAG).
  • a medium that is not supplemented with an Shh signaling pathway agent includes a medium that is substantially free of an Shh signaling pathway agent, such as its biological activity (ie, sonic hedgehog signaling pathway). Also included is a medium in which the concentration of the Shh signaling pathway agent is not added to such an extent that the activation) is expressed, that is, it has an adverse effect on selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue.
  • step (3) in the presence or absence of a Wnt signaling pathway inhibitor, the aggregate obtained in step (2) is transformed into a medium containing a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4) (preferably Are cultured in a serum-free medium). That is, the medium used in step (3) may or may not contain a Wnt signaling pathway inhibitor in addition to a BMP signaling pathway agonist (eg, BMP4).
  • the aggregate obtained in step (2) is cultured in a medium (preferably serum-free medium) containing a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4) in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • the medium (preferably serum-free medium) used in step (3) includes a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4) and a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • any of the aforementioned Wnt signaling pathway inhibitors can be used, but preferably the same type of Wnt signaling pathway inhibitor used in step (2). Used in step (3).
  • the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor may be any concentration that can induce retinal progenitor cells and retinal tissue.
  • the concentration is about 0.1 to about 100 ⁇ M, preferably about 0.3 to about 30 ⁇ M, more preferably about 1 to about 10 ⁇ M, and more preferably about 3 to about ⁇ M.
  • Add to medium When a Wnt signal transduction pathway inhibitor other than IWR-1-endo is used, it is desirable to use it at a concentration exhibiting Wnt signal transduction pathway inhibitory activity equivalent to the concentration of IWR-1-endo.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor in the medium of step (3) is preferably 50 to 150, more preferably 80, when the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor in the medium of step (2) is 100. It is more preferably 120 to 120, more preferably 90 to 110, and more preferably the same as the concentration of the Wnt signal transduction pathway inhibitor in the medium of step (2).
  • the timing of adding the Wnt signal transduction pathway inhibitor to the medium is not particularly limited as long as aggregate formation including retinal cells or retinal tissue can be achieved, but it is preferably as early as possible.
  • a Wnt signaling pathway inhibitor is added to the medium at the start of step (3). More preferably, after the Wnt signal transduction pathway inhibitor is added in step (2), it is also contained in the medium continuously in step (3) (that is, from the start of step (3)). More preferably, after the Wnt signal transduction pathway inhibitor is added at the start of suspension culture in step (2), it is also continuously contained in the medium in step (3).
  • a BMP signaling agent eg, BMP4 may be added to the culture obtained in step (2) (a suspension of aggregates in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor).
  • the period for which the Wnt signal transduction pathway inhibitor is allowed to act is not particularly limited as long as the above effect can be achieved.
  • the step Starting from the start of suspension culture in (2) 2 days to 30 days, more preferably 6 days to 20 days, 8 days to 18 days, 10 days to 18 days, or 10 days to 17 days (for example, 10 days Days).
  • the period of time that the Wnt signaling pathway inhibitor is acted on is counted from the start of suspension culture in step (2) when the Wnt signaling pathway inhibitor is added at the beginning of suspension culture in step (2).
  • it is preferably 3 days to 15 days (eg, 5 days, 6 days, 7 days), more preferably 6 days to 10 days (eg, 6 days).
  • the medium used in step (3) may further contain a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor.
  • a medium containing a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is used in the suspension culture in step (2), it is preferable to use a medium containing a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in step (3).
  • any of the aforementioned TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitors can be used, but preferably the same type of TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor used in step (2) is used. Used in step (3).
  • the concentration of the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor may be any concentration that can induce retinal progenitor cells and retinal tissue.
  • it is usually used at a concentration of 0.1 to 200 ⁇ M, preferably 2 to 50 ⁇ M, more preferably 3 to 10 ⁇ M.
  • A-83-01 is usually used at a concentration of 0.05 to 50 ⁇ M, preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor other than SB431542 or A-83-01 it is desirable to use a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor that is equivalent to the concentration of SB431542.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in the medium of step (3) is preferably 50 to 150, more preferably 80, when the concentration of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in the medium of step (2) is 100. It is more preferably 120 to 120, more preferably 90 to 110, and more preferably equal to the concentration of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in the medium of step (2).
  • the timing of addition of the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor to the medium and the duration of action are not particularly limited as long as aggregate formation including retinal cells or retinal tissues can be achieved, but preferably at the start of suspension culture in step (2)
  • a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is added, 2 days to 30 days, more preferably 6 days to 20 days, 8 days to 18 days, 10 days from the start of suspension culture in step (2) 18 days, or 10 days to 17 days (eg, 10 days).
  • the addition timing and the exposure period of the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor are the same as the addition timing and action period of the Wnt signaling pathway inhibitor described above. That is, in this embodiment, the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is added to the medium at the same time as the Wnt signal transduction pathway inhibitor, and is contained in the medium synchronous with the Wnt signal transduction pathway inhibitor.
  • step (1) pluripotent stem cells were treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent, and obtained in step (1) in step (2).
  • Cells are cultured in a medium (preferably serum-free medium) containing a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, or a Wnt signaling pathway inhibitor, a sonic hedgehog signaling pathway agonist and a TGF ⁇ signaling pathway
  • Aggregates are formed by suspension culture in a medium containing inhibitor (preferably a serum-free medium).
  • the aggregate obtained in step (2) is converted into a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • the medium is cultured in a medium (preferably a serum-free medium) containing an agent acting on the BMP signal transduction pathway (eg, BMP4).
  • a medium preferably a serum-free medium
  • the medium (preferably serum-free medium) used in step (3) includes a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4), a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, and a Wnt signaling pathway inhibitor. It is.
  • the medium of step (3) is substantially free of exogenous BMP signaling agent, and contains sonic hedgehog signaling pathway agent and serum.
  • the suspension culture can be continued.
  • pluripotent stem cells are treated with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent, and in step (2), the cells obtained in step (1)
  • a medium containing or not containing a Wnt signaling pathway inhibitor preferably a serum-free medium, which may further contain a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agent
  • the suspension obtained in step (2) is subjected to suspension culture to form aggregates, and the aggregate obtained in step (2) is a medium containing a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4) (preferably a serum-free medium, Wnt signaling After incubation for a period of time in a pathway inhibitor and / or a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (which may further comprise a TGF
  • the medium is a medium (preferably a serum-free medium) containing a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4), a Wnt signaling pathway inhibitor and / or TGF ⁇ . It may be replaced with a medium containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent and serum substantially free from an exogenous BMP signal transduction agent.
  • a BMP signaling pathway agent eg, BMP4
  • serum for example, bovine serum, calf serum, fetal bovine serum, horse serum, foal serum, horse fetal serum, rabbit serum, fetal rabbit serum, rabbit fetal serum, human serum such as human serum, and the like can be used.
  • the serum concentration is about 1 to 30%, preferably about 3 to 20%, more preferably around 10%.
  • an appropriate amount of a serum substitute such as commercially available KSR may be used instead of serum.
  • any of the aforementioned sonic hedgehog signal transduction pathway agents can be used, and SAG is preferred.
  • SAG is added usually at a concentration of about 0.1 to 10 ⁇ M, preferably about 10 to 1 ⁇ M, more preferably about 100 to nM.
  • the concentration of the BMP signal transduction agent (eg, BMP4) carried over from step (3) is such that its biological activity (ie, BMP signal transduction) is not expressed (for example, the concentration of BMP4 is BMP4).
  • BMP4 the concentration of BMP4 is BMP4.
  • the carryover of the BMP signal transduction agent (eg, BMP4) from step (3) is carried out, and BMP signaling in the medium used in step (3)
  • the concentration of the active substance (eg, BMP4) is suppressed to 3% or less, preferably 1% or less, 0.3% or less, 0.1% or less, 0.03% or less, or 0.01% or less.
  • the exchange to a medium that is substantially free of exogenous BMP signaling agent and contains sonic hedgehog signaling pathway agent and serum is 7 days after the start of suspension culture (step (2)) After the first day, more preferably after the ninth day (for example, the tenth day).
  • the exchange with a medium containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent and serum may be at a time when neuroepithelium begins to form. The formation of the neuroepithelium can be confirmed by observing the arrangement and morphology of the cells through bright field image observation using a microscope.
  • the medium is cultured for 3 to 20 days, preferably 5 to 15 days, and 7 to 10 days after replacement with a medium containing a sonic hedgehog signaling pathway agent and serum.
  • the suspension culture is performed in the absence of a basement membrane preparation through the steps (2) and (3).
  • the culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (3) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the present invention provides a method for producing an aggregate containing such retinal progenitor cells.
  • the fact that aggregates containing retinal progenitor cells have been obtained can be confirmed, for example, by detecting that cells expressing Rx, PAX6 or Chx10, which are markers of retinal progenitor cells, are contained in the aggregates. it can.
  • the aggregate formed in the step (2) is used at a concentration necessary for inducing differentiation into retinal cells until cells expressing the Rx gene begin to appear.
  • Examples include a step of suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing a BMP signaling pathway agent to obtain an aggregate containing retinal progenitor cells.
  • 20% or more (preferably 30%, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more) of the cells contained in the aggregate have Rx
  • the culture in the step (3) is performed until the state is expressed.
  • the Rx-expressing cell preferably co-expresses Chx10.
  • the aggregate obtained in step (3) includes retinal tissue and substantially does not include head non-neural ectoderm.
  • aggregates containing retinal tissue and substantially free of head non-neuronal ectoderm for example, in the immunostained image of the above-mentioned aggregate frozen section, Rx-positive tissue is observed, and RX-negative tissue is present outside of it. Not observed.
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • Serum-free medium containing an inhibitor eg SB431542, A-83-01
  • bFGF preferably 2 to 96 hours, 6 to 72 hours, 6 to 60 hours, 12 to 60 hours, 18 to 60 hours, 18 Adherent culture is performed for ⁇ 48 hours or 18 to 28 hours (eg, 24 hours)
  • the cells obtained in step (1) are treated with a Wnt signaling pathway inhibitor (eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2), suspended in a serum-free medium containing or not containing a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, SAG, PMA, Shh protein),
  • the aggregate is converted to a Wnt signaling pathway inhibitor (eg, CKI-7, D4476,
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • BMP signal in the absence of feeder cells.
  • the Wnt signaling pathway inhibitor eg, CKI-7, D4476, IWR-1-endo (IWR1e), IW
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • Serum-free medium containing a signal transduction pathway agent eg, SAG, PMA
  • bFGF preferably 2 to 96 hours, 6 to 72 hours, 6 to 60 hours, 12 to 60 hours, 18 to 60 hours, 18 to Adhesive culture is performed for 48 hours or 18 to 28 hours (eg, 24 hours)
  • the cells obtained in step (1) are transformed into Wnt signaling pathway inhibitors (eg, CKI-7, D4476).
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • TGF ⁇ family signaling eg, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP signals Transmission pathway inhibitors (eg, LDN193189) or combinations thereof (eg, SB431542 and LDN193189); Sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, Shh protein, SAG, PMA); or TGF ⁇ family signaling pathway inhibition A combination of a substance (eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) and a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, Shh protein, SAG, PMA); and serum-free medium containing bFGF
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01
  • endo IWR1e
  • BMP4 BMP4
  • the medium of step (2) preferably contains a ROCK inhibitor (eg, Y-27632).
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • TGF ⁇ family signaling Combinations with pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) and sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, Shh protein, SAG, PMA); and serum-free medium containing bFGF
  • pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • sonic hedgehog signaling pathway agents eg, Shh protein, SAG, PMA
  • serum-free medium containing bFGF adhere for 18 to 30 hours (eg, about 24 hours), and then 18 hours in serum-free medium containing Sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, Shh protein, SAG, PMA) and bFGF
  • the cells obtained in step (1) are treated with Wnt signaling pathway inhibitors (eg, CKI-7, D4476, IWR-1 -endo (IWR1e), IWP-2) Suspension culture
  • Retinal cells cultured in suspension in a serum-free medium containing a signal transduction pathway agent eg, BMP4 (with or without a TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor (eg, Lefty, SB431542, A-83-01)
  • a signal transduction pathway agent eg, BMP4
  • TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor eg, Lefty, SB431542, A-83-01
  • Aggregates containing eg, retinal progenitor cells, retinal layer specific neurons
  • the medium of step (2) preferably contains a ROCK inhibitor (eg, Y-27632).
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • TGF ⁇ family signaling eg, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP signals Transmission pathway inhibitors (eg, LDN193189) or combinations thereof (eg, SB431542 and LDN193189); Sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, Shh protein, SAG, PMA); or TGF ⁇ family signaling pathway inhibition A combination of a substance (eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) and a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, Shh protein, SAG, PMA); and serum-free medium containing bFGF
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • human pluripotent stem cells eg, human iPS cells
  • TGF ⁇ family signaling eg, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), Nodal / Activin signaling pathway inhibitors (eg, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP signals Transmission pathway inhibitors (eg, LDN193189) or combinations thereof (eg, SB431542 and LDN193189); Sonic hedgehog signaling pathway agents (eg, Shh protein, SAG, PMA); or TGF ⁇ family signaling pathway inhibition A combination of a substance (eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) and a sonic hedgehog signaling pathway agent (eg, Shh protein, SAG, PMA); and serum-free medium containing bFGF
  • TGF ⁇ signaling pathway inhibitors eg, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189
  • the obtained aggregate containing retinal progenitor cells may be used as it is as a reagent for evaluating toxicity and drug efficacy.
  • High-purity retinal progenitor cells can be obtained by dispersing aggregates containing retinal progenitor cells (for example, trypsin / EDTA treatment or papain treatment) and sorting the resulting cells using FACS or MACS It is.
  • the retinal progenitor cells are further differentiated by continuously culturing the aggregates containing the retinal progenitor cells obtained in the above steps (1) to (3) in a serum-free medium or a serum medium, and the neuroepithelial structure-like Retinal tissue can be produced.
  • the medium is not particularly limited, and the basal medium described in the above definition can be appropriately selected.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum medium supplemented with 10% fetal bovine serum, N2 supplement, 100 ⁇ M taurine, and 500 nM 500 retinoic acid in DMEM-F12 medium or a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a serum substitute such as commercially available KSR (for example, IMDM And a medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M ⁇ ⁇ 1-monothioglycerol and 1 x Chemically Defined Lipid) Concentrate to a 1: 1 mixture of F-12 and F-12.
  • the culture time for inducing retinal tissue from retinal progenitor cells varies depending on the target retinal layer-specific neurons, but is, for example, about 7 days to about 200 days.
  • the retinal tissue exists so as to cover the surface of the aggregate. After the suspension culture is completed, the aggregate is fixed using a fixative such as a paraformaldehyde solution, a frozen section is prepared, and then it is confirmed by immunostaining that a retinal tissue having a layer structure is formed. . Since retinal progenitor cells (visual cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells) that make up each layer are different in retinal tissue, using antibodies against the above-mentioned markers expressed in these cells The layer structure can be confirmed by immunostaining. In one embodiment, the retinal tissue is an Rx or Chx10 positive neuroepithelial structure.
  • the retinal tissue present on the surface of the aggregate it is also possible to physically cut out the retinal tissue present on the surface of the aggregate from the aggregate using tweezers or the like.
  • a nerve tissue other than the retinal tissue may be formed on the surface of each aggregate, a part of the nerve tissue cut out from the aggregate is cut out, and it will be described later that the tissue is a retinal tissue. This can be confirmed by immunostaining method.
  • the aggregate obtained in step (3) includes retinal tissue and substantially does not include head non-neural ectoderm.
  • the aggregate containing retinal tissue and substantially free of head non-neuronal ectoderm for example, in the immunostained image of the above-mentioned aggregate frozen section, an Rx-positive tissue is observed, and an Rx-negative tissue is present outside thereof. Not observed.
  • the aggregation formed in the step (2) is induced to differentiate into retinal cells until cells expressing the Rx gene and / or the Chx10 gene begin to appear.
  • a serum-free medium or serum medium containing a BMP signaling pathway agonist eg, BMP4
  • a concentration necessary for the treatment including a Wnt signaling pathway inhibitor and / or a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor as described above
  • Good to obtain an aggregate containing retinal progenitor cells, and then the aggregate containing the retinal progenitor cells is continuously suspended in serum-free medium or serum medium until retinal tissue is formed.
  • the serum-free medium or serum medium does not contain a BMP signaling pathway agent (eg, BMP4).
  • BMP signal transduction pathway agent concentration contained in the medium to induce retinal progenitor cells is gradually or stepwise reduced at a rate of 40-60% every 2-4 days It may be lowered.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor and / or the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor may be decreased at the same rate as the BMP signaling pathway agonist, but is preferably maintained constant.
  • 20% or more (preferably 30%, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more) of the cells contained in the aggregate contain Chx10 Suspension culture of aggregates containing retinal progenitor cells is performed until expression is achieved.
  • the aggregate obtained in the step (2) or the aggregate obtained by suspension culture of the aggregate obtained in the step (2) by the above method is used for adhesion culture.
  • Serum-free medium or serum containing BMP signaling pathway agonist at a concentration necessary for inducing differentiation into retinal cells until cells expressing Rx gene and / or Chx10 gene begin to appear Adhesion culture is performed in a medium (which may contain a Wnt signaling pathway inhibitor and / or a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor) to obtain an aggregate containing retinal progenitor cells.
  • the aggregate containing the retinal progenitor cells is subsequently adhered and cultured in a serum-free medium or a serum medium until a retinal tissue is formed to obtain an aggregate containing the retinal tissue.
  • 10% or more of the cells preferably 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more express Chx10 Adhesive culture of aggregates containing retinal progenitor cells is performed until a state is reached.
  • the retinal tissue can be obtained from pluripotent stem cells with high efficiency by the production method of the present invention. Since the retinal tissue obtained by the production method of the present invention includes neurons (neurons) specific to each of the retinal layers, photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, or It is also possible to obtain cells constituting the retinal tissue such as these progenitor cells. Which cells are obtained from the obtained retinal tissue can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a cell marker.
  • the obtained aggregate containing the retinal tissue may be used as it is as a reagent for toxicity / drug efficacy evaluation.
  • Aggregates containing retinal tissue are dispersed (for example, trypsin / EDTA treatment), and the cells obtained are sorted using FACS or MACS to obtain high-purity retinal tissue constituent cells, for example, high-purity photoreceptors. It is also possible to obtain.
  • the retinal tissue including the ciliary marginal part-like structure can be produced by A) and the step (B).
  • the cell aggregate containing the retinal tissue obtained in steps (1) to (3) which is 6 to 30 days, 10 to 20 days (10 days) after the start of suspension culture in step (2) (Day 11, Day 12, Day 12, Day 13, Day 14, Day 15, Day 16, Day 17, Day 18, Day 19 or Day 20)
  • 10 to 20 days 10 days
  • the start of suspension culture in step (2) Day 11, Day 12, Day 12, Day 13, Day 14, Day 15, Day 16, Day 17, Day 18, Day 19 or Day 20
  • Cell Aggregate Containing Retina Tissue From the following steps (A) and (B), the ciliary body periphery-like structure can be produced.
  • the ciliary body periphery-like structure in the present specification is a structure similar to the ciliary body periphery.
  • “Ciliary marginal zone (CMZ)” is, for example, a tissue existing in a boundary region between a retinal tissue (specifically, a neural retina) and a retinal pigment epithelium in a biological retina, and A region containing retinal tissue stem cells (retinal stem cells) can be mentioned.
  • the ciliary periphery is also called the ciliary margin or the retinal margin, and the ciliary margin, ciliary margin and retinal margin are equivalent tissues.
  • the peripheral part of the ciliary body plays an important role in supplying retinal progenitor cells and differentiated cells to the retinal tissue, maintaining the retinal tissue structure, and the like.
  • the marker gene for the ciliary margin include Rdh10 gene (positive), Otx1 gene (positive), and Zic1 (positive).
  • the production method of the present invention that is, the cell aggregate containing the retinal tissue obtained in the steps (1) to (3), the presence ratio of Chx10 positive cells in the retinal tissue is 20
  • cells that express the RPE65 gene appear in serum-free medium or serum medium containing Wnt signaling pathway agonists and / or FGF signaling pathway inhibitors, Incubate only during the whole period.
  • a floating culture can be exemplified.
  • serum-free medium used in step (A) examples include a serum-free medium in which N2 or KSR is added to the basal medium. More specifically, N2 supplement (Life Technologies) is added to the DMEM / F12 medium. Mention may be made of added serum-free media.
  • the serum medium examples include a serum medium obtained by adding fetal calf serum to a basal medium.
  • the culture conditions such as the culture temperature and CO 2 concentration in the step (A) may be set as appropriate.
  • the culture temperature include a range of about 30 ° C. to about 40 ° C.
  • the CO 2 concentration include a range of about 1% to about 10%.
  • about 5% can be mentioned.
  • the Wnt signaling pathway agent contained in the medium is mediated by Wnt.
  • Wnt signaling pathway agonists include, for example, proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt receptors, Wnt receptor agonists, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, 6-Bromoindirubin-3 ′ -oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) and the like.
  • the concentration of the Wnt signal transduction pathway agonist contained in the serum-free medium or serum medium of step (A) is, for example, about 0.1 ⁇ M to about 100 ⁇ M in the case of a normal Wnt signal transduction pathway agonist such as CHIR99021.
  • a range can be mentioned.
  • a range of about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M can be mentioned.
  • a concentration of around 3 ⁇ M can be mentioned.
  • the FGF signal transduction pathway inhibitor included in the medium is FGF-mediated signal transduction.
  • FGF signal transduction pathway inhibitors include FGF receptors, FGF receptor inhibitors (eg, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP kinase cascade inhibitors (eg, MEK inhibitors, MAPK inhibitors, ERK inhibition) Agent), PI3 kinase inhibitor, Akt inhibitor and the like.
  • the concentration of the FGF signal transduction pathway inhibitor contained in the serum-free medium or serum medium in the step (A) may be any concentration that can induce differentiation of the aggregate into a ciliary marginal-like structure.
  • concentration of the FGF signal transduction pathway inhibitor contained in the serum-free medium or serum medium in the step (A) may be any concentration that can induce differentiation of the aggregate into a ciliary marginal-like structure.
  • it is added at a concentration of about 0.1 ⁇ M to about 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M, more preferably about 5 ⁇ M.
  • step (A) “culturing only during the period until cells expressing the RPE65 gene appear” means that all or part of the period until cells expressing the RPE65 gene appear It means to cultivate as long as possible.
  • the “cell aggregates containing retinal tissue” present in the culture system is cultured only for the whole period or a part thereof (arbitrary period) composed of cells that do not substantially express the RPE65 gene. What is necessary is just to employ
  • the above-mentioned “cell aggregate including retinal tissue” is used as a sample, and the presence or absence of the RPE65 gene contained in the sample or the degree thereof is determined by a normal genetic engineering technique or a living What is necessary is just to measure using a chemical method. Specifically, for example, the presence or absence of RPE65 gene expression or the degree thereof can be examined by a method of immunostaining a frozen section of the “cell aggregate containing retinal tissue” using an antibody against RPE65 protein.
  • Examples of the “period until the appearance of cells expressing RPE65 gene” in the step (A) include, for example, the presence ratio of Chx10 positive cells in the retinal tissue is a Wnt signaling pathway agonist and / or FGF signaling pathway Examples include a period from the start of culturing of the cell aggregate in a serum-free medium or serum medium containing an inhibitor to a range of 30% to 0%. Examples of “cell aggregates in which cells expressing RPE65 gene do not appear” include cell aggregates in which the abundance of Chx10 positive cells in the retinal tissue is in the range of 30% to 0%.
  • the number of days for the period until the appearance of cells expressing RPE65 gene in step (A) is the type of Wnt signal transduction pathway agonist and / or FGF signal transduction pathway inhibitor, the type of serum-free medium or serum medium Although it varies depending on other culture conditions, for example, it may be within 14 days. More specifically, when a serum-free medium (for example, a serum-free medium in which N2 is added to a basal medium) is used, the period is preferably, for example, within 10 days (for example, the start of step (2) Is within 10 days from about the 20th day, more preferably 3 days to 6 days, for example.
  • the period is preferably, for example, within 12 days (for example, when the start of step (2) is taken as the start date) From about the 20th day, within 12 days), more preferably, for example, from 6 days to 9 days.
  • a “cell aggregate in which cells expressing RPE65 gene do not appear” obtained by culturing as described above, a serum-free medium containing no Wnt signaling pathway agent or Culture in serum medium.
  • Examples of preferable culture in the step (B) include suspension culture.
  • the serum-free medium in step (B) preferably does not contain an FGF signal transduction pathway inhibitor.
  • Examples of the serum-free medium in step (B) include a medium in which N2 or KSR is added to the basal medium.
  • Examples of the serum medium include a medium in which fetal calf serum is added to a basal medium, and more specifically, a serum medium in which fetal bovine serum is added to a DMEM / F12 medium.
  • a known growth factor, an additive that promotes growth, a chemical substance, or the like may be added to the serum-free medium or serum medium in step (B).
  • Known growth factors include EGF, FGF, IGF, insulin and the like.
  • additives that promote proliferation include N2Nsupplement (manufactured by Life Technologies), B27 supplement (manufactured by Life Technologies), KSR (manufactured by Life Technologies), and the like.
  • chemical substances that promote proliferation include retinoids (for example, retinoic acid) and taurine.
  • a preferable culture time of the step (B) is, for example, the start of culture of the cell aggregate in a serum-free medium or serum medium in which the presence ratio of Chx10 positive cells in the retinal tissue does not contain a Wnt signaling pathway agent
  • Examples of the incubation time can be given until the time increases to 30% or more.
  • the start of the step (A) is set as the starting date, from the third day to 3 days to 60 days, preferably about 35 days can be mentioned.
  • the culture conditions such as the culture temperature and CO 2 concentration in the step (B) may be set as appropriate.
  • the culture temperature include a range of about 30 ° C. to about 40 ° C.
  • the CO 2 concentration include a range of about 1% to about 10%, and preferably about 5%, for example.
  • the above culture days until the step (B) “cell aggregates containing ciliary rim-like structures” are obtained vary depending on the type of serum-free medium or serum medium, other culture conditions, etc. For example, it can be listed within 100 days.
  • the culture period is preferably 20 days to 70 days, and more preferably 30 days to 60 days, for example.
  • the retinal pigment epithelium and the ciliary marginal portion-like structure are adjacent to each other.
  • the retinal tissue (specifically, the neural retina) exists in the same cell aggregate.
  • the structure can be confirmed by microscopic observation or the like. Specifically, for example, a ciliary peripheral edge-like structure formed as an epithelial structure formed between a highly transparent retinal tissue and a retinal pigment epithelium where pigmentation can be seen by microscopic observation as a thick retinal side and a thin retinal pigment epithelium side.
  • the presence of the body can be confirmed.
  • the presence of the ciliary peripheral portion-like structure can be confirmed by immunostaining the frozen section of the aggregate as Rdh10 positive, Otx1 positive, or Zic1 positive.
  • differentiation of the retinal tissue (neuroepithelium) contained in the aggregate proceeds by the steps (A) and (B) described above, and photoreceptor precursor cells, photoreceptor cells, cone photoreceptor cells, rod photoreceptor cells
  • a mature retinal tissue comprising at least one, preferably a plurality, more preferably all cells selected from the group consisting of: horizontal cells, interneurons (amacrine cells, ganglion cells, etc.) can do.
  • the retinal tissue containing retinal pigment epithelial cells can be produced by the following step (C) from the cell aggregate containing the retinal tissue obtained in the production method of the present invention, that is, the above steps (1) to (3).
  • a retinal pigment epithelial sheet can be produced by the following step (D).
  • retinal pigment epithelial cell means an epithelial cell existing outside the neural retinal tissue in the living retina. If it is a person skilled in the art, whether it is a retinal pigment epithelial cell, for example, expression of cell markers (RPE65 (mature retinal pigment epithelial cell), Mitf (young or mature retinal pigment epithelial cell), etc.), melanin granules And the characteristic cell shape of the polygon.
  • RPE65 mature retinal pigment epithelial cell
  • Mitf youngng or mature retinal pigment epithelial cell
  • a cell aggregate containing a retinal tissue obtained by the production method of the present invention is contained in a serum-free medium or serum medium containing no WMP signal transduction pathway agent but containing a BMP signal transduction pathway agent.
  • a cell aggregate containing retinal pigment epithelial cells is obtained by the production method of the present invention.
  • serum-free medium used in step (C) examples include serum-free medium in which N2 or KSR is added to the basal medium. More specifically, N2 supplement (Life Technologies) is added to the DMEM / F12 medium. Mention may be made of added serum-free media.
  • the serum medium include a serum medium obtained by adding fetal calf serum to a basal medium.
  • the serum-free medium used in step (C) may contain the aforementioned Nodal / Activin signaling pathway agonist and / or the aforementioned FGF signaling pathway inhibitor in addition to the aforementioned Wnt signaling pathway agonist. .
  • a suspension culture can be exemplified.
  • step (D) in which the aggregate obtained in the step (C) of the present invention is dispersed and the resulting cells are adhered and cultured will be described.
  • Step (D) is performed within 60 days, preferably within 30 days, more preferably 3 days after the start of implementation of step (C).
  • the medium (basal medium) in the step (D) is not particularly limited, and the basal medium described in the above definition can be appropriately selected.
  • the serum-free medium or serum medium used for the adhesion culture in the step (D) include the above-described media.
  • a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a commercially available serum substitute such as KSR for example, a 1/2 x N2 supplement in a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 and Neurobasal, 1 / It is preferable to use a medium supplemented with 2 x B27 supplement and 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol).
  • KSR commercially available serum substitute
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • the cells are preferably cultured in the above-described serum-free medium or serum medium containing the ROCK inhibitor.
  • a serum-free medium further comprising one or more substances selected from the group consisting of a Wnt signaling pathway agonist, an FGF signaling pathway inhibitor, an Activin signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway agonist or More preferably, the cells are cultured in serum medium.
  • Activin signal transduction pathway agonist is a substance that can enhance the signal mediated by Activin.
  • Activin signal transduction pathway agonists include proteins belonging to the Activin family (for example, Activin A, Activin B, Activin C, Activin AB, etc.), Activin receptors, and Activin receptor agonists.
  • the concentration of the Activin signal transduction pathway agent used in step (D) may be any concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • concentration of the Activin signal transduction pathway agent used in step (D) may be any concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • Recombinant Human / Mouse / Rat Activin A R & D systems # 338-AC
  • about 1 ng / ml to about 10 ⁇ g / ml preferably about 10 ng / ml to about 1 ⁇ g / ml, more preferably Add to a concentration of about 100 ng / ml.
  • the Activin signal transduction pathway agent is added, for example, within 18 days from the start of step (D), preferably on the 6th day.
  • step (D) it is preferable to perform adhesion culture on the culture equipment surface-treated with the culture substrate.
  • the culture substrate used for the treatment of the culture equipment in the step (D) include a cell culture substrate that enables adhesion culture of aggregate-derived cells and formation of a retinal pigment epithelial sheet.
  • Step (3) may include the above-mentioned step (A) and step (B) or step (C) and step (D).
  • Retinal tissue or retinal system cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells) produced by the production method of the present invention are used to treat diseases based on disorders of retinal tissue or retinal system cells. Since it is useful as a disease research material and drug discovery material in drug screening and toxicity evaluation, it can be used as a reagent for evaluating the toxicity and efficacy of a test substance.
  • iPS cells are prepared from a human patient with a disease based on a disorder of retinal tissue, particularly a disease based on a hereditary disorder, and the retinal tissue or retinal system cells (eg, Retinal progenitor cells, retinal layer-specific neurons).
  • Retinal tissue or retinal cells can reproduce in vitro retinal tissue disorders that cause the disease the patient is suffering from. Therefore, the present invention is such that a test substance is brought into contact with a retinal tissue or retinal system cell (eg, retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell) produced by the production method of the present invention, and the substance is the cell or the tissue.
  • a retinal tissue or retinal system cell eg, retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell
  • a retinal tissue or a retinal system cell eg, retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell
  • a specific disorder eg, hereditary disorder
  • Culture in the presence or absence negative control
  • the degree of damage in the retinal tissue or retinal system cells treated with the test substance is compared with the negative control.
  • a test substance with a reduced degree of the disorder can be selected as a candidate substance for a therapeutic drug for a disease based on the disorder.
  • a test substance that further improves the physiological activity (eg, survival promotion or maturation) of retinal cells produced by the production method of the present invention can be searched for as a drug candidate substance.
  • an artificial pluripotent stem cell is prepared from a somatic cell having a genetic mutation exhibiting a specific disorder such as retinal disease, and a test substance is added to a retinal cell produced by inducing differentiation of the cell by the production method of the present invention
  • retinal tissue or retinal system cells eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells
  • a test substance negative control
  • the degree of toxicity in the retinal tissue or retinal system cells treated with the test substance is compared with the negative control.
  • the test substance showing toxicity compared to the negative control can be determined as a substance having toxicity against retinal tissue or retinal system cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells).
  • the present invention includes a toxicity evaluation method including the following steps.
  • Step 1 A step of measuring the degree of cell damage after culturing retinal tissue or retinal system cells produced by the production method of the present invention in a viable culture condition for a certain period of time in the presence of a test substance.
  • Step 2 After culturing retinal tissue or retinal system cells produced by the production method of the present invention under viable culture conditions for a certain period of time in the absence of a test substance or in the presence of a positive control, Measuring the degree of injury,
  • Step 3 A step of evaluating the toxicity of the test substance in Step 1 based on the difference between the results measured in (Step 1) and (Step 2).
  • “in the absence of the test substance” includes adding only a medium and a solvent dissolving the test substance instead of the test substance.
  • the “positive control” means a known compound having toxicity.
  • a method for measuring the degree of cell damage a method for measuring the number of living cells, for example, a method for measuring the amount of intracellular ATP, or a method for measuring the number of living cells by cell staining (for example, cell nucleus staining) and morphological observation. Methods and the like.
  • the measured value of step 1 is compared with the measured value of the negative control in step 2, and the test is conducted when the degree of cell damage in step 1 is large. It can be determined that the substance is toxic. Further, the measured value of the step 1 is compared with the measured value of the positive control in the step 2, and it can be determined that the test substance is toxic when the degree of cell damage in the step 1 is equal to or higher than that.
  • compositions comprising an effective amount of retinal tissue or retinal system cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells) produced by the production method of the present invention.
  • retinal tissue or retinal system cells eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells
  • the pharmaceutical composition contains an effective amount of retinal tissue or retinal system cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells) produced by the production method of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • retinal tissue or retinal system cells eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells
  • a physiological aqueous solvent physiological saline, buffer solution, serum-free medium, etc.
  • a preservative, a stabilizer, a reducing agent, an isotonic agent, and the like that are usually used may be added to the medicine containing the tissue or cells to be transplanted.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced as a suspension by suspending retinal tissue or retinal cells produced by the production method with an appropriate physiological aqueous solvent. If necessary, a cryopreservation agent may be added, cryopreserved, thawed at the time of use, washed with a buffer solution, and used for transplantation medicine.
  • the retinal tissue obtained by the production method of the present invention can be cut into an appropriate size using tweezers or the like to form a sheet.
  • the cells obtained by the production method of the present invention can be formed into sheet-like cells by adhesion culture in the step (3) of inducing differentiation to obtain a sheet agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a therapeutic agent for diseases based on disorders of retinal tissue or retinal system cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells).
  • retinal tissue or retinal system cells eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells.
  • Retinal tissues or retinal cells eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells
  • the present invention includes a retinal tissue or retinal system cell (eg, retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell) produced by the production method of the present invention, and a disease based on a disorder of the retinal tissue or retinal system cell.
  • a retinal tissue or retinal system cell eg, retinal progenitor cell, retinal layer-specific nerve cell
  • the retinal tissue or retina produced by the production method of the present invention as a therapeutic agent for a disease based on a disorder of the retinal tissue or retinal system cells, or in order to replenish a corresponding damaged site in a damaged state of the retinal tissue Systemic cells (eg, retinal progenitor cells, retinal layer-specific neurons) can be used.
  • a retinal tissue or retinal system cell produced by the production method of the present invention is transplanted to a patient in need of transplantation, a disease based on a disorder of retinal tissue or retinal system cell, or a damaged state of retinal tissue, and the retinal system By replenishing cells and the damaged retinal tissue itself, diseases based on retinal tissue or retinal system cell damage or retinal tissue damage can be treated.
  • diseases based on retinal tissue or retinal system cell disorders include, for example, ophthalmic diseases macular degeneration, age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, cataract, glaucoma, corneal disease, retinopathy and the like.
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells established from recipient somatic cells eg, induced pluripotent stem cells
  • Self-retinal tissue or retinal system cells are produced and transplanted into the recipient.
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • somatic cells that are compatible with the recipient's immunity (eg, compatible with HLA and MHC types), allo (others) Retinal tissue or retinal system cells
  • allo (others) Retinal tissue or retinal system cells may be produced and transplanted into the recipient.
  • Example 1 Example of production of retinal tissue from human iPS cells using a Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3 after Step 1 (also referred to as Precondition) Human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University) ) was feeder-free cultured according to the method described in Scientific Reports, 4, 3594 (2014).
  • StemFit (registered trademark) medium (AK03N, Ajinomoto Co., Inc.) was used as the feeder-free medium
  • Laminin511-E8 Nappi Co., Ltd.
  • human iPS cells (1231A3 strain) which became sub-confined were first washed with PBS and then dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies). Thereafter, the human iPS cells dispersed in the single cells were seeded in a plastic culture dish coated with Laminin511-E8, and the feeder was used in StemFit (registered trademark) medium in the presence of Y27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M). Culture was performed under free conditions.
  • StemFit registered trademark
  • Y27632 Y27632
  • the number of seeded cells of human iPS cells dispersed in the single cell was 1.0 ⁇ 10 4 did.
  • the stemFit (registered trademark) medium without Y27632 was replaced. Thereafter, the medium was changed once a day or two days with a StemFit (registered trademark) medium not containing Y27632. Then, 6 days after seeding, the cells were cultured until they became sub-confluent (about 60% of the culture area was covered with cells).
  • step 1 The following operation was performed as a specific example of the present manufacturing method step 1 (Precondition).
  • subconfluent human iPS cells (1231A3 strain) were washed with PBS, and then dispersed into single cells using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies). Thereafter, the human iPS cells dispersed in the single cells were seeded in a plastic culture dish (Iwaki) coated with Laminin511-E8, and StemFit (registered trademark) in the presence of Y27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M). ) Feeder-free culture in medium.
  • ROCK inhibitor Y27632
  • the number of seeded cells of the monodispersed human iPS cells was 1.0 ⁇ 10 4 .
  • the number of seeded cells of the monodispersed human iPS cells was 2.0 ⁇ 10 4 .
  • the stemFit (registered trademark) medium without Y27632 was replaced.
  • the medium was changed once a day or two days with a StemFit (registered trademark) medium not containing Y27632.
  • the cells were cultured until 5 days after seeding, that is, until 1 day before sub-confluent (about 50% of the culture area was covered with cells).
  • similar results were obtained even when cultured for 6 days after seeding.
  • the thus prepared human iPS cells not treated with Precondition and human iPS cells treated with Precondition were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies), and further subjected to pipetting. Dispersed in cells. Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is a serum-free medium containing 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Was used.
  • the cells were cultured in a medium not containing a Wnt signal transduction pathway inhibitor.
  • cell aggregates were formed under the preconditioned condition or not (the end of step 2 and the start of step 3).
  • Y27632 is included so that the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.54nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e does not change
  • the cell aggregates on the 17th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. These frozen sections are immunized against Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), one of the retinal tissue markers, or Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha, sheep), one of the retinal tissue markers. Staining was performed. These immunostained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (Keyence Co., BIOREVO) (FIG. 2).
  • nerve tissue was formed under any other conditions compared to the fact that almost no nerve tissue was formed under the conditions where no precondition was performed and no Wnt inhibitor was added in steps 2 and 3. I understood.
  • retinal tissue formation was slightly increased in the conditions in which Wnt signaling pathway inhibitor was added in Steps 2 and 3 without performing Precondition. It was found that there was a tendency to be promoted (Fig. 1A, B, Fig. 2A, B, E, F).
  • Example 2 Example of production of retinal tissue from human iPS cells preconditioned with a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor added in steps 2 and 3 human iPS cells (1231A3 Example 1 using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold. Feeder-free culture was carried out by the method described above.
  • Stem Fit registered trademark
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • Precondition-treated human iPS cells prepared in this way and human iPS cells under non-precondition conditions were each treated with cell dispersion using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies) and further subjected to pipetting. Dispersed in cells. Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium and cultured in the serum-free medium of the following five conditions 1-5. ⁇ Condition 1. Conditions that are not preconditioned in step 1 and that no exogenous Wnt signaling pathway inhibitor and exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist are added to the serum-free medium at the start of step 2. ( Figure 3A).
  • Condition 2 Precondition treatment in step 1 and no addition of exogenous Wnt signaling pathway inhibitor and exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist to the serum-free medium at the start of step 2 ( Figure 3B).
  • ⁇ Condition 3 Precondition treatment in Step 1 and addition of IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2 and exogenous sonic hedge Conditions without the addition of Hog signaling pathway agonists ( Figure 3C).
  • ⁇ Condition 4 Precondition treatment in step 1, and no exogenous Wnt signaling pathway inhibitor is added to the serum-free medium at the start of step 2, and a sonic hedgehog signaling pathway agonist As SAG (30 nM) was added (FIG. 3D).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e does not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing or not containing IWR-1e was added. Thereafter, once every 2 to 4 days, so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change, the medium does not contain Y27632, SAG and human recombinant BMP4, and further contains IWR-1e or does not contain the above serum-free medium. Then, a half-volume medium exchange operation was performed.
  • the cell aggregates on the 17th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. These frozen sections are immunized against Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), one of the retinal tissue markers, or Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha, sheep), one of the retinal tissue markers. Staining was performed. These immunostained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (Keyence Co., BIOREVO) (FIG. 4).
  • the ratio of Rx positive cells in all cells was about 60% in the cell aggregate prepared under the condition 4 in which the SAG was preconditioned in the step 1 and SAG was added in the step 2 ( ( Figure 4C). From the analysis of serial sections, it was found that Rx positive cells were Chx10 co-positive retinal tissue in the cell aggregates prepared under the above conditions (FIG. 4G). On the other hand, in the cell aggregate prepared under condition 5 where SAG was preconditioned in step 1, SAG was added in step 2, and IWR-1e was added in steps 2 and 3, Rx positive cells in all cells The ratio was about 90% (Fig. 4D). From the analysis of serial sections, it was found that Rx positive cells were Chx10 co-positive retinal tissue in the cell aggregate prepared under the above conditions (FIG. 4H).
  • retinal tissue can be formed with an efficiency of about 90%.
  • Example 3 Example of production of retinal tissue from human iPS cells, preconditioned with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in step 1 and added with a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, human iPS cells (1231A3 strain) , Obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium, and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold, as described in Example 1. Feeder-free culture was performed by this method.
  • SB431542 TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M was added to human iPS cells one day before sub-confinence cultured in feeder-free manner in this way, and exogenous sonic hedgehog signaling Conditions without the addition of pathway agonists (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i) treatment, Fig. 5 “Precondition: TGF ⁇ R-i”), or SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh), 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, Fig. 5 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit ( Feeder-free culture was performed for 1 day using (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • the precondition (TGF ⁇ R-i) -treated human iPS cells and the precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells thus prepared were subjected to cell dispersion using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies). The solution was treated and further dispersed into single cells by pipetting. Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium of the following three conditions 1 to 3. ⁇ Condition 1.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of the above serum-free medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added.
  • half the amount in the above serum-free medium without Y27632, SAG and human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change A medium exchange operation was performed.
  • the cells thus prepared on the 17th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under any condition 1-3.
  • Chx10-positive cells were Rx co-positive retinal tissues. That is, it was found that retinal tissue can be efficiently formed from human iPS cells under the conditions that a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor was used in Step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor was added in Step 2 and Step 3. .
  • Example 4 Example of production of retinal tissue from human iPS cells, preconditioned with a BMP signaling pathway inhibitor in step 1 and added with a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, human iPS cells (1231A3 strain) , Obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium, and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold, as described in Example 1. Feeder-free culture was performed by this method.
  • Step 1 Precondition (BMPR-i) treatment, Fig. 6 “Precondition: BMPR-i”), or LDN193189 (BMP signaling pathway inhibitor, 100 nM, BMPR-i) and Stem Fit in the presence of SAG (Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent (Shh), 300 nM)
  • Step 1 Precondition (BMPR-i + Shh) treatment, Fig. 6 “Precondition: BMPR-i + Shh”
  • Feeder-free culture was performed for 1 day using (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • Precondition (BMPR-i) -treated human iPS cells and Precondition (BMPR-i + Shh) -treated human iPS cells thus prepared were subjected to cell dispersion using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies). The solution was treated and further dispersed into single cells by pipetting. Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium of the following three conditions 1 to 3. ⁇ Condition 1.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of the above serum-free medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added.
  • half the amount in the above serum-free medium without Y27632, SAG and human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change A medium exchange operation was performed.
  • the cells thus prepared on the 17th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under any condition 1-3.
  • Chx10-positive cells were Rx co-positive retinal tissues. That is, it was found that a retinal tissue can be efficiently formed from human iPS cells under the conditions in which a BMP signaling pathway inhibitor was used in Step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor was added in Step 2 and Step 3. .
  • Example 5 Preconditioning using a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and / or a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1, adding a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3,
  • Example of production of retinal tissue from human iPS cells using sonic hedgehog signaling pathway agonists and serum after adding BMP signaling pathway agonists to human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University), feeder Feeder-free culture was carried out by the method described in Example 1, using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as the free medium and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as the feeder-free scaffold.
  • Stem Fit registered trademark
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • Step 1 Precondition (Shh) treatment, Figure 7 “Precondition: Shh”), SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling) Stem Fit (registered trademark) medium
  • Step 1 Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, FIG.
  • the human iPS cells treated with Precondition (Shh) or Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) prepared in this way are treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and pipetting. Dispersed into single cells by manipulation. Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium, and the mixture was cultured in the serum-free medium of the following four conditions 1 to 4. ⁇ Condition 1.
  • precondition (Shh) treatment in step 1 IWR-1e (3 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and exogenous sonic Conditions where the hedgehog signaling pathway agent was not added (FIG. 7A).
  • ⁇ Condition 2 IWR-1e (3 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and Sonic hedgehog signal Conditions in which SAG (30 nM) was added as a transmission pathway agent (FIG. 7B).
  • ⁇ Condition 3 IWR-1e (3 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and Sonic hedgehog signal Conditions in which SAG (30 nM) was added as a transmission pathway agent.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of the above serum-free medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added.
  • half the amount in the above serum-free medium without Y27632, SAG and human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change A medium exchange operation was performed.
  • the Shh serum medium in which SAG (100 nM) as a sonic hedgehog signaling pathway agent and fetal bovine serum (10%) as serum were added to the serum-free medium (Fig. 7)
  • SAG 100 nM
  • fetal bovine serum 10% as serum
  • the Shh serum medium was replaced. Thereafter, once in 2 to 4 days, a half-volume medium was exchanged with the Shh serum medium.
  • the cells thus prepared on the 17th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under any condition 1-4.
  • Chx10-positive cells were Rx co-positive retinal tissues. That is, preconditioning in step 1, adding Wnt signaling pathway inhibitor in step 2 and step 3, adding BMP signaling agent in step 3, and then culturing in Shh serum medium, from human iPS cells It was found that retinal tissue can be formed efficiently.
  • Example 6 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3,
  • a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3
  • Example of production of retinal tissue from human iPS cells Human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as the feeder-free medium, and Laminin511- Using E8 (Nippi), feeder-free culture was carried out by the method described in Example 1.
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, Fig. 8 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i TGF ⁇ signaling pathway inhibitor
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells thus prepared were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium, and the mixture was cultured in the serum-free medium of the following four conditions 1 to 4.
  • ⁇ Condition 1 IWR-1e (3 ⁇ M) is added as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and no exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist is added. Conditions ( Figure 8A).
  • ⁇ Condition 2 To the serum-free medium at the start of step 2, IWR-1e (3 ⁇ M) is added as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (30 nM) is added as a sonic hedgehog signaling pathway agonist. Added conditions ( Figure 8B). ⁇ Condition 3. IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor and SB431542 (5 ⁇ M) as a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor are added to the serum-free medium at the start of Step 2 and exogenous sonic. • Conditions where no hedgehog signaling pathway agonist was added (FIG. 8C). ⁇ Condition 4.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 was 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentrations of exogenous IWR-1e and SB431542 were not changed.
  • SAG 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing or not containing IWR-1e and SB431542 was added. Thereafter, once every 2 to 4 days, Y27632, SAG, human recombinant BMP4 is not contained, and the medium containing IWR-1e and SB431542 or the serum-free medium containing no IWR-1e and SB431542 is used.
  • Half volume medium exchange operation was performed so that a density
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e and / or SB431542 was 3% or less compared to that before the medium exchange. went.
  • a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, IWR-1e and SB431542.
  • the cells thus prepared on the 19th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under any condition 1-4.
  • the cell aggregate on the 19th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • These frozen sections are immunized against one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig). Staining was performed. Nucleic acids were stained with DAPI as a counterstain. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIG. 8).
  • Example 7 Preconditioning with a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3,
  • a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1
  • a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3
  • Example of production of retinal tissue from human iPS cells Human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium, and Laminin511- as a feeder-free scaffold Using E8 (Nippi), feeder-free culture was performed by the method described in Example 1.
  • feeder-free cultured sub-confined human iPS cells one day before were transformed into LDN193189 (BMP signaling pathway inhibitor (BMPR-i), 100 nM) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh ), 300 nM) (Step 1: Precondition (BMPR-i + Shh) treatment, Fig. 9 "Precondition: BMPR-i + Shh"), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) ) And feeder-free culture for 1 day.
  • BMP signaling pathway inhibitor BMPR-i
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (BMPR-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies), and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium, and the mixture was cultured in the following two serum-free conditions (conditions 1 and 2). ⁇ Condition 1. IWR-1e (3 ⁇ M) is added as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and no exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist is added. Conditions ( Figure 9A).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 was 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentrations of exogenous IWR-1e and SB431542 were not changed.
  • SAG 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing or not containing IWR-1e and SB431542 was added. Thereafter, once every 2 to 4 days, Y27632, SAG, human recombinant BMP4 is not contained, and the medium containing IWR-1e and SB431542 or the serum-free medium containing no IWR-1e and SB431542 is used.
  • Half volume medium exchange operation was performed so that a density
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e and / or SB431542 was 3% or less compared to that before the medium exchange. went.
  • a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, IWR-1e and SB431542.
  • the cells thus prepared on the 19th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 1 and 2.
  • the cell aggregate on the 19th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • These frozen sections are immunized against one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig). Staining was performed. Nucleic acids were stained with DAPI as a counterstain. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIG. 9).
  • preconditioning was performed with a BMPR inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1, and Wnt signaling pathway inhibitor and TGF ⁇ signaling pathway inhibitor were added in steps 2 and 3.
  • Wnt signaling pathway inhibitor and TGF ⁇ signaling pathway inhibitor were added in steps 2 and 3.
  • the BMPR inhibitor and the sonic hedgehog signaling pathway activity Even when preconditioning was performed using a substance, it was found that adding a Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3 efficiently differentiates into retinal cells.
  • Example 8 As a human iPS cells start material were established using the Sendai virus vector, and Precondition in Step 1, using Wnt signaling pathway inhibitors in step 2, the retinal tissue Preparation Human iPS cells (TFH- R1-10-2 strain and TFH-R2-10-F8 strain, established by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were established as follows.
  • a commercially available Sendai virus vector (Oct3 / 4, Sox2, KLF4, L-Myc, 4 factors, DNAVEC (currently ID Pharma), using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) prepared by well-known methods
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the public protocol of Life Technologies iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0
  • the public protocol of Kyoto University Establishment and maintenance culture of human iPS cells, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310 , Http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html
  • StemFit registered trademark
  • Laminin511-E8 Laminin511-E8 (Nippi) Established).
  • Human iPS cells (TFH-R1-10-2 and TFH-R2-10-F8 strains) were prepared using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium and Laminin511 as a feeder-free scaffold. Feeder-free culture was performed by the method described in Example 1 using -E8 (Nippi).
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, Fig. 8 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i TGF ⁇ signaling pathway inhibitor
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells thus prepared were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M
  • IWR-1e 3 ⁇ M
  • Wnt-i day 0-17
  • SAG 30 nM
  • FIG. 10 Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture using either human TFH-R1-10-2 or TFH-R2-10-F8 human iPS cells as the starting material (end of step 2) Process 3 started).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of the above serum-free medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added. Thereafter, once every 2 to 4 days, half-volume medium exchange operation is performed so that the concentration of IWR-1e does not change in the serum-free medium that does not contain Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and further contains IWR-1e. Went.
  • the cells thus prepared on the 17th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that neural tissue was formed using any human iPS cells of the TFH-R1-10-2 and TFH-R2-10-F8 strains as starting materials.
  • the ratio of Chx10-positive retinal tissue was found to be about 70% (FIG. 10A).
  • analysis of serial sections confirmed that these Chx10-positive cells were Rx co-positive cells (FIG. 10B).
  • the ratio of Chx10-positive retinal tissue was found to be about 90% (FIG. 10C).
  • analysis of serial sections confirmed that these Chx10-positive cells were Rx co-positive cells (FIG. 10D).
  • human iPS cells established using Sendai virus vector as a starting material can also be efficiently retined under the conditions where Precondition treatment was performed in Step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor was added in Step 2 and Step 3. It was found to differentiate into tissues. Therefore, iPS cells established with episomal vectors (eg, 1231A3 strain) and human iPS cells established with Sendai virus vectors (eg, TFH-R1-10-2 and TFH-R2-10-F8 strains) However, it was found that retinal cells and / or retinal tissue can be produced by the production method of the present application, regardless of the iPS cell establishment method.
  • episomal vectors eg, 1231A3 strain
  • human iPS cells established with Sendai virus vectors eg, TFH-R1-10-2 and TFH-R2-10-F8 strains
  • Example 9 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and using a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3.
  • Example of production of retinal cells including photoreceptors from human iPS cells Human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.), feeder free Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) was used as a scaffold, and feeder-free culture was carried out by the method described in Example 1.
  • Step 1 Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment) using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) for 1 day for feeder-free culture.
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells thus prepared were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. .
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M
  • IWR-1e 3 ⁇ M
  • the cells were cultured under the condition where SAG (30 nM) was added as a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist.
  • Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of the above serum-free medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added. Thereafter, once every 2 to 4 days, half-volume medium exchange operation is performed so that the concentration of IWR-1e does not change in the serum-free medium that does not contain Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and further contains IWR-1e. Went.
  • the cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed.
  • a part of the cells on the 20th day after the start of the suspension culture was extracted and fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section. These frozen sections are immunized against Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), one of the retinal tissue markers, or Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), one of the retinal tissue markers. Staining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO). As a result, it was found that the cells on the 20th day after the start of the suspension culture contained nerve tissue, and the nerve tissue was a retinal tissue that was both Chx10 and Rx.
  • the cell aggregates on the 23rd day after the start of the suspension culture were transferred to a 90 mm low adhesion culture dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in a serum medium containing neither Wnt signaling pathway activators nor FGF signaling pathway inhibitors.
  • DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, 0.5 ⁇ M retinoic acid, and 100 ⁇ M taurine
  • 37 ° C., 5% CO 2 atmospheric pressure oxygen concentration (20%
  • the suspension culture was continued until the 58th day (35 days) after the start of suspension culture.
  • the cell aggregates on the 58th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that pigmented retinal pigment epithelial cells were formed in addition to nerve tissue (FIG. 11, A, indicated by an arrowhead).
  • the thus prepared cell aggregates on the 58th day after the start of suspension culture were each fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections.
  • Rx anti-Rax / Rx antibody, manufactured by Takara, Guinea Pig
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha, one of the neural retinal progenitor cells
  • sheep Immunostaining was performed on Crx (anti-Crx antibody, manufactured by Takara, rabbit), which is one of the photoreceptor cell progenitor markers, and observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence, BIOREVO).
  • Rx-positive retinal tissues were formed in the cell aggregates on the 58th day after the start of the suspension culture (FIG. 11, B). Further, the Rx-positive retinal tissue was found to contain Chx10-positive neural retinal progenitor cells (FIG. 11, C). The Rx-positive retinal tissue was found to contain Crx-positive photoreceptor precursor cells (FIG. 11, D). From morphological observation, it was found that the Rx-positive retinal tissue contained a ciliary peripheral edge-like structure (FIG. 11, E, indicated by an arrow). Morphological observation also confirmed that retinal tissue contained Rx-positive, Chx10-negative, and Crx-negative inner retinal neurons (eg, ganglion cells and amacrine cells) ( Figure 11). .
  • retinal cells or retinal layer-specific neurons
  • neural retinal progenitor cells such as neural retinal progenitor cells, photoreceptor progenitor cells, retinal pigment epithelial cells, inner layer retina
  • neurons and ciliary marginal structures can be produced.
  • neural retinal progenitor cells, photoreceptor progenitor cells, and retinal neurons in the inner layer form a continuous epithelial structure having a layer structure. That is, it was found that retinal tissue / retinal system cells useful for regenerative medicine / cell transplantation treatment and efficacy / safety evaluation research can be produced from feeder-free cultured human pluripotent stem cells by the present production method.
  • Example 10 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using Wnt signaling pathway inhibitors in Step 2 and Step 3, from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, Fig. 12 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i TGF ⁇ signaling pathway inhibitor
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium of the following three conditions 1 to 3. ⁇ Condition 1. Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist. ( Figure 12A-C, “Condition 1”).
  • IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) Is added (FIG. 12D-F “Condition 2”).
  • SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Is added FIG. 12D-F “Condition 2”.
  • -Condition 3 IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (30 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) Added (FIG. 12G-I “Condition 3”).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (R & D) without Y27632 and SAG and further containing IWR-1e was added.
  • Y27632, SAG, human recombinant BMP4 is not included, and IWR-1e is further included in the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change.
  • Half volume medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 1, 2 and 3.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections.
  • one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), or retina Immunostaining was performed for Pax6, which is one of the markers of neural tissue including tissues.
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep
  • Rx anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig
  • retina Immunostaining was performed for Pax6, which is one of the markers of neural tissue including tissues.
  • condition 1 preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1, adding a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, (12 days after the start of suspension culture), it was found that even if the concentration of the exogenous Wnt signal transduction pathway inhibitor was reduced to 3% or less, it was efficiently differentiated into retinal tissue. Furthermore, in conditions 2 and 3, preconditioning is performed with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1, and a sonic hedgehog signaling pathway agonist is added in step 2, It was found that the cells were efficiently differentiated into retinal cells even under conditions where a Wnt signal pathway inhibitor was added in steps 2 and 3.
  • Example 11 Production Example of Retinal Tissue from Human iPS Cells Using Preconditioning with Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agents in Step 1 and Wnt Signaling Pathway Inhibitors in Steps 2 and 3 Human iPS Cells (QHJI01s04 Example 1 using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold. Feeder-free culture was carried out by the method described above.
  • Stem Fit registered trademark
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium of the following three conditions 1 to 3.
  • ⁇ Condition 1 Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist. ( Figure 13A-C, “Condition 1”).
  • Condition 2 IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) Added (FIG.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 1, 2 and 3.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections.
  • one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), or retina Immunostaining was performed for Pax6, which is one of the markers of neural tissue including tissues.
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep
  • Rx anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig
  • retina Immunostaining was performed for Pax6, which is one of the markers of neural tissue including tissues.
  • preconditioning with a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1 and addition of a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, halfway through step 3 (10 days after the start of suspension culture) Eye showed that even if the concentration of exogenous Wnt signaling pathway inhibitor was reduced to 3% or less, it was efficiently differentiated into retinal tissue. Furthermore, in conditions 2 and 3, preconditioning is performed using a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1, a sonic hedgehog signaling pathway agent is added in step 2, and a Wnt signal is added in steps 2 and 3. It was found that the cells were efficiently differentiated into retinal cells even under conditions where a pathway inhibitor was added.
  • Example 12 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3, photoreceptor cells from human iPS cells
  • a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1 and using Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3, photoreceptor cells from human iPS cells
  • Examples of production of retinal tissue containing human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 Laminin511-E8 (Nippi) as a feeder-free scaffold Feeder-free culture by the method described in Example 1.
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) was added for 1 day in a feeder-free culture using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; Ajinomoto Co., Inc.).
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. .
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M was added to the serum-free medium and cultured in the serum-free medium of Condition 1 below.
  • ⁇ Condition 1 Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist.
  • Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • Y27632, SAG, human recombinant BMP4 is not included, and IWR-1e is further included in the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e does not change.
  • Half volume medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed.
  • the cell aggregates on the 23rd day after the start of the suspension culture were transferred to a 90 mm low adhesion culture dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in a serum medium containing neither Wnt signaling pathway activators nor FGF signaling pathway inhibitors.
  • DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, 0.5 ⁇ M retinoic acid, and 100 ⁇ M taurine
  • 37 ° C., 5% CO 2 atmospheric pressure oxygen concentration (20%
  • the suspension culture was continued until the 85th day (62 days) after the start of suspension culture.
  • the cell aggregates on the 85th day after the start of suspension culture were observed with a bright field using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that neural tissue having a continuous epithelial structure was formed (FIG. 14A).
  • the cell aggregates prepared on the 85th day after the start of suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections.
  • Crx anti-Crx antibody, Takara, rabbit
  • one of the progenitor cell markers Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, one), one of the neuroretinal progenitor markers ),
  • Rx retinal tissue markers
  • Rx anti-Rax / Rx antibody, Takara, Guinea Pig
  • Recoverin anti-Recoverin antibody, Proteintech, rabbit
  • rod photoreceptor precursor One cell marker, NRL (anti-NRL antibody, R ⁇ and D, goat), one of the cone photoreceptor precursor markers, RXR-gamma (anti-RXRG antibody, R and D, goat)
  • N-cadherin an anti-N-cadherin antibody, manufactured by BD, mouse
  • Aqp1 an anti-Aqp1 antibody
  • retinal tissues containing Chx10-positive neural retinal progenitor cells and Crx-positive photoreceptor precursor cells were formed in the cell aggregates on the 85th day after the start of the suspension culture.
  • FIG. 14, B Furthermore, analysis of serial sections revealed that the retinal tissue was Rx-positive retinal tissue and contained Recoverin-positive photoreceptors (FIG. 14, C). Furthermore, analysis of serial sections revealed that the retinal tissue contained NRL positive rod photoreceptor precursor cells and RXR-gamma positive cone photoreceptor precursor cells (FIG. 14, D). In addition, the retinal tissue was found to be N-cadherin positive nerve tissue (FIG. 14E).
  • Step 1 precondition treatment with TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and sonic hedgehog signaling pathway agonist, and in Step 2 and Step 3 Wnt signal It was found that differentiation into a retinal tissue efficiently under the condition of adding a pathway inhibitor. Furthermore, by continuing differentiation culture of the retinal tissue thus prepared, retinal cells (or retinal specific neurons) such as neural retinal progenitor cells, photoreceptor precursor cells, photoreceptor cells, cone photoreceptor precursor cells It was found that rod photoreceptor precursor cells can be produced. In the retinal tissue, it was found that neural retinal progenitor cells, photoreceptor precursor cells, and photoreceptor cells form a continuous epithelial structure having a layered structure.
  • retinal cells or retinal specific neurons
  • Example 13 Production Example of Retinal Tissue Containing Photocells from Human iPS Cells Using Preconditioning with Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agents in Step 1 and Wnt Signaling Pathway Inhibitors in Steps 2 and 3
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M was added to the serum-free medium and cultured in a serum-free medium under the following conditions.
  • IWR-1e 3 ⁇ M was added as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2
  • SAG 30 nM as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist The condition of adding.
  • Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less as compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 19th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed.
  • the cell aggregates on the 22nd day after the start of the suspension culture were transferred to a 90 mm low-adhesion culture dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in a serum medium containing neither Wnt signaling pathway activators nor FGF signaling pathway inhibitors (DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, 0.5 ⁇ M retinoic acid, and 100 ⁇ M taurine) at 37 ° C., 5% CO 2 , atmospheric pressure oxygen concentration (20% The suspension culture was continued until the 92nd day (70 days) after the start of suspension culture.
  • DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, 0.5 ⁇ M retinoic acid, and 100 ⁇ M taurine
  • the cell aggregates on the 92nd day after the start of suspension culture were observed with a bright field using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that neural tissue having a continuous epithelial structure was formed (FIG. 15A).
  • retinal cells or retinal specific neurons
  • neural retinal progenitor cells such as neural retinal progenitor cells, photoreceptor precursor cells, photoreceptor cells, cone photoreceptor precursor cells
  • rod photoreceptor precursor cells and ciliary marginal structures can be produced.
  • neural retinal progenitor cells, photoreceptor precursor cells, and photoreceptor cells form a continuous epithelial structure having a layered structure.
  • Example 14 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3, from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, Fig. 16 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i TGF ⁇ signaling pathway inhibitor
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the serum-free medium (gfCDM + KSR) was serum-free with 6% KSR , 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M was added to the serum-free medium and cultured in serum-free medium under the following conditions.
  • IWR-1e (3 ⁇ M) was added as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2
  • SAG (30 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist (Fig. 16, A, B).
  • Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed. -Condition B.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added.
  • the human recombinant BMP4 R & D
  • the human recombinant BMP4 does not contain Y27632 and SAG so that the concentration of exogenous human recombinant BMP4 and the concentration of exogenous IWR-1e do not change.
  • the medium was replaced with half of the serum-free medium containing IWR-1e. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e. A medium exchange operation was performed.
  • culturing was further performed as follows. On the 12th day after the start of suspension culture, the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e. The cells thus prepared on the 18th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions A and B.
  • the cell aggregate on the 18th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers.
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep
  • These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 16A and B).
  • condition A the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%
  • condition B the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%. That is, regardless of whether the exogenous BMP was added under conditions A or B, the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and the sonic hedgehog signaling pathway agent were preconditioned in step 1, and the sonic Add hedgehog signaling pathway agonist, add Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, and exogenous Wnt signaling pathway inhibitor during step 3 (12 days after suspension culture) It was found that under the condition that the concentration of selenium was reduced to 3% or less, even when the concentration of KSR contained in the serum-free medium was 6%, it was efficiently differentiated into retinal tissue.
  • Example 15 Example of production of retinal tissue from human iPS cells using Preconditioning with a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3 Human iPS cells (QHJI01s04 Example 1 using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold. Feeder-free culture was carried out by the method described above.
  • Stem Fit registered trademark
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • Step 1 The condition that SAG (Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent (Shh), 300 nM) was added to human iPS cells 2 days before subconfluent cultured in feeder-free manner in this way
  • Step 1 Precondition (+ Shh)
  • Fig. 16 "Precondition: Shh”
  • feeder free culture was performed for 2 days using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • AK03N registered trademark
  • the thus prepared Precondition (Shh) -treated human iPS cells were treated with cell dispersion using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies), and further dispersed into single cells by pipetting operation.
  • ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the serum-free medium (gfCDM + KSR) was serum-free with 6% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M was added to the serum-free medium and cultured in serum-free medium under the following conditions.
  • IWR-1e 3 ⁇ M was added as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and no exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist was added.
  • Conditions ( Figure 16C, D) Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the cells were cultured using a serum-free medium under the following two conditions C and D. -Condition C.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed. -Condition D.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e is not changed.
  • 50 ⁇ l of a medium containing human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e was added.
  • the human recombinant BMP4 R & D
  • the human recombinant BMP4 does not contain Y27632 and SAG so that the concentration of exogenous human recombinant BMP4 and the concentration of exogenous IWR-1e do not change.
  • the medium was replaced with half of the serum-free medium containing IWR-1e. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e. A medium exchange operation was performed.
  • the cells were cultured as follows. On the 12th day after the start of suspension culture, the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e. The cells thus prepared on the 18th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions C and D.
  • the cell aggregate on the 18th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers.
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep
  • These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 16C and D).
  • Example 16 Preconditioning with a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1 and using Wnt signaling pathway inhibitors in Step 2 and Step 3 from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • feeder-free cultured sub-confined human iPS cells one day before were transformed into LDN193189 (BMP signaling pathway inhibitor (BMPR-i), 100 nM) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh ), 300 nM) (Step 1: Precondition (BMPR-i + Shh) treatment, FIG. 17 “Precondition: BMPR-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) ) And feeder-free culture for 1 day.
  • BMP signaling pathway inhibitor BMPR-i
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Precondition (BMPR-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium and cultured in serum-free medium under the following conditions. ⁇ Condition 1. Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist. Conditions (Fig. 17A, B). Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed. -Condition B.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • the human recombinant BMP4 (R & D) does not contain Y27632 and SAG so that the concentration of exogenous human recombinant BMP4 and the concentration of exogenous IWR-1e do not change.
  • the medium was replaced with half of the serum-free medium containing IWR-1e. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e. A medium exchange operation was performed.
  • culturing was performed as follows. On the 10th day after the start of suspension culture, the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e. The cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions A and B.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. With respect to these frozen sections, immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 17A and B).
  • condition A the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 90%
  • condition B the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 90%. That is, regardless of the conditions of exogenous BMP addition in either condition A or condition B, preconditioning with a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and Wnt in steps 2 and 3 A signal transduction pathway inhibitor is added, and the concentration of the exogenous Wnt signal transduction pathway inhibitor is reduced to 3% or less during the process 3 (10 days after the start of suspension culture). It was found to differentiate.
  • Example 17 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1, and using Wnt signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3, from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • the human iPS cells 2 days before sub-confinence cultured in feeder-free manner in this manner were added Stem Fit (registered trademark) medium under the condition that SAG (Sonic hedgehog signal transduction pathway agonist (Shh), 300 nM) was added.
  • SAG Sonic hedgehog signal transduction pathway agonist
  • AK03N manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • SB431542 TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M)
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Step 1 Precondition (TGF ⁇ R-i 24h + Shh 48h) treatment, FIG. 18).
  • Precondition (TGF ⁇ R-i 24h + Shh 48h) -treated human iPS cells thus prepared were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies), and further pipetted to single cells. Distributed.
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed. -Condition B.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • the human recombinant BMP4 (R & D) does not contain Y27632 and SAG so that the concentration of exogenous human recombinant BMP4 and the concentration of exogenous IWR-1e do not change.
  • the medium was replaced with half of the serum-free medium containing IWR-1e. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e. A medium exchange operation was performed.
  • culturing was further performed as follows. On the 10th day after the start of suspension culture, the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e. The cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions A and B.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. With respect to these frozen sections, immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 18A and 18B).
  • condition A the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%
  • condition B the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%. That is, regardless of the conditions of exogenous BMP addition in either condition A or condition B, preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and Wnt in steps 2 and 3 A signal transduction pathway inhibitor is added, and the concentration of the exogenous Wnt signal transduction pathway inhibitor is reduced to 3% or less during the process 3 (10 days after the start of suspension culture). It was found to differentiate.
  • Example 18 Preconditioning with a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1 and using Wnt signaling pathway inhibitors in Step 2 and Step 3 from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University
  • Stem Fit (registered trademark) medium AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 Neppi
  • the human iPS cells 2 days before sub-confinence cultured in feeder-free manner in this manner were added Stem Fit (registered trademark) medium under the condition that SAG (Sonic hedgehog signal transduction pathway agonist (Shh), 300 nM) was added.
  • SAG Sonic hedgehog signal transduction pathway agonist
  • AK03N manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • LDN193189 BMP signaling pathway inhibitor (BMPR-i), 100 nM
  • SAG Sonic hedgehog signaling pathway agonist
  • Step 1 Precondition (BMPR-i 24h + Shh 48h) treatment, FIG. 19).
  • Precondition (BMPR-i 24h + Shh 48h) -treated human iPS cells prepared in this way are treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies), and further pipetted into single cells. Distributed.
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed. -Condition B.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • the human recombinant BMP4 (R & D) does not contain Y27632 and SAG so that the concentration of exogenous human recombinant BMP4 and the concentration of exogenous IWR-1e do not change.
  • the medium was replaced with half of the serum-free medium containing IWR-1e. Then, once every 2-4 days, half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e. A medium exchange operation was performed.
  • the cells were cultured as follows under the two conditions A and B.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange.
  • a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions A and B.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. With respect to these frozen sections, immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 19A and B).
  • condition A the proportion of Chx10-positive retinal tissue was about 50%
  • condition B the proportion of Chx10-positive retinal tissue was about 70%. That is, regardless of the conditions of exogenous BMP addition in either condition A or condition B, preconditioning with a BMP signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and Wnt in steps 2 and 3 Signaling pathway inhibitor is added and differentiated into retinal tissue under the condition that the concentration of exogenous Wnt signaling pathway inhibitor is reduced to 3% or less in the middle of step 3 (10 days after the start of suspension culture) I understood it.
  • Example 19 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1, and using a Wnt signaling pathway inhibitor and a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3.
  • Example of production of retinal tissue from human iPS cells Human iPS cells (QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as the feeder-free medium, and Laminin511- Using E8 (Nippi), feeder-free culture was performed by the method described in Example 1.
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, FIG. 20 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i + Shh Stem Fit (registered trademark) medium
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium and cultured in serum-free medium under the following conditions.
  • IWR-1e 3 ⁇ M
  • SB431542 5 ⁇ M
  • TGF ⁇ TGF ⁇ signal transduction inhibitor
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml), and the concentrations of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) and SB431542 (5 ⁇ M) are In order not to change, 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e and SB431542 was added.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml), and the concentrations of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) and SB431542 (5 ⁇ M) are In order not to change, 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e and SB431542 was added.
  • human recombinant BMP4 does not contain Y27632 and SAG.
  • half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing IWR-1e and SB431542.
  • concentration of exogenous IWR-1e should not change in the serum-free medium that does not contain Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and further contains IWR-1e and SB431542.
  • a half-volume medium exchange operation was performed.
  • culturing was further performed as follows. On the 10th day after the start of suspension culture, the 80% medium exchange operation was performed 3 times using the above serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e and SB431542 was 3% or less compared to before the medium exchange. It was. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium not containing Y27632, SAG, human recombinant BMP4, IWR-1e and SB431542. The cells thus prepared on the 20th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions A and B.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. With respect to these frozen sections, immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 20A and B).
  • condition A the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 95%
  • condition B the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 95%. That is, regardless of the conditions of exogenous BMP addition in either condition A or condition B, preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and Wnt in steps 2 and 3 Add signal transduction pathway inhibitor and TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor, and adjust the concentration of exogenous Wnt signal transduction pathway inhibitor and TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor in the middle of step 3 (10 days after the start of suspension culture). It was found that the cells were efficiently differentiated into retinal tissue under conditions reduced to less than%.
  • Example 20 Preconditioning with a sonic hedgehog signaling pathway agent in Step 1 and Wnt signaling pathway inhibitor and TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in Step 2 and Step 3 from human iPS cells.
  • Production Example Human iPS cells (QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as the feeder-free medium, and Laminin511-E8 (Nippi) as the feeder-free scaffold
  • the feeder-free culture was performed by the method described in Example 1.
  • Step 1 Precondition (Shh) treatment
  • SAG Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent (Shh), 300 nM
  • Step 1 Precondition (Shh) treatment
  • feeder free culture was performed using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) for 2 days.
  • AK03N registered trademark
  • the thus prepared Precondition (Shh) -treated human iPS cells were treated with cell dispersion using TrypLE Select (manufactured by Life Technologies), and further dispersed into single cells by pipetting operation.
  • iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium gfCDM + KSR
  • gfCDM + KSR is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 final concentration 20 ⁇ M was added to the serum-free medium and cultured in serum-free medium under the following conditions. -Conditions. Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor and SB431542 (5 ⁇ M) as a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and Conditions without adding a sonic hedgehog signaling pathway agonist ( Figure 21, A, B). Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the cells were cultured in a serum-free medium under the following conditions A and B. -Condition A.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml), and the concentrations of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) and SB431542 (5 ⁇ M) are In order not to change, 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e and SB431542 was added.
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml), and the concentrations of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) and SB431542 (5 ⁇ M) are In order not to change, 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D) and further containing IWR-1e and SB431542 was added.
  • the cell aggregates on the 20th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. With respect to these frozen sections, immunostaining was performed on Chx10 (anti-Chx10 antibody, manufactured by Exalpha Co., Ltd. sheep), which is one of retinal tissue markers. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIGS. 21A and 21B).
  • condition A the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%
  • condition B the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 80%. That is, regardless of the conditions of exogenous BMP addition in either condition A or condition B, preconditioning is performed with a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1, and Wnt signaling pathway inhibitor and TGF ⁇ in steps 2 and 3. Signal transduction pathway inhibitor was added, and the concentration of exogenous Wnt signal transduction pathway inhibitor and TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor was reduced to 3% or less in the middle of step 3 (10 days after the start of suspension culture) It was found that it efficiently differentiates into retinal tissue.
  • Example 21 Example of production of retinal tissue from human iPS cells using a Sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3 Human iPS cells (QHJI01s04 Example 1 using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold. Feeder-free culture was carried out by the method described above.
  • Stem Fit registered trademark
  • Laminin511-E8 manufactured by Nippi
  • ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium under the following conditions 1 and 2.
  • ⁇ Condition 1 Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist.
  • Conditions (FIG. 22A, B).
  • Condition 2 IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) was added (FIGS. 22C and D).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) under conditions 1 and 2, and the concentration of exogenous IWR-1e ( 3 ⁇ M), 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D), and further containing IWR-1e was added.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less as compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells prepared on the 18th day after the start of the suspension culture were observed with a bright field using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE®Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 1 and 2.
  • the cell aggregate on the 18th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), Immunostaining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO).
  • a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist is added in step 2
  • preconditioning with a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and Wnt signaling in steps 2 and 3 It is possible to efficiently differentiate into retinal tissue under the condition that the amount of exogenous Wnt signaling pathway inhibitor is reduced to 3% or less in the middle of step 3 ( 6 days after the start of suspension culture ) by adding a pathway inhibitor. all right.
  • Example 22 From human iPS cells to photoreceptor precursor cells and ganglion cells, preconditioned with Sonic hedgehog signaling pathway agonists in step 1 and Wnt signaling pathway inhibitors in steps 2 and 3
  • Example of production of retinal tissue Human iPS cells (QHJI01s04 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium, and Laminin511-E8 (Nippi) as a feeder-free scaffold was used for feeder-free culture by the method described in Example 1.
  • ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium at the start of suspension culture (0 days after suspension culture started, step 2 started), and cultured in serum-free medium under the following conditions 1 and 2.
  • ⁇ Condition 1 Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist.
  • Conditions (FIGS. 23A-D).
  • Condition 2 IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) was added (FIG. 23E-H).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) under conditions 1 and 2, and the concentration of exogenous IWR-1e ( 3 ⁇ M), 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (manufactured by R & D), and further containing IWR-1e was added.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less as compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • a part of the cell aggregate on the 11th day after the start of the suspension culture was extracted and fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig), Immunostaining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO).
  • the cell aggregates on the 14th day after the start of the suspension culture were transferred to a 90 mm low adhesion culture dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) in a serum medium containing neither Wnt signaling pathway activators nor FGF signaling pathway inhibitors.
  • DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, and 100 ⁇ M taurine
  • the suspension culture was continued until 35 days (21 days) after the start of the culture. From the 20th day after the start of suspension culture to the end of suspension culture, half of the medium was replaced with the serum medium once every 2 to 4 days. During this period, about 30 aggregates per 90 mm low adhesion culture dish were suspended in 15 ml of the serum medium.
  • the cell aggregates on the 35th day after the start of suspension culture were observed with a bright field using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE) Ti). As a result, it was found that a nerve retina-like tissue exists and a nerve tissue having a continuous epithelial structure is formed.
  • the thus-prepared 35 day-old cell aggregates after the start of suspension culture were each fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections.
  • Crx anti-Crx antibody, Takara, rabbit
  • one of the progenitor cell markers or Brn3b (anti-Brn3b, Santa Cruz, one of the ganglion cell markers) And goats) were immunostained and observed using an inverted fluorescence microscope (BIOREVO, manufactured by Keyence Corporation).
  • the sonic hedgehog signal transduction pathway in step 1 was started using feeder-free cultured human iPS cells as a starting material, regardless of whether or not a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist was added in step 2. It was found that the cells were efficiently differentiated into retinal tissues under the condition that precondition treatment with an active substance and a Wnt signal transduction pathway inhibitor was added in step 2 and step 3. Furthermore, it was found that retinal cells (or retina-specific nerve cells) such as photoreceptor precursor cells and ganglion cells can be produced by continuing differentiation culture of the retinal tissue thus prepared. In the retinal tissue, it was found that photoreceptor precursor cells and ganglion cells form a continuous epithelial structure having a layered structure.
  • Example 23 Example of production of retinal tissue using human iPS cells established using Sendai virus vector as a starting material, preconditioning in step 1 and using a Wnt signaling pathway inhibitor in step 2 human iPS cells (TFH- HA stock, established by Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) was established as follows.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • Sendai virus vector Oct3 / 4, Sox2, KLF4, L-Myc 4 factors, ID Tune cytotune kit
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, FIG. 24 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i + Shh Stem Fit (registered trademark) medium
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of human iPS cells dispersed in the single cells were added to 1.3 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). The suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the beginning of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium, and the mixture was cultured in the following two serum-free conditions (conditions 1 and 2). ⁇ Condition 1. Add IWR-1e (3 ⁇ M) as a Wnt signaling pathway inhibitor to the serum-free medium at the start of Step 2, and do not add an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist. (Fig.
  • Condition 2 IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) Added (FIG. 24E, F “Condition 2”).
  • SAG 10 nM
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 19th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 1 and 2.
  • the cell aggregate on the 19th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • These frozen sections are immunized against one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig). Staining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIG. 24).
  • step 2 using condition 1 and human iPS cells established using Sendai virus vector as a starting material, preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1 and step 2
  • step 2 add a Wnt signaling pathway inhibitor in step 2 and step 3
  • step 3 add an exogenous Wnt signal in the middle of step 3 (12 days after the start of suspension culture). It was found that even when the concentration of the transmission pathway inhibitor was reduced to 3% or less, it efficiently differentiated into retinal tissue.
  • condition 2 using human iPS cells established using Sendai virus vector as a starting material, preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1,
  • a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist was added and a Wnt signaling pathway inhibitor was added in steps 2 and 3
  • the cells were efficiently differentiated into retinal cells.
  • Example 24 Example of production of retinal tissue using human iPS cells established using a Sendai virus vector as a starting material, preconditioning in step 1 and using a Wnt signaling pathway inhibitor in step 2 human iPS cells (TFH- HA strain, established by Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.) was established as described in Example 23.
  • Feeder was prepared by the method described in Example 1 using human iPS cells using Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as the feeder-free medium and Laminin511-E8 (Nippi) as the feeder-free scaffold. Free culture was performed.
  • Stem Fit registered trademark
  • AK03N manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 Laminin511-E8
  • ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite).
  • the suspension was suspended in a serum-free medium and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used.
  • IWR-1e 3 ⁇ M is added as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ) Added (FIG. 24G, H “Condition 4”).
  • SAG 10 nM
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 will be 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) will not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 19th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed under conditions 3 and 4.
  • the cell aggregate on the 19th day after the start of the suspension culture was fixed with 4% paraformaldehyde to prepare a frozen section.
  • These frozen sections are immunized against one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig). Staining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, BIOREVO) (FIG. 24).
  • condition 4 using human iPS cells established using Sendai virus vector as a starting material, preconditioning with a sonic hedgehog signaling pathway agent in step 1 and sonic hedgehog signaling in step 2 Add a pathway agent, add a Wnt signaling pathway inhibitor in steps 2 and 3, and reduce the concentration of exogenous Wnt signaling pathway inhibitor to 3% or less in the middle of step 3 (12 days after the start of suspension culture) It was found that even under reduced conditions, the cells efficiently differentiate into retinal cells.
  • Example 25 Preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in Step 1 and using Wnt signaling pathway inhibitors in Step 2 and Step 3 from human iPS cells to retinal tissue Production
  • Human iPS cells (1231A3 strain, obtained from Kyoto University), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) as a feeder-free medium, and Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) as a feeder-free scaffold
  • the feeder-free culture was performed by the method described in Example 1.
  • Sub-confined human iPS cells one day before feeder-free culture in this way were transformed into SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor (TGF ⁇ R-i), 5 ⁇ M) and SAG (Sonic hedgehog signaling pathway agonist (Shh) , 300 nM) (Step 1: Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) treatment, FIG. 25 “Precondition: TGF ⁇ R-i + Shh”), Stem Fit (registered trademark) medium (AK03N; manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used for feeder-free culture for 1 day.
  • TGF ⁇ R-i + Shh Stem Fit (registered trademark) medium
  • Precondition (TGF ⁇ R-i + Shh) -treated human iPS cells prepared in this way were treated with cell dispersion using TrypLE Select (Life Technologies) and further dispersed into single cells by pipetting. . Thereafter, 100 ⁇ l of the human iPS cells dispersed in the single cells are added to 1.3 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96 slit well plate, manufactured by Sumitomo Bakelite). Were suspended in a serum-free medium and suspended in culture at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Serum-free medium (gfCDM + KSR) is serum-free with 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 x Chemically defined lipid concentrate in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium. Medium was used. At the start of suspension culture (day 0 after suspension culture started, step 2 started), Y27632 (final concentration 20 ⁇ M) was added to the serum-free medium, and cultured in serum-free medium under the following condition 2. Condition 2: IWR-1e (3 ⁇ M) is added to the serum-free medium at the start of Step 2 as a Wnt signaling pathway inhibitor, and SAG (10 nM) as an exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist ). Cell aggregates were formed by the second day after the start of suspension culture (end of step 2 and start of step 3).
  • the final concentration of exogenous human recombinant BMP4 is 1.5 nM (55 ng / ml) and the concentration of exogenous IWR-1e (3 ⁇ M) does not change.
  • 50 ⁇ l of a medium containing Y27632 and SAG, human recombinant BMP4 (R & D), and IWR-1e was added.
  • half the amount of exogenous IWR-1e is not changed in the serum-free medium without Y27632, SAG, human recombinant BMP4 and further containing IWR-1e.
  • a medium exchange operation was performed.
  • the 80% medium exchange operation was performed three times using the serum-free medium so that the concentration of exogenous IWR-1e was 3% or less compared to before the medium exchange. Thereafter, once every 2 to 4 days, a half-volume medium exchange operation was performed in the serum-free medium containing no Y27632, SAG, human recombinant BMP4, and IWR-1e.
  • the cells thus prepared on the 17th day after the start of suspension culture were subjected to bright field observation using an inverted microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti). As a result, it was found that nerve tissue was formed.
  • the cell aggregates on the 17th day after the start of the suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde to prepare frozen sections. These frozen sections are immunized against one of the retinal tissue markers, Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha, sheep), or one of the retinal tissue markers, Rx (anti-Rx antibody, Takara, Guinea Pig). Staining was performed. These stained sections were observed using an inverted fluorescence microscope (Keyence Co., BIOREVO) (FIG. 25).
  • Chx10-positive retinal tissue was formed. Further, under this condition, the ratio of Chx10-positive retinal tissue was about 90% (FIG. 25, A). In addition, analysis of serial sections confirmed that these Chx10-positive cells were Rx co-positive cells (FIG. 25, B). That is, preconditioning with a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 1 and adding a sonic hedgehog signaling pathway agonist in step 2 and seeding in a slit well plate, It was found that even when the Wnt signal pathway inhibitor was added in steps 2 and 3, the cells efficiently differentiate into retinal cells.

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Abstract

本発明は、下記工程（1）～（3）を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法を提供する： （1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地中で培養する第一工程、 （2）第一工程で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び （3）第二工程で得られた凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。

Description

網膜組織の製造法
　本発明は、多能性幹細胞から、網膜系細胞又は網膜組織を製造する方法に関するものである。
　多能性幹細胞から網膜組織等の神経組織(neural tissue)を製造する方法として、均一な多能性幹細胞の凝集体を無血清培地中で形成させ、これを浮遊培養した後、分化誘導用の培地中、適宜分化誘導因子等の存在下で浮遊培養し、多能性幹細胞から目的とする神経系細胞（neural cells）へ分化誘導をすることにより、神経組織を製造する方法が報告されている（特許文献1及び非特許文献1）。例えば、多能性幹細胞から多層の網膜組織を得る方法（非特許文献2及び特許文献2）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献3及び特許文献3）、又は、多能性幹細胞の凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、網膜組織を得る方法（特許文献5及び非特許文献10）が知られている。また、多能性幹細胞から視床下部組織への分化誘導方法（特許文献4及び非特許文献4）、及び多能性幹細胞から神経前駆細胞への分化誘導方法（非特許文献5及び6）についても報告されている。
　これら製造法の出発材料である多能性幹細胞は、特に霊長類多能性幹細胞の場合、フィーダー細胞存在下・未分化維持因子添加条件で未分化状態を維持して培養することが可能であった。近年、未分化維持培養の改良が進み、霊長類多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）・未分化維持因子添加条件にて培養する手法が報告されている（非特許文献7、8及び9）。当該手法でフィーダーフリー培養された多能性幹細胞を出発材料として、網膜等の神経系細胞又は神経組織を安定的に製造する方法が切望されていた。
国際公開第2009/148170号 国際公開第2011/055855号 国際公開第2013/077425号 国際公開第2013/065763号 国際公開第2015/025967号
Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008) Nature, 472, 51-56 (2011) Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012) Nature, 480, 57-62 (2011) Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009) Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013) Nature Methods, 8, 424-429 (2011) Scientific Reports, 4, 3594 (2014) In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010) Nature Communications, 6, 6286 (2015)
　本発明が解決しようとする課題は、フィーダー細胞非存在下で未分化状態を維持しながら培養された多能性幹細胞から網膜系細胞又は網膜組織を製造する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリーの条件下）で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有する培地中で培養した後、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含有する培地中で浮遊培養することにより、未分化性を維持した細胞凝集体を高効率で形成できることを見出した。そしてこの高品質の細胞凝集体を用いれば、網膜組織等の神経組織や神経系細胞を高い効率で誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［1］下記工程（1）～（3）を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法；
（1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地中で培養する第一工程、
（2）第一工程で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
（3）第二工程で得られた凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
［2］第一工程において多能性幹細胞を0.5時間～144時間培養する、［1］に記載の製造方法。
［3］第一工程の培養が接着培養で行われる、［1］又は［2］に記載の製造方法。
［4］第二工程において、第一工程で得られた細胞を分散し、当該分散した細胞を浮遊培養する、［1］～［3］のいずれかに記載の製造方法。
［5］未分化維持因子が、少なくともFGFシグナル伝達経路作用物質を含む、［1］～［4］に記載の製造方法。
［6］FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、［5］に記載の製造方法。
［7］第二工程において、浮遊培養に用いる培地が、更にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む、［1］～［6］のいずれかに記載の製造方法。
［8］多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であり、第二工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質濃度がSAG10nM～700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度である、［7］に記載の製造方法。
［9］TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、又はBMPシグナル伝達経路阻害物質である、［1］～［8］のいずれかに記載の製造方法。
［10］TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01及びLDN193189からなる群から選ばれる1以上の物質である、［1］～［9］のいずれかに記載の製造方法。
［11］ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がShh、SAG及びPurmorphamineからなる群から選ばれる1以上の物質である、［1］～［10］のいずれかに記載の製造方法。
［12］第三工程において、第二工程の開始後1日目から9日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、［1］～［11］のいずれかに記載の製造方法。
［13］第三工程において、第二工程開始後1日目から6日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、［12］に記載の製造方法。
［14］第三工程において、第二工程開始後1日目から3日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、［13］に記載の製造方法。
［15］BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である、［1］～［14］のいずれかに記載の製造方法。
［16］BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、［1］～［15］のいずれかに記載の製造方法。
［17］第三工程において、培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度がSAG700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度以下である培地で凝集体を培養する、［1］～［16］のいずれかに記載の製造方法。
［18］第三工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度がSAG700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度以下である、［1］～［16］のいずれかに記載の製造方法。
［19］第二工程開始後3日間から18日間、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で培養する、［1］～［18］のいずれかに記載の製造方法。
［20］第二工程開始後10日間、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で培養する、［1］～［19］のいずれかに記載の製造方法。
［21］Wntシグナル伝達経路阻害物質が、IWR-1-endoである、［1］～［20］のいずれかに記載の製造方法。
[22]第三工程が、以下の工程を含む、[1]～[21]のいずれかに記載の製造方法：
（i）第二工程で得られた凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜系細胞もしくは網膜組織を含み、Chx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を得る工程；
（ii）工程(i)で得られた細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、FGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程；
(iii)工程(ii)で得られたRPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程。
［23］第三工程において得られる凝集体が、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、神経節細胞、双極細胞、網膜色素上皮細胞、及び毛様体周縁部細胞からなる群から選択される1又は複数の細胞を含む凝集体である、［1］～［22］のいずれかに記載の製造方法。
［24］多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、［1］～［23］のいずれかに記載の製造方法。
［25］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［1］～［24］のいずれかに記載の製造方法。
［26］第二工程において、均一な凝集体を形成させる、［1］～［25］のいずれかに記載の製造方法。
［27］浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる、［1］～［26］のいずれかに記載の製造方法。
［28］［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を含有する、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
［29］［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞または網膜組織に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
［30］［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を含有する、網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬。
［31］網膜系細胞又は網膜組織が、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、又は網膜組織である、［30］に記載の治療薬。
［32］［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
［33］網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織。
［34］［1］～［27］のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を有効成分として含有する、医薬組成物。
　本発明によれば、フィーダー細胞非存在下に培養された多能性幹細胞から、高品質の細胞凝集体、並びに網膜系細胞又は網膜組織を高効率に製造することが可能となる。
Precondition有り（図中C,D）と無し（図中A,B）の条件の間で、細胞凝集体の形態を明視野観察にて比較した結果を示す。 Precondition有り（図中C,D,G,H）と無し（図中A,B,E,F）の条件の間で、細胞凝集体におけるRx (図中A-D)及びChx10 (図中E-H)の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体の形態を明視野観察にて比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるRx (図中A-D)及びChx10 (図中E-H)の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。DAPIにより対比染色した。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。DAPIにより対比染色した。 種々の培養条件下で、ヒトiPS細胞（図中A,B：TFH-R1-10-2株、図中C,D：TFH-R2-10-F8株）から形成した細胞凝集体におけるChx10 (図中A,C)及びRx (図中B,D)の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 ヒトiPS細胞から誘導した視細胞含有網膜組織の明視野観察した結果を示す（図中A）。当該視細胞含有網膜組織におけるRx、Chx10及びCrxの発現を免疫組織染色により観察した結果(図中B-E)を示す。DAPIにより対比染色した(図中E)。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10 (図中A,D,G)、Rx (図中B,E,H)、及びPax6 (図中C,F,I)の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10 (図中A,D,G)、Rx (図中B,E,H)、及びPax6 (図中C,F,I)の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 ヒトiPS細胞から誘導した視細胞含有網膜組織の明視野観察した結果を示す（図中A）。当該視細胞含有網膜組織におけるCrx、Chx10、Rx、Recoverin、NRL、RXRG、N-cadherin及びAqp1の発現を免疫組織染色により観察した結果(図中B－E)を示す。DAPIにより対比染色した(図中B－E)。 ヒトiPS細胞から誘導した視細胞含有網膜組織の明視野観察した結果を示す（図中A）。当該視細胞含有網膜組織におけるCrx、Chx10、Rx、Recoverin、NRL、RXRG、N-cadherin及びAqp1の発現を免疫組織染色により観察した結果(図中B－E)を示す。DAPIにより対比染色した(図中B－E)。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10の発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10及びRxの発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10、Rx、Crx、及びBrn3bの発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 種々の培養条件下でヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10及びRxの発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。 ヒトiPS細胞から形成した細胞凝集体におけるChx10及びRxの発現を免疫組織染色により比較した結果を示す。
1．定義
　本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるRx::GFP株（KhES-1由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
　ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
　EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る(Cell, 70: 841-847, 1992)。
　本発明における「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（1）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（2）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466)を挙げることが出来る。
　人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4), pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872；Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。
　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013,341, pp. 651-654）。
　また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞、Ff-I14細胞及びQHJI01s04細胞が、京都大学より入手可能である。
　人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球(PBMC)やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
　人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子の発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、細胞質型RNAベクターであるセンダイウイルスベクター）を用いた感染法、非ウイルスベクターであるプラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、又は、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）等が挙げられる。
　人工多能性幹細胞は、フィーダー細胞存在下またはフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地、すなわち未分化維持因子を含む培地(未分化維持培地)としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地や、フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地として当業者に周知の培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための未分化維持培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8（Life Technologies社製）培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/l), sodium selenite(14 μg/1), insulin(19.4mg /l), NaHCO3(543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1(2 ng/mL) またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。他の市販のフィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、例えば、Essential 6培地（Life Technologies社製）、Stabilized Essential 8培地（Life Technologies社製）、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro(Life Technologies社製)、hESF9（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、TeSR培地(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、StemFit（登録商標）（味の素社製）が挙げられる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダー細胞非存在下で体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMycの4因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。
　本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。
　複能性幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、間葉系幹細胞等の組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）を挙げることができる。
　遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）等に記載の方法を用いて行うことができる。
　具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）を含むゲノムDNAを単離し、単離されたゲノムDNAを用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲッティングベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
　標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離する方法としては、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）やCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons（1987-1997）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems製）やUniversal GenomeWalker Kits（CLONTECH製）などを用いることにより、標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離することもできる。ゲノムDNAの代わりに、標的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いることもできる。当該ポリヌクレオチドは、PCR法で該当するポリヌクレオチドを増幅することにより取得する事ができる。
　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリA選択などの方法を用いることができる。
　選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
　また、ゲノム編集により、遺伝子改変された多能性幹細胞を製造することもできる。ゲノム編集（Genome Editing）とは、Zinc Fingerシステム、CRISPR/Cas9システムやTranscription Activator-Like Effector Nucleases（TALEN）等の技術により遺伝子特異的な破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う遺伝子改変技術である。
　CRISPR/Cas9ゲノム編集システムでは、一般的には、Cas9（DNA切断酵素）の発現ベクター又はmRNAと、ポリメラーゼIIIプロモーター等の制御下でガイドRNAを発現する発現ベクター又はガイドRNA自体を、細胞中に導入する。ガイドRNAは、標的ゲノム配列に相補的なRNA (crRNA)とtracrRNAとの融合RNAであり得る。標的ゲノム配列の3'末端にプロトスペーサー近接モチーフ（PAM - 配列NGG）が存在すると、Cas9がDNA二本鎖を解離させ、ガイドRNAによってターゲット配列を認識して両方の鎖を切断し、切断部位が修復される過程で変異が導入される。
　Transcription activator-like effector nuclease（TALEN）は植物病原菌Xanthomonasspp.が生産するTAL effectorを用いたシステムである。TALEN は、一般的には、TAL effectorのDNA結合ドメインとFokIヌクレアーゼのDNA切断ドメインを融合した人工ヌクレアーゼである。DNA結合ドメインは34アミノ酸の繰り返し配列からなり、1リピートが標的DNAの1塩基を認識する。繰り返し配列中の12，13番目のアミノ酸はrepeat variable di-residues（RVD）と呼ばれ、この配列によって標的塩基が決定される。二組のTALEN分子がゲノム上の特定の配列上に向き合うように設計することで、標的配列上でFokIドメインが二量体化しヌクレアーゼ活性を示す。切断されたDNA二重鎖は細胞内在の機構によって修復されるがその過程で変異が導入される。TALENによるゲノム編集を行う場合には、TALENの発現ベクター又はmRNAを細胞内に導入する。
　本発明における「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
　本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）又はヒト胚性幹細胞（ES細胞）である。
　本発明における「浮遊培養」あるいは「浮遊培養法」とは、細胞または細胞の凝集体が培地に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
　浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
　細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、三角フラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
　接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。
　本発明において細胞の培養に用いられる「培地」は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。「基礎培地」としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
　本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製；現ThermoFisher：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2サプリメント（Life Technologies社製）、ITSサプリメント（Life Technologies社製）が挙げられる。
　浮遊培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のKSR（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約0.5％から約30％、好ましくは約1％から約20％）添加した無血清培地（例えば、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、Chemically-defined Lipid concentrated、及び450μM 1-モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、KSR同等品として特表2001-508302に開示された培地が挙げられる。
　本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　一態様として、本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行ってもよい。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
　本発明において、「物質Xを含む培地」「物質Xの存在下」とは、外来性（exogenous）の物質Xが添加された培地または外来性の物質Xを含む培地、又は外来性の物質Xの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞または組織が当該物質Xを内在的（endogenous）に発現、分泌もしくは産生する場合、内在的な物質Xは外来性の物質Xとは区別され、外来性の物質Xを含んでいない培地は内在的な物質Xを含んでいても「物質Xを含む培地」の範疇には該当しないと解する。
　例えば、「TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質を含む培地」とは、外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が添加された培地または外来性のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質を含む培地である。
　本発明において、「フィーダー細胞」とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞のことである。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（MEF等）、ヒト線維芽細胞、SNL細胞等が挙げられる。フィーダー細胞としては、増殖抑制処理したフィーダー細胞が好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンC）処理又はガンマ線照射もしくはUV照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌や、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。
　本発明において、「フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）」とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えば、フィーダー細胞を添加していない条件、または、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下、好ましくは0.5%以下）の条件が挙げられる。
　本発明において、細胞の「凝集体」（Aggregate）とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体（Embryoid body）、スフェア（Sphere）、スフェロイド（Spheroid）も細胞の凝集体に包含される。好ましくは、細胞の凝集体において、細胞同士が面接着している。一部の態様において、凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞-細胞間結合（cell-cell junction）及び／又は細胞接着（cell adhesion）、例えば接着結合(adherence junction)、を形成している場合がある。本発明における「凝集体」として具体的には、上記本発明［1］の第二工程で生成する、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成する凝集体や、上記本発明［1］の第三工程で生成する、多能性幹細胞から分化誘導された網膜系細胞を含む凝集体が挙げられるが、「凝集体」には、上記本発明［1］の第二工程の浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体も含まれる。第二工程で生成する細胞の凝集体は、「胚様体」（Embryoid body；EB）を包含する。
　本発明において、「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75％以上の凝集体が、当該凝集塊の集団における最大径の平均値±100％、好ましくは平均値±50％の範囲内、より好ましくは平均値±20％の範囲内であることを意味する。
　本発明において、「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで大きさが均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
　「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
　多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
　機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
　細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
　多能性幹細胞を分散する際に、細胞保護剤で処理することにより、多能性幹細胞の細胞死を抑制してもよい。細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、IGFシグナル伝達経路作用物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死（特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死）を抑制するために、分散の際に、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害物質又はMyosinの阻害物質を添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil（HA1077）、H-1152等を挙げることができる。Myosinの阻害物質としてはBlebbistatinを挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。
　例えば、多能性幹細胞を分散させる方法として、多能性幹細胞のコロニーを、細胞保護剤としてROCK阻害物質の存在下、細胞分散液（TrypLE Select）で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
　本発明の製造方法においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（例えば、ウェルの底面積が平底換算で0.1～2.0 cm2程度のプレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば24ウェルプレート（面積が平底換算で1.88 cm2程度）、48ウェルプレート（面積が平底換算で1.0 cm2程度）、96ウェルプレート（面積が平底換算で0.35 cm2程度、内径6～8mm程度）、384ウェルプレートが挙げられる。好ましくは、96ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、平底構造でも、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造でもよい。底面の形状として、例えば、U底、V底、M底が挙げられ、好ましくはM底またはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば、60mm～150mmディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸、又は、くぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは前記細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。
　多能性幹細胞、又は多能性幹細胞を含む細胞集団の凝集体が形成されたこと、及びその均一性は、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性などに基づき判断することが可能である。また、凝集体において上皮様構造が形成されたこと、及びその均一性は、凝集体の巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　本発明における「組織」とは、形態や性質が均一な一種類の細胞、又は、形態や性質が異なる複数種類の細胞が、一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
　本発明において、「神経組織（Neural tissue）」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、末梢神経、前脳、後脳、終脳、間脳等の、神経系細胞によって構成される組織を意味する。細胞凝集体中の神経組織は、光学顕微鏡（例えば、明視野顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、実体顕微鏡等）による顕鏡や、PSA-NCAMやN-cadherin等の神経組織マーカーの発現を指標とする事で確認できる。
　神経組織は、「神経上皮組織」（層構造をもつ上皮構造）を形成可能である。神経上皮組織の特徴は、当該組織に含まれる細胞の形態、組織中の細胞体の配向、組織全体の透明度、巨視的形態などの指標で判別する事ができる。また、細胞凝集体中の神経上皮組織は光学顕微鏡を用いた明視野観察により存在量を評価することができる。
　本発明において、「神経系細胞（Neural cell）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞は、Nestin、TuJ1、PSA-NCAM、N-cadherin等をマーカーとして同定することができる。神経細胞（Neuron・Neuronal cell）は、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、TuJ1、Dcx、HuC/D等の幼若神経細胞マーカー、及び／又は、Map2、NeuN等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
　神経系細胞には、下述する網膜系細胞が包含される。
　本発明における「網膜系細胞（Retinal cell）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞またはその前駆細胞を意味し、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞、網膜色素上皮細胞（RPE）、毛様体周縁部細胞、これらの前駆細胞などの細胞が含まれるがこれらに限定されない。本発明における「網膜組織（Retinal tissue）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する上記細胞が一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。
　本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。
　本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟な網膜層特異的神経細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
　本発明における「神経網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、等のいずれか1つあるいは複数の成熟な網膜層特異的神経細胞に分化しうる前駆細胞をいう。一般的には、神経網膜前駆細胞は、網膜色素上皮細胞へは分化しない。
　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　本発明における「網膜層特異的神経細胞（Retinal layer-specific neural cell）」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、桿体視細胞及び錐体視細胞を挙げることができる。
　網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するRx（Raxとも言う）、PAX6及びChx10、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSox1、視細胞の前駆細胞で発現するCrx、Blimp1などが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するChx10、PKCα及びL7、網膜神経節細胞で発現するTuJ1及びBrn3、アマクリン細胞で発現するCalretinin、水平細胞で発現するCalbindin、成熟視細胞で発現するRhodopsin及びRecoverin、桿体視細胞で発現するNrl及びRhodopsin、錐体視細胞で発現するRxr-gamma、S-Opsin及びM/L-Opsin、網膜色素上皮細胞で発現するRPE65及びMitf、毛様体周縁部細胞で発現するRdh10及びSSEA1などが挙げられる。
2．網膜系細胞又は網膜組織の製造方法
　本発明の一態様は、下記工程（1）～（3）を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法である：
（1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地中で培養する第一工程、
（2）第一工程で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
（3）第二工程で得られた凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
2-1.　工程（1）について
　工程（1）においては、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地中で培養する。
　工程（1）における好ましい多能性幹細胞として、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞（ES細胞）、より好ましくはヒト人工多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞（ES細胞）が挙げられる。
　ここで人工多能性幹細胞の製造方法には特に限定はなく、上述のとおり当業者に周知の方法で製造することができるが、人工多能性幹細胞の作製工程（すなわち、体細胞を初期化し多能性幹細胞を樹立する工程）もフィーダーフリーで行うことが望ましい。
　ここで胚性幹細胞（ES細胞）の製造方法には特に限定はなく、上述のとおり当業者に周知の方法で製造することができるが、胚性幹細胞（ES細胞）の作製工程もフィーダーフリーで行うことが望ましい。
　工程（1）で用いられる多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、当業者に周知の方法で実施することができる。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、接着培養でも浮遊培養でも実施することができるが、好ましくは接着培養で実施される。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、フィーダー存在下で実施してもよいしフィーダーフリーで実施してもよいが、好ましくはフィーダーフリーで実施される。多能性幹細胞の維持培養及び拡大培養におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下の）条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において、多能性幹細胞の維持培養及び拡大培養が実施される。
　工程（1）におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において、工程（1）が実施される。工程（1）において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されないが、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。
　未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（Primed pluripotent stem cells）（例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞）の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、bFGF、FGF4やFGF8）が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、ActivinA、ActivinBが挙げられる。未分化維持因子として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。ヒト多能性幹細胞（ヒトES細胞、ヒトiPS細胞等）を培養する場合、工程（1）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、bFGFを含む。
　本発明に用いる未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよいが、好適には培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子が用いられる。例えば、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例、bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等）が用いられる。ここで「ヒトタンパク質X」とは、タンパク質Xが、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Xのアミノ酸配列を有することを意味する。
　本発明に用いる未分化維持因子は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、更に好ましくは100％である。従って、一態様において、本発明は、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。また、一態様において、工程（1）に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来性（又は外因性）に添加する工程を含む。あるいは、工程（1）に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
　工程（1）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、具体的には、未分化維持因子として、フィーダー細胞非存在下でbFGFを用いる場合、その濃度は、通常4 ng～500 ng/mL程度、好ましくは10 ng～200 ng/mL程度、より好ましくは30 ng～150 ng/mL程度である。
　工程（1）で用いられるフィーダーフリー培地（すなわち、未分化維持培地）として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8（Life Technologies社製）培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/l), sodium selenite(14 μg/1), insulin(19.4mg /l), NaHCO3(543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1(2 ng/mL) またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。他の市販のフィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、例えば、Essential 6培地（Life Technologies社製）、Stabilized Essential 8培地（Life Technologies社製）、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro(Life Technologies社製)、hESF9（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、TeSR培地(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、StemFit（登録商標）（味の素社製）が挙げられる。上記工程（1）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。
　工程（1）における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養の何れの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
　接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養容器を使用することもできる。好ましくは、ラミニンが挙げられ、より好ましくは、ラミニン511E-8が挙げられる。ラミニン511E-8は、市販品を購入する事ができる(例：iMatrix-511、ニッピ)。
　工程（1）において用いられる培地は、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。具体的には、例えば、上述の未分化維持培地に、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加する事ができる。第一工程において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理してから、第二工程において浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、凝集体の質が向上し、未分化性を維持した細胞凝集体を高効率で製造することができる。この様にして得られる細胞凝集体は、例えば、丸く、表面が滑らかで、凝集体の内部が密であるという特徴を示す事が期待できる。
　TGFβファミリーシグナル伝達経路（すなわちTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路）とは、TGFβ、Nodal/Activin、又はBMPをリガンドとし、細胞内でSmadファミリーにより伝達される、シグナル伝達経路である。
　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβファミリーシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはTGFβシグナル伝達経路阻害物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等）を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Lefty等が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等が挙げられる。ここでSB431542（4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド）及びA-83-01（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）は、TGFβ受容体(ALK5)及びActivin受容体(ALK4/7)の阻害剤（すなわちTGFβR阻害剤）として公知の化合物である。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはSB431542又はA-83-01である。
　Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質としては、Nodal又はActivinに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、NodalもしくはActivinに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、NodalもしくはActivinをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Nodal／Activin受容体とNodal／Activinの結合を阻害する物質、Nodal／Activin受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。Nodal／Activinシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、A-83-01等が挙げられる。また、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質（Lefty、Cerberus等）を使用してもよい。Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Nodal／Activinシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、SB431542、A-83-01又はLeftyである。
　BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、BMPに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでBMPとしては、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7が挙げられる。当該物質として例えば、BMPに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、BMP受容体（BMPR）とBMPの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMPRとして、ALK2又はALK3を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、LDN193189、Dorsomorphin等が挙げられる。ここでLDN193189（4-[6-(4-ピペラジン-1-イルフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）は、公知のBMPR(ALK2/3)阻害剤（以下、BMPR阻害剤）であり、通常は塩酸塩の形態で市販されている。また、BMPシグナル伝達経路阻害物質として知られるタンパク質（Chordin、Noggin等）を使用してもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはLDN193189である。
　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である。
　作用点が異なる複数種類のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質を組み合わせて用いても良い。組み合わせることにより、凝集体の質を向上する効果が増強されることが期待される。例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とBMPシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、BMPシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせが挙げられるが、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質がBMPシグナル伝達経路阻害物質と組み合わせて用いられる。具体的な好ましい組み合わせとしては、SB431542とLDN193189との組み合わせが挙げられる。
　ソニック・ヘッジホッグシグナル（以下、Shhと記すことがある。）伝達経路作用物質とは、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白質（例えば、ShhやIhh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、PMA（Purmorphamine; 9-シクロヘキシル-N-[4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-(1-ナグタレニルオキシ)-9H-プリン-6-アミン）、又はSAG（Smoothened Agonist； N-メチル-N'-(3-ピリジニルベンジル)-N'-(3-クロロベンゾ[b]チオフェン-2-カルボニル)-1,4-ジアミノシクロヘキサン）等が挙げられる。Shhシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Shhシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはShhタンパク質（Genbankアクセッション番号：NM_000193、NP_000184）、SAG又はPMAである。
　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とShhシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いても良い。組み合わせることにより、凝集体の質を向上する効果が増強される。具体的な組み合わせとしては、例えば、Lefty、SB431542、A-83-01及びLDN193189からなる群から選択されるいずれかのTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質と、Shhタンパク質、SAG及びPMAからなる群から選択されるいずれかのShhシグナル伝達経路作用物質との組み合わせが挙げられる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とShhシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いる場合、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とShhシグナル伝達経路作用物質の両方を含む培地中で細胞を培養してもよいし、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、いずれか一方又は両方で引き続き細胞を処理してもよい。または、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質の両方で細胞を処理した後、いずれか一方で引き続き細胞を処理してもよい。
　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SB431542は、通常0.1～200 μM、好ましくは2～50 μMの濃度で使用される。A-83-01は、通常0.05～50 μM、好ましくは0.5～5 μMの濃度で使用される。LDN193189は、通常1～2000 nM、好ましくは10～300 nMの濃度で使用される。Leftyは、通常5～200 ng/ml、好ましくは10～50 ng/mlの濃度で使用される。Shhタンパク質は、通常20～1000 ng/ml、好ましくは50～300 ng/mlの濃度で使用される。SAGは、通常、1～2000 nM、好ましくは10～700 nM、より好ましくは30～600 nMの濃度で使用される。PMAは、通常0.002～20 μM、好ましくは0.02～2 μMの濃度で使用される。一態様において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、前記濃度のSB43154と同等のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害活性を有する量で適宜使用することができる。また、一態様において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を有する量で適宜使用することができる。
　尚、SB431542やLDN193189等のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害活性は、当業者に周知の方法、例えばSmadのリン酸化をウェスタンブロッティング法で検出することで決定できる（Mol Cancer Ther. (2004) 3, 737-45.）。SAG等のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばGli1遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Oncogene (2007) 26, 5163-5168）。
　工程（1）において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよいが、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、無血清培地である。
　工程（1）において用いられる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、含有成分が化学的に決定された培地であってもよい
　工程（1）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、培地として前記フィーダーフリー培地（すなわち、未分化維持培地）を用いるとよい。フィーダーフリー培地（未分化維持培地）として、Essential 8培地、Essential 6培地、Stabilized Essential 8培地、S-medium培地、StemPro培地、hESF9培地、TeSR培地、mTeSR培地（mTeSR1、mTeSR2など）、TeSR-E8、又はStemFit（登録商標）培地等が挙げられ、好ましくはEssential 8培地又はStemFit（登録商標）培地が用いられる。
　工程（1）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
　足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）、ラミニン断片(Nat Commun 3, 1236 (2012))、基底膜標品 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001))、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Vitronectin）等が挙げられる。
　「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、5種のα鎖、4種のβ鎖および3種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約15種類のアイソフォームを有する。α鎖（α1～α5）、β鎖（β1～β4）およびγ鎖（γ1～γ3）のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα5鎖、β1鎖、γ1鎖の組合せによるラミニンをラミニン511という。本発明においては、好ましくはラミニン511が用いられる（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）。
　本発明で用いるラミニンは、通常哺乳動物のラミニンである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。ゼノフリー条件を達成する観点から、好適には培養する細胞と同一種の哺乳動物のラミニンが用いられる。例えば、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒトラミニン（好ましくは、ヒトラミニン511）が用いられる。
　本発明で用いるラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくは、E8フラグメントである。ラミニンE8フラグメントは、ラミニン511をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（EMBO J., 3:1463-1468, 1984、J. Cell Biol., 105:589-598, 1987）。本発明においては、好ましくはラミニン511のE8フラグメントが用いられる（NatCommun 3, 1236 (2012)、Scientific Reports 4, 3549 (2014)）。本発明に用いられるラミニンE8フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。未同定成分の混入を回避する観点から、本発明においては、好ましくは、組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン511のE8フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
　本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、好ましくは単離されている。
　本発明における「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。例えば、本発明により製造された網膜系細胞・網膜組織を分散させ、更に接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えば、MatrigelTM（コーニング社製：以下、マトリゲルと記すこともある））やGeltrexTM（Life Technologies社製）、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
　MatrigelTMは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫から抽出された基底膜調製物である。MatrigelTMの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであり、これらに加えてTGFβ、FGF、組織プラスミノゲン活性化因子及びEHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。MatrigelTMの「growth factor reduced製品」は、通常のMatrigelTMよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はEGFが＜0.5 ng/ml、NGFが＜0.2 ng/ml、PDGFが＜5 pg/ml、IGF1が5 ng/ml、TGFβが1.7 ng/mlである。
　未同定成分の混入を回避する観点から、本発明においては、好ましくは、単離されたラミニン又はラミニン断片が用いられる。
　好ましくは、工程（1）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、単離されたラミニン511又はラミニン511のE8フラグメント（更に好ましくは、ラミニン511のE8フラグメント）により、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
　工程（1）における多能性幹細胞の培養時間は、工程（2）において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲であれば特に限定されないが、通常0.5～144時間である。工程（1）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは1時間以上、2時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、20時間以上、又は24時間以上である。工程（1）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは96時間以内、72時間以内、60時間以内、48時間以内、又は28時間以内である。一態様において、工程（1）における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間）である。即ち、工程（2）における浮遊培養開始の0.5～144時間（好ましくは、12～60時間、18～48時間、又は18～28時間）前に第一工程を開始し、工程（1）を完了した後引き続き工程（2）が行われる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、他方で引き続き細胞を処理する場合、それぞれの処理時間が、独立して、上述の培養時間の範囲内となるようにすることができる。
　また、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質の両方で細胞を処理した後、いずれか一方で引き続き細胞を処理する場合、および、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、両方で引き続き細胞を処理する場合も、それぞれの処理時間が、独立して、上述の培養時間の範囲内となるようにすることができる。
　一態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。この場合において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質の濃度としては、3μM～10μMのSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度、又は50 nM～200 nMのLDN193189と同等のBMPシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度が挙げられ、Shhシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、100 nM～500 nMのSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度が挙げられる。
　別の態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。この場合において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質の濃度としては、3μM～10μMのSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度、又は50 nM～200 nMのLDN193189と同等のBMPシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度が挙げられ、Shhシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、100 nM～500 nMのSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度が挙げられる。
　別の態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542もしくはLDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。この場合において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質の濃度としては、3μM～10μMのSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度、又は50 nM～200 nMのLDN193189と同等のBMPシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度が挙げられ、Shhシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、100 nM～500 nMのSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度が挙げられる。
　工程（1）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地（未分化維持培地）中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511、ラミニン511のE8フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくは、フィーダーフリー培地（未分化維持培地）としてEssential 8、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、又はStemFit（登録商標）培地、更に好ましくはEssential 8又はStemFit（登録商標）培地を用いて実施される。
　一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。
　好ましい態様において、工程（1）により得られる細胞は多能性様性質（pluripotent-like state）が維持された細胞であり、工程（1）を通じて多能性様性質が維持される。多能性様性質とは、多能性を含む、多能性幹細胞に共通する多能性幹細胞に特有の形質の少なくとも一部を維持している状態を意味する。多能性様性質には厳密な多能性は要求されない。具体的には、多能性性質（pluripotent state）の指標となるマーカーの全て又は一部を発現している状態が、「多能性様性質」に含まれる。多能性様性質のマーカーとしては、Oct3/4陽性、アルカリフォスファターゼ陽性などが挙げられる。一態様において、多能性様性質が維持された細胞は、Oct3/4陽性である。Nanogの発現量がES細胞もしくはiPS細胞に比べて低い場合であっても「多能性様性質を示す細胞」に該当する。
　一態様において、工程（1）により得られる細胞は、少なくとも網膜系細胞や網膜組織（好ましくは、網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する幹細胞である。一態様において、工程（1）により得られる細胞は、少なくとも網膜系細胞や網膜組織（好ましくは、網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する、Oct3/4陽性の幹細胞である。一態様として、工程（1）により得られる細胞は、Oct3/4陽性の幹細胞を60%以上、例えば90%以上を含む。
　好ましい態様において、工程（1）において、ヒト多能性幹細胞（例、iPS細胞、ES細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養する。
　工程（1）における上記の当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189、Chordin、Noggin）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはShhタンパク質、SAG又はPurmorphamine(PMA)、より好ましくはSAGである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。培養時間は、0.5～144時間（好ましくは、2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間））である。当該培養の途中において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）、Shhシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）又はその組み合わせを変更してもよい。一態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。別の態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方またはいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。
　例えば、工程（1）開始前に、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地中で維持培養しておき、この培養中へTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、培養を継続することにより工程（1）を実施する。具体的には、例えば、維持培養終了後、工程（1）を開始する際に、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加した未分化維持培地の添加や、該未分化維持培地への一部もしくは全部の培地交換を行い、培養を継続する。
　例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含む無血清培地中で維持培養する。当該維持培養は、好ましくは接着培養により行われる。当該接着培養は、好ましくは、ビトロネクチン、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。維持培養する期間は、特に限定されない。多能性幹細胞は分化能を維持した増殖（好ましくは、自己複製）できる細胞であり、維持培養とは多能性を維持できるような培養法であるため、適切に操作すれば無限に維持培養させることが可能である。一部の態様において、維持培養の途中で、多能性幹細胞を凍結させて凍結細胞ストックをつくり、当該凍結細胞ストックを起眠させて維持培養を継続することができる。起眠後の培養期間は特に限定されないが、例えば約1日～1000日間、好ましくは約7日～150日間、より好ましくは約10日～90日間が挙げられる。一部の態様において、維持培養の途中で、細胞の継代操作を行うことができる。
　工程（1）では上述の様に維持培養したヒト多能性幹細胞を含む培地中へTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、培養を継続する。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはShhタンパク質、SAG又はPMAである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。添加後、0.5～144時間（好ましくは、2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間））培養を継続する。当該培養の途中において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）、Shhシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）又はその組み合わせを変更してもよい。一態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。別の態様として、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）のいずれか一方で18～28時間（例、24時間）培養し、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質(例：SB431542、LDN193189)及びShhシグナル伝達経路作用物質（例：SAG）の両方またはいずれか一方で更に18～28時間（例、24時間）培養する事ができる。
2-2.　工程（2）について
　工程（1）で得られた細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養することにより細胞の凝集体を形成させる工程（2）について説明する。
　本発明における工程（2）における浮遊培養開始時点とは、以下の操作を行う時点である。
・操作：工程（1）で用いる未分化維持培地（すなわち、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地)から培地交換を行い、かつ、浮遊培養へ移行する操作。
　上記操作における培地交換とは、未分化維持培地以外への培地交換であり、本発明の網膜系細胞及び／又は網膜組織、又はその中間体への分化誘導が可能な培地であれば特に限定はなく、例えば、後述する基礎培地等、「未分化維持因子」を含まない培地が挙げられる。工程（2）開始時点、すなわち培地交換時点ではWntシグナル伝達経路阻害物質を含んでいても含んでいなくてもよく、後述するように、培地交換後にWntシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。
　工程（2）において用いられる培地（基礎培地）としては、特に限定はなく、上記定義の項で記載した基礎培地を適宜選択することができる。工程（2）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1：1の混合液に10％ KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又は、GMEMに5％～20％KSR、NEAA、ピルビン酸、2-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒト多能性幹細胞の場合は、通常約1％から約30％であり、好ましくは約2％から約20％（例：約5%、約10%）である。
　工程（2）において用いられる培地は、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む。工程（1）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、工程（2）において、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させることにより、凝集体の質が、更に向上し、未分化性を維持した細胞の凝集体、また網膜細胞への分化に適した凝集体を高効率で形成できる。この様にして得られる細胞凝集体は、例えば、丸く、表面が滑らかで、形が崩れておらず、凝集体の内部が密であるという特徴を示す事が期待できる。
　工程（2）に用いる、Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、蛋白質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Wntにより媒介されるシグナルは、Frizzled（Fz）及びLRP5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6）のヘテロ二量体として存在するWnt受容体を介して伝達される。Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Wnt又はWnt受容体に直接作用する物質（抗Wnt中和抗体、抗Wnt受容体中和抗体等）、Wnt又はWnt受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Wnt受容体とWntの結合を阻害する物質（可溶型Wnt受容体、ドミナントネガティブWnt受容体等、Wntアンタゴニスト、Dkk1、Cerberus蛋白等）、Wnt受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質[CKI-7（N-(2-アミノエチル)-5-クロロイソキノリン-8-スルホンアミド)、D4476（4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド）、IWR-1-endo (IWR1e) （4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル]-N-8-キノリニル-ベンズアミド）、並びに、IWP-2（N-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)-2-[(3,4,6,7-テトラヒドロ-4-オキソ-3-フェニルチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)チオ]アセタミド）等の低分子化合物等]等が挙げられるが、これらに限定されない。Wntシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2等は公知のWntシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Wntシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはIWR1eが用いられる。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばIWR-1-endoの場合は、約0.1 μMから約100 μM、好ましくは約0.3 μMから約30 μM、より好ましくは約1 μMから約10 μM、更に好ましくは約3 μMの濃度となるように培地に添加する。IWR-1-endo以外のWntシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記IWR-1-endoの濃度と同等のWntシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。Wntシグナル伝達経路阻害物質は、工程（2）における浮遊培養開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、より好ましくは12時間以内、更に好ましくは工程（2）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部もしくは全部の培地交換を行う事ができる。工程（1）で得られた細胞を、工程（2）においてWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、好ましくは、工程（2）における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、工程（2）終了時(BMPシグナル伝達経路作用物質添加直前)まで作用させる。更に好ましくは、後述する通り、工程（2）終了後（すなわち工程（3）の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、工程（2）終了後（すなわち工程（3）の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、神経上皮組織及び／又は神経組織が形成されるまで作用させても良い。神経上皮組織及び／又は神経組織が形成されたことは上述の方法で確認する事ができる。
　凝集体の形成に際しては、まず、工程（1）で得られた細胞の分散操作により、分散された細胞を調製する。分散操作により得られた「分散された細胞」とは、例えば7割以上が単一細胞であり2～50細胞の塊が3割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞として、好ましくは、8割以上が単一細胞であり、2～50細胞の塊が2割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態があげられる。一部の態様において、分散された細胞とは、細胞－細胞間結合（例えば、接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。
　工程（1）で得られた細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
　細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、IGFシグナル伝達経路作用物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するための細胞保護剤として、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤又はMyosinの阻害剤を添加してもよい。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制し、細胞を保護するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤又はMyosinの阻害剤を第二工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil（HA1077）、H-1152等を挙げることができる。Myosinの阻害剤としてはBlebbistatinを挙げることができる。
　細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
　機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
　分散された細胞は上記培地中に懸濁される。例えば、分散した細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質（及び必要に応じてROCK阻害剤等の細胞保護剤）を含有する無血清培地中に懸濁することにより、工程（2）における浮遊培養開始時から、Wntシグナル伝達経路阻害物質による処理が可能となる。
　そして、分散された細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。
　この際、分散された細胞を、10cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養器中に複数の細胞の凝集塊を同時に形成させてもよいが、こうすると凝集塊ごとの大きさにばらつきが生じる。そこで、例えば、96穴マイクロプレートのようなマルチウェルプレート（U底、V底、M底）の各ウェルに一定数の分散された幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて1個の凝集体が形成される。この凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な凝集体の集団を得ることができる。
　工程（2）における細胞の濃度は、細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96穴マイクロウェルプレートを用いてヒト細胞（例、工程（1）においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1 x 103から約1 x 105細胞、好ましくは約3 x 103から約5 x 104細胞、より好ましくは約4 x 103から約2 x 104細胞、更に好ましくは、約4 x 103から約1.6 x 104細胞、より更に好ましくは約8 x 103から約1.2 x 104細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
　工程（2）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　工程（2）において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90％程度、例えば40～60％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90％、例えば40～60％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
　ある時点で、特定の成分（例えば、分化誘導因子）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い、具体的には終濃度の1.5～3倍、例えば終濃度の約2倍の濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作、半量培地交換）を行ってもよい。
　ある時点で、元の培地に含まれる特定の成分の濃度を維持する場合、例えば元ある培地を半量程度捨てて、元の培地に含まれる濃度と同じ濃度の特定の成分を含む新しい培地を半量程度加える操作を行ってもよい。
　ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回（例えば2～3回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
　培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペットを使ってもよい。
　細胞の凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞の凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えば、ヒト細胞（例、工程（1）においてヒトiPS細胞から得られた幹細胞）の場合には、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内に集合した細胞を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの時間は、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内である。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心分離条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
　細胞の凝集体が形成されたこと、及びその均一性は、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　凝集体が形成された後、そのまま、凝集体の培養を継続してもよい。工程（2）における浮遊培養の時間は、通常24時間～6日間、好ましくは24時間～3日間、さらに好ましくは24時間～48時間程度である。
　一態様において、工程（2）において用いられる培地は、更にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい。工程（1）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、工程（2）において、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させることにより、凝集体の質が、更に向上し、未分化性を維持した細胞の凝集体（例えば、丸く、表面が滑らかで、形が崩れていない、凝集体の内部が密な、未分化性を維持した細胞の凝集体）を高効率で形成することが期待できる。
　ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを用いることができる。好ましくは、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質はSAG、Purmorphamine（PMA）又はShhタンパク質である。一態様において、工程（2）において、工程（1）で用いたものと同じ種類のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いる事ができる。培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（2）において用いられるSAGは、通常、1～2000 nM、好ましくは10 nM～1000 nM、より好ましくは10 nM～700 nM、更に好ましくは50 nM～700 nM、更に好ましくは100 nM～600 nM、更に好ましくは100 nM～500 nMの濃度で使用される。別の態様として、工程(2)において用いられるSAGは、通常、1～2000 nM、好ましくは3 nM～100 nM、より好ましくは5 nM～50 nM、更に好ましくは10 nM～30 nMの濃度で使用される。工程（2）において用いられるPMAは通常0.002～20 μM、好ましくは0.02～2 μMの濃度で使用される。工程（2）において用いられるShhタンパク質は、通常20～1000 ng/ml、好ましくは50～300 ng/mlの濃度で使用される。SAG、PMA、Shhタンパク質以外のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記SAGの濃度（例えば、5 nM～50 nM）と同等のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
　ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、工程（2）における浮遊培養開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、より好ましくは12時間以内、更に好ましくは工程（2）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、工程（2）終了時(BMPシグナル伝達経路作用物質添加直前)までの任意の期間（例：約24時間、約48時間、工程(2)終了時まで）培地に含まれ得る。一態様において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、Wntシグナル伝達経路阻害物質と同時に添加され、工程(2)において同期間（例、工程（2）の終了まで）培地に含まれる。
　一態様において、工程（2）において用いられる培地は、更にTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよい。工程（1）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、第二工程において、第一工程で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）、又はWntシグナル伝達経路阻害物質、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させることにより、凝集体の質が、更に向上し、未分化性を維持した細胞の凝集体（例えば、丸く、表面が滑らかで、形が崩れていない、凝集体の内部が密な、未分化性を維持した細胞の凝集体）を高効率で形成することが期待できる。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、上述したものを用いることができる。好ましくは、TGFβシグナル伝達経路阻害物質はSB431542又はA83-01である。一態様において、工程（2）において、工程（1）で用いたものと同じ種類のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いる事ができる。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SB431542は、通常0.1～200 μM、好ましくは2～50 μM、より好ましくは3～10μMの濃度で使用される。A-83-01は、通常0.05～50 μM、好ましくは0.5～5 μMの濃度で使用される。SB431542又はA-83-01以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記SB431542の濃度と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、工程（2）における浮遊培養開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、より好ましくは12時間以内、更に好ましくは工程（2）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。工程（2）において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、工程（2）終了時(BMPシグナル伝達経路作用物質添加直前)までの任意の期間（例：約24時間、約48時間、工程(2)終了時まで）培地に含まれる。一態様において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、Wntシグナル伝達経路阻害物質と同時に添加され、同期間（例、工程（2）の終了まで）培地に含まれる。
　尚、工程（2）において用いられる培地は、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を実質的に含まなくてもよい。本明細書において、工程(1)において用いる培地がTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む場合、培地交換（例えば全量程度の培地交換）の際に工程(1)から工程（2）へ持ち越されるTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度が、その生物学的活性（即ち、TGFβシグナル伝達経路阻害活性）が発現しない程度（例えば、SB431542であれば、5 nM以下）にまで抑制されている場合、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を実質的に含まない培地とみなすことができる。本明細書中、TGFβシグナル伝達経路阻害物質以外の物質についても、同様に解釈するものとする。例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地での培地交換操作により、工程(1)からのTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542）の持越しを、工程(1)において用いる培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542）の濃度の3%以下、好ましくは1％以下、0.3％以下、0.1％以下、0.03%以下、又は0.01%以下にまで抑制し、培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度を、その生物学的活性（即ち、TGFβシグナル伝達経路阻害活性）が発現しない程度（例えば、SB431542であれば、5nM以下）にまで抑制することにより、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を実質的に含まない培地を得ることができる。旧培地中の成分の新鮮な培地への持越しは、培地交換（例えば全量程度の培地交換）の際に、旧培地を抜き取った後、新鮮な培地で1回又は複数回、細胞及び培養容器を共洗いすることにより、最小限に抑制することができる。
　また、工程（2）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まなくてもよい。本明細書において、工程(1)において用いる培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む場合、培地交換（例えば全量程度の培地交換）の際に工程(1)から工程（2）へ持ち越されるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度が、その生物学的活性（即ち、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路活性化）が発現しない程度（例えば、SAGであれば、0.03 nM以下）にまで抑制されている場合、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地とみなすことができる。例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地での培地交換操作により、工程(1)からのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG）の持越しを、工程(1)において用いる培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG）の濃度の3%以下、好ましくは1％以下、0.3％以下、0.1％以下、0.03%以下、又は0.01%以下にまで抑制し、培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度を、その生物学的活性（即ち、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路活性化）が発現しない程度（例えば、SAGであれば、0.03 nM以下）にまで抑制することにより、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地を得ることができる。旧培地中の成分の新鮮な培地への持越しは、培地交換（例えば全量程度の培地交換）の際に、旧培地を抜き取った後、新鮮な培地で1回又は複数回、細胞及び培養容器を共洗いすることにより、最小限に抑制することができる。
　好ましい態様において、工程（2）においては、工程（1）で得られたヒト細胞（例、工程（1）によりヒトiPS細胞から得られた細胞）を、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む無血清培地中で浮遊培養に付し、凝集体を形成する。培地は、更にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含んでいてもよい。Wntシグナル伝達経路阻害物質の添加時期と、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、Wntシグナル伝達経路阻害物質と、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質とは、両者とも浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ROCK阻害剤（例、Y-27632）を添加してもよい。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　例えば、工程（1）で得られたヒト細胞（例、工程（1）によりヒトiPS細胞から得られた細胞）を回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）、並びにソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含む無血清培地中に分散し、浮遊培養に付す。該無血清培地は、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含んでいても良い。ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の懸濁液を、上述の培養器中に播き、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集体を形成する。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　好ましい一態様においては、工程（1）において、多能性幹細胞を、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含有する又は含有しない培地中で培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、工程（1）において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を使用することができる。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　好ましい一態様においては、工程（1）において、多能性幹細胞を、BMPシグナル伝達経路阻害物質を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含有する又は含有しない培地中で培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、工程（1）において、BMPシグナル伝達経路阻害物質としてLDN193189又はDorsomorphin、より好ましくはLDN193189を使用することができる。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　好ましい一態様においては、工程（1）において、多能性幹細胞をソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有し、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及び／又はBMPシグナル伝達経路阻害物質を含有する又は含有しない培地中で培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、工程（1）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAGを使用することができる。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　好ましい一態様において、工程（1）において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせを含む培地中で培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含む培地（一態様において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含まない）、又はWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含む培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　別の態様において、工程（1）において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせを含む培地中で培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む培地；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む培地：又は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含む培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　別の態様において、工程（1）において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）およびソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせを含む培地中で18時間～30時間(例：約24時間)培養（好ましくは、接着培養）し、その後ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）を含む培地で更に18時間～30時間(例：約24時間)培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む培地；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む培地：又は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含まず、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含む培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　別の態様において、工程（1）において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）およびソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせを含む培地中で18時間～30時間(例：約24時間)培養（好ましくは、接着培養）し、その後ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）を含む培地で更に18時間～30時間(例：約24時間)培養（好ましくは、接着培養）し、かつ、工程（2）において、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含有し、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない培地で工程（1）において得られた細胞の浮遊培養が実施される。工程（2）の培養時間は24時間～6日間、好ましくは24時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
　いずれの態様においても、工程（2）の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含む。
　このようにして、工程（2）を実施することにより、工程（1）で得られた細胞、又はこれに由来する細胞の凝集体が形成される。本発明はこのような凝集体の製造方法をも提供する。工程（2）で得られる凝集体は、工程（1）において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理しない場合よりも、高い品質を有している。具体的には、例えば、丸く、表面が滑らかで、凝集体の内部が密であり、形が崩れていない凝集体の割合に富んだ、凝集体の集団を得ることが出来る。一態様において、第二工程開始から6日目に無作為的に凝集体（例えば、100個以上）を選出した際に、崩れていない凝集体の割合及び／又は嚢胞化していない凝集体の割合の和が、例えば70％以上、好ましくは80％以上である。
　工程（2）で得られる凝集体は、網膜系細胞や網膜組織（例：網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する。
　一態様において、工程（1）で得られた、少なくとも網膜系細胞や網膜組織（例：網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する幹細胞（好ましくは、少なくとも網膜系細胞や網膜組織（例：網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する、Oct3/4陽性の幹細胞）を工程（2）で用いることにより、少なくとも網膜系細胞や網膜組織（例：網膜組織、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞）へ分化する能力を有する幹細胞（好ましくはOct3/4陽性幹細胞）を含む凝集体を得ることができる。工程（2）で得られる凝集体を、適切な分化条件下で培養することにより、網膜系細胞や網膜組織を高い効率で誘導することが出来る。
　一態様において、工程（2）で得られる凝集体には、工程（1）終了時に得られる多能性様性質を保持した細胞（具体的には、Oct3/4を発現している）と、網膜系細胞や網膜組織との間の、中間段階の細胞に相当する細胞が含まれる。当該細胞は、(i) 多能性性質マーカーOct3/4、並びに(ii) 前述の網膜系細胞マーカー（Rx、PAX6、Chx10、Crx、Blimp1）及び／又は前述の網膜層特異的神経細胞マーカーのいずれかを発現している。即ち、一態様において、工程（2）で得られる凝集体には、(i) 多能性性質マーカーOct3/4、並びに(ii) 前述の網膜系細胞マーカー（Rx、PAX6、Chx10、Crx、Blimp1）及び／又は前述の網膜層特異的神経細胞マーカーのいずれかを発現している細胞の混合物が含まれる。すなわち、工程（2）で得られる凝集体は、少なくとも網膜系細胞又は網膜組織へ分化する能力を有する幹細胞、及び／又は網膜系細胞又は網膜組織の前駆細胞を含む。当該前駆細胞は、公知の適切な培養条件で培養すれば、前述の網膜系細胞又は網膜層特異的神経細胞マーカーを発現する能力（competence）があることを特徴とする。従って、一態様において、工程（2）で得られる凝集体には、Oct3/4陽性の、少なくとも網膜系細胞又は網膜組織へ分化する能力を有する幹細胞、及び／又は網膜系細胞又は網膜組織の前駆細胞を含む。工程（2）で得られる凝集体に含まれる細胞の一部が、上述の網膜層特異的細胞マーカーを発現していてもよい。一態様において、工程（2）で得られる凝集体に含まれる全細胞中のOct3/4陽性の割合が50％以上、例えば70％以上であり得る。
2-3.　工程（3）について
　工程（2）で得られた凝集体から、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体を誘導する工程（3）について説明する。
　工程（3）において用いられる培地（基礎培地）としては、特に限定はなく、上記定義の項で記載した基礎培地を適宜選択することができる。また、工程（3）において用いられる培地は、例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）である。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1：1の混合液に10％ KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒト多能性幹細胞（例、iPS細胞）の場合は、通常約1％から約20％であり、好ましくは約2％から約20％である。
　工程（3）で用いられる培地（好ましくは、無血清培地）は、工程（2）で用いた培地（好ましくは、無血清培地）をそのまま用いることもできるし、新たな培地（好ましくは、無血清培地）に置き換えることもできる。工程（2）で用いた、BMPシグナル伝達経路物質を含まない培地をそのまま工程（3）に用いる場合、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
　工程（3）に用いる、BMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばBMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMP蛋白、GDF7等のGDF蛋白、抗BMP受容体抗体、又は、BMP部分ペプチドなどが挙げられる。BMP2蛋白、BMP4蛋白及びBMP7蛋白は例えばR＆D Systemsから、GDF7蛋白は例えば和光純薬から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはBMP4である。
　BMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトBMP4の場合は、約0.01 nMから約1 μM、好ましくは約0.1 nMから約100 nM、より好ましくは約1 nMから約10 nM、更に好ましくは約1.5 nM（55 ng/mL）の濃度となるように培地に添加する。BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記BMP4の濃度と同等のBMPシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
　培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、工程（3）の期間中変動させてもよい。例えば、工程（3）の開始時において、BMPシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。一態様として、工程（3）の開始から一定期間（例えば、4～10日）、一定濃度(例えば、約1.5 nM)のBMPシグナル伝達経路作用物質で培養した後、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
　BMPシグナル伝達経路作用物質は、工程（2）の浮遊培養開始から約24時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、15日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、BMPシグナル伝達経路作用物質は、工程（2）の浮遊培養開始後1日目から15日目までの間、好ましくは1日目から9日目、1日目から8日目、1日目から7日目、1日目から6日目、1日目から5日目、又は1日目から4日目までの間、より好ましくは1日目から3日目に培地に添加する。本明細書において、「工程（2）の浮遊培養開始後N日目」とは、工程（2）の浮遊培養開始N日後（N×24時間後）からN+1日（(N+1)×24時間）経過直前までの期間を意味する。例えば、工程（2）開始後2日目とは、工程（2）の浮遊培養開始時を基準として48時間後から72時間経過直前までを意味する。
　具体的な態様として、例えば、工程（2）の浮遊培養開始後1～9日目、好ましくは1～3日目に、培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換し、BMP4の終濃度を約1～10 nMに調製し、BMP4の存在下で例えば1～12日、好ましくは2～9日、更に好ましくは2～5日間培養することができる。ここにおいて、BMP4の濃度を同一濃度を維持すべく、1もしくは2回程度培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換することができる。又は前述のとおり、BMP4の濃度を段階的に減じることもできる。
　BMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、凝集体を形成する細胞の網膜系細胞への分化誘導が開始された後は、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。一態様において、網膜系細胞への分化誘導が開始された後、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質濃度を、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に低下させる。網膜系細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞における網膜前駆細胞マーカー遺伝子（例、Rx遺伝子（別名Rax）、Pax6遺伝子、Chx10遺伝子）の発現を検出することにより確認することができる。GFP等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がRx遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて工程（2）により形成された凝集体を、網膜系細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜系細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（3）の実施態様の一つとして、工程（2）で形成された凝集体を、網膜前駆細胞マーカー遺伝子（例、Rx遺伝子、Pax6遺伝子、Chx10遺伝子）を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜系細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
　工程（3）において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80％）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
　ある時点で特定の成分（例えば、BMP4）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度（具体的には終濃度の1.5～3.0倍、例えば終濃度の約2倍の濃度）で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作、半量培地交換）を行ってもよい。
　ある時点で、元の培地に含まれる特定の成分の濃度を維持する場合、例えば元ある培地を半量程度捨てて、元の培地に含まれる濃度と同じ濃度の特定の成分を含む新しい培地を半量程度加える操作を行ってもよい。
　ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回（例えば2～3回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
　培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャネルマイクロピペットを使ってもよい。
　一態様において、工程（2）で培地中に添加するShhシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的低濃度（例えば、SAGについては300 nM以下、好ましくは30nM以下、更に好ましくは3nM以下、他のShhシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等以下のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度）の場合、培地交換を行う必要はなく、工程（2）で用いた培地にBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を添加すればよい。一方、Shhシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的高濃度（例えば、SAGについては700 nM超、又は1000 nM以上、他のShhシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度）の場合には、BMPシグナル伝達作用物質添加時に残存するShhシグナル伝達経路作用物質の影響を抑制するために、BMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を含み、Shhシグナル伝達経路作用物質を含まない新鮮な培地に交換することが望ましい。
　好ましい態様において、工程（3）で用いられる培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与えない濃度以下である。具体的には、SAGのShhシグナル伝達促進活性換算で700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下、より更に好ましくは、Shhシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない。「Shhシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地」とは、培地中のShhシグナル伝達経路作用物質濃度が、その生物学的活性（即ち、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路活性化）が発現しない程度（例えば、SAGの場合、0.03 nM以下）にまで抑制されている培地を意味する。「Shhシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、Shhシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、その生物学的活性（即ち、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路活性化）が発現する程度、すなわち網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のShhシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地も含まれる。
　工程(3)においては、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、工程(2)で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む培地（好ましくは無血清培地）中で培養する。即ち、工程(3)において用いる培地は、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）に加えて、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。好ましい態様において、工程(2)で得られた凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む培地（好ましくは無血清培地）中で培養する。即ち、該態様において、工程(3)において用いる培地（好ましくは無血清培地）には、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）、及びWntシグナル伝達経路阻害物質が含まれる。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のWntシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、工程(2)で用いたWntシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程(3)において使用する。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばIWR-1-endoの場合は、約0.1 μMから約100 μM、好ましくは約0.3 μMから約30 μM、より好ましくは約1 μMから約10 μM、更に好ましくは約3 μMの濃度となるように培地に添加する。IWR-1-endo以外のWntシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記IWR-1-endoの濃度と同等のWntシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（3）の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（2）の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を100としたとき、好ましくは50～150、より好ましくは80～120、更に好ましくは90～110であり、工程（2）の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、工程（3）開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、工程（2）においてWntシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（3）においても継続して（即ち、工程(3)の開始時から）培地中に含まれる。更に好ましくは、工程（2）の浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（3）においても継続して培地中に含まれる。例えば、工程（2）で得られた培養物（Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を添加すればよい。
　Wntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、好ましくは、工程（2）における浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（2）における浮遊培養開始時を起算点として、2日間から30日間、より好ましくは6日間から20日間、8日間から18日間、10日間から18日間、又は10日間から17日間（例えば、10日間）である。別の態様において、Wntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、工程（2）における浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（2）における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは3日間から15日間（例えば、5日間、6日間、7日間）であり、より好ましくは6日間から10日間（例えば、6日間）である。
　一態様において、工程（3）において用いられる培地は、更にTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよい。特に、工程(2)の浮遊培養において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地を用いる場合、工程(3)においても、引き続きTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地を用いることが好ましい。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のTGFβシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、工程（2）で用いたTGFβシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程(3)において使用する。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばSB431542の場合は、通常0.1～200 μM、好ましくは2～50 μM、より好ましくは3～10 μMの濃度で使用される。A-83-01は、通常0.05～50 μM、好ましくは0.5～5 μM の濃度で使用される。SB431542又はA-83-01以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記SB431542の濃度と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（3）の培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（2）の培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度を100としたとき、好ましくは50～150、より好ましくは80～120、更に好ましくは90～110であり、工程（2）の培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。
　TGFβシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期及び作用期間は、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、好ましくは、工程（2）における浮遊培養開始時にTGFβシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（2）における浮遊培養開始時を起算点として、2日間から30日間、より好ましくは6日間から20日間、8日間から18日間、10日間から18日間、又は10日間から17日間（例えば、10日間）である。好ましい態様において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質の添加時期及び曝露期間は、上述したWntシグナル伝達経路阻害物質の添加時期及び作用期間と同一である。即ち、該態様において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、Wntシグナル伝達経路阻害物質と同時に培地に添加され、Wntシグナル伝達経路阻害物質と同期間培地中に含まれる。
　例えば、工程（1）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、工程（2）において、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）、又はWntシグナル伝達経路阻害物質、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させ、工程（3）において、工程（2）で得られた凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む培地（好ましくは無血清培地）中で培養する。即ち、該態様において、工程（3）において用いる培地（好ましくは無血清培地）には、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びWntシグナル伝達経路阻害物質が含まれる。
　一態様において、工程（3）の浮遊培養後に、工程(3)の培地を、外来性のBMPシグナル伝達作用物質を実質的に含まず、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地に交換し、浮遊培養を継続する事ができる。工程（1）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、工程（2）において、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む又は含まない培地（好適には無血清培地であり、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を更に含んでいてもよい）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させ、工程（2）で得られた凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む培地（好ましくは無血清培地であり、Wntシグナル伝達経路阻害物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質を更に含んでいてもよい）中で一定期間培養した後、外来性のBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を実質的に含まず、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地に交換して培養を継続する。即ち、該態様において、工程（3）の培養後に、培地が、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む培地（好ましくは無血清培地であり、Wntシグナル伝達経路阻害物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質を更に含んでいてもよい）から、外来性のBMPシグナル伝達作用物質を実質的に含まず、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地に交換される。
　血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。血清濃度については、約1～30％、好ましくは約3～20%、より好ましくは10%前後で添加する。本態様においては、血清の代わりに市販のKSR等の血清代替物を適量用いてもよい。
　ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、前述のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、SAGである。例えばSAGの場合は、通常約0.1 nM ～10 μM、好ましくは約10 nM～1 μM、より好ましくは100 nM前後の濃度で添加する。
　ここで、工程(3)から持ち越されるBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）の濃度が、その生物学的活性（即ち、BMPシグナル伝達作用）が発現しない程度（例えば、BMP4であればその濃度が0.01 nM未満）にまで抑制されている場合、BMPシグナル伝達作用物質を実質的に含まない培地とみなすことができる。例えば、BMPシグナル伝達作用物質を含まない培地での培地交換操作により、工程(3)からのBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）の持越しを、工程(3)において用いる培地中のBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）の濃度の3%以下、好ましくは1％以下、0.3％以下、0.1％以下、0.03%以下、又は0.01%以下にまで抑制し、培地中のBMPシグナル伝達作用物質の濃度を、その生物学的活性（即ち、BMPシグナル伝達作用）が発現しない程度（例えば、BMP4であればその濃度が0.01 nM未満）にまで抑制することにより、BMPシグナル伝達作用物質を実質的に含まない培地を得ることができる。
　一態様において、外来性のBMPシグナル伝達作用物質を実質的に含まず、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地への交換は、浮遊培養（工程（2））開始後7日目以降、より好ましくは9日目以降（例えば、10日目）に行う。ここにおいて、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地への交換は、神経上皮が形成され始める時期でもよい。神経上皮が形成されたことは、顕微鏡を用いた明視野像観察にて、細胞の配列・形態を観察することで確認できる。一態様において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を含む培地への交換後、3日間から20日間、好ましくは5日間から15日間、7日間から10日間培養する。
　本発明の方法においては、好適には、工程(2)及び工程(3)を通じて、浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる。
　工程（3）における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
　かかる培養により、工程（2）で得られた凝集体を形成する細胞から網膜前駆細胞への分化が誘導され、網膜前駆細胞を含む凝集体を得ることが出来る。本発明は、このような網膜前駆細胞を含む凝集体の製造方法をも提供する。網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるRx、PAX6又はChx10を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。工程（3）の実施態様の一つとして、工程（2）で形成された凝集体を、Rx遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜系細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。一態様において、凝集体に含まれる細胞の20％以上（好ましくは、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70%以上、80％以上、90%以上）が、Rxを発現する状態となるまで、工程（3）の培養が実施される。該態様において、Rx発現細胞は、好適には、Chx10を共発現する。
　一態様において、工程（3）で得られる凝集体は、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない。網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、Rx陽性の組織が観察され、その外側にRX陰性の組織が観察されない。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例えばSB431542、A-83-01）並びにbFGFを含有する無血清培地で、好ましくは2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間）、接着培養し、工程（2）にて、工程(1)で得られた細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）存在下、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA、Shhタンパク質）を含有しない又は含有する無血清培地で浮遊培養し、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
　また、網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）及びbFGFを含有する無血清培地で、好ましくは2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間）、接着培養し、工程（2）にて、工程(1)で得られた細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質及（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）存在下、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有しない又は含有する無血清培地で浮遊培養し、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）並びにbFGFを含有する無血清培地で、好ましくは2～96時間、6～72時間、6～60時間、12～60時間、18～60時間、18～48時間、又は18～28時間（例、24時間）、接着培養し、工程（2）にて、工程(1)で得られた細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）存在下、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有しない又は含有する無血清培地で浮遊培養し、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty 、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、工程（2）にて、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む、無血清培地（ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない）中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地（TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない）で浮遊培養し、網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）又は網膜組織を含む凝集体を得る。
　工程（2）の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含む。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）およびソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、18時間～30時間(例：約24時間)接着培養し、その後ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）並びにbFGFを含有する無血清培地で、18時間～30時間(例：約24時間)接着培養し、工程（2）にて、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む無血清培地（ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない）中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地（TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）を含有する又は含有しない）で浮遊培養し、網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）又は網膜組織を含む凝集体を得る。
　工程（2）の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含む。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty 、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、工程（2）にて、工程（1）で得られた細胞を、無血清培地、又はWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）を含む無血清培地（ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）を含有する又は含有しない）中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で10日間浮遊培養し、外来性のBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を含まず、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG）及び血清を含む培地に交換して浮遊培養を継続し、網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）又は網膜組織を含む凝集体を得る。
　工程（2）の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含む。
　網膜系細胞及び／又は網膜組織を製造する上での好ましい態様において、工程（1）にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty 、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、Shhタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、工程（2）にて、工程（1）で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2）存在下で、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、Shhタンパク質）及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、工程（3）にて、凝集体をWntシグナル伝達経路阻害物質（例、CKI-7、D4476、IWR-1-endo(IWR1e)、IWP-2）及びBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）存在下で、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）を含有する無血清培地で浮遊培養し、網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）又は網膜組織を含む凝集体を得る。
　工程（2）の培地は、好ましくは、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を含む。
　得られた網膜前駆細胞を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜前駆細胞を含む凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／EDTA処理又はパパイン処理）し、得られた細胞をFACS又はMACSを用いて選別することにより、高純度な網膜前駆細胞を得ることも可能である。
　更に、上述の工程（1）～工程（3）で得られる網膜前駆細胞を含む凝集体を無血清培地又は血清培地で引き続き培養することにより、網膜前駆細胞を更に分化させて、神経上皮構造様の網膜組織を製造することができる。
　かかる培地（基礎培地）としては、特に限定はなく、上記定義の項で記載した基礎培地を適宜選択することができる。また、かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、DMEM-F12培地に10％ウシ胎児血清、N2サプリメント、100μMタウリン、及び500nM レチノイン酸を添加した血清培地、又は、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1：1の混合液に10％KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateを添加した培地）等を挙げることができる。
　網膜前駆細胞から網膜組織を誘導する際の培養時間は、目的とする網膜層特異的神経細胞によって異なるが、例えば約7日間から約200日間である。
　網膜組織は凝集体の表面を覆うように存在する。浮遊培養終了後、凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製した後、層構造を有する網膜組織が形成されていることを免疫染色法などにより確認すればよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞）がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて、免疫染色法により、層構造が形成されていることを確認することができる。一態様において、網膜組織はRx又はChx10陽性の神経上皮構造である。
　凝集体の表面に存在する網膜組織を、ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、その組織が網膜組織であることを、後述の免疫染色法等により確認することが出来る。
　一態様において、工程（3）で得られる凝集体は、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない。網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、Rx陽性の組織が観察され、その外側にRx陰性の組織が観察されない。
　工程（3）の実施態様の一つとして、工程（2）で形成された凝集体を、Rx遺伝子及び／又はChx10遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜系細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む無血清培地又は血清培地中（上述の通り、Wntシグナル伝達経路阻害物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよい）で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得て、該網膜前駆細胞を含む凝集体を網膜組織が形成されるまで、引き続き無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。網膜前駆細胞を含む凝集体を網膜組織が形成されるまで、引き続き無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する際、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、網膜前駆細胞を誘導するために培地中に含まれていたBMPシグナル伝達経路作用物質濃度を、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に低下させてもよい。この場合において、Wntシグナル伝達経路阻害物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度はBMPシグナル伝達経路作用物質と同じ割合で低下させてもよいが、好ましくは一定に維持する。一態様において、凝集体に含まれる細胞の20％以上（好ましくは、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70%以上、80%以上、90％以上）が、Chx10を発現する状態となるまで、網膜前駆細胞を含む凝集体の浮遊培養が実施される。
　また、工程（3）の実施態様の一つとして、工程（2）で得られた凝集体、又は工程（2）で得られた凝集体を、上記方法により浮遊培養した凝集体を、接着培養に付し、接着凝集体を形成させてもよい。該接着凝集体を、Rx遺伝子及び／又はChx10遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜系細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地（該培地は、Wntシグナル伝達経路阻害物質及び／又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよい）中で接着培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る。該網膜前駆細胞を含む凝集体を網膜組織が形成されるまで、引き続き無血清培地又は血清培地中で接着培養し、網膜組織を含む凝集体を得る。一態様において、細胞の10％以上（好ましくは、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70%以上、80%以上、90％以上）が、Chx10を発現する状態となるまで、網膜前駆細胞を含む凝集体の接着培養が実施される。
　本発明の製造方法により、多能性幹細胞から高効率で網膜組織を得ることができる。本発明の製造方法により得られる網膜組織には、網膜層のそれぞれに特異的なニューロン（神経細胞）が含まれることから、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞または、これらの前駆細胞など網膜組織を構成する細胞を入手することも可能である。得られた網膜組織から入手した細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。
　得られた網膜組織を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜組織を含む凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／EDTA処理）し、得られた細胞をFACS又はMACSを用いて選別することにより、高純度な網膜組織構成細胞、例えば高純度な視細胞を得ることも可能である。
　本発明の製造方法、すなわち上述の工程(1)～工程(3)で得られた網膜組織を含む細胞凝集体から、公知の方法（例えば、WO15/087614）、具体的には、下記工程（A）及び工程（B）により、毛様体周縁部様構造体を含む網膜組織を製造できる。
　一態様として、工程（1）～（3）で得られた網膜組織を含む細胞凝集体であって、工程（2）の浮遊培養開始後6～30日目、10～20日目(10日目、11日目、12日目、13日目、14日目、15日目、16日目、17日目、18日目、19日目又は20日目) の網膜組織を含む細胞凝集体から、下記工程（A）及び工程（B）により、毛様体周縁部様構造体を製造できる。
　本明細書における毛様体周縁部様構造体とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。「毛様体周縁部（ciliary marginal zone；CMZ）」としては、例えば、生体網膜において網膜組織（具体的には、神経網膜）と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ciliary margin）または網膜縁（retinal margin）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞や分化細胞の供給や網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Rdh10遺伝子（陽性）及びOtx1遺伝子（陽性）及びZic1（陽性）を挙げることができる。
　まず、工程（A）として、本発明の製造方法、すなわち工程（1）～工程(3)で得られた網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、FGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する。
　ここで、工程（A）の好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
　工程（A）で用いる無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地にN2 supplement（Life Technologies社）が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
　工程（A）の培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃から約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃前後を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1％から約10％の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約5％前後を挙げることができる。
　工程（A）にて、上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるWntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なWntシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Wntファミリーに属するタンパク質（例えば、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a）、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）等を挙げることができる。
　工程（A）の無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、例えば、約0.1μMから約100μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1μMから約30μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、3μM前後の濃度を挙げることができる。
　工程（A）の上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるFGFシグナル伝達経路阻害物質としては、FGFにより媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。FGFシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、FGF受容体、FGF受容体阻害剤（例えば、SU-5402、AZD4547、BGJ398）、MAPキナーゼカスケード阻害物質（例えば、MEK阻害剤、MAPK阻害剤、ERK阻害剤）、PI3キナーゼ阻害剤、Akt阻害剤などが挙げられる。
　工程（A）の無血清培地又は血清培地に含まれるFGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、凝集体の毛様体周縁部様構造への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばSU-5402の場合、約0.1μMから約100μM、好ましくは約1μMから約30μM、より好ましくは約5μMの濃度で添加する。
　工程（A）における「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」するとは、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間の全部又はその一部に限り培養することを意味する。つまり、培養系内に存在する前記「網膜組織を含む細胞凝集体」が、RPE65遺伝子を実質的に発現しない細胞から構成されている期間の全部又はその一部（任意な期間）に限り培養すればよく、このような培養を採用することにより、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を得ることができる。
　このような特定な期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法又は生化学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現の有無又はその程度を調べることができる。
　工程（A）の「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合がWntシグナル伝達経路作用物質及び／又はFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも減少し、30%から0％の範囲内になるまでの期間を挙げることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」としては、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が30%から0％の範囲内である細胞凝集体を挙げることができる。
　工程（A）の「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル伝達経路作用物質及び／又はFGFシグナル伝達経路阻害物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地（例えば、基礎培地にN2が添加された無血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内（例えば、工程（2）の開始を起算日とした場合、約20日目から、10日間以内）を挙げることができ、より好ましくは、例えば、3日間から6日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内（例えば、工程（2）の開始を起算日とした場合、約20日目から、12日間以内）を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間から9日間を挙げることができる。
　次いで、工程（B）として、上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する。
　工程（B）で好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。
　工程（B）の無血清培地は、好適には、FGFシグナル伝達経路阻害物質を含まない。
　工程（B）の無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
　工程（B）の前記無血清培地又は血清培地に、既知の増殖因子、増殖を促進する添加剤や化学物質等を添加してもよい。既知の増殖因子としては、EGF、FGF、IGF、insulin等を挙げることができる。増殖を促進する添加剤として、N2 supplement（Life Technologies社製）、B27 supplement（Life Technologies社製）、KSR（Life Technologies社製）等を挙げることができる。増殖を促進する化学物質としては、レチノイド類（例えば、レチノイン酸）、タウリンを挙げることができる。
　工程（B）の好ましい培養時間としては、例えば、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも増加し、30%以上になるまで行う培養時間を挙げることができる。具体的には、例えば、工程（A）の開始を起算日とした場合、約3日目から、3日間～60日間、好ましくは約35日間を挙げることができる。
　工程（B）の培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃から約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃前後を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1％から約10％の範囲を挙げることができ、好ましくは、例えば、約5％前後を挙げることができる。
　工程（B）の「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を得られるまでの上記の培養日数は無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、100日間以内を挙げることができる。前記培養日数として、好ましくは、例えば、20日間から70日間を挙げることができ、より好ましくは、例えば、30日間から60日間を挙げることができる。
　上述の工程（A）、（B）により調製された「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」においては、毛様体周縁部様構造体にそれぞれ隣接して、網膜色素上皮と網膜組織（具体的には、神経網膜）とが同一の細胞凝集体内に存在している。当該構造については顕微鏡観察等で確認することが可能である。具体的には例えば、顕微鏡観察により、透明度が高い網膜組織から、色素沈着が見える網膜色素上皮との間に形成される、網膜側が厚く網膜色素上皮側が薄い上皮構造として毛様体周縁部様構造体の存在を確認することができる。また、凝集体の凍結切片の免疫染色によって、Rdh10陽性、Otx1陽性、又は、Zic1陽性として、毛様体周縁部様構造体の存在を確認することができる。
　更なる態様において、上述の工程（A）、（B）により、凝集体に含まれる網膜組織（神経上皮）の分化が進み、視細胞前駆細胞、視細胞、錐体視細胞、桿体視細胞、水平細胞、介在神経細胞（アマクリン細胞、神経節細胞等）からなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての細胞を含む、成熟した網膜組織、及び前記細胞を製造することができる。
　本発明の製造方法等、すなわち上述の工程（1）～工程(3)で得られた網膜組織を含む細胞凝集体から、下記工程（C）により網膜色素上皮細胞を含む網膜組織を製造できる。下記工程（C）で得られた網膜色素上皮細胞から、下記工程（D）により網膜色素上皮シートを製造できる。
　本発明における「網膜色素上皮細胞」とは生体網膜において神経網膜組織の外側に存在する上皮細胞を意味する。網膜色素上皮細胞であるかは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（RPE65（成熟した網膜色素上皮細胞）、Mitf（幼若な又は成熟した網膜色素上皮細胞）など）の発現や、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態などにより確認できる。
　まず、工程（C）として、本発明の製造方法で得られた網膜組織を含む細胞凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まずWntシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る。
　工程（C）で用いる無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地にN2 supplement（ Life Technologies社）が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
　工程（C）で用いる無血清培地に、前述のWntシグナル伝達経路作用物質に加えて、前述のNodal/Activinシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、前述のFGFシグナル伝達経路阻害物質を含んでもよい。
　ここで、工程（C）の好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
　次いで、本発明工程(C)で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する工程（D）について説明する。
　工程（D）は、工程（C）の実施開始から60日以内、好ましくは30日以内、より好ましくは3日後に実施する。
　工程（D）における培地（基礎培地）としては、特に限定はなく、上記定義の項で記載した基礎培地を適宜選択することができる。また、工程（D）における接着培養に用いられる無血清培地又は血清培地としては、上述したような培地を挙げることができる。調製の煩雑さ回避するには、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、DMEM/F-12とNeurobasalの1：1混合液に1/2 x N2サプリメント、1/2 x B27サプリメント及び100 μM 2-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトiPS細胞由来細胞の場合は、通常約1％から約20％であり、好ましくは約2％から約20％である。
　工程（D）において前述の、ROCK阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することが好ましい。
　工程（D）において、Wntシグナル伝達経路作用物質、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Activinシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる1以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することがより好ましい。
　Activinシグナル伝達経路作用物質とは、Activinにより媒介されるシグナルを増強し得る物質である。Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Activinファミリーに属する蛋白（例えば、Activin A,Activin B,Activin C,Activin ABなど）、Activin受容体、Activin受容体アゴニストが挙げられる。
　工程（D）で用いられるActivinシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばRecombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems社 ＃338-AC)の場合、約1 ng/mlから約10 μg/ml、好ましくは約10 ng/mlから約1 μg/ml、より好ましくは約100 ng/mlの濃度となるように添加する。Activinシグナル伝達経路作用物質は、工程（D）の開始から例えば18日以内、好ましくは6日目に添加する。
　工程（D）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養を行うことが好ましい。工程（D）における培養器材の処理に用いられる培養基質としては、凝集体由来細胞の接着培養と網膜色素上皮シートの形成を可能とする細胞培養基質が挙げられる。
　上述のとおり、上記工程（1）～工程（3）に加えて、工程（A）及び工程（B）又は工程（C）及び工程（D）を含む網膜細胞又は網膜組織の製造方法もまた、本発明の範疇である。工程(3)は上記工程（A）及び工程（B）又は工程（C）及び工程（D）等を含んでいてもよい。
4．毒性・薬効評価方法
　本発明の製造方法により製造された、網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）は、網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、毒性評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被験物質の毒性・薬効評価用試薬とすることができる。例えば、網膜組織の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を作製し、このiPS細胞を用いて本発明の方法により、網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）を製造する。網膜組織又は網膜系細胞は、その患者が患っている疾患の原因となる網膜組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
　例えば、本発明の製造方法により製造された、特定の障害（例、遺伝性の障害）を有する網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）を、被験物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被験物質で処理した網膜組織又は網膜系細胞における障害の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、その障害の程度を軽減した被験物質を、当該障害に基づく疾患の治療薬の候補物質として、選択することができる。例えば、本発明の製造方法で製造した網膜系細胞の生理活性(例えば、生存促進又は成熟化)をより向上させる被験物質を、医薬品の候補物質として探索することができる。あるいは、網膜疾患等の特定の障害を呈する遺伝子変異を有する体細胞から人工多能性幹細胞を調製し、当該細胞を本発明の製造方法で分化誘導させて製造した網膜系細胞に被験物質を添加し、前記障害を呈するか否かを指標として当該障害の治療薬・予防薬として有効な被験物質の候補を探索することができる。
　毒性評価においては、本発明の製造方法により製造された網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）を、被験物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被験物質で処理した網膜組織又は網膜系細胞における毒性の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、ネガティブコントロールと比較して、毒性を示した被験物質を、網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）に対する毒性を有する物質として判定することが出来る。
　すなわち、本発明は、以下の工程を含む、毒性評価方法を包含する。
（工程1）本発明の製造方法により製造された網膜組織又は網膜系細胞を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程2）本発明の製造方法により製造された網膜組織又は網膜系細胞を、生存可能な培養条件で、一定時間、被験物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程3）（工程1）及び（工程2）において測定した結果の差異に基づき、工程1における被験物質が有する毒性を評価する工程。
　ここで、「被験物質の非存在下」とは、被験物質の代わりに培地、被験物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、「ポジティブコントロール」とは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色（例えば細胞核染色）と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
　工程3において、被験物質が有する毒性を評価する方法としては、例えば、工程1の測定値と工程2におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が大きい場合に当該被験物質が毒性を有すると判断できる。また、工程1の測定値と工程2におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が同等以上の場合に当該被験物質が毒性を有すると判断できる。
5．医薬組成物
　本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）の有効量を含む医薬組成物を提供する。
　該医薬組成物は、本発明の製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。
　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
　本発明の医薬組成物は、製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
　本発明の製造方法で得られる網膜組織を、ピンセット等を用いて適切な大きさに細切し、シート剤とすることもできる。
　また、本発明の製造方法で得られる細胞は、分化誘導を行う工程（3）で接着培養を行うことにより、シート状の細胞に成形し、シート剤とすることもできる。
　本発明の医薬組成物は、網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）の障害に基づく疾患の治療薬として有用である。
6．治療薬
　本発明の製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）は、当該網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）を含む、当該網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。当該網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の製造方法により製造された網膜組織又は網膜系細胞（例、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞）を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態の患者に、本発明の製造方法により製造された網膜組織又は網膜系細胞を移植し、当該網膜系細胞や、障害を受けた網膜組織自体を補充することにより、網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することが出来る。例えば、網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、眼科疾患である黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、白内障、緑内障、角膜疾患、網膜症等が挙げられる。
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の網膜組織又は網膜系細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される。
　また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、HLA型やMHC型が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロ（他家）の網膜組織又は網膜系細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植してもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例1：工程1（Preconditionとも言う）後に、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞からの網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit（登録商標）培地（AK03N、味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いた。
　具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトiPS細胞（1231A3株）を、PBSにて洗浄後、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞を、Laminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Y27632（ROCK阻害物質、10 μM）存在下、StemFit（登録商標）培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、6ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積9.4 cm2）を用いた場合、前記単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は1.0 x 104とした。播種した1日後に、Y27632を含まないStemFit（登録商標）培地に交換した。以降、1日～2日に一回Y27632を含まないStemFit（登録商標）培地にて培地交換した。その後、播種した6日後に、サブコンフレント（培養面積の6割が細胞に覆われる程度）になるまで培養した。
　本願製造法工程1(Precondition)の具体例として以下の操作を行った。まずサブコンフレントになったヒトiPS細胞（1231A3株）を、PBSにて洗浄後、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、Laminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュ（イワキ社製）に播種し、Y27632（ROCK阻害物質、10 μM）存在下、StemFit（登録商標）培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、6ウェルプレート（イワキ社製、培養面積9.4 cm2）を用いた場合、前記単一分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は1.0 x 104とした。前記プラスチック培養ディッシュとして、60mmディッシュ（イワキ社製、細胞培養用、培養面積21 cm2）を用いた場合、前記単一分散されたヒトiPS細胞の播種細胞数は2.0x 104とした。播種した1日後に、Y27632を含まないStemFit（登録商標）培地に交換した。以降、1日～2日に一回Y27632を含まないStemFit（登録商標）培地にて培地交換した。その後、播種した5日後、即ちサブコンフレント1日前（培養面積の5割が細胞に覆われる程度）まで培養した。ここで、播種した後6日間培養した場合であっても、同様の結果を得られた。
　前記フィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)の存在下（工程1：Precondition処理、図1“Precondition: TGFβR-i + Shh”）、あるいは非存在下（工程1：Precondition処理しない、図1 “Untreated control”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。培養した細胞を、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて明視野観察を行った。その結果、フィーダーフリー培養中に、TGFβシグナル伝達経路阻害物質(SB431542)及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にて処理してもヒトiPS細胞の形態に大きな影響は与えないことが分かった。
　このようにして調製されたPrecondition処理しなかったヒトiPS細胞、及び、Precondition処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。
　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、さらにWntシグナル伝達経路阻害物質（IWR-1e, 3μM）を含む培地あるいはWntシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地で培養した。浮遊培養開始後2日目までに、Preconditionした条件でも、していない条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632を含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地又は含まない培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632、SAG及びヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む培地又は含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った（図1）。その結果、Preconditionしない条件において、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件では凝集体の成長が悪く、形が崩れたのに比べて（図1A）、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件では、形が崩れていない、凝集体の内部が密な細胞凝集体が得られ、神経組織が形成されたことがわかった（図1B）。さらに、Preconditionした条件では、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加しなかった条件も（図1C）、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件も（図1D）、丸く、表面が滑らかで、形が崩れていない、凝集体の内部が密な細胞凝集体が得られ神経組織が形成されたことがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図2）。
　その結果、まず工程1にてSB431542及びSAGにてPreconditionせず、工程2及び工程3でIWR-1eを添加しなかった条件から作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が3％以下程度であることがわかった（図2A）。
　また、工程1にてSB431542及びSAGにてPreconditionせず、工程2及び工程3でIWR-1eを添加した条件で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が40％程度であることがわかった（図2B）。連続切片の解析から、本条件で作製された細胞凝集体では、Chx10弱陽性が観察された（図2F）。
　工程1にてSB431542及びSAGにてPreconditionして、工程2及び工程3でIWR-1eを添加しなかった条件で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が40％程度であることがわかった（図2C）。連続切片の解析から、本条件で作製された細胞凝集体では、Chx10陽性（強陽性）細胞が40%程度観察された（図2G）。
　さらに、工程1にてSB431542及びSAGにてPreconditionして、工程2及び工程3でIWR-1eを添加した条件で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が60％程度であることがわかった（図2D）。連続切片の解析から、本条件で作製された細胞凝集体では、Chx10陽性（強陽性）細胞が60%程度観察された（図2H）。
　これらの結果から、Preconditionを行わず工程2及び工程3でWnt阻害剤も添加しない条件では神経組織がほとんど形成されなかったことに比べて、他のいずれの条件においても神経組織が形成されることがわかった。
　また、Preconditionを行わず工程2及び工程3でWnt阻害剤も添加しない条件に比べて、Preconditionを行わず工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加する条件では、網膜組織形成が若干促進される傾向があることがわかった（図1A, B、図2A, B, E, F）。一方、工程1にてTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びShhシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、さらに工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加することで、非常に効率よく網膜組織が形成されることがわかった（図2B, D, F, H）。
実施例2：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)の存在下（工程1：Precondition処理、図3 “Precondition: Shh”）あるいは非存在下（工程1：Preconditionしない条件、図3 “Untreated control”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition処理したヒトiPS細胞、及び、Preconditionしない条件のヒトiPS細胞を、それぞれTrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～5の5条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程1でPreconditionしない条件で、かつ、工程2開始時の前記無血清培地に外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質及び外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（図3A）。
・条件2. 工程1でPrecondition処理して、かつ、工程2開始時の前記無血清培地に外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質及び外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（図3B）。
・条件3. 工程1でPrecondition処理して、かつ、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（図3C）。
・条件4. 工程1でPrecondition処理して、かつ、工程2開始時の前記無血清培地に、外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質を添加せず、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図3D）。
・条件5. 工程1でPrecondition処理して、かつ、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図3E）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1-5のいずれの条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地又は含まない培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632、SAG及びヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む培地又は含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った（図3）。その結果、工程1でPreconditionしなかった条件1では、凝集体が成長せず神経組織が形成されなかったのと比べて（図3A）、工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPrecondition処理した条件2～5では、凝集体が成長し、神経組織が形成されることがわかった（図3B-E）。特に、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を作用させた条件3及び5では（図3C,E）、Wntシグナル伝達経路阻害物質を作用させなかった条件2及び4と比べて（図3B,D）、神経組織の形成効率が良いことがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図4）。
　その結果、Preconditionしなかった条件1では神経組織が形成されなかったことに比べて、SAGでPrecondition処理を行った条件2～5のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。
　このうち、工程1にてSAGにてPreconditionし、かつ、工程2及び工程3で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質を添加しなかった条件2では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が40％程度であることがわかった（図4A）。連続切片の解析から、前記条件で作製された細胞凝集体では、Rx陽性細胞がChx10共陽性の網膜組織であることがわかった（図4E）。
　一方、工程1にてSAGにてPreconditionして、工程2及び工程3でIWR-1eを添加した条件3で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が90％程度であることがわかった（図4B）。連続切片の解析から、前記条件で作製された細胞凝集体では、Rx陽性細胞がChx10共陽性の網膜組織であることがわかった（図4F）。
　すなわち条件2と条件3の比較から、工程1にてPreconditionし、さらに工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質処理をすることで、90％程度の効率で網膜組織が形成できることがわかった。
　また、工程1にてSAGにてPreconditionして、工程2でSAGを添加した条件4で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が60％程度であることがわかった（図4C）。連続切片の解析から、前記条件で作製された細胞凝集体では、Rx陽性細胞がChx10共陽性の網膜組織であることがわかった（図4G）。
　一方、工程1にてSAGにてPreconditionして、工程2でSAGを添加し、工程2及び工程3でIWR-1eを添加した条件5で作製した細胞凝集体では、全細胞中のRx陽性細胞の割合が90％程度であることがわかった（図4D）。連続切片の解析から、前記条件で作製された細胞凝集体では、Rx陽性細胞がChx10共陽性の網膜組織であることがわかった（図4H）。
　すなわち条件4と条件5の比較から、工程1にてPreconditionし、工程2でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、さらに工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質処理をすることで、90％程度の効率で網膜組織が形成できることがわかった。
実施例3：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（工程1：Precondition(TGFβR-i)処理、図5“Precondition: TGFβR-i”）、あるいは、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)の存在下（工程1：Precondition(TGFβR-i+Shh)処理、図5“Precondition: TGFβR-i + Shh”）、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i)処理したヒトiPS細胞、及び、Precondition(TGFβR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、それぞれTrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～3の3条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程1でPrecondition(TGFβR-i)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図5A）。
・条件2. 工程1でPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図5B）。
・条件3. 工程1でPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図5C）。
　浮遊培養開始後2日目までに、前記条件1-3のいずれの条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632、SAG及びヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1-3のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。その結果、条件1～3のいずれの条件でも神経組織が形成され、神経組織のうちのChx10陽性の割合が90％程度であることがわかった（図5A-C）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の網膜組織であることが確認できた。
　すなわち、工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、ヒトiPS細胞から効率よく、網膜組織が形成できることがわかった。
実施例4：工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質を用いてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189（BMPシグナル伝達経路阻害物質（BMPR-i）、100 nM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（工程1：Precondition(BMPR-i)処理、図6“Precondition: BMPR-i”）、あるいは、LDN193189（BMPシグナル伝達経路阻害物質、100 nM、BMPR-i）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)の存在下（工程1：Precondition(BMPR-i+Shh)処理、図6“Precondition: BMPR-i + Shh”）、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(BMPR-i)処理したヒトiPS細胞、及び、Precondition(BMPR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、それぞれTrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～3の3条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程1でPrecondition(BMPR-i)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図6A）。
・条件2. 工程1でPrecondition(BMPR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図6B）。
・条件3. 工程1でPrecondition(BMPR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図6C）。
　浮遊培養開始後2日目までに、前記条件1-3のいずれの条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632、SAG及びヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1-3のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。その結果、条件1～3のいずれの条件でも神経組織が形成され、神経組織のうちのChx10陽性の割合が90％程度であることがわかった（図6A-C）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の網膜組織であることが確認できた。
　すなわち、工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質を用いてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、ヒトiPS細胞から効率よく、網膜組織が形成できることがわかった。
実施例5：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程3にてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した後にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及び血清を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、外来性のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加せずSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図7“Precondition: Shh”）、並びに、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i+Shh)処理、図7“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理、又は、Precondition(TGFβR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～4の4条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程1でPrecondition(Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図7A）。
・条件2. 工程1でPrecondition(Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図7B）。
・条件3. 工程1でPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図7C）。
・条件4. 工程1でPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理した後、工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図7D）。
　浮遊培養開始後2日目までに、前記条件1-4のいずれの条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632、SAG及びヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　次に、浮遊培養開始後10日目に、前記無血清培地にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (100 nM)及び血清として牛胎児血清(10%)を加えたShh血清培地（図7 “Shh+serum”）を用いて、培地の80%程度を交換する操作（80%交換操作）を3回繰り返し、Y27632、ヒト組換えBMP4、及びIWR1-eを含まず、SAGと血清を含む前記Shh血清培地に交換した。その後、2～4日に一回、前記Shh血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1-4のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。その結果、条件1～4のいずれの条件でも神経組織が形成され、神経組織のうちのChx10陽性の割合が80％程度であることがわかった（図7A-D）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の網膜組織であることが確認できた。
　すなわち、工程1でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程3にてBMPシグナル作用物質を添加した後に、Shh血清培地で培養する条件で、ヒトiPS細胞から効率よく、網膜組織が形成できることがわかった。
実施例6：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i+Shh)処理、図8“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～4の4条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図8A）。
・条件2. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図8B）。
・条件3. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542（5μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図8C）。
・条件4. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542（5μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図8D）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1～4のいずれの条件でも、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地又は含まない培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地又は含まない前記無血清培地にて、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1e及び又はSB431542の濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、IWR-1e及びSB431542を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後19日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1-4のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後19日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。対比染色として核酸をDAPIで染色した。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図8）。
　その結果、条件1～4のいずれの条件でも、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件1ではChx10陽性の網膜組織の割合が70%程度、条件2ではChx10陽性の網膜組織の割合が70%程度、条件3ではChx10陽性の網膜組織の割合が70%程度、条件4ではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた。
　すなわち、条件1及び条件2のように、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程3の途中で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件3及び4のように、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例7：工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189（BMPシグナル伝達経路阻害物質（BMPR-i）、100 nM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(BMPR-i+Shh)処理、図9“Precondition: BMPR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(BMPR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～2の2条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図9A）。
・条件2. 工程2開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542（5μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図9B）。
浮遊培養開始後2日目までに、条件1及び条件2で、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地又は含まない培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地又は含まない前記無血清培地にて、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1e及び又はSB431542の濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、IWR-1e及びSB431542を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後19日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1及び条件2で、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後19日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。対比染色として核酸をDAPIで染色した。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図9）。
　その結果、条件1及び条件2で、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件1ではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度、条件2ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度であった。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた。
　すなわち、条件1では、工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程3の途中で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件2では、工程1でBMPR阻害剤及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
　また実施例6及び実施例7から、工程1でのTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いてPreconditionした場合でも、BMPR阻害剤及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いてPreconditionした場合でも、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加することで、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例8：センダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でPreconditionし、工程2でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株、大日本住友製薬にて樹立）は、下記の通り樹立した。周知の方法で調製した末梢血単核球（PBMC）を原料に、市販されているセンダイウイルスベクター（Oct3/4、Sox2、KLF4、L-Mycの4因子、DNAVEC社(現、ID Pharma社)製サイトチューンキット）を用いて、Life Technologies社の公開プロトコル（iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit、Publication Number MAN0009378、Revision 1.0）、及び、京都大学の公開プロトコル（ヒトiPS細胞の樹立・維持培養、CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310、http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html）記載の方法に従って、StemFit（登録商標）培地 (AK03N;味の素社製)、Laminin511-E8（ニッピ社製）を用いて樹立した。
　ヒトiPS細胞（TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i+Shh)処理、図8“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）には、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し（図10“Wnt-i (day 0-17)”）、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件（図10“Shh day 0”）で培養した。TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株のいずれのヒトiPS細胞をスタート原料としても、浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、IWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株のいずれのヒトiPS細胞をスタート原料としても、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図10）。
　その結果、TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株のいずれのヒトiPS細胞をスタート原料としても、神経組織が形成されることがわかった。そしてTFH-R1-10-2株をスタート原料とした場合、Chx10陽性の網膜組織の割合が70%程度であることがわかった（図10A）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図10B）。また、TFH-R2-10-F8株をスタート原料とした場合、Chx10陽性の網膜組織の割合が90%程度であることがわかった（図10C）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図10D）。
　これらの結果から、スタート原料としてセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞でも、工程1にてPrecondition処理し、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
　従って、エピソーマルベクターにて樹立したiPS細胞（例、1231A3株）でもセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞（例、TFH-R1-10-2株及びTFH-R2-10-F8株）でも、iPS細胞の樹立方法に関わらず、本願製造法により網膜系細胞及び／又は網膜組織が製造できることがわかった。
実施例9：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から視細胞を含む網膜系細胞の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i+Shh)処理）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i+Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）には、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG (30 nM)を添加した条件で培養した。浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、IWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて明視野観察を行った。その結果、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞の一部を抜き取り、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。その結果、前記浮遊培養開始後20日目の細胞が、神経組織を含み、当該神経組織がChx10及びRx共陽性の網膜組織であることが分かった。
　さらに、前記浮遊培養開始後20日目の細胞の一部を抜き取り、「Nature Communications 6, 6286 (2015)」に記載の方法に準じて分化培養した。
　当該浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Wntシグナル伝達経路作用物質（CHIR99021、3μM）及びFGFシグナル伝達経路阻害物質（SU5402、5μM）を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で、37℃、5％CO2で、3日間すなわち浮遊培養開始後23日目まで培養した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、50個程度の凝集体を、10 mlの前記CHIR99021及びSU5402を含む無血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後23日目には、薄い神経上皮が形成され、網膜色素上皮（RPE）様組織が形成された。
　さらに、当該浮遊培養開始後23日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（DMEM/F12培地に、10%牛胎児血清、1% N2 supplement、0.5μM レチノイン酸、及び100μMタウリンが添加された培地）で、37℃、5％CO2、大気圧の酸素濃度（20%程度）で、浮遊培養開始後58日目まで（35日間）まで浮遊培養した。浮遊培養開始以後20日目から浮遊培養終了時までの間、2～4日に一回、前記血清培地にて半量培地交換した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、30個程度の凝集体を、15 mlの前記血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後35日目以降には、神経網膜様組織が存在した。
　浮遊培養開始後58日目の細胞凝集体を倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、神経組織に加えて、色素沈着した網膜色素上皮細胞が形成されることがわかった（図11、A、矢頭にて示す）。
　このようにして調製された浮遊培養開始後58日目の細胞凝集体をそれぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rax/Rx抗体、Takara社製、ギニアピッグ）、神経網膜前駆細胞マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製、ヒツジ）、視細胞前駆細胞マーカーの1つであるCrx（抗Crx抗体、Takara社製、ウサギ）について免疫染色を行い、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。
　その結果、前記浮遊培養開始後58日目の細胞凝集体には、Rx陽性の網膜組織が90%程度形成されていることがわかった（図11、B）。さらに、当該Rx陽性の網膜組織が、Chx10陽性の神経網膜前駆細胞を含むことがわかった（図11、C）。そして、当該Rx陽性の網膜組織が、Crx陽性の視細胞前駆細胞を含むことがわかった（図11、D）。また形態的な観察から、当該Rx陽性の網膜組織が、毛様体周縁部様構造体を含むことがわかった（図11、E、矢印にて示す）。また形態的な観察から、網膜組織の内側に、Rx陽性かつChx10陰性かつCrx陰性の、内層の網膜神経細胞（例えば、神経節細胞やアマクリン細胞）が含まれることが確認できた（図11）。
　これらの結果から、フィーダーフリー培養したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1にてPrecondition処理し、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、このようにして調製した網膜組織を分化培養を続けることで、網膜系細胞（または網膜層特異的神経細胞）、例えば神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、網膜色素上皮細胞、内層の網膜神経細胞、毛様体周縁部様構造体を産生できることがわかった。そして、前記網膜組織では、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、内層の網膜神経細胞が層構造をもった連続上皮構造を形成することがわかった。
　すなわちフィーダーフリー培養したヒト多能性幹細胞から、本願製法により、再生医療・細胞移植治療や有効性・安全性評価研究に有用な網膜組織・網膜系細胞を製造できることがわかった。
実施例１０：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i +Shh)処理、図12“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～3の3条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図12A-C、“Condition 1”）。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図12D-F“Condition 2”）。
・条件３. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（30nM）を添加した条件（図12G-I“Condition 3”）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1、条件２及び条件３で、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む培地前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後12日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1、条件２及び条件３で、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、又は、網膜組織を含む神経組織のマーカーの1つであるPax6について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図12）。
　その結果、条件1、条件２及び条件３で、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件１ではChx10陽性の網膜組織の割合が95%程度（図12A）、条件２ではChx10陽性の網膜組織の割合が95%程度（図12D）、条件３ではChx10陽性の網膜組織の割合が85%程度であった（図12G）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx及びPax6共陽性の細胞であることが確認できた。
　すなわち、条件１では、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件２及び条件３では、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル経路阻害物質添加する条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例１１：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図13“Precondition: Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した（すなわち、分化開始前にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を２日間程度作用させた）。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1～3の3条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図13A-C、“Condition 1”）。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図13D-F、“Condition 2”）。
・条件３. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（30nM）を添加した条件（図13G-I、“Condition 3”）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1、条件２及び条件３で、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1eを含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1、条件２及び条件３で、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、又は、網膜組織を含む神経組織のマーカーの1つであるPax6について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図13）。
　その結果、条件1、条件２及び条件３で、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件１ではChx10陽性の網膜組織の割合が95%程度、条件２ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度、条件３ではChx10陽性の網膜組織の割合が70%程度であった。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx及びPax6共陽性の細胞であることが確認できた。
　すなわち、条件１では、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件２及び条件３では、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル経路阻害物質を添加した条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例１２：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から視細胞を含む網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む培地前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1eを含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、神経組織が形成されることがわかった。
　さらに、前記浮遊培養開始後20日目の細胞の一部を抜き取り、「Nature Communications  6, 6286 (2015)」に記載の方法に準じて分化培養した。
　当該浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Wntシグナル伝達経路作用物質（CHIR99021、3μM）及びFGFシグナル伝達経路阻害物質（SU5402、5μM）を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で、37℃、5％CO2で、3日間すなわち浮遊培養開始後23日目まで培養した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、50個程度の凝集体を、10 mlの前記CHIR99021及びSU5402を含む無血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後23日目には、薄い神経上皮が形成され、網膜色素上皮（RPE）様組織が形成された。
　さらに、当該浮遊培養開始後23日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（DMEM/F12培地に、10%牛胎児血清、1% N2 supplement、0.5μM レチノイン酸、及び100μMタウリンが添加された培地）で、37℃、5％CO2、大気圧の酸素濃度（20%程度）で、浮遊培養開始後85日目まで（62日間）まで浮遊培養した。浮遊培養開始以後23日目から浮遊培養終了時までの間、2～4日に一回、前記血清培地にて半量培地交換した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、30個程度の凝集体を、15 mlの前記血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後35日目以降には、神経網膜様組織が存在した。
　浮遊培養開始後85日目の細胞凝集体を倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、連続上皮構造を持つ神経組織が形成されることがわかった（図14A）。
　このようにして調製された浮遊培養開始後85日目の細胞凝集体をそれぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、視細胞前駆細胞マーカーの1つであるCrx（抗Crx抗体、Takara社製、ウサギ）、神経網膜前駆細胞マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rax/Rx抗体、Takara社製、ギニアピッグ）、視細胞マーカーの1つであるRecoverin（抗Recoverin抗体、Proteintech社製、ウサギ）、杆体視細胞前駆細胞マーカーの1つであるNRL（抗NRL抗体、R and D社製、ヤギ）、錐体視細胞前駆細胞マーカーの1つであるRXR-gamma（抗RXRG抗体、R and D社製、ヤギ）、神経組織のマーカーの１つであるN-cadherin（抗N-cadherin抗体、BD社製、マウス）、RPE及び毛様体縁のマーカーの１つであるAqp1（抗Aqp1抗体、Millipore社製、ウサギ）、について免疫染色を行い、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。対比染色として核酸をDAPIで染色した。
　その結果、前記浮遊培養開始後85日目の細胞凝集体には、Chx10陽性の神経網膜前駆細胞、及び、Crx陽性の視細胞前駆細胞を含む網膜組織が90%程度形成されていることがわかった（図14、B）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織が、Rx陽性の網膜組織であり、Recoverin陽性の視細胞を含むことがわかった（図14、C）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織が、NRL陽性の杆体視細胞前駆細胞、及び、RXR-gamma陽性の錐体視細胞前駆細胞を含むことがわかった（図14、D）。また、当該網膜組織がN-cadherin陽性の神経組織であることがわかった（図14E）。
　これらの結果から、フィーダーフリー培養したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程１にてTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPrecondition処理し、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、このようにして調製した網膜組織を分化培養を続けることで、網膜系細胞（または網膜特異的神経細胞）、例えば神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、錐体視細胞前駆細胞、杆体視細胞前駆細胞を製造できることがわかった。そして、前記網膜組織では、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞が層構造をもった連続上皮構造を形成することがわかった。
実施例１３：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から視細胞を含む網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図15）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、2日間フィーダーフリー培養した（すなわち、分化開始前にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を２日間程度作用させた）。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件の無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（30nM）を添加した条件。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後9日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1eを含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後19日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、神経組織が形成されることがわかった。
　さらに、前記浮遊培養開始後19日目の細胞の一部を抜き取り、「Nature Communications  6, 6286 (2015)」に記載の方法に準じて分化培養した。
　当該浮遊培養開始後19日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Wntシグナル伝達経路作用物質（CHIR99021、3μM）及びFGFシグナル伝達経路阻害物質（SU5402、5μM）を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で、37℃、5％CO2で、3日間すなわち浮遊培養開始後22日目まで培養した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、50個程度の凝集体を、10 mlの前記CHIR99021及びSU5402を含む無血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後22日目には、薄い神経上皮が形成され、網膜色素上皮（RPE）様組織が形成された。
　さらに、当該浮遊培養開始後22日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（DMEM/F12培地に、10%牛胎児血清、1% N2 supplement、0.5μM レチノイン酸、及び100μMタウリンが添加された培地）で、37℃、5％CO2、大気圧の酸素濃度（20%程度）で、浮遊培養開始後92日目まで（70日間）まで浮遊培養した。浮遊培養開始以後20日目から浮遊培養終了時までの間、2～4日に一回、前記血清培地にて半量培地交換した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、30個程度の凝集体を、15 mlの前記血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後35日目以降には、神経網膜様組織が存在した。
　浮遊培養開始後92日目の細胞凝集体を倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、連続上皮構造を持つ神経組織が形成されることがわかった（図15A）。
　このようにして調製された浮遊培養開始後92日目の細胞凝集体をそれぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、視細胞前駆細胞マーカーの1つであるCrx（抗Crx抗体、Takara社製、ウサギ）、神経網膜前駆細胞マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rax/Rx抗体、Takara社製、ギニアピッグ）、視細胞マーカーの1つであるRecoverin（抗Recoverin抗体、Proteintech社製、ウサギ）、杆体視細胞前駆細胞マーカーの1つであるNRL（抗NRL抗体、R and D社製、ヤギ）、錐体視細胞前駆細胞マーカーの1つであるRXR-gamma（抗RXRG抗体、R and D社製、ヤギ）、神経組織のマーカーの１つであるN-cadherin（抗N-cadherin抗体、BD社製、マウス）、RPE及び毛様体縁のマーカーの１つであるAqp1（抗Aqp1抗体、Millipore社製、ウサギ）、について免疫染色を行い、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。対比染色として核酸をDAPIで染色した。
　その結果、前記浮遊培養開始後92日目の細胞凝集体には、Chx10陽性の神経網膜前駆細胞、及び、Crx陽性の視細胞前駆細胞を含む網膜組織が80%程度形成されていることがわかった（図15、B）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織が、Rx陽性の網膜組織であり、Recoverin陽性の視細胞を含むことがわかった（図15、C）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織が、NRL陽性の杆体視細胞前駆細胞、及び、RXR-gamma陽性の錐体視細胞前駆細胞を含むことがわかった（図15、D）。また、連続切片の解析から、当該網膜組織がN-cadherin陽性の神経組織であることがわかった（図15、E）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織がAqp1陽性の毛様体縁様構造体を含むことがわかった（図15、E）。
　これらの結果から、フィーダーフリー培養したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程１にてソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPrecondition処理し、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、このようにして調製した網膜組織を分化培養を続けることで、網膜系細胞（または網膜特異的神経細胞）、例えば神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、錐体視細胞前駆細胞、杆体視細胞前駆細胞、毛様体縁様構造体を製造できることがわかった。そして、前記網膜組織では、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞が層構造をもった連続上皮構造を形成することがわかった。
実施例１４：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i +Shh)処理、図16“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に6％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（30nM）を添加した条件（図１６、A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）及びIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの２条件にて培養後、さらに以下のように培養した。
　浮遊培養開始後12日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後18日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図16A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった。
　すなわち、外来性のBMPの添加条件が条件A及び条件Bのいずれの条件でも、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、前記無血清培地に含まれるKSRの濃度が6%の条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例１５：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(+Shh)処理、図１６“Precondition: Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に6％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図16C,D）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件CおよびDの２条件で、無血清培地を用いて培養した。
・条件C．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件D．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）及びIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件CおよびDの２条件にて培養後、以下のように培養した。
　浮遊培養開始後12日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後18日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件C及び条件Dで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図16C,D）。
　その結果、条件C及び条件Dで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件CではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度、条件DではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった。
　すなわち、外来性のBMPの添加条件が条件C及び条件Dのいずれの条件でも、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、前記無血清培地に含まれるKSRの濃度が6%の条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例１６：工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、LDN193189（BMPシグナル伝達経路阻害物質（BMPR-i）、100 nM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(BMPR-i +Shh)処理、図１７“Precondition: BMPR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(BMPR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図17A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）及びIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの２条件にて培養後、以下のように培養した。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図17A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度であった。
　すなわち、条件A及び条件Bのいずれの外来性のBMPの添加条件でも、工程１でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例１７：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養し、サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を調製した。さらに、前記サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞をSB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した（工程１：Precondition(TGFβR-i 24h +Shh 48h)処理、図18）。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i 24h +Shh 48h)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図18A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）及びIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの２条件にて培養後、さらに以下のように培養した。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図18A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった。
　すなわち、条件A及び条件Bのいずれの外来性のBMPの添加条件でも、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例１８：工程1でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養し、サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を調製した。さらに、前記サブコンフレント1日前のヒトiPS細胞をLDN193189（BMPシグナル伝達経路阻害物質（BMPR-i）、100 nM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した（工程１：Precondition(BMPR-i 24h +Shh 48h)処理、図１９）。
　このようにして調製されたPrecondition(BMPR-i 24h +Shh 48h)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図19A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）及びIWR-1eを含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの２条件にて、以下のように培養した。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図19A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が50%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が70%程度であった。
　すなわち、条件A及び条件Bのいずれの外来性のBMPの添加条件でも、工程１でBMPシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、網膜組織へと分化することがわかった。
実施例１９：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i +Shh)処理、図２０ “Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10% KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、TGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542（5μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（図２０、A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e（3μM）及びSB431542（5μM）の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地前記無血清培地にて、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e（3μM）及びSB431542（5μM）の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）、IWR-1e及びSB431542を含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの２条件にて培養後、さらに以下のように培養した。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、IWR-1e及びSB431542を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図20A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が95%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が95%程度であった。
　すなわち、条件A及び条件Bのいずれの外来性のBMPの添加条件でも、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例２０：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図21 “Precondition: Shh 48 h”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.0 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10% KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件で無血清培地で培養した。
・条件. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）、及び、TGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542（5μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件（図21、A,B）。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　さらに下記の条件A，Bの２条件で無血清培地で培養した。
・条件A．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e（3μM）及びSB431542（5μM）の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
・条件B．浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1e（3μM）及びSB431542（5μM）の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1e及びSB431542を含む培地培地を50μl加えた。さらに、浮遊培養開始後６日目に、外来性のヒト組換えBMP4の濃度、及び、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）、IWR-1e及びSB431542を含む前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1e及びSB431542を含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　上記条件A、Bの2条件で培養した細胞を、以下のように培養した。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1e及びSB431542の濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、IWR-1e及びSB431542を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後20日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後20日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図21A,B）。
　その結果、条件A及び条件Bで、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件AではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度、条件BではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった。
　すなわち、条件A及び条件Bのいずれの外来性のBMPの添加条件でも、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後10日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例21：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図２２）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.3 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10% KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件１及び条件２で無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図22A,B）。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図22C,D）。
浮遊培養開始後2日目までに、条件1及び条件２にて、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、条件1及び条件２にて、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。
　浮遊培養開始後6日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後18日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1及び条件２にて、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後18日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。
　その結果、条件1及び条件２において、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件1ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度（図22A）、条件２ではChx10陽性の網膜組織の割合が80%程度であった（図22C）。また連続切片の解析から、条件1及び条件２のChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図22　B、D）。
　すなわち、工程２においてソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加する条件でも添加しない条件でも、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後6日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質を3%以下に減らした条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。
実施例２２：工程1でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から視細胞前駆細胞および神経節細胞を含む網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（QHJI01s04株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(Shh)処理、図２３）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.3 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10% KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件１及び条件２で無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図23A-D）。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図23E-H）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1及び条件２にて、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、条件1及び条件２にて、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。
　浮遊培養開始後6日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後11日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1及び条件２にて、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後11日目の細胞凝集体の一部を抜き取って、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）、について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。
　その結果、条件1及び条件２にて、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件1ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度（図23A）、条件２ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度であった（図23E）。また連続切片の解析から、条件1及び条件２のChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図23B、F）。
　さらに、条件1及び条件２にて、前記浮遊培養開始後11日目の細胞の一部を抜き取り、「Nature Communications  6, 6286 (2015)」に記載の方法に準じて分化培養した。
　当該浮遊培養開始後11日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Wntシグナル伝達経路作用物質（CHIR99021、3μM）及びFGFシグナル伝達経路阻害物質（SU5402、5μM）を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で、37℃、5％CO2で、3日間すなわち浮遊培養開始後14日目まで培養した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、５０個程度の凝集体を、10 mlの前記CHIR99021及びSU5402を含む無血清培地で浮遊培養した。浮遊培養開始後14日目には、薄い神経上皮が形成され、網膜色素上皮（RPE）様組織が形成された。
　さらに、当該浮遊培養開始後14日目の細胞凝集体を、90 mmの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（DMEM/F12培地に、10%牛胎児血清、1% N2 supplement、及び100μMタウリンが添加された培地）で、37℃、5％CO2、大気圧の酸素濃度（20%程度）で、浮遊培養開始後35日目まで（21日間）まで浮遊培養した。浮遊培養開始以後20日目から浮遊培養終了時までの間、2～4日に一回、前記血清培地にて半量培地交換した。この期間、一枚の90 mmの低接着培養皿あたり、30個程度の凝集体を、15 mlの前記血清培地で浮遊培養した。
　浮遊培養開始後35日目の細胞凝集体を倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、神経網膜様組織が存在し、連続上皮構造を持つ神経組織が形成されることがわかった。
　このようにして調製された浮遊培養開始後35日目の細胞凝集体をそれぞれ4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、視細胞前駆細胞マーカーの1つであるCrx（抗Crx抗体、Takara社製、ウサギ）、又は、神経節細胞マーカーの１つであるBrn3b（抗Brn3b抗体、Santa Cruz社製, ヤギ）について免疫染色を行い、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した。
　その結果、条件1及び条件２の、前記浮遊培養開始後35日目の細胞凝集体には、Crx陽性の視細胞前駆細胞を含む網膜組織が90%程度形成されていることがわかった（図23C,G）。さらに、連続切片の解析から、当該網膜組織が、Brn3b陽性の神経節細胞を含むことがわかった（図23 D,H）。
　これらの結果から、工程２においてソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加する条件でも添加しない条件でも、フィーダーフリー培養したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程１にてソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPrecondition処理し、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件で、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、このようにして調製した網膜組織を分化培養を続けることで、網膜系細胞（または網膜特異的神経細胞）、例えば視細胞前駆細胞や神経節細胞を産生できることがわかった。そして、前記網膜組織では、視細胞前駆細胞や神経節細胞が、層構造をもった連続上皮構造を形成することがわかった。
実施例２３：センダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でPreconditionし、工程2でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（TFH-HA株、大日本住友製薬にて樹立）は、下記の通り樹立した。周知の方法で調製した末梢血単核球（PBMC）を原料に、市販されているセンダイウイルスベクター（Oct3/4、Sox2、KLF4、L-Mycの4因子、ID Pharma社製サイトチューンキット）を用いて、StemFit（登録商標）培地 (AK03N;味の素社製)、Laminin511-E8（ニッピ社製）を用いて樹立した。
　ヒトiPS細胞（TFH-HA株）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i +Shh)処理、図２４ “Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.3 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件1及び２の２条件の無血清培地で培養した。
・条件1. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図24A,B、“Condition 1”）。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図24E,F“Condition 2”）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件1及び条件２で、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後12日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後19日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件1及び条件２で、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後19日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図24）。
　その結果、条件1及び条件２で、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件１ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度（図24A）、条件２ではChx10陽性の網膜組織の割合が90%程度（図24E）であった。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図24B,F）。
　すなわち、条件１で、スタート原料としてセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞を用いて、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加せず、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件２では、スタート原料としてセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞を用いて、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル経路阻害物質添加し条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例２４：センダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞をスタート原料として、工程1でPreconditionし、工程2でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（TFH-HA株、大日本住友製薬にて樹立）は、実施例２３記載の通り樹立した。ヒトiPS細胞を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント２日前のヒトiPS細胞を、SAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（図２４ “Precondition: Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、２日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.3 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件3及び4の２条件の無血清培地で培養した。
・条件3. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しなかった条件（図24C,D、“Condition 3”）。
・条件4. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件（図24G,H“Condition 4”）。
　浮遊培養開始後2日目までに、条件3及び条件4で、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後3日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後12日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後19日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、条件3及び条件4で、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後19日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図24）。
　その結果、条件3及び条件4で、神経組織が形成されることがわかった。さらに、条件3ではChx10陽性の網膜組織の割合が60%程度（図24C）、条件4ではChx10陽性の網膜組織の割合が50%程度（図24G）であった。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図24D,H）。
　すなわち、条件3で、スタート原料としてセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞を用いて、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加せず、工程2及び工程３でWntシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜組織へと分化することがわかった。さらに、条件4では、スタート原料としてセンダイウイルスベクターを用いて樹立したヒトiPS細胞を用いて、工程１でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加し、工程2及び工程３でWntシグナル経路阻害物質添加し、工程３の途中（浮遊培養開始後12日目）で外来性のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を3%以下に減らした条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
実施例２５：工程1でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質でPreconditionし、工程2及び工程3でWntシグナル伝達経路阻害物質を用いた、ヒトiPS細胞から網膜組織の製造例
　ヒトiPS細胞（1231A3株、京都大学より入手）を、フィーダーフリー培地としてはStem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8（ニッピ社製）を用いて、実施例1記載の方法でフィーダーフリー培養した。
　このようにしてフィーダーフリー培養したサブコンフレント1日前のヒトiPS細胞を、SB431542 （TGFβシグナル伝達経路阻害物質（TGFβR-i）、5μM）及びSAG (ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(Shh)、300 nM)を添加した条件（工程1：Precondition(TGFβR-i +Shh)処理、図25“Precondition: TGFβR-i + Shh”）で、Stem Fit（登録商標）培地（AK03N;味の素社製）を用いて、1日間フィーダーフリー培養した。
　このようにして調製されたPrecondition(TGFβR-i +Shh)処理したヒトiPS細胞を、TrypLE Select（Life Technologies社製）を用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作により単一細胞に分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を、非細胞接着性の96穴培養プレート（PrimeSurface 96スリットウェルプレート，住友ベークライト社製）の1ウェルあたり1.3 x 104細胞になるように100μlの無血清培地に浮遊させ、37℃、5％CO2で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール、1 x Chemically defined lipid concentrateを添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後0日目、工程2開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度20μM）を加え、下記の条件2で無血清培地で培養した。
・条件2. 工程２開始時の前記無血清培地に、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてIWR-1e（3μM）を添加し、かつ、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAG（10nM）を添加した条件。
　浮遊培養開始後2日目までに、細胞凝集体が形成された（工程2終了、工程3開始）。
　浮遊培養開始後4日目に、外来性のヒト組換えBMP4の終濃度が1.5 nM（55 ng/ml）になり、かつ、外来性のIWR-1eの濃度（3μM）が変わらないように、Y27632とSAGを含まず、ヒト組換えBMP4（R&D社製）を含み、さらにIWR-1eを含む培地培地を50μl加えた。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4を含まず、さらにIWR-1eを含む前記無血清培地にて、外来性のIWR-1eの濃度が変わらないように、半量培地交換操作を行った。
　浮遊培養開始後10日目に、外来性のIWR-1eの濃度が培地交換前に比べて3%以下になるように、前記無血清培地を用いて80%培地交換操作を3回行った。その後、2～4日に一回、Y27632、SAG、ヒト組換えBMP4、及びIWR-1e を含まない前記無血清培地にて、半量培地交換操作を行った。
　このようにして調製された浮遊培養開始後17日目の細胞を、倒立顕微鏡（ニコン社製、ECLIPSE Ti）を用いて、明視野観察を行った。その結果、神経組織が形成されることがわかった。
　前記浮遊培養開始後17日目の細胞凝集体を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、網膜組織マーカーの1つであるChx10（抗Chx10抗体、Exalpha社製, ヒツジ）、又は、網膜組織マーカーの1つであるRx（抗Rx抗体、Takara社、ギニアピッグ）について免疫染色を行った。これらの染色された切片を、倒立型蛍光顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて観察した（図25）。
　その結果、神経組織が形成されることがわかった。さらに、この条件では、Chx10陽性の網膜組織の割合が90%程度であった（図25、A）。また連続切片の解析から、これらのChx10陽性細胞がRx共陽性の細胞であることが確認できた（図25、B）。
　すなわち、工程１でTGFβシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質にてPreconditionし、工程２でソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加してスリットウェルプレートに播種し、工程2及び工程３でWntシグナル経路阻害物質添加した条件でも、効率よく網膜系細胞へと分化することがわかった。
　本発明によれば、フィーダー細胞非存在下に培養された多能性幹細胞から、網膜系細胞又は網膜組織、並びにこれらを製造するために用いられる細胞凝集体を高効率に製造することが可能となる。
　ここで述べられた特許、特許出願明細書及び科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、日本で出願された特願2016-086602（出願日：2016年4月22日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (32)

  1. 　下記工程（1）～（3）を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法；
    （1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地中で培養する第一工程、
    （2）第一工程で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
    （3）第二工程で得られた凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下又は非存在下において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
  2. 　第一工程において多能性幹細胞を0.5時間～144時間培養する、請求項1に記載の製造方法。
  3. 　第一工程の培養が接着培養で行われる、請求項1又は2に記載の製造方法。
  4. 　第二工程において、第一工程で得られた細胞を分散し、当該分散した細胞を浮遊培養する、請求項1～3のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　未分化維持因子が、少なくともFGFシグナル伝達経路作用物質を含む、請求項1～4に記載の製造方法。
  6. 　FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、請求項5に記載の製造方法。
  7. 　第二工程において、浮遊培養に用いる培地が、更にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む、請求項1～6のいずれかに記載の製造方法。
  8. 　多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であり、第二工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質濃度がSAG10nM～700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度である、請求項7に記載の製造方法。
  9. 　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、又はBMPシグナル伝達経路阻害物質である、請求項1～8のいずれかに記載の製造方法。
  10. 　TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質が、Lefty、SB431542、A-83-01及びLDN193189からなる群から選ばれる1以上の物質である、請求項1～9のいずれかに記載の製造方法。
  11. 　ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がShh、SAG及びPurmorphamineからなる群から選ばれる1以上の物質である、請求項1～10のいずれかに記載の製造方法。
  12. 　第三工程において、第二工程の開始後1日目から9日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、請求項1～11のいずれかに記載の製造方法。
  13. 　第三工程において、第二工程開始後1日目から6日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、請求項12に記載の製造方法。
  14. 　第三工程において、第二工程開始後1日目から3日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する、請求項13に記載の製造方法。
  15. 　BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である、請求項1～14のいずれかに記載の製造方法。
  16. 　BMPシグナル伝達経路作用物質が、BMP4である、請求項1～15のいずれかに記載の製造方法。
  17. 　第三工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度がSAG700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度以下である、請求項1～16のいずれかに記載の製造方法。
  18. 　第二工程開始後3日間から18日間、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で培養する、請求項1～17のいずれかに記載の製造方法。
  19. 　第二工程開始後10日間、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で培養する、請求項1～18のいずれかに記載の製造方法。
  20. 　Wntシグナル伝達経路阻害物質が、IWR-1-endoである、請求項1～19のいずれかに記載の製造方法。
  21. 　第三工程において得られる凝集体が、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、神経節細胞、双極細胞、網膜色素上皮細胞、及び毛様体周縁部細胞からなる群から選択される1又は複数の細胞を含む凝集体である、請求項1～20のいずれかに記載の製造方法。
  22. 　多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項1～21のいずれかに記載の製造方法。
  23. 　多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1～22のいずれかに記載の製造方法。
  24. 　第二工程において、均一な凝集体を形成させる、請求項1～23のいずれかに記載の製造方法。
  25. 　浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる、請求項1～24のいずれかに記載の製造方法。
  26. 　請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を含有する、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
  27. 　請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞または網膜組織に被験物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
  28. 　請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を含有する、網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬。
  29. 　網膜系細胞又は網膜組織が、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、又は網膜組織である、請求項28に記載の治療薬。
  30. 　請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
  31. 　網膜系細胞又は網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織。
  32. 　請求項1～25のいずれかに記載の方法により製造される網膜系細胞又は網膜組織を有効成分として含有する、医薬組成物。
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