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WO2015068505A1 - 網膜色素上皮細胞の製造方法 - Google Patents

網膜色素上皮細胞の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2015068505A1
WO2015068505A1 PCT/JP2014/076471 JP2014076471W WO2015068505A1 WO 2015068505 A1 WO2015068505 A1 WO 2015068505A1 JP 2014076471 W JP2014076471 W JP 2014076471W WO 2015068505 A1 WO2015068505 A1 WO 2015068505A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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cells
serum
medium
culture
retinal pigment
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/076471
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
徳重 中野
親文 大曽根
Yoshiki Sasai (笹井 芳樹)
Original Assignee
住友化学株式会社
独立行政法人理化学研究所
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Filing date
Publication date
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Priority to CN201480068651.2A priority patent/CN105829527A/zh
Priority to AU2014345110A priority patent/AU2014345110B2/en
Priority to EP14860084.4A priority patent/EP3070162B1/en
Priority to KR1020167015215A priority patent/KR102297584B1/ko
Priority to CA2930092A priority patent/CA2930092C/en
Priority to US15/035,966 priority patent/US10760050B2/en
Priority to JP2015546349A priority patent/JP6495176B2/ja
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing retinal pigment epithelial cells.
  • Non-patent Document 1 A report of producing retinal pigment epithelial cells using pluripotent stem cells is known (Non-patent Document 1). Uniform pluripotent stem cell aggregates are formed in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor, and this is cultured in suspension in the presence of a basement membrane preparation and then suspended in serum and then Wnt. Methods for obtaining retinal pigment epithelial cells by suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing a signal pathway agonist but not a sonic hedgehog signal pathway agonist (Non-patent Document 2 and Patent Document 1) are shown. Has been.
  • the present invention provides a method for producing retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheets from pluripotent stem cells. That is, the present invention provides: [1] (1) a first step of forming an aggregate of pluripotent stem cells by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregate formed in the step (1) is suspended in a serum-free medium or a serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent without containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, and retinal progenitor cells And (3) the aggregate obtained in step (2) does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agonist or a BMP signaling pathway agonist, and a Wnt signaling pathway agonist
  • a method for producing retinal pigment epithelial cells comprising the third step of obtaining an aggregate containing retinal pigment epithelial cells by suspension culture in a serum-free medium or serum medium comprising ); [2] (1) a first step of forming an aggregate of pluripotent stem cells
  • a method for producing an epithelial cell sheet (hereinafter sometimes referred to as the production method 2 of the present invention); [3] The production method according to [2], wherein in the step (4), adhesion culture is performed in the presence of a serum substitute; [4] The production method according to [2] or [3], wherein in the step (4), adhesion culture is performed in the presence of a ROCK inhibitor; [5] A serum-free medium further comprising at least one substance selected from the group consisting of a Wnt signal pathway agonist, an FGF signal pathway inhibitor, an Activin signal pathway agonist, and a BMP signaling pathway agonist in the step (4) Or the production method according to any one of [2] to [4], wherein adhesion culture is performed using a serum medium; [6] The production method according to any one of [2] to [5], wherein in the step (4), adhesion culture is performed on a culture device surface-treated with a culture substrate; [7] The production method according to [6], wherein
  • a method for evaluating the toxicity and efficacy of the substance including testing the effect of the substance; [17] A therapeutic agent for a disease based on a disorder of retinal tissue, comprising a retinal pigment epithelial cell or a retinal pigment epithelial cell sheet produced by the method according to any one of [1] to [14]; [18] Transplanting an effective amount of a retinal pigment epithelial cell or retinal pigment epithelial cell sheet produced by the method according to any one of [1] to [14] above into a subject in need of transplantation A method for treating a disease based on a disorder of retinal tissue; and [19] a retina produced by the method according to any one of [1] to [14] for use in treating a disease based on a disorder of retinal tissue Pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheets; Etc.
  • retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheets can be produced with high efficiency.
  • the retinal pigment epithelial cell or the retinal pigment epithelial cell sheet is obtained by adding the basement membrane sample to the medium, that is, by culturing the aggregate in suspension in the absence of the basement membrane sample.
  • the risk of contamination of heterogeneous components into the resulting cells or cell sheets is reduced.
  • FIG. 1 shows a bright field image (A) of suspension culture on day 18 of suspension culture obtained by adding BMP4 to the medium on the third day of suspension culture, and BMP4 on the third day of suspension culture.
  • FIG. 2 shows human embryonic stem cell-derived aggregates suspended in a medium containing BMP4 from day 3 to day 18 from the start of suspension culture.
  • FIG. 3 shows that human embryonic stem cell-derived aggregates are suspended in a medium containing BMP4 from the 3rd to 18th day of suspension culture, and from 18th to 21st day of suspension culture in a medium containing CHIR99021 without BMP4.
  • A Bright field image and
  • B Retinal pigment on the 27th day from the start of suspension culture when cells obtained by suspension culture and cells obtained by disrupting the aggregates on the 21st day of culture are cultured in a medium containing CHIR99021
  • FIG. 2 shows a fluorescent immunostained image of the epithelial marker Mitf and
  • C a fluorescent immunostained image of the tight junction marker ZO-1.
  • FIG. 4 shows that human embryonic stem cell-derived aggregates were suspended in a medium containing BMP4 from the 3rd to 18th day of suspension culture, and from 18th to 21st day of suspension culture in a medium containing CHIR99021 without BMP4.
  • A From the start of the suspension culture when the suspension cells are dispersed and dispersed on the 21st day of suspension culture, and the obtained cells are seeded in a Boyden chamber surface-treated with Synthemax TM and adherently cultured in a medium containing Y27632. It is an image of the retinal pigment epithelial cell sheet on the 40th day, and
  • FIG. 5 is an enlarged bright field image of the retinal pigment epithelial cell sheet on the 40th day from the start of suspension culture.
  • Human embryonic stem cell-derived aggregates are float-cultured in a medium containing BMP4 from the 3rd to 18th day of suspension culture, and suspended in a medium containing CHIR99021 without containing BMP4 from the 18th to 21st day of suspension culture. Then, the cells were dispersed on the 21st day of culture, and the obtained cells were seeded in a Boyden chamber surface-treated with Synthemax TM and cultured for adhesion.
  • FIG. 6 shows that human embryonic stem cell-derived aggregates are suspended in a medium containing BMP4 from the 3rd to 18th day of suspension culture, and from 18th to 21st day of suspension culture in a medium containing CHIR99021 without BMP4.
  • “Floating culture” in the present invention means culturing under conditions that do not allow cells or cell masses to adhere to culture equipment or the like.
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can perform “suspension culture” and can be appropriately determined by those skilled in the art. Examples of such incubators include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, multi well plates, chamber slides, A petri dish, a tube, a tray, a culture bag, or a roller bottle is mentioned.
  • These incubators are preferably non-cell-adhesive in order to enable suspension culture.
  • the non-cell-adhesive incubator those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells can be used.
  • the medium used for cell culture can be prepared using a medium usually used for animal cell culture as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, ham medium
  • the culture medium include RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof that can be used for animal cell culture.
  • serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components is also included in the serum-free medium unless it contains unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a serum replacement.
  • serum substitutes include those containing albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiolglycerol, or their equivalents as appropriate.
  • Such a serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product may be used as a serum substitute.
  • examples of such commercially available serum substitutes include Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Invitrogen: hereinafter referred to as KSR), Chemically-defined Lipid concentrate (manufactured by Gibco), and Glutamax TM (Gibco). Can be mentioned.
  • the serum-free medium used for suspension culture contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like. May be.
  • a serum-free medium for example, F-12 medium and IMDM medium 1: 1 to which an appropriate amount of commercially available KSR is added (for example, about 1% to about 20%) is added.
  • KSR commercially available KSR
  • a medium containing 10% KSR and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol added to one mixed solution may be used.
  • serum medium means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. May be.
  • the “basement membrane preparation” refers to epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, movement, functional expression, etc., when desired cells having basement membrane forming ability are seeded and cultured thereon.
  • the “basement membrane component” refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule that exists between an epithelial cell layer and a stromal cell layer in an animal tissue.
  • a basement membrane preparation removes cells having a basement membrane-forming ability adhered to a support through a basement membrane from the support using a solution or an alkaline solution having lipid-dissolving ability of the cells. Can be produced.
  • Basement membrane preparations include products that are commercially available as basement membrane preparations (for example, Matrigel TM (manufactured by Becton Dickinson: hereinafter, sometimes referred to as Matrigel)), and known extracellular matrix as a basement membrane component. Examples include molecules (for example, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, etc.). Matrigel TM is a basement membrane preparation extracted from Engelbreth Holm Swarm (EHS) mouse sarcoma.
  • EHS Engelbreth Holm Swarm
  • Matrigel TM The main components of Matrigel TM are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, in addition to these naturally produced by TGF- ⁇ , fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator and EHS tumor Growth factors are included.
  • Matrigel TM “growth factor reduced products” have lower concentrations of growth factors than normal Matrigel TM , with standard concentrations of EGF ⁇ 0.5 ng / ml, NGF ⁇ 0.2 ng / ml, PDGF ⁇ 5 pg / ml, IGF-1 at 5 ng / ml, and TGF- ⁇ at 1.7 ng / ml.
  • the “medium containing the substance X” means a medium to which the exogenous substance X is added or a medium containing the exogenous substance X
  • the “medium not containing the substance X” Means a medium to which no exogenous substance X is added or a medium not containing exogenous substance X.
  • exogenous substance X means substance X that is foreign to cells or tissues cultured in the medium, and includes endogenous substance X produced by the cells or tissues. I can't.
  • the “medium containing a BMP signal transduction pathway agent” is a medium to which an exogenous BMP signal transduction agent is added or a medium containing an exogenous BMP signal transduction pathway agent.
  • “Sonic hedgehog signaling pathway agent-free medium” refers to a medium to which exogenous sonic hedgehog signaling pathway agent is not added or exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist The medium does not contain.
  • primary refers to mammals belonging to the order of primates, and examples of primates include wild monkeys such as lemurs, loris and camellia, and monkeys such as monkeys, apes and humans.
  • the “stem cell” in the present invention is a cell that maintains the same differentiation ability even after cell division, and can contribute to regeneration of the tissue when the tissue is damaged.
  • Stem cells include embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells) or tissue stem cells (also called tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), or induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced). (primipotent stem cell). It is known that the above stem cell-derived tissue cells can be differentiated into normal cells close to a living body, as can be seen from the fact that tissue regeneration is possible. Stem cells can be obtained from a predetermined institution, and commercially available products can also be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • EB5 cells both mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
  • Stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • human stem cells can be maintained by culturing them in a medium supplemented with Knockout TM Serum Replacement (Invitrogen).
  • Mouse stem cells can be maintained by adding fetal calf serum (FCS) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) and culturing under feeder-free conditions.
  • FCS fetal calf serum
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • the “pluripotent stem cell” in the present invention can be cultured in vitro and all cells constituting the living body excluding the placenta (tissues derived from the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)) Refers to a stem cell having the ability to differentiate into (pluripotency).
  • Embryonic stem cells ES cells
  • Pluripotent stem cells are obtained from fertilized eggs, cloned embryos, germline stem cells or stem cells in tissue. Cells that are artificially provided with pluripotency similar to embryonic stem cells by introducing several types of genes into somatic cells (also called induced pluripotent stem cells) are also included in “pluripotent stem cells”.
  • Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se. As a manufacturing method, for example, Cell, 2007, 131 (5) pp. 861-872, Cell, 2006, 126 (4) pp. The method described in 663-676 is mentioned.
  • the “embryonic stem cell (ES cell)” in the present invention is a stem cell having self-renewal ability and pluripotency (in particular, pluripotency “pluripotency”), and is a pluripotent stem cell derived from an early embryo.
  • pluripotency in particular, pluripotency “pluripotency”
  • Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • the “artificial pluripotent stem cell” in the present invention refers to the induction of pluripotency by directly initializing differentiated cells such as fibroblasts by the expression of several types of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc. Cells.
  • artificial pluripotent stem cells were established by mouse cells in Yamanaka et al. (Cell, 2006, 126 (4) pp. 663-676).
  • Artificial pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007 and have pluripotency similar to embryonic stem cells (Cell, 2007, 131 (5) pp. 861-872; Science, 2007, 318 ( 5858) pp. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1) 101 pp. 101-106).
  • a genetically modified pluripotent stem cell can be prepared, for example, by using a homologous recombination technique.
  • genes on the chromosome to be modified include cell marker genes, histocompatibility antigen genes, and disease-related genes based on nervous system cell disorders. Modification of the target gene on the chromosome is the following: Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harboratory Press (1994); Gene Targeting AP, Gene Targeting. 8. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, Yochisha (1995); and the like.
  • a genomic gene of a target gene to be modified eg, cell marker gene, histocompatibility antigen gene, disease-related gene, etc.
  • the target gene is homologous using the isolated genomic gene
  • a target vector for recombination is prepared.
  • genomic gene of the target gene can also be isolated by using a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome Systems) or Universal Genome Walker Kits (manufactured by CLONTECH).
  • target vectors for homologous recombination of target genes and efficient selection of homologous recombinants are described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting , Production of mutant mice using ES cells, Yodosha (1995); and the like.
  • the target vector can be either a replacement type or an insertion type.
  • methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, or poly A selection can be used. Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
  • the “aggregate” in the present invention refers to a mass formed by aggregation of cells dispersed in a medium.
  • the “aggregate” in the present invention includes an aggregate formed by cells dispersed at the start of suspension culture and an aggregate already formed at the start of suspension culture.
  • “Aggregate formation” means that when cells are aggregated to form cell aggregates and suspension culture is performed, a qualitatively uniform cell is formed by “aggregating a certain number of dispersed cells rapidly”. It means forming an aggregate.
  • Experimental operations for forming aggregates include, for example, a method of confining cells in a small space using a plate with a small well (96-well plate) or a micropore, or a short centrifugation using a small centrifuge tube.
  • a method of aggregating cells is mentioned.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells and the formation of epithelial structures in the cells forming the aggregates are microscopically determined by aggregate size and number of cells, macroscopic morphology, and tissue staining analysis. It is possible to make a judgment based on the target morphology and its uniformity, the expression and uniformity of differentiation and undifferentiation markers, the expression control and synchronization of differentiation markers, the reproducibility of the differentiation efficiency between aggregates, and the like.
  • tissue in the present invention refers to a structure of a cell population having a structure in which a plurality of types of cells having different forms and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
  • retinal tissue means at least cells such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells, progenitor cells thereof, or retinal progenitor cells constituting each retinal layer in a living retina. It means multiple types of retinal tissues arranged in layers and three-dimensionally. Whether each cell constitutes which retinal layer can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of the expression of a cell marker or the degree thereof.
  • the “retinal layer” in the present invention means each layer constituting the retina. Specifically, the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer boundary membrane, outer granular layer, outer reticulated layer, inner granular layer, inner granular layer, Mention may be made of the reticular layer, the ganglion cell layer, the nerve fiber layer and the inner limiting membrane.
  • the “retinal layer-specific nerve cell” means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
  • retinal layer-specific neurons include bipolar cells, nodal cells, amacrine cells, horizontal cells, photoreceptor cells, pigment epithelial cells, rod cells, and cone cells.
  • retinal pigment epithelial cell means an epithelial cell existing outside the neural retinal tissue in the living retina. If it is those skilled in the art, whether it is a retinal pigment epithelial cell, for example, expression of a cell marker (RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) etc.), presence of melanin granule, characteristic cell of polygon It can be confirmed by the form.
  • a cell marker RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) etc.
  • the “retinal progenitor cell” in the present invention refers to a progenitor cell that can differentiate into any mature retinal cell of a photoreceptor cell, a horizontal cell, a bipolar cell, an amacrine cell, a retinal node cell, and a retinal pigment epithelial cell.
  • Visual cell progenitor cells, horizontal cell progenitor cells, bipolar cell progenitor cells, amacrine cell progenitor cells, retinal node cell progenitor cells, and retinal pigment epithelial progenitor cells, respectively, are photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal nodes.
  • Cell a progenitor cell that has been determined to differentiate into retinal pigment epithelial cells.
  • Rax and PAX6 expressed in retinal progenitor cells As retinal cell markers, Rax and PAX6 expressed in retinal progenitor cells, Nkx2.1 that is expressed in progenitor cells of hypothalamic neurons but not in retinal progenitor cells, Sox1 that is expressed in hypothalamic neuroepithelium but not in the retina, visual Examples include Crx expressed in cell precursor cells.
  • Chx10 and L7 expressed in bipolar cells As markers for retinal layer-specific neurons, Chx10 and L7 expressed in bipolar cells, Tuj1 and Brn3 expressed in nodal cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, Rhodopsin expressed in photoreceptor cells and Recoverin, RPE65 and Mitf expressed in pigment epithelial cells, Nrl expressed in rod cells, Rxr-gamma expressed in cone cells, and the like.
  • the production method 1 of the present invention is a method for producing retinal pigment epithelial cells including the following steps (1), (2) and (3): (1) a first step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregate formed in the step (1) is suspended in a serum-free medium or a serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent without containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, and retinal progenitor cells And (3) the aggregate obtained in step (2) does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agonist or a BMP signaling pathway agonist, and a Wnt signaling pathway agonist A third step of obtaining an aggregate containing retinal pigment epithelial cells by suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing
  • the step (1) of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium will be described.
  • the serum-free medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium to which neither a BMP signal transduction pathway agonist nor a Wnt signal pathway inhibitor is added can be used.
  • a serum-free medium for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1-mono in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12 added with a suitable amount of a commercially available serum substitute such as KSR). It is preferable to use a medium supplemented with thioglycerol and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the step (1) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, from about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the concentration of pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so that aggregates of pluripotent stem cells are formed more uniformly and efficiently.
  • concentration of pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so that aggregates of pluripotent stem cells are formed more uniformly and efficiently.
  • a solution prepared to be about 5 ⁇ 10 3 to about 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably about 1.2 ⁇ 10 4 cells is added to the well, and the plate is allowed to stand to form an aggregate. .
  • the suspension culture time required to form aggregates can be determined as appropriate depending on the pluripotent stem cells used so that the cells can be aggregated uniformly, but as short as possible to form uniform aggregates. It is desirable to be time. For example, in the case of human ES cells, aggregates are preferably formed within about 24 hours, more preferably within about 12 hours. The time until the formation of the aggregates can be appropriately adjusted by adjusting tools for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells is due to the size and number of the aggregates, the macroscopic morphology, the microscopic morphology and its homogeneity by tissue staining analysis, the expression and the homogeneity of differentiation and undifferentiation markers It is possible to make a judgment based on the expression control of the differentiation marker and its synchrony, the reproducibility between the aggregates of the differentiation efficiency, and the like.
  • the aggregate formed in the step (1) is suspended in a serum-free medium or a serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent without containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, and a coagulation containing a retinal progenitor cell.
  • the step (2) for obtaining the aggregate will be described.
  • the medium used in the step (2) is, for example, a serum-free medium or a serum medium to which a BMP signal transduction pathway agent is not added without adding a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist, There is no need to add.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1-mono in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12 added with a suitable amount of a commercially available serum substitute such as KSR. It is preferable to use a medium supplemented with thioglycerol and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • the serum-free medium used in step (2) can be used as it is as long as the serum-free medium used in step (1) does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agent. It can also be replaced with serum medium.
  • a BMP signal transduction pathway agent may be added to the medium.
  • a sonic hedgehog (hereinafter sometimes referred to as Shh) signaling pathway agent is a substance capable of enhancing signal transduction mediated by Shh.
  • substances acting on the Shh signal transduction pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purphamine, SAG, and the like.
  • Sonic hedgehog signaling pathway agent free media includes media that are substantially free of sonic hedgehog signaling pathway agonists, such as selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue. Also included are media that do not contain sonic hedgehog signal transduction pathway agents at concentrations that have a significant impact.
  • “Sonic hedgehog signaling pathway agonist” medium is essentially free of sonic hedgehog signaling pathway agonist, eg selection for retinal progenitor cells and retinal tissue Also included is a medium to which no sonic hedgehog signaling pathway agent is added at a concentration that adversely affects sexual differentiation.
  • a substance acting on a BMP signal transduction pathway is a substance that can enhance a signal transduction pathway mediated by BMP.
  • BMP signal transduction pathway agonists include BMP proteins such as BMP2, BMP4 or BMP7, GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, or BMP partial peptides.
  • BMP2 protein, BMP4 protein and BMP7 protein are available from, for example, R & D Systems, and GDF7 protein is available from, for example, Wako Pure Chemical Industries.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent may be any concentration that can induce differentiation of cells forming aggregates of pluripotent stem cells into retinal cells. For example, in the case of BMP4, it is added to the medium to a concentration of about 0.01 nM to about 1 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to about 100 nM, more preferably about 1.5 nM.
  • the BMP signal transduction pathway agent may be added after about 24 hours from the start of suspension culture in step (1), and may be added to the medium within several days (for example, within 15 days) after the start of suspension culture. Also good. Preferably, the BMP signal transduction pathway agent is added to the culture medium from the first day to the fifteenth day after the start of suspension culture, more preferably from the first day to the ninth day, most preferably the third day. To do. After the BMP signaling pathway agent is added to the medium and the induction of differentiation into cells that form aggregates of pluripotent stem cells is initiated, it is necessary to add the BMP signaling pathway agent to the medium. Alternatively, the medium may be changed using a serum-free medium or serum medium that does not contain a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregate formed in the step (1) is used for the BMP at a concentration necessary for inducing differentiation into a retinal cell until cells expressing the Rax gene begin to appear.
  • the culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the step (2) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • Obtaining an aggregate containing retinal progenitor cells can be confirmed, for example, by detecting that cells expressing Rax or PAX6, which are markers for retinal progenitor cells, are contained in the aggregate.
  • the aggregate obtained in the step (2) is suspended and cultured in a serum-free medium or a serum medium that does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agent and a BMP signaling pathway agonist and contains a Wnt signaling pathway agonist,
  • the step (3) for obtaining an aggregate containing retinal pigment epithelial cells will be described.
  • the medium used in the step (3) is, for example, a serum-free medium or serum in which neither a sonic hedgehog signaling pathway agent nor a BMP signaling pathway agonist is added and a Wnt signaling pathway agonist is added.
  • Medium “Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent and BMP Signaling Pathway Agent Excluded” The medium does not substantially contain either a sonic hedgehog signaling pathway agent or a BMP signaling pathway agent Also included are media, eg, media that do not contain sonic hedgehog signaling pathway agents and BMP signaling pathway agents at concentrations that adversely affect selective differentiation into retinal tissue.
  • “Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent and BMP Signaling Pathway Agent are not added” medium contains both Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent and BMP Signaling Pathway Agent
  • Non-additive medium for example, medium to which no sonic hedgehog signaling pathway agonist and BMP signaling pathway agonist are added at a concentration that adversely affects selective differentiation into retinal tissue, Is also included.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium include the above-mentioned medium.
  • a serum-free medium in which a neurotrophic factor mixture such as N2 supplement (Invitrogen) or B27 supplement (Invitrogen) is added to a basal medium such as DMEM-F12 medium and KSR is not added can be mentioned. .
  • a Wnt signal pathway agonist is a substance that can enhance signal transduction mediated by Wnt.
  • Wnt signaling pathway agonists include proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt receptor agonists, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, 6-Bromoindrubin-3′-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaulone) and the like.
  • the concentration of the agent acting on the Wnt signal pathway may be any concentration that can induce differentiation of cells forming aggregates of pluripotent stem cells into retinal cells.
  • the Wnt signal pathway agonist is added on or after the 12th day from the start of suspension culture in step (1), preferably on the 18th day.
  • the aggregate is formed in a serum-free medium or serum medium that does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway agonist and contains a Wnt signaling pathway agonist and an FGF signaling pathway inhibitor. It is more preferable to culture.
  • An FGF signal pathway inhibitor is a substance that can inhibit a signal mediated by FGF.
  • FGF signal pathway inhibitors include FGF receptors, FGF receptor inhibitors (eg, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP kinase cascade inhibitors (eg, MEK inhibitors, MAPK inhibitors, ERK inhibitors) ), PI3 kinase inhibitor, Akt inhibitor and the like.
  • the concentration of the FGF signal pathway inhibitor used in step (3) may be any concentration that can induce differentiation of cells forming pluripotent stem cell aggregates into retinal cells. For example, in the case of SU-5402, it is added at a concentration of about 0.1 ⁇ M to about 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M.
  • the retinal pigment epithelial cells thus produced are present on the surface of the aggregates, they can be confirmed by microscopic observation or the like.
  • Aggregates containing retinal pigment epithelial cells can be dispersed, for example (trypsin / EDTA treatment), and the resulting cells can be selected using FACS to obtain high-purity retinal pigment epithelial cells. It is. It is also possible to physically cut out the retinal pigment epithelial cells from the aggregate using tweezers or the like and culture them.
  • the dispersed or excised retinal pigment epithelial cells can be cultured under adhesive conditions.
  • Aggregates containing retinal pigment epithelial cells can be crushed by pipetting operation using a microdispenser, and the resulting cells can be cultured under adhesion conditions.
  • a cell adhesive culture vessel for example, a culture vessel coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • Culture conditions such as the culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in adhesion culture can be determined as appropriate.
  • the cells may be cultured in the presence of serum, known growth factors, additives that promote growth, or chemical substances. Examples of known growth factors include EGF and FGF. Examples of additives that promote growth include N2 supplement (Invitrogen) and B27 supplement (Invitrogen).
  • the production method 2 of the present invention is a method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet comprising the following steps (1), (2), (3) and (4): (1) a first step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregate formed in the step (1) is suspended in a serum-free medium or a serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent without containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, and retinal progenitor cells A second step of obtaining an aggregate comprising (3) The aggregate obtained in the step (2) is suspended in a serum-free medium or serum medium that does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway agonist and contains a Wnt signaling pathway agonist A third step of culturing and obtaining an aggregate containing retinal pigment epithelial cells; and (4) a fourth step of dispersing the aggregate obtained in step (3) and adhering the obtained cells.
  • Step (1), step (2) and step (3) of the production method 2 of the present invention can be carried out in the same manner as the step (1), step (2) and step (3) of the production method 1 of the present invention. .
  • Step (4) in which the aggregate obtained in step (3) is dispersed and the obtained cells are cultured for adhesion will be described.
  • Step (4) is performed within 60 days, preferably within 30 days, more preferably 3 days after the start of the implementation of step (3).
  • the aggregate-derived cells dispersed in the step (4) are seeded in an adhesion culture container so as to have a concentration capable of efficiently forming a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • a concentration capable of efficiently forming a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells for example, when the aggregate-derived cells are adherently cultured using a 65 mm Boyden chamber, about 1 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 7 cells, preferably about 3 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per well, and more
  • a solution prepared to be about 5 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 6 cells, more preferably about 2 ⁇ 10 5 cells, is added to the well, and the plate is allowed to stand to adhere the aggregate-derived cells. Incubate.
  • Examples of the serum-free medium or serum medium used for the adhesion culture in the step (4) include the above-mentioned media.
  • a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a commercially available serum substitute such as KSR for example, a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 and Neurobasal, 1/2 ⁇ N2 supplement, 1/2 ⁇
  • KSR for example, a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 and Neurobasal, 1/2 ⁇ N2 supplement, 1/2 ⁇
  • B27 supplement for example, a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 and Neurobasal, 1/2 ⁇ N2 supplement, 1/2 ⁇
  • B27 supplement for example, a medium supplemented with B27 supplement and 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol.
  • the concentration of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • the cells are preferably cultured in a serum-free medium or serum medium containing a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor is a substance that can inhibit a signal mediated by Rho kinase.
  • the ROCK inhibitor include Y-27632 and Fasudil.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used in step (4) may be any concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • Y-27632 it is added so as to have a concentration of about 0.01 ⁇ M to about 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M, more preferably about 20 ⁇ M.
  • step (4) in a serum-free medium or serum medium further comprising one or more substances selected from the group consisting of a Wnt signal pathway agonist, an FGF signal pathway inhibitor, an Activin signal pathway agonist, and a BMP signal pathway agonist More preferably, the cells are cultured in
  • Wnt signaling pathway agonists include proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt receptor agonists, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, 6-Bromoindrubin-3′-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaulone).
  • the concentration of the Wnt signal pathway acting substance used in the step (4) may be a concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • CHIR99021 it is added to a concentration of about 0.1 ⁇ M to about 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M, more preferably about 3 ⁇ M.
  • the substance acting on the Wnt signal pathway is added, for example, within 18 days, preferably on the 6th day from the start of the step (4).
  • FGF signal pathway inhibitors examples include FGF receptors, FGF receptor inhibitors (eg, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP kinase cascade inhibitors (eg, MEK inhibitors, MAPK inhibitors, ERK inhibitors) ), PI3 kinase inhibitor, Akt inhibitor.
  • the concentration of the FGF signal pathway inhibitor used in step (4) may be any concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells. For example, in the case of SU-5402, it is added to a concentration of about 0.1 ⁇ M to about 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to about 30 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M.
  • the FGF signal pathway inhibitor is added, for example, within 18 days from the start of step (4), preferably on the 6th day.
  • An activin signal pathway agonist is a substance that can enhance a signal mediated by activin.
  • Examples of the activin signaling pathway agonist include proteins belonging to the activin family (eg, activin A, activin B, activin C, activin AB, etc.), activin receptor, and activin receptor agonist.
  • the concentration of the activin signal pathway acting substance used in the step (4) may be a concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • the activin signaling pathway agent is added, for example, within 18 days from the start of step (4), preferably on the 6th day.
  • BMP signal transduction pathway agonists examples include BMP proteins such as BMP2, BMP4 or BMP7, GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, or BMP partial peptides.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent used in the step (4) may be any concentration that can efficiently form a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells.
  • BMP4 it is added to the medium to a concentration of about 0.01 nM to about 1 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to about 100 nM, more preferably about 1.5 nM.
  • the BMP signal transduction pathway agent is added, for example, within 18 days from the start of step (4), preferably on the 6th day.
  • a serum-free medium or serum further comprising one substance selected from the group consisting of a Wnt signal pathway agonist, an FGF signal pathway inhibitor, an Activin signal pathway agonist, and a BMP signal pathway agonist
  • the cells are cultured in a medium or a serum-free medium or serum medium further containing a Wnt signal pathway agonist and an FGF signal pathway inhibitor.
  • the step (4) it is preferable to perform adhesion culture on a culture device surface-treated with a culture substrate.
  • the culture substrate used for the treatment of the culture equipment in the step (4) include a cell culture substrate that enables adhesion culture of aggregate-derived cells and formation of a retinal pigment epithelial sheet.
  • culture substrates include synthetic culture substrates such as Synthemax TM (Corning), human-derived basement membrane components such as Cellstart TM (Invitrogen) or human extracellular matrix (BD), or human group Replacement laminin 111 (Biolamina), human recombinant laminin 511 (BioLamina), human recombinant laminin 521 (BioLamina), human recombinant laminin 411 (BioLamina), human recombinant laminin 421 (BioLamina), human group Examples thereof include recombinant human laminin such as a modified laminin 332 (BioLamina) or a human recombinant laminin 211 (BioLamina).
  • synthetic culture substrates such as Synthemax TM (Corning), human-derived basement membrane components such as Cellstart TM (Invitrogen) or human extracellular matrix (BD), or human group Replacement laminin 111 (Biolamina), human recombinant laminin 511 (BioLamina
  • laminin 111 is a laminin composed of ⁇ 1, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains
  • laminin 511 is a laminin composed of ⁇ 5, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains
  • laminin 521 is an ⁇ 5 chain
  • Laminin 411 is a laminin composed of ⁇ 4 chain, ⁇ 1 chain and ⁇ 1 chain
  • laminin 421 is a laminin composed of ⁇ 4 chain, ⁇ 2 chain and ⁇ 1 chain
  • laminin 332 Is laminin composed of ⁇ 3 chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 2 chain
  • laminin 211 is laminin composed of ⁇ 2 chain, ⁇ 1 chain and ⁇ 1 chain.
  • E8 fragment composed of C-terminal regions of laminin ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain also shows binding activity to integrin expressed by cells (J. Biol. Chem., 284, 7820-7831 (2009)) is expected to be used in the same manner as the above laminin.
  • retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheets produced by the production method 1 or 2 of the present invention have characteristics very similar to those of living retinal pigment epithelial cells, treatment of diseases based on retinal cell disorders It can be used as a screening material for drugs, a cell therapy transplant material, a disease research material, or a drug discovery material for a therapeutic drug in a cell damage state caused by other causes. It can also be used for toxicity studies such as phototoxicity, toxicity tests, etc. in the evaluation of toxicity and drug efficacy of chemical substances.
  • diseases based on retinal cell damage include organic mercury poisoning, chloroquine retinopathy, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and neonatal retinopathy.
  • the retinal pigment epithelial cells or the retinal pigment epithelial cell sheet produced by the production method 1 or 2 of the present invention is used to replenish the cells or the damaged tissue itself in a cell damage state (for example, used for transplantation surgery). It can be used as a retinal pigment epithelial cell for transplantation used for, for example.
  • Human ES cells (derived from KhES-1) were obtained from “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559”, “Watabebe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”was cultured.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 2 mM L-glutamine 1 ⁇ non-essential amino acid
  • 5 ng / ml bFGF Using.
  • the cultured ES cells were monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and then the monodispersed ES cells were added to a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) The suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to be 1.2 ⁇ 10 4 cells per well, and an aggregate was rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 is added to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. It was. On the third day from the start of suspension culture, BMP4 having a final concentration of 1.5 nM was added to continue suspension culture. Half of the culture solution in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agent.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are added to one well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite).
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to be 1.2 ⁇ 10 4 cells per cell, and aggregates were rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 is added to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. It was. On the third day from the start of suspension culture, BMP4 having a final concentration of 1.5 nM was added to continue suspension culture. Half of the culture solution in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregates were transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and suspension culture was continued until the suspension culture started on the 21st day.
  • the aggregates were also cultured in the absence of CHIR99021.
  • Some of the aggregates floating-cultured in the above medium containing CHIR99021 were suspended in the same medium conditions until the 27th day from the start of suspension culture, and the other part was 3 ⁇ M CHIR99021 (Wnt signal from the 21st day of suspension culture start).
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are added to one well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite).
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to be 1.2 ⁇ 10 4 cells per cell, and aggregates were rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 is added to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. It was. On the third day from the start of suspension culture, BMP4 having a final concentration of 1.5 nM was added to continue suspension culture. Half of the culture solution in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregates were transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and suspension culture was continued until the suspension culture started on the 21st day.
  • aggregates were disrupted by loading and unloading the solution using a microdispenser, and the resulting cells were treated with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021 (a substance acting on the Wnt signal pathway).
  • Adhesion culture was performed with the added serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • FIG. 3A On the 27th day from the start of suspension culture, retinal pigment epithelial cells having a characteristic polygonal cell morphology were observed (FIG. 3A).
  • the transcription factor Mitf positive (FIG. 3B), which is a retinal pigment epithelial cell marker
  • ZO-1 positive (FIG. 3C), which is a tight junction marker, were obtained. It was confirmed to be a pigment epithelial cell.
  • Example 4 Production of Retinal Pigment Epithelial Cell Sheet Using Human ES Cells
  • Human ES cells (derived from KhES-1) were obtained from “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559”, “Watabebe”. , K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 2 mM L-glutamine 1 ⁇ non-essential amino acid
  • 5 ng / ml bFGF Using.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are added to one well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite).
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to be 1.2 ⁇ 10 4 cells per cell, and aggregates were rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 is added to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. It was. On the third day from the start of suspension culture, BMP4 having a final concentration of 1.5 nM was added to continue suspension culture. Half of the culture solution in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregate On day 18 from the start of suspension culture, the aggregate was transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and cultured until the beginning of suspension culture 21 days. On the 21st day from the start of suspension culture, the aggregates were dispersed using a cell dispersion Accutase (ICT), and debris was removed using a 40 ⁇ m cell strainer.
  • ICT cell dispersion Accutase
  • the obtained cells were 2 ⁇ 10 5 cells per well in a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 medium and Neurobasal medium with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 ⁇ M Y27632 Suspended in 200 ⁇ l of serum-free medium supplemented with seeds, seeded in a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning) coated with Synthemax TM , added 1 ml of medium with the same composition to the lower well, 37 ° C., was carried out adhesion culture in 5% CO 2. The medium was changed once every three days, and the degree of epithelial formation was observed with a microscope on the 40th day after the start of suspension culture. On the 40th day from the start of suspension culture, a uniform sheet of retinal pigment epithelial cells having a characteristic polygonal cell morphology (FIG. 4B) and accumulated pigment was formed (FIG. 4A).
  • Example 5 Production of Retinal Pigment Epithelial Cell Sheet Using Human ES Cells
  • Human ES cells (derived from KhES-1) were obtained from “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559”, “Watabebe”. , K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 2 mM L-glutamine 1 ⁇ non-essential amino acid
  • 5 ng / ml bFGF Using.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the cultured ES cells are added to one well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite).
  • the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to be 1.2 ⁇ 10 4 cells per cell, and aggregates were rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 is added to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. It was. On the third day from the start of suspension culture, BMP4 having a final concentration of 1.5 nM was added to continue suspension culture. Half of the culture solution in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregate On day 18 from the start of suspension culture, the aggregate was transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and cultured until the beginning of suspension culture 21 days. On the 21st day from the start of suspension culture, the aggregates were dispersed using a cell dispersion Accutase (ICT), and debris was removed using a 40 ⁇ m cell strainer.
  • ICT cell dispersion Accutase
  • the obtained cells were 2 ⁇ 10 5 cells per well in a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 medium and Neurobasal medium with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 ⁇ M Y27632 Suspended in 200 ⁇ l of serum-free medium supplemented with sucrose, seeded in a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning) coated with Synthemax TM , added 1 ml of medium with the same composition to the lower well, 37 ° C. in 5% CO 2 was carried out adhesion culture.
  • Example 6 Production of Retinal Pigment Epithelial Cell Sheet Using Human ES Cells Growth Factor Reduced Matrigel TM diluted 30-fold or Synth diluted 40-fold in a well of a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning) Add 100 ⁇ l of each of Max TM (Corning), and incubate the chamber by adding the above-mentioned Matrigel for 24 hours at 4 ° C. and for the chamber to which the Synthemax TM is added for 2 hours at room temperature. The equipment was coated.
  • a suspension of single cells was prepared from the aggregates on the 21st day from the start of suspension culture by the method described in Example 4, and DMEM / F ⁇ so that 2 ⁇ 10 5 cells per well were formed in the wells coated under the above conditions.
  • Cells suspended in 200 ⁇ l of serum-free medium supplemented with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 ⁇ M Y27632 in a 1: 1 mixture of 12 medium and Neurobasal medium, medium of the same composition 1 ml was also added to the lower well, and adhesion culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cell adhesion and epithelialization were observed on day 5 after seeding into the Boyden chamber.
  • Synthemax TM FIG.
  • Example 7 Example of production of retinal pigment epithelial cells using induced pluripotent stem cells (iPS cells) Human iPS cell line 201B7 (available from RIKEN BioResource Center or iPS Academia Japan Ltd.) "Ueno , M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559 ”,“ Watabebe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • the cultured iPS cells were monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen) and then 1.2 ⁇ 10 4 per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite). The cells are suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium to form cells, and aggregates are rapidly formed, followed by suspension culture at 37 ° C.
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. .
  • BMP4 having a final concentration of 1.5 nM is added, and suspension suspension is continued. Half of the culture in the well is replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agonist.
  • the aggregates are transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and cultured until the beginning of suspension culture 21 days.
  • the aggregates were disrupted by loading and unloading the solution using a microdispenser, and the obtained cells were added with 1 ⁇ N2 supplement to DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021 (Wnt signal pathway agonist).
  • Adhesion culture is performed at 37 ° C. and 5% CO 2 with the serum-free medium prepared.
  • retinal pigment epithelial marker gene (Mitf, ZO-1) is confirmed by a cell staining method. In this way, retinal pigment epithelial cells are produced from human iPS cells.
  • Example 8 Example of production of retinal pigment epithelial cell sheet using induced pluripotent stem cells (iPS cells) Human iPS cell line 201B7 (available from RIKEN BioResource Center or iPS Academia Japan) The cells are cultured according to the method described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559”, “Watabebe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686”.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • the cultured iPS cells were monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen) and then 1.2 ⁇ 10 4 per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite). The cells are suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium to form cells, and aggregates are rapidly formed, followed by suspension culture at 37 ° C.
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. .
  • BMP4 having a final concentration of 1.5 nM is added, and suspension suspension is continued. Half of the culture in the well is replaced every 3 days with the above medium without the addition of a BMP signaling pathway agonist.
  • the aggregates are transferred to a serum-free medium supplemented with 1 ⁇ N2 supplement in DMEM / F-12 medium containing 3 ⁇ M CHIR99021, and cultured until the beginning of suspension culture 21 days.
  • the aggregates are dispersed using cell dispersion Accutase (ICT), and debris is removed using a 40 ⁇ m cell strainer.
  • ICT cell dispersion Accutase
  • the obtained cells were 2 ⁇ 10 5 cells per well in a 1: 1 mixture of DMEM / F-12 medium and Neurobasal medium with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 ⁇ M Y27632 Suspended in 200 ⁇ l of serum-free medium supplemented with sucrose, seeded in a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning) coated with Synthemax TM , added 1 ml of medium with the same composition to the lower well, 37 ° C. Adhesive culture is performed with 5% CO 2 .
  • retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheets can be produced with high efficiency.

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Abstract

　本発明は、（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程を含む、網膜色素上皮細胞の製造方法を提供する。

Description

網膜色素上皮細胞の製造方法
　本発明は、網膜色素上皮細胞の製造方法等に関する。
　多能性幹細胞を用いて網膜色素上皮細胞を製造する報告が知られている（非特許文献１）。均一な多能性幹細胞の凝集体をＷｎｔシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養し、次いで血清培地中で浮遊培養した後、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養することにより、網膜色素上皮細胞を得る方法（非特許文献２及び特許文献１）が示されている。
国際公開第２０１３／０７７４２５号
Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　５，　３９６－４０８　（２００９） Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　１０（６），　７７１－７８５　（２０１２）
　多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法の更なる開発が望まれている。
　本発明は、網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを多能性幹細胞から製造する方法等を提供する。
　即ち、本発明は：
［１］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程
を含む網膜色素上皮細胞の製造方法（以下、本発明製造方法１と記すこともある。）；
［２］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
（４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程
を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法（以下、本発明製造方法２と記すこともある。）；
［３］前記工程（４）において、血清代替物存在下で接着培養が行われる前記［２］に記載の製造方法；
［４］前記工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質存在下で接着培養が行われる前記［２］または［３］に記載の製造方法；
［５］前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地を用いて接着培養が行われる前記［２］から［４］のいずれかに記載の製造方法；
［６］前記工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養が行われる前記［２］から［５］のいずれかに記載の製造方法；
［７］前記培養基質が、合成培養基質である前記［６］に記載の製造方法；
［８］前記培養基質が、ラミニンである前記［６］に記載の製造方法；
［９］前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である前記［１］から［８］のいずれかに記載の製造方法；
［１０］前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である前記［１］から［９］のいずれかに記載の製造方法；
［１１］前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる前記［１］から［１０］のいずれかに記載の製造方法；
［１２］浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる前記［１］から［１１］のいずれかに記載の製造方法；
［１３］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上のタンパク質である前記［１］から［１２］のいずれかに記載の製造方法；
［１４］工程（２）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、ＦＧＦシグナル経路阻害物質を更に含む、前記［１］から［１３］のいずれかに記載の製造方法；
［１５］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、毒性・薬効評価用試薬；
［１６］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートに被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該細胞シートに及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法；
［１７］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤；
［１８］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される、有効量の網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法；及び
［１９］網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シート；
等を提供する。
　本発明の製造方法によれば、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを高効率に製造することが可能となる。本発明の製造方法においては、基底膜標品を培地中に添加することなく、すなわち基底膜標品非存在下に凝集体を浮遊培養して、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを得ることが可能であるので、得られた細胞または細胞シートへの異種由来成分の混入のリスクが低減される。本発明の製造方法によれば、化学物質等の毒性または薬効評価や移植治療などを目的として、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを効率よく提供することが可能となる。
図１は、浮遊培養３日目にＢＭＰ４を培地に添加して浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養１８日目の明視野像（Ａ）、および浮遊培養３日目にＢＭＰ４を培地に添加して浮遊培養し、浮遊培養１８日目からＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養２０日目の明視野像（Ｂ）を示す図である。 図２は、浮遊培養開始３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体を、（Ａ）浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、その後ＢＭＰ４及びＣＨＩＲ９９０２１をいずれも含まない培地で浮遊培養した際の浮遊培養２７日目の明視野像、（Ｂ）浮遊培養１８日目から２７日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養した際の浮遊培養２７日目の明視野像、及び（Ｃ）浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目から２７日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１及びＳＵ－５４０２を含む培地で浮遊培養をした際の浮遊培養２７日目の明視野像、を示す図である。 図３は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、培養２１日目に凝集体を破砕して得られた細胞をＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で接着培養した際の浮遊培養開始から２７日目の（Ａ）明視野像、（Ｂ）網膜色素上皮マーカーＭｉｔｆの蛍光免疫染色像、及び（Ｃ）密着結合マーカーＺＯ－１の蛍光免疫染色像である。 図４は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目に分散して、得られた細胞をシンセマックスＴＭで表面処理したボイデンチャンバーに播種してＹ２７６３２を含む培地で接着培養した際の（Ａ）浮遊培養開始から４０日目の網膜色素上皮細胞シートの像、および（Ｂ）明視野拡大像である。 図５は、浮遊培養開始から４０日目の網膜色素上皮細胞シートの明視野拡大像である。ヒト胚性幹細胞由来凝集体を、浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、培養２１日目に分散して、得られた細胞をシンセマックスＴＭで表面処理したボイデンチャンバーに播種して接着培養した。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、（Ａ）成分添加せずに、または（Ｂ）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１，（Ｃ）１０μＭ　ＳＵ－５４０２，（Ｄ）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ　ＳＵ－５４０２，（Ｅ）１ｎＭ　ヒトＢＭＰ４タンパク質、もしくは（Ｆ）５０ｎｇ／ｍｌ　ヒトアクチビンを添加して浮遊培養開始から４０日目まで接着培養を継続した。 図６は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目に分散して、得られた細胞を（Ａ）ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ、又は、（Ｂ）シンセマックスＴＭのいずれかで表面処理したボイデンチャンバーに播種して接着培養した際の、浮遊培養開始から２６日目の網膜色素上皮シートの像である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
　本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
　本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
　浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ及び４５０μＭ　１－モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。
　本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、１－モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　本発明における「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製：以下、マトリゲルと記すこともある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
　ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜調製物である。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであり、これらに加えてＴＧＦ－β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子及びＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの「ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ－βが１．７ｎｇ／ｍｌである。
　本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地または外因性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外因性の物質Ｘが添加されていない培地または外因性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外因性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘはこれに含まれない。
　例えば、「ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外因性のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外因性のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地」とは、外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地または外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地である。
　本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
　本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織の再生に寄与することができる。幹細胞としては、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と記すこともある。）もしくは組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）が挙げられる。上記の幹細胞由来の組織細胞は、組織再生が可能なことから分かるように、生体に近い正常な細胞に分化できることが知られている。
　幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。
　幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した培地で培養することにより維持できる。マウス幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＬｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。
　本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）も「多能性幹細胞」に含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞又は組織内幹細胞から得られる。体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞とも呼ばれる）も「多能性幹細胞」に含まれる。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作製することが可能である。作製方法としては、例えばＣｅｌｌ，２００７，１３１（５） ｐｐ．８６１－８７２や、Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４） ｐｐ．６６３－６７６に記載される方法が挙げられる。
　本発明における「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（特に、多能性「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
　本発明における「人工多能性幹細胞」とは、繊維芽細胞等分化した細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ等の数種類の遺伝子の発現により直接初期化するなどして多分化能を誘導した細胞である。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４） ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５） ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８） ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１） ｐｐ．１０１－１０６）。
　遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
　具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
　標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ　Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。
　選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
　本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいう。本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれる。
　「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
　本発明においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
　凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。
　多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
　本発明における「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞、または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。
　本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。
　本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。
　本発明における「網膜色素上皮細胞」とは生体網膜において神経網膜組織の外側に存在する上皮細胞を意味する。網膜色素上皮細胞であるかは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（RPE65（色素上皮細胞）、Mitf（色素上皮細胞）など）の発現や、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態などにより確認できる。
　本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲａｘ及びＰＡＸ６，視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないＮｋｘ２．１、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘなどが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０及びＬ７、節細胞で発現するＴｕｊ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、杆体細胞で発現するＮｒｌ、錐体細胞で発現するＲｘｒ－ｇａｍｍａなどが挙げられる。
　本発明製造方法１は、下記工程（１）、（２）及び（３）を含む網膜色素上皮細胞の製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程。
　多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程（１）について説明する。
　工程（１）において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＷｎｔシグナル経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　工程（１）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
　工程（１）における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０３から約1×１０５細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０４細胞、より好ましくは約５×１０３から約３×１０４細胞、最も好ましくは約１．２×１０４細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
　凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトＥＳ細胞の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に凝集体を形成させる。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
　多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程（２）について説明する。
　工程（２）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　工程（２）で用いられる無血清培地は、工程（１）で用いた無血清培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。工程（１）で用いた無血清培地をそのまま工程（２）に用いる場合、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
　ソニック・ヘッジホッグ（以下、Ｓｈｈと記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、又はＳＡＧなどが挙げられる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１nMから約１μM、好ましくは約０．１nMから約１００nM、より好ましくは約１．５nMの濃度となるように培地に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（１）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目から１５日目までの間、より好ましくは１日目から９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。これにより、培地に掛かる経費を抑えることができる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞におけるＲaｘ遺伝子の発現を検出することにより確認することができる。ＧＦＰ等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がＲaｘ遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を工程（１）で用いて形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（２）の実施態様の一つとして、工程（１）で形成された凝集体を、Ｒaｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
　工程（２）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
　網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるＲaｘ又はＰＡＸ６を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。
　工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る工程（３）について説明する。
　工程（３）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質がいずれも添加されておらずWntシグナル経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地である。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質がいずれも添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地としては、上述したような培地を挙げることができる。好ましくは、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地等の基礎培地に、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の神経栄養因子混合物が添加され、ＫＳＲが添加されていない無血清培地を挙げることができる。
　Ｗｎｔシグナル経路作用物質とは、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｗｎｔシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ）、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）などが挙げられる。
　Ｗｎｔシグナル経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約３μＭの濃度で添加する。
　Ｗｎｔシグナル経路作用物質は、例えばヒトＥＳ細胞を用いる場合、工程（１）の浮遊培養開始から１２日目以降、好ましくは１８日目に添加する。
　工程（３）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質とを含む無血清培地又は血清培地中で凝集体を培養することがより好ましい。
　ＦＧＦシグナル経路阻害物質とは、ＦＧＦにより媒介されるシグナルを阻害し得る物質である。ＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８）、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害物質（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤などが挙げられる。
　工程（３）で用いられるＦＧＦシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＳＵ－５４０２場合、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１０μＭの濃度で添加する。
　このようにして製造された網膜色素上皮細胞は凝集体の表面に存在するため、顕微鏡観察等で確認が可能である。網膜色素上皮細胞が存在する凝集体を、例えば分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、得られた細胞をＦＡＣＳを用いて選別することにより、高純度な網膜色素上皮細胞を得ることも可能である。ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に網膜色素上皮細胞を切り出し、培養することも可能である。分散または切り出した網膜色素上皮細胞は接着条件下で培養することができる。網膜色素上皮細胞を含む凝集体を微量分注器によるピペッティング操作等によって破砕し、得られた細胞を接着条件下で培養することもできる。接着培養する場合、細胞接着性の培養器、例えば細胞外マトリクス等（例えば、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は、適宜決定できる。この際、血清、既知の増殖因子や増殖を促進する添加剤や化学物質の存在下で培養してもよい。既知の増殖因子としては、例えばＥＧＦ、ＦＧＦなどをあげることができる。増殖を促進する添加剤としてＮ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＢ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などをあげることができる。
　本発明製造方法２は、下記工程（１）、（２）、（３）及び（４）を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
（４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程。
　本発明製造方法２の工程（１）、工程（２）及び工程（３）は、本発明製造方法１の工程（１）、工程（２）及び工程（３）と同様に実施することができる。
　工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する工程（４）について説明する。
　工程（４）は、工程（３）の実施開始から６０日以内、好ましくは３０日以内、より好ましくは３日後に実施する。
　工程（４）において分散した凝集体由来細胞は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度となるよう接着培養容器に播種する。例えば６５ｍｍボイデンチャンバーを用いて凝集体由来細胞を接着培養する場合、１ウェルあたり約１×１０３から約１×１０７細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０６細胞、より好ましくは約５×１０３から約１×１０６細胞、さらに好ましくは約２×１０５細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体由来細胞を接着させ培養する。
　工程（４）における接着培養に用いられる無血清培地又は血清培地としては、上述したような培地を挙げることができる。調製の煩雑さ回避するには、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌの１：１混合液に１／２ｘ Ｎ２サプリメント、１／２ｘ Ｂ２７サプリメント及び１００μＭ　２－メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へ添加されるＫＳＲの濃度としては、例えばヒトＥＳ細胞由来細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することが好ましい。
　ＲＯＣＫ阻害物質とは、Ｒｈｏキナーゼにより媒介されるシグナルを阻害し得る物質である。ＲＯＣＫ阻害物質としては、例えば、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌが挙げられる。
　工程（４）で用いられるＲＯＣＫ阻害物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＹ－２７６３２の場合、約０．０１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約２０μＭの濃度となるように添加する。
　工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することがより好ましい。
　Ｗｎｔシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ）、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）が挙げられる。
　工程（４）で用いられるＷｎｔシグナル経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約３μＭの濃度となるように添加する。
　Ｗｎｔシグナル経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
　ＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８）、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害物質（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤が挙げられる。
　工程（４）で用いられるＦＧＦシグナル経路阻害物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＳＵ－５４０２の場合、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１０μＭの濃度となるように添加する。
　ＦＧＦシグナル経路阻害物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
　Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質とは、Ａｃｔｉｖｉｎにより媒介されるシグナルを増強し得る物質である。Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質としては、例えば、Ａｃｔｉｖｉｎファミリーに属するタンパク質（例えば、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ，Ａｃｔｉｖｉｎ　Ｂ，Ａｃｔｉｖｉｎ　Ｃ，Ａｃｔｉｖｉｎ　ＡＢなど）、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体アゴニストが挙げられる。
　工程（４）で用いられるＡｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社　＃３３８－ＡＣ）の場合、約１ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように添加する。
　Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。
　工程（４）で用いられるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１ｎＭから約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭから約１００ｎＭ、より好ましくは約１．５ｎＭの濃度となるように培地に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
　工程（４）において、例えば、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１種類の物質を更に含む無血清培地又は血清培地、又は、Ｗｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質とを更に含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養する。
　工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養を行うことが好ましい。
　工程（４）における培養器材の処理に用いられる培養基質としては、凝集体由来細胞の接着培養と網膜色素上皮シートの形成を可能とする細胞培養基質が挙げられる。調製の煩雑さを回避し異種由来成分の混入を防止するためには、合成培養基質、ヒト由来基底膜成分、または組換えヒト型基底膜タンパク質等を用いることが好ましい。かかる培養基質として、具体的には、シンセマックスＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）等の合成培養基質、ＣｅｌｌｓｔａｒｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）若しくはヒト細胞外基質（ＢＤ社）等のヒト由来基底膜成分、または、ヒト組換えラミニン１１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン５１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン４１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン４２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン３３２（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）若しくはヒト組換えラミニン２１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）等の組換えヒトラミニンがあげられる。ここで、ラミニン１１１とは、α１鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン５１１とは、α５鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン５２１とは、α５鎖、β２鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン４１１とは、α４鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン４２１とは、α４鎖、β２鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン３３２とは、α３鎖、β３鎖及びγ２鎖から成るラミニンであり、ラミニン２１１とは、α２鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンである。さらに、ラミニンのα鎖、β鎖及びγ鎖それぞれのＣ末端領域から構成されるＥ８フラグメントと称する部分も細胞が発現するインテグリンに対して結合活性を示すことが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，７８２０－７８３１（２００９））ので上記のラミニンと同様に使用できることが期待される。
　本発明製造方法１または２により製造された網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートは、生体の網膜色素上皮細胞に極めて類似した特徴を有しているので、網膜細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
　網膜細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
　本発明製造方法１または２により製造された網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートは、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用網膜色素上皮細胞として用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養し、顕微鏡観察を実施した。
　浮遊培養開始１８日目では、神経上皮の形成が確認された（図１Ａ）。浮遊培養開始２１日目には、上皮の厚さが薄い網膜色素上皮細胞へと分化した細胞が確認された（図１Ｂ）。
実施例２：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで浮遊培養した。対照として、ＣＨＩＲ９９０２１非存在下でも同様に凝集体を培養した。ＣＨＩＲ９９０２１を含む前記培地で浮遊培養した凝集体の一部は浮遊培養開始２７日目まで同じ培地条件で浮遊培養し、他の一部については、浮遊培養開始２１日目から、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）と１０μＭ　ＳＵ－５４０２（ＦＧＦシグナル経路阻害物質）とを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地にて３７℃、５％　ＣＯ２で浮遊培養開始２７日目まで浮遊培養した。
　培養２１日目からＷｎｔシグナル経路作用物質非存在下で培養した凝集体では、上皮の厚さが薄い網膜色素上皮から厚みのある神経上皮へと戻っていたのに対し（図２Ａ）、Ｗｎｔシグナル経路作用物質存在下での培養を継続した凝集体では、ほぼ全ての凝集体の表面において黒色を呈する網膜色素上皮細胞が出現した（図２Ｂ）。Ｗｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質の存在下で培養した凝集体では、分化誘導の効率が増大し、凝集体表面のほぼ全面が網膜色素上皮細胞である凝集体が形成された（図２Ｃ）。
実施例３：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に倣って培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで浮遊培養した。浮遊培養開始２１日目に凝集体を微量分注器による溶液の出し入れによって破砕し、得られた細胞を、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地により３７℃、５％　ＣＯ２で接着培養した。
　浮遊培養開始から２７日目には特徴的な多角形の細胞形態を有する網膜色素上皮細胞が観察された（図３Ａ）。細胞染色法によりタンパク質の発現を確認したところ、網膜色素上皮細胞マーカーである転写因子Ｍｉｔｆ陽性（図３Ｂ）および密着結合マーカーであるＺＯ－１陽性（図３Ｃ）であり、得られた細胞が網膜色素上皮細胞であることが確認された。
実施例４：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養した。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ　セルストレイナーでデブリを除去した。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、１／２　Ｎ２サプリメント、１／２　Ｂ２７サプリメント、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁して、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ　ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して、３７℃、５％　ＣＯ２で接着培養を実施した。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察した。
　浮遊培養開始から４０日目には、特徴的な多角形の細胞形態を有し（図４Ｂ）、色素が蓄積した一様な網膜色素上皮細胞のシートが形成された（図４Ａ）。
実施例５：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、培養された前記ＥＳ細胞を、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養した。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ　セルストレイナーでデブリを除去した。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、１／２　Ｎ２サプリメント、１／２　Ｂ２７サプリメント、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁し、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ　ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％　ＣＯ２で接着培養を実施した。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加、１０μＭ　ＳＵ－５４０２を添加、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ　ＳＵ－５４０２とを同時添加、１ｎＭ　組換えヒトＢＭＰ４タンパク質を添加、または、５０ｎｇ／ｍｌ　組換えヒトアクチビンを添加し、接着培養を継続した。前記物質を添加しない条件でも同様に培養した。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察した。
　浮遊培養開始から２４日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加（図５Ｂ）した場合、無添加のコントロール（図５Ａ）と比較して黒色のより濃い網膜色素上皮細胞へと分化した。３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ　ＳＵ－５４０２との同時添加（図５Ｄ）では、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１単独の添加（図５Ｂ）よりもさらに濃く着色した色素上皮が得られた。１ｎＭ　組換えヒトＢＭＰ４タンパク質を添加（図５Ｅ）、または５０ｎｇ／ｍｌ　組換えヒトアクチビンを添加（図５Ｆ）した場合はそれぞれ、無添加のコントロール（図５Ａ）と比較してより均一な上皮が得られた。
実施例６：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
　６５ｍｍ　ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）のウェルに、３０倍に希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲルＴＭ、又は、４０倍に希釈したシンセマックスＴＭ（コーニング）の何れかを各１００μｌ添加し、上記マトリゲルを添加したチャンバーについては４℃で２４時間、上記シンセマックスＴＭを添加したチャンバーについては室温で２時間、それぞれ保温することにより、培養器材のコーティング処理を実施した。実施例４に記載の方法で浮遊培養開始２１日目の凝集体から単細胞の懸濁液を調製し、上記各条件でコーティングしたウェルに１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、１／２　Ｎ２サプリメント、１／２　Ｂ２７サプリメント、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁した細胞を播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％　ＣＯ２で接着培養を実施した。ボイデンチャンバーへの播種から５日目に細胞の接着と上皮形成を観察した。
　シンセマックスＴＭ（図６Ｂ）でコーティングした培養器材では、基底膜標品であるマトリゲルをコーティングした培養器材（図６Ａ）においてと同様に、培養した凝集体由来細胞が接着し、細胞同士が密接した網膜色素上皮様の形態が観察された。
実施例７：人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた網膜色素上皮細胞の製造例
　ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から入手可能）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養する。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いる。培養された前記ｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で浮遊培養する。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続する。ウェル内の培養液の半量を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に３日おきに交換する。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養する。浮遊培養開始２１日目に凝集体を微量分注器による溶液の出し入れによって破砕し 、得られた細胞を、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘＮ２サプリメントを添加した無血清培地により３７℃、５％ＣＯ２で接着培養する。浮遊培養開始から２７日目に、顕微鏡による細胞形態の観察および細胞染色法による網膜色素上皮マーカー遺伝子（Ｍｉｔｆ、ＺＯ－１）の発現の確認を行う。
　このようにして、ヒトｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞を製造する。
実施例８：人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造例
　ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から入手可能）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．ＰＮＡＳ　２００６，１０３（２５），９５５４－９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２００７，２５，６８１－６８６」に記載の方法に準じて培養する。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％　ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加した培地を用いる。培養された前記ｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン　スフェロイド　プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％　ＣＯ２で浮遊培養する。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続する。ウェル内の培養液の半量を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に３日おきに交換する。浮遊培養開始１８日目に３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に１ｘ　Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養する。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ　セルストレイナーでデブリを除去する。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、１／２　Ｎ２サプリメント、１／２　Ｂ２７サプリメント、２０μＭ　Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁し、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ　ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％　ＣＯ２で接着培養を実施する。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ　ＳＵ－５４０２、１ｎＭ　組換えヒトＢＭＰ４タンパク質、５０ｎｇ／ｍｌ　組換えヒトアクチビンのいずれか、あるいはこれらを組み合わせて添加してもよい。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察する。
　このようにして、ヒトｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞シートを製造する。
　本出願は、2013年11月11日付で日本国に出願された特願2013-232795を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　本発明の製造方法によれば、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを高効率に製造することが可能である。
 
 
 

Claims (19)

  1. 　（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
    （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
    （３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程
    を含む網膜色素上皮細胞の製造方法。
  2. 　（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
    （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
    （３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
    （４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程
    を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法。
  3. 　前記工程（４）において、血清代替物存在下で接着培養が行われる請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質存在下で接着培養が行われる請求項２または３に記載の製造方法。
  5. 　前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地を用いて接着培養が行われる請求項２から４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養が行われる請求項２から５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記培養基質が、合成培養基質である請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記培養基質が、ラミニンである請求項６に記載の製造方法。
  9. 　前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である請求項１から８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である請求項１から９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる請求項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる請求項１から１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上のタンパク質である請求項１から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　工程（２）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、ＦＧＦシグナル経路阻害物質を更に含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、毒性・薬効評価用試薬。
  16. 　請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートに被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該細胞シートに及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
  17. 　請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤。
  18. 　請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法により製造される、有効量の網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
  19. 　網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シート。
     
     
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