KR102388863B1 - 망막 조직의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계 (1) - (3)을 포함하는 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하기 위한 방법을 제공한다:
(1) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 배양시키는 제1 단계,
(2) Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 제1 단계에서 수득된 세포를 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제2 단계, 및
(3) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 수득하는 제3 단계.
(1) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 배양시키는 제1 단계,
(2) Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 제1 단계에서 수득된 세포를 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제2 단계, 및
(3) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 수득하는 제3 단계.
Description
본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포로부터 신경 조직 예컨대 망막 조직을 제조하는 방법으로서, 균일한 다능성 줄기 세포 응집체를 혈청-무함유 배지에서 형성시키는 단계, 그들을 현탁 배양시키는 단계로서, 의도하는 신경 세포로 다능성 줄기 세포의 분화를 유도시키기 위해서 적절한 분화-유도 인자 등의 존재 하에서 분화 유도를 위한 배지 중에 그들을 현탁 배양시키는 단계를 포함하는 신경 조직의 제조 방법이 보고된 바 있다 (특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1). 예를 들어, 다능성 줄기 세포로부터 다층 망막 조직을 수득하는 방법 (비특허 문헌 2 및 특허 문헌 2), 및 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 다능성 줄기 세포의 균일한 응집체를 형성시키는 단계, 후속하여 기저막 제제의 존재 하에서 그들을 현탁 배양시키는 단계, 및 다음으로 혈청-함유 배지에서 그들을 현탁 배양시키는 단계를 포함하는 다층 망막 조직을 수득하는 방법 (비특허 문헌 3 및 특허 문헌 3), 및 다능성 줄기 세포 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지에서 현탁 배양하여 망막 조직을 수득하기 위한 방법 (특허 문헌 5 및 비특허 문헌 10)이 알려져 있다. 또한, 시상하부 조직으로 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 방법 (특허 문헌 4 및 비특허 문헌 4), 및 신경 전구 세포로 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 방법 (비특허 문헌 5 및 6)이 또한 보고되었다.
이들 제조 방법의 출발 물질로서 다능성 줄기 세포는, 특히 영장류 다능성 줄기 세포의 경우에, 피더 세포의 존재 하에서 그리고 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 첨가하여 미분화 상태를 유지하면서 배양할 수 있다. 최근에, 미분화 상태를 유지하는 배양에 개선이 이루어졌고, 피더 세포의 부재 하에서 (피더-무함유) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 첨가하여 영장류 다능성 줄기 세포를 배양하는 방법이 보고되었다 (비특허 문헌 7, 8 및 9). 출발 물질로서 이러한 방법에 의해 피더-무함유 배양이 수행된 다능성 줄기 세포를 사용하여 망막 등과 같은 신경 세포 또는 신경 조직을 안정하게 제조하기 위한 방법이 요구되고 있다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1 : WO 2009/148170
특허 문헌 2 : WO 2011/055855
특허 문헌 3 : WO 2013/077425
특허 문헌 4 : WO 2013/065763
특허 문헌 5 : WO 2015/025967
[비특허 문헌]
비특허 문헌 1: Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)
비특허 문헌 2: Nature, 472, 51-56 (2011)
비특허 문헌 3: Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)
비특허 문헌 4: Nature, 480, 57-62 (2011)
비특허 문헌 5: Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009)
비특허 문헌 6: Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013)
비특허 문헌 7: Nature Methods, 8, 424-429 (2011)
비특허 문헌 8: Scientific Reports, 4, 3594 (2014)
비특허 문헌 9: In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)
비특허 문헌 10: Nature Communications, 6, 6286 (2015)
본 발명으로 해결하려는 과제는 피더 세포의 부재 하에서 미분화 상태를 유지하면서 배양된 다능성 줄기 세포로부터 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기에 언급된 과제를 해결하고자 광범위한 실험을 수행하였고, 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체를, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 (피더-무함유 조건 하에) 다능성 줄기 세포를 배양시킨 후, 그들을 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 현탁 배양시킴으로써 고효율로 형성시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자는 신경 조직 예컨대 망막 조직 및 신경 세포가 이러한 고품질 세포 응집체를 사용함으로써 고효율로 유도될 수 있다는 것을 발견하였고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다.
[1] 하기 단계 (1)∼(3)을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하기 위한 방법:
(1) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 배양하는 제1 단계,
(2) Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중에서 제1 단계에서 수득된 세포를 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제2 단계, 및
(3) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 수득하는 제3 단계.
[2] [1]의 제조 방법에 있어서, 다능성 줄기 세포는 제1 단계에서 0.5시간∼144시간 동안 배양된다.
[3] [1] 또는 [2]의 제조 방법에 있어서, 제1 단계의 배양은 부착 배양으로 수행된다.
[4] [1]∼[3] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제2 단계에서, 제1 단계에서 수득된 세포를 분산시키고, 분산된 세포를 현탁 배양시킨다.
[5] [1]∼[4] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 미분화 상태를 유지시키기 위한 인자는 적어도 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질을 포함한다.
[6] [5]의 제조 방법에 있어서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질은 bFGF이다.
[7] [1]∼[6] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제2 단계에서 현탁 배양을 위해 사용되는 배지는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 더 포함한다.
[8] [7]의 제조 방법에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포이고, 제2 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 10 nM∼700 nM의 SAG의 소닉 헤지호그 신호 전달 활성에 해당하는 농도이다.
[9] [1]∼[8] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 또는 BMP 신호 전달 경로 억제 물질이다.
[10] [1]∼[9] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 Lefty, SB431542, A-83-01 및 LDN193189로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질이다.
[11] [1]∼[10] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh, SAG 및 퍼모프아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질이다.
[12] [1]∼[11] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작부터 1일 내지 9일 사이에 배지에 첨가된다.
[13] [12]의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작부터 1일 내지 6일 사이에 배지에 첨가된다.
[14] [13]의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작부터 1일 내지 3일 사이에 배지에 첨가된다.
[15] [1]∼[14] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이다.
[16] [1]∼[15] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4이다.
[17] [1]∼[16] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서, 응집체는 700 nM의 SAG의 소닉 헤지호그 신호 전달 활성에 해당하는 농도 이하의 농도로 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지에서 배양된다.
[18] [1]∼[16] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 700 nM의 SAG의 소닉 헤지호그 신호 전달 활성에 해당하는 농도 이하이다.
[19] [1]∼[18] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 배양은 제2 단계의 시작으로부터 3일 내지 18일 동안 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 수행된다.
[20] [1]∼[19] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 배양은 제2 단계의 시작으로부터 10일 동안 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 수행된다.
[21] [1]∼[20] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 IWR-1-엔도이다.
[22] [1]∼[21] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제3 단계는 다음의 단계들을 포함한다:
(i) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하고 20% 이상 100% 이하의 Chx10 양성 세포의 존재 비율을 갖는 세포 응집체를 수득하는 단계;
(ii) Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 단계 (i)에서 수득된 세포 응집체를 RPE65 유전자를 발현하는 세포의 출현 전 시기 동안에만 배양시키는 단계;
(iii) Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서, RPE65 유전자 발현 세포가 출현하지 않은, 단계 (ii)에서 수득된 세포 응집체를 배양하는 단계.
[23] [1] ∼[22] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 제3 단계에서 수득된 웅집체는 망막 전구 세포, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 간상 광수용기 세포, 추상 광수용기 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 쌍극 세포, 망막 색소 상피 세포, 및 모양체 주변부 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 포함한다.
[24] [1]∼[23] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포이다.
[25] [1]∼[24] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포이다.
[26] [1]∼[25] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 균일한 응집체는 제2 단계에서 형성된다.
[27] [1]∼[26] 중 어느 하나의 제조 방법에 있어서, 현탁 배양은 기저막 제제의 부재 하에서 수행된다.
[28] [1]∼[27] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 시약.
[29] 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 방법으로서, [1]∼[27] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 망막 세포 또는 망막 조직과 물질을 접촉시키는 단계, 및 세포 또는 조직에 대한 물질의 영향을 검출하는 단계를 포함한다.
[30] 망막 세포 또는 망막 조직의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 약물로서, [1]∼[27] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함한다.
[31] [30]의 약물에 있어서, 망막 세포 또는 망막 조직은 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포 또는 망막 조직이다.
[32] 망막 세포 또는 망막 조직의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 방법으로서, [1]∼[27] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 망막 세포 또는 망막 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다.
[33] 망막 세포 또는 망막 조직의 장애로 인한 질환의 치료에서 사용을 위한 [1]∼[27] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 세포 또는 망막 조직.
[34] 활성 성분으로서 [1]∼[27] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 약학 조성물.
본 발명에 따라서, 고품질 세포 응집체를 비롯하여, 망막 세포 또는 망막 조직을 피더 세포의 부재 하에서 배양되는 다능성 줄기세포로부터 고효율로 제조할 수 있다.
도 1은 사전조건화가 있거나 (C, D), 또는 없는 (A, B) 조건 간 명시야 관찰에 의한 세포 응집체 형태의 비교 결과를 도시한다.
도 2는 사전조건화가 있거나 (C, D, G, H), 또는 없는 (A, B, E, F) 조건 간 면역조직염색에 의한 세포 응집체의 Rx (A-D) 및 Chx10 (E-H) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 3은 명시야 관찰에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체 형태의 비교 결과를 도시한다.
도 4는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Rx (A-D) 및 Chx10 (E-H) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 5는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 6은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 7은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 8은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다. DAPI로 대비염색하였다.
도 9는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다. DAPI로 대비염색하였다.
도 10은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포 (A, B: TFH-R1-10-2 세포주, C, D: TFH-R2-10-F8 세포주)로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, C) 및 Rx (B, D) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 11은 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Rx, Chx10 및 Crx 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (E).
도 12는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, D, G), Rx (B, E, H) 및 Pax6 (C, F , I) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 13은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, D, G), Rx (B, E, H) 및 Pax6 (C, F , I) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 14는 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Crx, Chx10, Rx, 리커버린, NRL, RXRG N-카데린 및 Aqp1 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (B-E).
도 15는 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Crx, Chx10, Rx, 리커버린, NRL, RXRG N-카데린 및 Aqp1 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (B-E).
도 16은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 17은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 18은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 19는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 20은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 21은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 22는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 23은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10, Rx, Crx 및 Brn3b 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 24는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 25는 면역조직염색에 의한 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 2는 사전조건화가 있거나 (C, D, G, H), 또는 없는 (A, B, E, F) 조건 간 면역조직염색에 의한 세포 응집체의 Rx (A-D) 및 Chx10 (E-H) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 3은 명시야 관찰에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체 형태의 비교 결과를 도시한다.
도 4는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Rx (A-D) 및 Chx10 (E-H) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 5는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 6은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 7은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 8은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다. DAPI로 대비염색하였다.
도 9는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다. DAPI로 대비염색하였다.
도 10은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포 (A, B: TFH-R1-10-2 세포주, C, D: TFH-R2-10-F8 세포주)로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, C) 및 Rx (B, D) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 11은 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Rx, Chx10 및 Crx 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (E).
도 12는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, D, G), Rx (B, E, H) 및 Pax6 (C, F , I) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 13은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 (A, D, G), Rx (B, E, H) 및 Pax6 (C, F , I) 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 14는 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Crx, Chx10, Rx, 리커버린, NRL, RXRG N-카데린 및 Aqp1 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (B-E).
도 15는 인간 iPS 세포로부터 유도된 광수용기 세포-함유 망막 조직의 명시야 관찰 결과를 도시한다 (A). 면역조직염색에 의한 광수용기 세포-함유 망막 조직의 Crx, Chx10, Rx, 리커버린, NRL, RXRG N-카데린 및 Aqp1 발현의 관찰 결과 (B-E)를 보여준다. DAPI로 대비염색하였다 (B-E).
도 16은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 17은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 18은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 19는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 20은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 21은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 22는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 23은 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10, Rx, Crx 및 Brn3b 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 24는 면역조직염색에 의한 다양한 배양 조건 하의 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
도 25는 면역조직염색에 의한 인간 iPS 세포로부터 형성된 세포 응집체의 Chx10 및 Rx 발현의 비교 결과를 도시한다.
1. 정의
본 발명에서, "줄기 세포"는 분화 능력 및 분화 능력을 유지하는 증식능 (특히 자기 재생 능력)을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 줄기 세포는 분화 능력에 따라서 하위개체군 예컨대 다능성 (pluripotent) 줄기 세포, 만능성 (multipotent) 줄기 세포, 단능성 (unipotent) 줄기 세포 등을 포함한다. 다능성 줄기 세포는 시험관 내에서 배양할 수 있고 3층 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배아외 조직에 속하는 임의 세포 계통으로 분화되는 능력 (다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 만능성 줄기 세포는 모든 종류는 아니나, 다수 유형의 조직 또는 세포로 분화되는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포는 특정 조직 또는 세포로 분화되는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포는 수정란, 복제 배아, 생식 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도될 수 있다. 다능성 줄기 세포의 예에는 배아 줄기 세포 (ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포 (Embryonic germ cell), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등이 포함된다. 간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cell; MSC)로부터 얻는 Muse 세포 (Multi-lineage differentiating stress enduring cell) 및 생식 세포 (예를 들어, 고환)로부터 생성되는 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는 1981년에 처음으로 수립되었고, 또한 1989년 이래로 넉아웃 마우스의 생성에 적용되어왔다. 1998년에, 인간 배아 줄기 세포가 수립되었고, 이것은 또한 재생 의학에 이용되고 있다. ES 세포는 내부 세포괴를 피더 세포 상에서 또는 LIF를 함유하는 배지에서 배양하여 제조될 수 있다. ES 세포의 제조 방법은 예를 들면, WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있거나, 또는 상업적으로 입수할 수 있는 제품을 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학의 프론티어 의과학 연구소 (Institute for Frontier Medical Sciences)에서 입수할 수 있다. 인간 배아 줄기 세포인 Rx::GFP 세포주 (KhES-1 유래)는 국가 연구 개발 법인 이화학 연구소 (Incorporated Administrative Agency RIKEN)에서 입수할 수 있다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소에서 입수할 수 있고 마우스 배아 줄기 세포인 D3 세포주는 ATCC에서 입수할 수 있다.
ES 세포 중 하나인 핵 이입 ES 세포 (ntES 세포)는 체세포의 핵을 제핵 난자에 이식하여 생성된 복제 배아로부터 수립될 수 있다.
EG 세포는 mSCF, LIF 및 bFGF를 함유하는 배지 중에서 원시 생식 세포를 배양하여 생성시킬 수 있다 (Cell, 70 : 841-847, 1992).
본 발명에서 "유도 다능성 줄기 세포"는 공지 방법 등에 의해 체세포를 리프로그래밍하여 다능성을 갖도록 유도시킨 세포이다. 구체적으로, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 리프로그래밍 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 유전자 조합의 발현에 의하여, 분화된 체세포 예컨대 섬유아세포, 말초 혈액 단핵구 세포 등을 리프로그래밍함으로써 다능성을 갖도록 유도된 세포를 언급할 수 있다. 바람직한 리프로그래밍 인자 조합의 예에는 (1) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc (c-Myc 또는 L-Myc), 및 (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc 이 포함된다 (Stem Cells 2013; 31 : 458-466).
유도 다능성 줄기 세포는 2006년 마우스 세포에서 Yamanaka 등에 의해 수립되었다 (Cell, 2006, 126 (4), pp.663-676). 2007년, 유도 다능성 줄기 세포는 또한 인간 섬유아세포로부터 수립되었고, 배아 줄기 세포와 유사한 다능성 및 자가 재생 능력을 갖는다 (Cell, 2007, 131 (5), pp.861-872; Science 2007, 318 (5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1), pp.101-106).
유전자 발현에 의한 직접 리프로그래밍을 기반으로 하는 제조 방법 이외에도, 유도 다능성 줄기 세포는 또한 화합물 등의 첨가에 의해 체세포로부터 수득될 수 있다 (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
또한, 수립된 유도 다능성 줄기 세포를 수득하는 것이 또한 가능하며, 예를 들어 교토 대학에서 수립한 인간 유도 다능성 세포주 예컨대 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포 또는 1231A3 세포 등이 교토 대학교 및 iPS Academia Japan, Inc.에서 입수 가능하다. 수립된 유도 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어, 교토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포, Ff-I14 세포 및 QHJI01s04 세포가 교토 대학에서 입수 가능하다.
유도 다능성 줄기 세포를 제조하기 위해 사용되는 체세포는 특히 한정되지 않지만, 조직-유래 섬유아세포, 혈액-계통 세포 (예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 T 세포), 간 세포, 췌장 세포, 대장 상피 세포, 평활근 세포 등을 언급할 수 있다.
유도 다능성 줄기 세포가 몇몇 종류의 유전자 발현에 의한 리프로그래밍에 의해 제조될 때, 유전자 발현용 수단은 특히 한정되지 않는다. 상기 수단의 예에는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연합 바이러스 벡터, 세포질 RNA 벡터인 센다이 바이러스 벡터)를 사용한 감염 방법, 비바이러스 벡터인 플라스미드 벡터 (예를 들면, 플라스미드 벡터, 에피솜 벡터)를 사용한 유전자 전달 방법 (예를 들면, 칼슘 포스페이트 방법, 리포펙션 방법, 레트로넥틴 방법, 전기천공법) 또는 RNA의 벡터를 사용한 유전자 전달법 (예를 들면, 칼슘 포스페이트 방법, 리포펙션 방법, 전기천공법), 단백질의 직접 주입법 (예를 들면, 바늘 사용 방법, 리포펙션 방법, 전기천공법) 등이 포함된다.
유도 다능성 줄기 세포는 피더 세포의 존재 하에 또는 피더 세포의 부재 (피더-무함유) 하에 제조할 수 있다. 유도 다능성 줄기 세포를 피더 세포 존재 하에 제조하는 경우, 유도 다능성 줄기 세포는 미분화된 상태를 유지하기 위한 인자의 존재 하에서 공지 방법에 의해 제조될 수 있다. 피더 세포 부재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조하기 위해 사용되는 배지, 즉 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 (미분화 유지 배지)는 특별히 한정되지 않지만, 배아 줄기 세포 및/또는 유도 다능성 줄기 세포를 위한 공지의 유지 배지, 및 피더-무함유 조건 하에 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지로서 당업자에게 공지된 배지가 사용될 수 있다. 피더-무함유 조건 하에 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 미분화 유지 배지로서, 많은 합성 배지가 개발되었고 상업적으로 입수할 수 있으며, 예를 들어 에센셜 8 (Life Technologies 제품) 배지를 언급할 수 있다. 에센셜 8 배지는 첨가제로 L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 mg/L), 소듐 셀레나이트 (14 μg/L), 인슐린 (19.4 mg/L), NaHCO3 (543 mg/L), 트랜스페린 (10.7 mg/L), bFGF (100 ng/mL) 및, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질 (TGFβ1 (2 ng/mL) 또는 노달 (100 ng/mL))을 함유하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 다른 시판되는 피더-무함유 배지 (미분화 유지 배지)의 예에는 에센셜 6 배지 (Life Technologies 제품), 안정화 에센셜 8 배지 (Life Technologies 제품), S-배지 (DS 파마 바이오 메디칼 제품), StemPro (Life Technologies 제품), hESF9 (Proc Natl Acad Sci US A. 2008 Sep 9; 105 (36) : 13409-14), TeSR 배지 (STEMCELL Technologies 제품), mTeSR1 (STEMCELL Technologies 제품), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 제품), 및 TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 제품)이 포함된다. 이들 이외에도, 다른 피더-무함유 배지 (미분화 유지 배지)의 예에는 StemFit (등록 상표) (Ajinomoto Co., Inc. 제품)이 포함된다. 유도 다능성 줄기 세포를 제조하려고 할 때, 예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포는 피더 세포의 부재 하에서 센다이바이러스 벡터를 사용하여 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc의 4개 인자를 체세포에 유전자 전달하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용하려는 다능성 줄기 세포는 바람직하게 ES 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포, 보다 바람직하게 유도 다능성 줄기 세포이다.
만능성 줄기 세포로서, 조직 줄기 세포 (조직의 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포라고도 함) 예컨대 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 등을 언급할 수 있다.
유전자 변형된 다능성 줄기 세포는 예를 들어 상동성 재조합 기술을 사용해 제조될 수 있다. 변형시키려는 염색체 상의 유전자의 예에는 세포 마커 유전자, 조직적합성 항원 유전자, 신경 세포의 장애로 인한 질환과 관련된 유전자 등이 포함된다. 염색체 상의 표적 유전자는 문헌 [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)]; [Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)]; [Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995)] 등에 기재된 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
구체적으로, 예를 들면, 변형시키려는 표적 유전자(예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직적합성 항원 유전자 및 질환-관련 유전자 등)를 포함하는 게놈 DNA를 단리시키고, 표적 유전자의 상동성 재조합에 사용되는 표적화 벡터를 단리된 게놈 DNA를 사용하여 제조한다. 제조된 표적화 벡터를 줄기 세포로 도입시키고 표적 유전자와 표적화 벡터 사이에 상동성 재조합을 보이는 세포를 선별하고, 그리하여 염색체 상에 변형된 유전자를 갖는 줄기 세포를 제조할 수 있다.
표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 단리하는 방법의 예는 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 등에 기재된 공지 방법을 포함한다. 표적 유전자를 포함하는 게놈 유전자는 또한 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 제품), 유니버설 게놈워커 키트 (CLONTECH 제품) 등을 사용하여 단리할 수 있다. 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 게놈 DNA 대신 사용할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 PCR 방법에 의해 해당 폴리뉴클레오티드를 증폭시켜서 얻을 수 있다.
표적 유전자의 상동성 재조합에 사용되는 표적화 벡터의 제조, 및 상동성 재조합의 효율적인 선별은 문헌 [Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)]; [Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995)] 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다. 표적화 벡터로서, 임의의 교체 유형 또는 삽입 유형이 사용될 수 있다. 선별 방법으로서, 양성 선별과 같은 방법, 프로모터 선별, 음성 선별, 폴리A 선별 등이 사용될 수 있다.
선별된 세포주로부터 바람직한 상동성 재조합체를 선별하기 위한 방법의 예에는 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화 방법, PCR 방법 등이 포함된다.
또한, 유전자 변형된 다능성 줄기 세포는 게놈 편집에 의해서도 제조될 수 있다. 게놈 편집은 징크 핑거 시스템, CRISPR/Cas9 시스템, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 등과 같은 기술을 통해 유전자-특이적 파괴, 리포터 유전자의 넉인 등을 수행하기 위한 유전자 변형 기술이다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템에서, 일반적으로, Cas9 (DNA 절단 효소)의 발현 벡터 또는 mRNA 및 중합효소 III 프로모터의 제어 하에서 가이드 RNA를 발현하는 발현 벡터 또는 가이드 RNA 그 자체 등을 세포에 도입시킨다. 가이드 RNA는 표적 게놈 서열에 상보적인 RNA (crRNA)와 tracrRNA의 융합 RNA일 수 있다. 표적 게놈 서열의 3' 말단에 프로토스페이서 근접 모티프 (PAM - 서열 NGG)가 존재하게 되면, Cas9는 DNA 이중 가닥을 해리시키고, 가이드 RNA에 의해 표적 서열을 인식하고, 양쪽 가닥을 절단하고, 돌연변이가 절단 부위를 복구하는 과정 중에 도입된다.
전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)는 식물 병원균 잔토모나스 (Xanthomonas) 종이 생산하는 TAL 이펙터를 사용한 시스템이다. TALEN은, 일반적으로는 TAL 이펙터의 DNA 결합 도메인과 FokI 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인이 융합된 인공 뉴클레아제이다. DNA 결합 도메인은 34개 아미노산의 반복 서열로 이루어지고, 1개 반복은 표적 DNA의 1개 염기를 인식한다. 반복 서열 내 12번째 및 13번째 아미노산은 반복 가변성 2-잔기 (repeat variable di-residues) (RVD)라고 하며, 표적 염기는 이 서열에 의해 결정된다. FokI 도메인은 표적 서열 상에서 이량체화되고, 게놈 상의 특이적 서열 상에서 TALEN 분자의 2개 쌍이 서로 마주하도록 디자인함으로써 뉴클레아제 활성을 나타낸다. 절단된 DNA 이중 가닥은 세포에서 기전에 의해 복구되고 돌연변이가 그 과정 동안 도입된다. TALEN에 의한 게놈 편집이 수행될 때, TALEN의 발현 벡터 또는 mRNA가 세포로 도입된다.
본 발명에서 "포유동물"은 설치류, 유제류, 식육목, 영장류 등을 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등을 포함한다. 유제류는 돼지, 소, 염소, 말, 양 등을 포함한다. 식육목은 개, 고양이 등을 포함한다. 본 발명에서 "영장류"는 영장류에 속하는 포유동물을 의미하고, 영장류는 원원류 예컨대 여우원숭이, 로리스 원숭이, 투파이 등, 및 진원류 예컨대 원숭이, 유인원 인간 등을 포함한다.
본 발명에 사용하려는 다능성 줄기 세포는 포유류 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트) 또는 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이)의 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게 인간 다능성 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포)이다.
본 발명에서 "현탁 배양"또는 "현탁 배양 방법"은 세포 또는 세포 응집체가 배지에 현탁된 상태를 유지하는 배양 및 그 배양을 수행하는 방법을 의미한다. 즉, 현탁 배양은 세포 또는 세포 응집체가 배양 용기 등에 부착되지 않는 조건 하에서 수행되고, 배양 용기 등에 부착을 허용하는 조건 하에서 수행되는 배양 (부착 배양 또는 부착 배양 방법)은 현탁 배양의 범주에 포함되지 않는다. 이 경우, 세포의 부착은 강력한 세포-기층 접합이 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 사이에 형성되는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 현탁 배양은 강력한 세포-기층 접합이 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 사이에 형성되지 않는 조건 하에서의 배양을 의미하고, 부착 배양은 강력한 세포-기층 접합이 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 사이에 형성되는 조건 하의 배양을 의미한다.
현탁 배양 중인 세포 응집체에서, 평면 세포-세포 부착이 형성된다. 현탁 배양 중인 세포 응집체에서, 배양 용기 등과의 세포-기층 접합은 거의 형성되지 않으며, 형성되더라도, 그 기여는 작다. 일부 구체예에서, 내생성 세포-기층 접합이 응집체에 존재하지만, 배양 용기 등과 세포-기층 접합은 거의 형성되지 않으며, 형성되더라도, 그 기여가 작다.
평면 세포-세포 부착 (평면 부착)은 세포가 평면을 통해서 다른 세포에 부착된 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 평면 세포-세포 부착은 예를 들어, 세포 표면적의 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상이 다른 세포의 표면에 부착하는 것을 의미한다. 세포의 표면은 막을 염색하는 시약 (예를 들어, DiI)에 의한 염색, 세포 부착 인자 (예를 들어, E-카데린 및 N-카데린)의 면역염색을 통해 관찰할 수 있다.
현탁 배양을 수행할 때 사용되는 배양 용기는 "현탁 배양"을 할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절하게 결정할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예에는 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 배양 디쉬 (접시), 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 스피너 플라스크, 엘렌메이어 플라스크, 롤러 병이 포함된다. 현탁 배양을 할 수 있으려면, 이들 배양 용기는 바람직하게 세포 비부착성이다. 유용한 세포 비부착성 배양 용기는 그 표면이 세포 부착성을 향상시키기 위한 인공 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 예컨대 기저막 제제, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴 등에 의한 표면 처리, 또는 중합체 예컨대 폴리리신, 폴리오르니틴 등에 의한 코팅 처리 또는 양전하 처리 등)가 가해지지 않은 배양 용기를 포함한다. 세포 비부착성 배양 용기로서, 그 표면을 세포 부착성을 저하시키기 위해 인공적으로 처리 (예를 들어, MPC 중합체 등에 의한 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등)한 배양 용기 등이 사용될 수 있다. 스피너 플라스크 및 롤러 병 등을 사용하여 회전 배양을 수행할 수 있다. 배양 용기의 배양 표면은 편평한 바닥일 수 있거나 또는 요철을 가질 수도 있다.
부착 배양에 사용되는 배양 용기는 "부착 배양"을 수행할 수 있다면 특별히 한정되지 않고, 당업자가 배양 규모, 배양 조건 및 배양 기간에 따라 적합한 배양 용기를 적절하게 선택할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는 플라스크, 조직 배양용 플라스크 배양 디쉬 (접시), 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브 트레이, 배양 백, 마이크로캐리어, 비드, 스택 플레이트, 스피너 플라스크 및 롤러 병을 포함한다. 부착 배양을 할 수 있기 위해, 이들 배양 용기는 바람직하게 세포-부착성이다. 세포 부착성 배양 용기는 그 표면이 세포와의 부착성 향상을 위해 인공적으로 처리된 배양 용기를 포함하고, 구체적으로 표면-처리된 배양 용기, 또는 그 내부가 코팅제로 코팅된 배양 용기를 언급할 수 있다. 코팅제의 예는 세포외 매트릭스 예컨대 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등)], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), 마트리겔 등, 또는 중합체 예컨대 폴리리신, 폴리오르니틴 등을 포함한다. 표면-처리된 배양 용기의 예는 양전하 처리 등에 의해 표면-처리된 배양 용기를 포함한다.
본 발명에서 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 기초 배지로서 동물 세포를 배양하는데 일반적으로 사용되는 배지로부터 제조될 수 있다. 기초 배지의 예는 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글래스고우 MEM (GMEM) 배지, 개량 MEM 징크 옵션 배지, IMDM 배지, 미디움199 배지, 이글 MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F-12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지 및 이의 혼합 배지 등을 포함한다.
본 발명에서 "혈청-무함유 배지"는 미조정 또는 미정제 혈청이 없는 배지를 의미한다. 본 발명에서, 정제된 혈액-유래 성분 및 동물 조직-유래 성분 (예를 들어, 성장 인자)을 함유하는 배지가 또한 미조정 또는 미정제 혈청이 그에 함유되지 않았으면 혈청-무함유 배지에 포함된다.
혈청-무함유 배지는 혈청 대체물을 함유할 수도 있다. 혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3' 티올 글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절하게 함유하는 것을 포함한다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어 WO98/30679에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 혈청 대체물은 시판 제품일 수 있다. 이러한 시판 혈청 대체물의 예는 KnockoutTM 혈청 대체물 (Life Technologies, 현, ThermoFisher: 이하, 때때로 KSR로 표기), 화학적으로 한정된 지질 농축물 (Life Technologies 제품) 및 GlutamaxTM (Life Technologies 제품), B27 (Life Technologies 제품), N2 보충물 (Life Technologies 제품) 및 ITS 보충물 (Life Technologies 제품)을 포함한다.
현탁 배양에 사용하려는 혈청-무함유 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들면, 불필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 적절하게 함유할 수 있다.
복잡한 준비를 피하기 위해서, 적절한 양, 예를 들면, 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%)의 시판되는 KSR (Life Technologies 제품)이 보충된 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 10% KSR, 화학적으로 한정된 지질 농축물, 및 450 μM 1-모노티오글리세롤이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 배지)가 이러한 혈청-무함유 배지로서 사용될 수 있다. 또한, KSR과 동등한 제품으로서, JP-A-2001-508302에 개시된 배지를 언급할 수 있다.
본 발명에서 "혈청-함유 배지"는 미조정 또는 미정제 혈청을 함유하는 배지를 의미한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들면, 불필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에서 배양은 이종-무함유 (xeno-free) 조건 하에서 수행될 수 있다. "이종-무함유"는 배양하려는 세포와 상이한 종으로부터 유래된 성분들을 제거한 조건을 의미한다.
본 발명에서 "물질 X를 함유하는 배지", 및 "물질 X의 존재 하에서"는 외생성 물질 X가 보충된 배지 또는 외생성 물질 X를 함유하는 배지, 또는 외생성 물질 X의 존재 하에서를 의미한다. 즉, 배지에 존재하는 세포 또는 조직이 물질 X를 내생적으로 발현, 분비 또는 생산하는 경우에, 내생성 물질 X는 외생성 물질 X와 구별되고, 외생성 물질 X가 없는 배지는 그것이 내생성 물질 X를 함유하는 경우라도, "물질 X를 함유하는 배지"의 범주에 속하지 않는 것으로 이해한다.
예를 들어, "TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지"는 외생성 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질이 보충된 배지이거나 또는 외생성 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지이다.
본 발명에서 "피더 세포"는 줄기 세포를 배양할 때 공존하는 줄기 세포 이외의 세포를 의미한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포의 예에는 마우스 섬유아세포 (MEF 등), 인간 섬유아세포, SNL 세포 등이 포함된다. 피더 세포로서, 성장 억제 처리가 가해진 피더 세포가 바람직하다. 성장 억제 처리의 예는 성장 억제제 (예를 들어, 마이토마이신 C) 처리, 감마선 조사, UV 조사 등을 포함한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포는 체액성 인자 (바람직하게 미분화 상태를 유지하기 위한 인자)의 분비, 또는 세포 부착용 스캐폴드 (세포외 매트릭스)의 생산에 의해 다능성 줄기 세포의 미분화 상태의 유지에 기여한다.
본 발명에서, "피더 세포의 부재 (피더-무함유)"는 피더 세포의 부재 하에서의 배양을 의미한다. 피더 세포의 부재는 예를 들어, 피더 세포를 첨가하지 않은 조건, 또는 피더 세포가 실질적으로 없는 (예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3% 이하, 바람직하게는 0.5% 이하) 조건을 의미한다.
본 발명에서, 세포의 "응집체"는 배지에 분산된 세포의 집합으로 형성되는 덩어리를 의미하고, 여기서 세포가 서로 부착되어 있다. 세포 덩어리, 배양체 (Embryoid body), 구체 (Sphere), 회전 타원체 (Spheroid)도 역시 세포 응집체에 포함된다. 바람직하게, 평면 세포-세포 부착이 세포의 응집체에서 형성된다. 일부 구체예에서, 세포는 때때로 응집체의 일부 또는 전체에서, 세포-세포 접합 및/또는 세포 부착, 예를 들어 부착 접합부를 형성한다. 본 발명에서 "응집체"는 구체적으로는, 현탁 배양의 시작 시점에 분산된 세포에 의해 형성되는, 상기 본 발명 [1]의 제2 단계에서 생성된 응집체, 및 다능성 줄기 세포로부터 분화된 유도 망막 세포를 함유하는 상기 본 발명 [1]의 제3 단계에서 생성되는 응집체를 포함하고, 또한 "응집체"는 상기 본 발명 [1]의 제2 단계의 현탁 배양의 시작 시에 이미 형성된 응집체를 포함한다. 제2 단계에서 형성된 응집체는 "배상체 (EB)"를 포함한다.
본 발명에서 "균일한 응집체"는 다수 응집체를 배양할 때 각 응집체의 크기가 일정하고, 응집체의 크기가 최대 직경의 길이로 평가될 때 최대 직경 길이의 편차가 작은 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 전체 응집체 개체군의 75% 이상의 응집체가 응집체 개체군의 최대 직경의 평균 ± 100%, 바람직하게는 평균 ± 50%의 범위, 보다 바람직하게는 평균 ± 20% 내인 것을 의미한다.
본 발명에서 "균일한 응집체를 형성시키다"는 세포를 집합시켜 세포 응집체를 형성시키고 그 응집체를 현탁 배양할 때, 크기가 균일한 세포 응집체가 형성되도록 소정 개수의 분산된 세포를 신속하게 응집"시키는 것을 의미한다.
"분산"은 분산 처리 예컨대 효소적 처리, 물리적 처리 등에 의해 세포 또는 조직을 작은 세포 클러스터 (2개 세포 이상 및 10개 세포 이하, 바람직하게 50개 세포 이하) 또는 단일 세포로 나누는 것을 의미한다. 소정 개수의 분산된 세포는 일정 수의 세포 클러스터 또는 단일 세포의 컬렉션이다.
다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법의 예는 기계적 분산 처리, 세포 분산 용액 처리, 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함한다. 이들 처리는 조합하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산 용액 처리가 수행되고 이어서 기계적 분산 처리가 수행된다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 파이펫팅 처리 또는 스크래퍼에 의한 스크래핑 작업을 언급할 수 있다.
세포 분산 용액 처리에 사용하려는 세포 분산 용액으로서, 임의의 효소 예컨대 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DNase, 파파인 등, 및 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 등을 함유하는 용액을 언급할 수 있다. 시판 세포 분산 용액 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 제품) 및 TrypLE Express (Life Technologies 제품)를 사용할 수도 있다.
다능성 줄기 세포를 분산시킬 때, 세포 보호제를 처리함으로써 다능성 줄기 세포의 세포 사멸을 억제할 수 있다. 세포 보호제 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 헤파린, IGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 혈청 또는 혈청 대체물을 언급할 수 있다. 분산에 의해 유도된 세포 사멸 (특히, 인간 다능성 줄기 세포의 세포 사멸)을 억제하기 위해서, ROCK (Rho-associated coiled-coil kinase)의 억제 물질 또는 미오신 억제 물질이 분산 시에 첨가될 수도 있다. ROCK 억제 물질로서, Y-27632, 파수딜 (HA1077), H-1152 등을 언급할 수 있다. 미오신 억제 물질로서, 블레비스타틴을 언급할 수 있다. 바람직한 세포 보호제로서, ROCK 억제 물질을 언급할 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법은 세포 보호제로서 ROCK 억제 물질의 존재 하에서 세포 분산 용액 (TrypLE Select)으로 다능성 줄기 세포의 콜로니 처리, 및 파이펫팅에 의해 그들을 더욱 분산시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 제조 방법에서, 다능성 줄기 세포를 신속하게 집합시켜 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 방식으로 다능성 줄기 세포 응집체가 형성되면, 형성된 응집체로부터 유도 및 분화되는 세포에서 양호한 재현성으로 상피-유사 구조가 형성될 수 있다. 응집체를 형성시키는 실험 작업의 예는 작은 웰을 갖는 플레이트 (예를 들어, 편평 바닥의 경우 계산 시 약 0.1∼2.0 ㎠의 바닥 면적을 갖는 웰을 구비한 플레이트), 마이크로포어 등을 사용하여 작은 공간에 세포를 유지시키는 것을 포함하는 방법, 작은 원심분리 튜브를 사용해 단시간 동안 원심분리에 의해 세포를 응집시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 예를 들어 24웰 플레이트 (편평 바닥의 경우 계산 시 약 1.88 ㎠의 면적), 48웰 플레이트 (편평 바닥의 경우 계산 시 약 1.0 ㎠ 의 면적), 96웰 플레이트 (편평 바닥의 경우 계산 시 약 0.35 ㎠의 면적, 약 6∼8 mm의 내경), 및 384 웰 플레이트를 언급할 수 있다. 바람직하게는 96웰 플레이트이다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 웰을 위에서 볼때, 바닥 표면의 형상이 예를 들어 다각형, 사각형, 타원형, 원형, 바람직하게는 원형이다. 웰을 측면에서 볼 때 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 바닥 표면의 형상은 편평 바닥 구조 또는 높은 외주부 및 낮은 내부 오목부를 갖는 구조일 수 있다. 바닥표면의 형상은 예를 들어, U 바닥, V 바닥, M 바닥, 바람직하게는 M 바닥 또는 V 바닥을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 바닥 표면 상에 요철부, 또는 함몰부가 있는 세포 배양용 디쉬 (예를 들어, 60 mm∼150 mm 디쉬, 배양 플라스크)가 또한 사용될 수 있다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 바닥 표면은 바람직하게 세포 비부착성 바닥 표면, 바람직하게 상기 세포 비부착성-코팅된 바닥 표면이다.
다능성 줄기 세포 응집체의 형성, 또는 다능성 줄기 세포를 함유하는 세포 개체군, 및 이의 균일도는 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 이의 균질도 등을 기초로 결정할 수 있다. 또한, 응집체 내 상피-유사 구조의 형성, 및 이의 균일성은 응집체의 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 이의 균일도, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 이의 균일도, 분화 마커의 발현 제어 및 이의 동시성, 응집체 간 분화 효율의 재현성 등을 기반으로 결정할 수 있다.
본 발명에서 "조직"은 균일한 형상 또는 특성을 갖는 한 종류의 세포, 또는 상이한 형태 및 특성을 갖는 다수 유형의 세포가 소정 패턴으로 입체적으로 배열된 구조를 갖는 세포 개체군의 구조를 의미한다.
본 발명에서 "신경 조직"은 발생기 또는 성체기의 대뇌, 중뇌, 소뇌, 척수, 망막, 말초 신경, 전뇌, 후뇌, 종뇌, 간뇌 등을 포함하는 신경 세포로 구성된 조직을 의미한다. 세포 응집체 중 신경 조직은 광학 현미경 (예를 들어, 명시야 현미경, 위상차 현미경, 차등 간섭 대비 현미경, 입체 현미경 등)에 의한 미시적 관찰 또는 지표로서 신경 조직 마커 예컨대 PSA-NCAM, N-카데린 등의 신경 조직의 발현에 의해 확인할 수 있다.
신경 조직은 "신경상피 조직"(층구조를 가진 상피 구조)을 형성할 수 있다. 신경상피 조직의 특징은 조직에 함유된 세포의 형성, 조직 내 세포체의 배향, 전체 조직의 투명도, 거시적 형태 등과 같은 지표로서 확인할 수 있다. 세포 응집체 중 신경상피 조직의 양은 광학 현미경을 사용한 명시야 관찰에 의해 평가할 수 있다.
본 발명에서 "신경 세포"는 외배엽 유래 조직 중 표피 계통 세포 이외의 세포를 의미한다. 즉, 신경 전구 세포, 뉴런 (뉴런 세포), 교세포, 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포, 교세포 전구 세포 등과 같은 세포를 포함한다. 신경 세포는 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM, N-카데린 등을 마커로서 사용하여 식별할 수 있다. 뉴런 (뉴런 세포)은 신경 회로를 형성하여 신호 전달에 기여하는 기능적인 세포이며, TuJ1, Dcx, HuC/D 등과 같는 미성숙 뉴런 마커 및/또는 Map2, NeuN 등과 같은 성숙 뉴런 세포 마커의 발현을 지표로서 사용하여 식별할 수 있다.
신경 세포는 하기 기술된 망막 세포를 포함한다.
본 발명에서, "망막 세포"는 생체내 망막에서 각각의 망막층을 구성하는 세포 또는 이의 전구/선구 세포를 의미하고, 비제한적으로 망막 전구 세포, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 간상 광수용기 세포, 추상 광수용기 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 망막 신경절 세포 (신경절 세포), 쌍극 세포, 망막 색소 상피 세포 (RPE), 모양체 주변부 세포, 이들의 전구/선구 세포 등을 포함한다. 본 발명에서, "망막 조직"은 생체내 망막의 개별 망막층을 구성하는 상기 세포의 한 유형 또는 적어도 둘 이상의 유형이 층으로 입체적으로 배열된 조직을 의미한다. 각각의 세포로 구성된 망막층은 기지 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 존재 또는 부재 또는 이의 수준 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에서 "망막 층"은 망막을 구성하는 각각의 층을 의미한다. 이의 구체적인 예는 망막 색소 상피층, 광수용기 세포층, 외부 경계막, 외부 핵층, 외부 외부 망상층, 내부 핵층, 내부 망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내부 경계막을 포함한다.
본 발명에서 "망막 전구 세포"는 광수용기 세포, 간상 광수용기 세포, 추상 광수용기 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등을 포함하는 임의의 성숙한 망막층-특이적 신경 세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 의미한다.
본 발명에서, "신경 망막 전구 세포"는 광수용기 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 등을 포함하는 임의의 하나 또는 다수의 성숙한 망막층-특이적 신경 세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 의미한다. 일반적으로, 신경 망막 전구 세포는 망막 색소 상피 세포로 분화하지 않는다.
광수용기의 전구 세포, 수평 세포의 전구 세포, 쌍극 세포의 전구 세포, 아마크린 세포의 전구 세포, 망막 신경절 세포의 전구 세포, 망막 색소 상피의 전구 세포는 각각 광수용기 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 및 망막 색소 상피 세포로 분화되게 되는 전구 세포를 의미한다.
본 발명에서, "망막층-특이적 신경 세포"는 망막층을 구성하는 세포로서 망막층에 특이적인 신경 세포이다. 망막층-특이적 신경 세포의 예는 쌍극 세포, 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 광수용기 세포, 망막 색소 상피 세포, 간상 광수용기 세포 및 추상 광수용기 세포를 포함한다.
망막 세포 마커의 예는 망막 전구 세포에서 발현되는 Rx (Rax이라고도 함), PAX6 및 Chx10, 시상하부 신경 전구 세포에서는 발현되지만 망막 전구 세포에서는 발현되지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경상피에서 발현되지만 망막에서는 발현되지 않는 Sox1, 광수용기 세포의 전구 세포에서 발현되는 Crx 및 Blimp1 등을 포함한다. 망막층-특이적 신경 세포 마커의 예에는 쌍극 세포에서 발현되는 Chx10, PKCα 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현되는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현되는 칼레티닌, 수평 세포에서 발현되는 칼빈딘, 성숙한 광수용기 세포에서 발현되는 로돕신 및 리커버린, 간상 광수용기 세포에서 발현되는 Nrl 및 로돕신, 추상 광수용기에서 발현되는 Rxr-감마, S-옵신 및 M/L-옵신, 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 RPE65 및 Mitf, 모양체 주변부 세포에서 발현되는 Rdh10 및 SSEA1 등이 포함된다.
2. 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법
본 발명의 일 구체예는 다음의 단계 (1)∼(3)을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하기 위한 방법이다:
(1) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 배양하는 제1 단계,
(2) Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중에서 제1 단계에서 수득된 세포를 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제2 단계, 및
(3) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 수득하는 제3 단계.
2-1. 단계 (1)
단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포는 피더 세포의 부재 하에 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 배양된다.
단계 (1)에서 바람직한 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 보다 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포)이다.
유도 다능성 줄기 세포의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 상기에 언급된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 또한 피더-무함유 조건 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 단계 (즉, 다능성 줄기 세포를 수립하기 위해 체세포를 리프로그래밍하는 단계)를 수행하는 것이 바람직하다.
배아 줄기 세포 (ES 세포)의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 상기 언급된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있고, 또한 피더-무함유 조건 하에서 배아 줄기 세포 (ES 세포)를 제조하기 위한 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
단계 (1)에서 사용되는 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양이 부착 배양 또는 현탁 배양에 의해 수행될 수 있지만, 바람직하게 부착 배양에 의해 수행된다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양은 피더의 존재 하에서 또는 피더-무함유 조건 하에서 수행될 수 있지만, 바람직하게 피더-무함유 조건 하에서 수행한다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양에서 피더 세포의 부재 (피더-무함유)는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조건 (예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3% 이하)을 의미한다. 바람직하게, 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양이 수행된다.
단계 (1)의 피더 세포의 부재 (피더-무함유)는 피더 세포가 실질적으로 없는 조건 (예를 들어, 전체 세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3%이하)을 의미한다. 바람직하게, 단계 (1)은 피더 세포가 없는 조건 하에서 수행된다. 단계 (1)에서 사용되는 배지는 피더-무함유 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 배양을 미분화 상태로 유지시킬 수 있는 배지 (피더-무함유 배지)이면 특별히 한정되지 않는다. 배양이 미분화 상태를 유지할 수 있기 위해서, 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유한다.
미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질이라면 특별히 제한은 없다. 당업자에 범용되는 미분화 상태 유지를 위한 인자의 예는 프라이밍된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포)의 경우에 FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, TGFβ 패밀리 신호 경로 활성화 물질, 인슐린 등을 포함한다. FGF 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 구체적으로 섬유아세포 성장 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4 및 FGF8)를 언급할 수 있다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질로서, TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질, 노달/액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질을 언급할 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 TGFβ1, TGFβ2를 언급할 수 있다. 노달/액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 예를 들어 노달, 액티빈 A, 액티빈 B를 언급할 수 있다. 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 이들 중 하나 이상의 종류를 함유할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포 등)를 배양할 때, 단계 (1)에서 배지는 바람직하게는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자로서 bFGF를 함유한다.
본 발명에 사용하려는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 일반적으로 포유동물의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자이다. 포유동물은 예를 들어, 상기 언급한 것들이다. 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 포유동물 종 사이에서 교차 반응성을 가질 수 있기 때문에, 배양되는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지 할 수 있다면 임의 포유동물의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자라도 사용될 수 있다. 바람직하게, 배양하려는 세포와 동일한 포유동물 종의 미분화 상태를 유지하기 위한 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양을 위해서, 미분화 상태를 유지하기 위한 인간 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, TGFβ1, TGFβ2 등)가 사용된다. 여기에, "인간 단백질 X"는 단백질 X가 인간 생체내에서 자연적으로 발현되는 단백질 X의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명에 사용되는 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 바람직하게는 단리된다. "단리"는 의도하는 성분 또는 세포 이외의 요인들을 제거하기 위한 작업이 수행되어, 그 성분 또는 세포가 더 이상 자연적으로 발생된 상태가 아닌 것을 의미한다. 그러므로, "단리된 단백질 X"는 배양되는 세포 또는 조직으로부터 제조되고 세포 또는 조직 또는 배지에 함유된 내생성 단백질 X를 포함하지 않는다. "단리된 단백질 X"의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 중량의 백분율)는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 더욱 바람직하게는 100%이다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 미분화 상태를 유지하기 위해 단리된 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 일 구체예에서, 미분화 상태를 유지하기 위한 단리된 인자를 단계 (1)에서 사용되는 배지에 외생적으로 첨가하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 단계 (1)에서 사용하려는 배지에 미리 첨가될 수도 있다.
단계 (1)에서 사용되는 배지에서 미분화 상태를 유지하기 위한 인자의 농도는 배양하려는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 농도이고, 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 구체적으로는, 피더 세포 부재 하에서 미분화 상태를 유지하기 위한 인자로서 bFGF를 사용하는 경우, 이의 농도는 일반적으로, 약 4 ng∼500 ng/mL, 바람직하게는 약 10 ng∼200 ng/mL, 더 바람직하게는 약 30 ng∼150 ng/mL이다.
단계 (1)에서 사용되는 피더-무함유 배지 (즉, 미분화 유지 배지)로서, 많은 합성 배지가 개발되어 시판되고 있다. 예를 들어 에센셜 8 (Life Technologies 제품) 배지를 언급할 수 있다. 에센셜 8 배지는 첨가제로서 L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 mg/L), 소듐 셀레나이트 (14 μg/L), 인슐린 (19.4 mg/L), NaHCO3 (543 mg/L), 트랜스페린 (10.7 mg/L), bFGF (100 ng/mL) 및, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 활성화 물질 (TGFβ1 (2 ng/mL) 또는 노달 (100 ng/mL))을 함유하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 다른 시판되는 피더-무함유 배지 (미분화 유지 배지)의 예는 에센셜 6 배지 (Life Technologies 제품), 안정화 에센셜 8 배지 (Life Technologies 제품), S-배지 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd. 제품), StemPro (Life Technologies 제품), hESF9 (Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 9; 105 (36): 13409-14), TeSR 배지 (STEMCELL Technologies 제품), mTeSR1 (STEMCELL Technologies 제품), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 제품), TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 제품)을 포함한다. 이들 이외에도, 피더-무함유 배지로서, StemFit (등록 상표) (Ajinomoto Co., Inc. 제품)을 언급할 수 있다. 본 발명은 상기 단계 (1)에서 이들을 사용하여 간편하게 본 발명을 수행할 수 있다.
단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포는 현탁 배양 및 부착 배양 중 임의 조건, 바람직하게 부착 배양으로 배양할 수 있다.
부착 배양에 사용되는 배양 용기는 "부착 배양"을 수행할 수 있으면 특별히 제한은 없고, 세포-부착성 배양 용기가 바람직하다. 세포 부착 배양 용기는 그 표면이 세포와의 부착을 개선시키도록 인공적으로 처리된 배양 용기를 포함하고, 구체적으로, 그 내부가 코팅제로 코팅된 상기 배양 용기를 언급할 수 있다. 코팅제의 예는 세포외 매트릭스 예컨대 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등)], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), 마트리겔 등, 또는 중합체 예컨대 폴리리신, 폴리오르니틴 등을 포함한다. 또한, 양전하 처리 등으로 그 표면을 처리한 배양 용기를 사용하는 것이 가능하다. 라미닌이 바람직하고 511E-8이 보다 바람직하다. 라미닌 511E-8은 시판 제품일 수 있다 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi).
단계 (1)에서 사용되는 배지는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유한다. 구체적으로는, 예를 들어, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 상기 미분화 유지 배지에 첨가할 수 있다. 제1 단계에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고 제2 단계에서 현탁 배양을 수행하며, 그리하여 세포의 상태가 변화되고, 응집체의 품질이 향상되어, 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체를 고효율로 제조할 수 있다. 이렇게 수득된 세포 응집체는 예를 들어, 표면이 매끄럽고 내부가 조밀한 구형 세포 응집체의 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 (즉, TGFβ 수퍼패밀리 신호 전달 경로)는 리간드로서 TGFβ, 노달/액티빈 또는 BMP와 Smad 패밀리에 의해 세포내에서 전달되는 신호 전달 경로이다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는 신호 전달 경로를 억제하는 물질이다. 구체적으로는, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질, 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 및 BMP 신호 전달 경로 억제 물질을 언급할 수 있다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 TGFβ에 의해 야기되는 신호 전달 경로를 억제하는 물질이라면 특별히 제한되지 않고, 임의의 핵산, 단백질 및 저분자 유기 화합물일 수 있다. 물질로서, 예를 들어 TGFβ에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 앱타머 등), TGFβ를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), TGFβ 수용체와 TGFβ의 결합을 억제하는 물질, 및 TGFβ 수용체에 의한 신호 전달로 야기되는 생리적 활성을 억제하는 물질 (예를 들어, TGFβ 수용체 억제제, Smad 억제제 등)을 언급할 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로 알려진 단백질로서, Lefty 등을 언급할 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서, 당업자에게 알려진 화합물이 사용될 수 있고, 구체적으로는 SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 등을 언급할 수 있다. SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드) 및 A-83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드)은 TGFβ 수용체 (ALK5) 및 액티빈 수용체 (ALK4/7)의 억제제 (즉, TGFβR 억제제)로서 알려진 화합물이다. 이들 중 하나 이상의 종류가 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서 함유될 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01이다.
노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질은 노달 또는 액티빈으로 야기되는 신호 전달 경로를 억제하는 물질이라면 특별히 제한은 없고, 임의의 핵산, 단백질 및 저분자 유기 화합물일 수 있다. 이 물질의 예는 노달 또는 액티빈에 직접 작용하는 물질 (예를 들면 항체, 앱타머 등), 노달 또는 액티빈을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들면, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), 노달/액티빈 수용체와 노달/액티빈의 결합을 억제하는 물질, 및 노달/액티빈 수용체에 의한 신호 전달에 기인하는 생리 활성을 억제하는 물질을 포함한다. 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질로서, 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 SB431542, A-83-01 등을 언급할 수 있다. 또한, 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질로서 알려진 단백질 (Lefty, Cerberus 등)이 사용될 수 있다. 이들 중 하나 이상의 종류가 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질로서 함유될 수 있다. 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 SB431542, A-83-01 또는 Lefty이다.
BMP 신호 전달 경로 억제 물질은 BMP로 인한 신호 전달 경로를 억제하는 물질이라면 특별히 제한은 없고, 임의의 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물일 수 있다. 여기서 BMP로서, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7을 언급할 수 있다. 이 물질의 예는 BMP에 직접 작용하는 물질 (예를 들면, 항체, 앱타머 등), BMP를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들면, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), BMP 수용체 (BMPR)와 BMP의 결합을 억제하는 물질, 및 BMP 수용체에 의한 신호 전달로 야기되는 생리 활성을 저해하는 물질을 포함한다. BMPR로서, ALK2 또는 ALK3을 언급할 수 있다. BMP 신호 전달 경로 억제 물질로서, 당업자에게 알려진 화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 LDN193189, 돌소몰핀 등을 언급할 수 있다. 여기서, LDN193189 (4-[6-(4-피페라진-1-일페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린)는 공지의 BMPR (ALK2/3) 억제제 (이하, BMPR 억제제)이며, 일반적으로는 히드로클로라이드의 형태로 시판되고 있다. 또한, BMP 신호 전달 경로 억제 물질로 알려진 단백질 (Chordin, Noggin 등)을 사용할 수도 있다. BMP 신호 전달 경로 억제 물질로서 이들을 중 하나 이상의 종류를 함유할 수 있다. BMP 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 LDN193189이다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189이다.
작용점이 다른 다수 종류의 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질을 조합하여 사용할 수 있다. 그들을 조합함으로써, 응집체의 품질을 개선시키는 효과가 향상될 것으로 기대된다. 예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 BMP 신호 전달 경로 억제 물질의 조합, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질의 조합, 및 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 노달/액티빈 신호 경로 억제 물질의 조합을 언급할 수 있다. 바람직하게는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 BMP 신호 전달 경로 억제 물질이 조합하여 사용된다. 구체적으로 바람직한 조합은 SB431542와 LDN193189과의 조합이다.
소닉 헤지호그 (이하, 때대로 Shh라고 표기) 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh에 의해 매개되는 신호 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 예는 헤지호그 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh 및 Ihh), Shh 수용체, Shh 수용체 효현제, PMA (퍼모프아민; 9-사이클로 헥실-N-[4-(4-몰폴리닐)페닐]-2-(1-나프탈레닐옥시)-9H-퓨린-6-아민) 또는 SAG (Smoothened Agonist; N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조 [b]티오펜-2-카보닐)-1,4-디아미노 시클로헥산) 등을 포함한다. Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 이들 중 하나 이상의 종류를 함유할 수 있다. 바람직한 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh 단백질 (유전자은행 등록 번호: NM_000193, NP_000184), SAG 및 PMA이다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 조합하여 사용할 수 있다. 그들을 조합함으로써, 응집체의 품질에 대한 개선된 효과가 향상될 것으로 기대된다. 구체적인 조합의 예는 Lefty, SB431542, A-83-01 및 LDN193189로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질, 및 Shh 단백질, SAG와 PMA로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 조합을 포함한다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 조합하여 사용하는 경우, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질을 모두 함유하는 배지에서 배양할 수 있거나, 또는 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 중 어느 하나로 처리할 수 있고 이후에 세포를 그들 중 어느 하나 또는 둘 모두로 계속적으로 처리할 수 있다. 대안적으로, 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 둘 모두로 처리할 수 있고, 그 이후에 연속적으로 그들 중 어느 하나로 처리한다.
TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수있는 범위로 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들어, SB431542는 일반적으로 0.1∼200 μM, 바람직하게는 2∼50 μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 일반적으로 0.05∼50 μM, 바람직하게는 0.5∼5 μM의 농도로 사용된다. LDN193189은 일반적으로 1∼2000 nM, 바람직하게는 10∼300 nM의 농도로 사용된다. Lefty는 일반적으로 5∼200 ng/mL, 바람직하게는 10∼50 ng/mL의 농도로 사용된다. Shh 단백질은 일반적으로 20∼1000 ng/mL, 바람직하게는 50∼300 ng/mL의 농도로 사용된다. SAG는 일반적으로 1∼2000 nM, 바람직하게는 10∼700 nM, 보다 바람직하게는 30∼600 nM의 농도로 사용된다. PMA는 일반적으로 0.002∼20 μM, 바람직하게는 0.02∼2 μM의 농도로 사용된다. 일 구체예에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 상기 농도의 SB43154와 동등한 TGFβ 패밀리 신호 경로 억제 활성을 나타내는 양으로 적절하게 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 상기 농도의 SAG와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 양으로 적절하게 사용될 수 있다.
SB431542 및 LDN193189 등의 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 활성은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예컨대 웨스턴 블롯팅 방법으로 Smad의 인산화를 검출하여 결정할 수 있다 (Mol Cancer Ther (2004) 3, 737-45). SAG 등의 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면 Gli1 유전자의 발현에 주목하는 리포터 유전자 어세이를 통해 결정할 수 있다 (Oncogene (2007) 26, 5163-5168).
단계 (1)에서 사용되는 배지가 혈청-함유 배지 또는 혈청-무함유 배지일 수 있지만, 화학적으로 불확정적인 성분의 오염을 방지하기 위해, 혈청-무함유 배지가 바람직하다.
화학적으로 불확정적인 성분의 오염을 피하기 위해 단계 (1)에서 사용되는 배지는 그 성분이 화학적으로 한정된 배지일 수 있다.
단계 (1)의 피더-무함유 조건 하에 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해서, 상기 피더-무함유 배지 (즉, 미분화 유지 배지)를 배지로서 사용할 수 있다. 피더-무함유 배지 (미분화 유지 배지)로서 에센셜 8 배지, 에센셜 6 배지, 안정화 에센셜 8 배지, S-배지, StemPro 배지, hESF9 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지 (mTeSR1, mTeSR2 등), TeSR-E8, StemFit (등록 상표) 배지 등을 언급할 수 있고, 에센셜 8 배지 또는 StemFit (등록 상표) 배지가 바람직하게 사용된다.
단계 (1)에서 피더-무함유 조건 하에서 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해서, 다능성 줄기 세포에 피더 세포 대신 스캐폴드를 제공하기 위해 적절한 매트릭스가 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 그 표면이 스캐폴드로서 매트릭스로 코팅된 세포 용기에서 부착 배양된다.
스캐폴드로서 이용가능한 매트릭스로서, 라미닌 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), 라미닌 단편 (Nat Commun 3, 1236 (2012)), 기저막 제제 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란, 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴 등을 언급할 수 있다.
"라미닌"은 α, β, γ 사슬로 이루어진 이종삼량체 분자이며, 상이한 서브유닛 사슬 조성을 갖는 이소폼을 함유하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로, 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬과 헤테로삼량 체의 조합을 기반으로 약 15종의 이소폼을 갖는다. α 사슬 (α1∼α5), β 사슬 (β1∼β4) 및 γ 사슬 (γ1∼γ3)의 각 숫자를 조합하여 라미닌의 명칭이 결정된다. 예를 들어, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합을 갖는 라미닌은 라미닌 511이라고 한다. 본 발명에서, 라미닌 511이 바람직하게 사용된다 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
본 발명에서 사용되는 라미닌은 일반적으로 포유동물 라미닌이다. 포유동물로서, 상기 언급된 것들을 인용할 수 있다. 이종-무함유 조건을 획득하기 위해서, 배양하려는 세포와 동일종 포유동물의 라미닌이 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 인간 라미닌 (바람직하게, 인간 라미닌 511)이 인간 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용된다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 단편은 다능성 줄기 세포에 대한 부착성을 가지고 피더-무함유 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 유지 배양을 할 수 있으면 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 E8 단편이다. 라미닌 E8 단편은 라미닌 511을 엘라스타제로 분해하여 얻은 단편 중에서 강력한 세포 부착 활성을 갖는 단편으로서 동정되었다 (EMBO J. 3 : 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105 : 589-598, 1987). 본 발명은 바람직하게는 라미닌 511의 E8 단편이 사용된다 (NatCommun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). 본 발명에 사용되는 라미닌 E8 단편은 라미닌의 엘라스타제 분해 산물을 요구하지 않고 재조합일 수 있다. 미확인 성분의 오염을 피하기 위해서 재조합 라미닌 단편이 바람직하게 본 발명에서 사용된다. 라미닌 511의 E8 단편은 시판되며, 예를 들어 Mippi, Inc. 등에서 구매할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 또는 라미닌 단편은 바람직하게는 단리된다.
본 발명에서 "기저막 제제"는 기저막을 형성할 수 있는 목적 세포를 그 위에 파종하여 배양할 때, 상피 세포와 유사한 세포 형태, 분화, 성장, 운동성, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막-구성 성분을 함유하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제조된 망막 세포 및 망막 조직을 추가 부착 배양을 수행할 때 기저막 제제의 존재 하에서 분산시키고, 배양할 수 있다. 여기서, "기저막 구성 성분"은 동물 조직에서 상피 세포층과 간질 세포층 등의 사이에 존재하는 얇은 막의 형태인 세포외 매트릭스 분자를 의미한다. 기저막 제제는 예를 들어 세포의 지질을 용해시킬 수 있는 용액, 알칼리 용액 등으로 지지체로부터, 기저막을 통해 지지체에 부착된 기저막을 형성할 수 있는 세포를 제거하여 제조될 수 있다. 기저막 제제의 예는 기저막 제제로서 시판되는 제품 (예를 들어, MatrigelTM (Corning Incorporated 제품: 이하, 때때로 마트리겔이라고도 함), GeltrexTM (Life Technologies 제품), 및 기저막 성분으로 알려진 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 등)를 포함한다.
MatrigelTM 은 EHS (Engelbreth Holm Swarn) 마우스 육종에서 추출된 기저막 제제이다. MatrigelTM 의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴이다. 이들 외에도, TGFβ, FGF, 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 EHS 종양에 의해 자연적으로 생산되는 성장 인자가 함유된다. MatrigelTM 의 "성장 인자 감소 제품"은 일반 MatrigelTM 보다 낮은 성장 인자 농도를 가지며, 이의 표준 농도는 EGF가 < 0.5 ng/mL, NGF가 < 0.2 ng/mL, PDGF가 < 5 pg/mL, IGF1이 5 ng/mL, TGFβ가 1.7 ng/mL이다.
미확인 성분의 오염을 피하기 위해서, 단리된 라미닌 또는 라미닌 조각이 본 발명에서 바람직하게 사용된다.
바람직하게, 단계 (1)의 피더-무함유 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 배양에서, 인간 다능성 줄기 세포는 단리된 라미닌 511 또는 라미닌 511의 E8 단편 (더욱 바람직하게는, 라미닌 511의 E8 단편)으로 표면을 코팅한 세포 용기에서 부착된 상태로 배양된다.
단계 (1)에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은 단계 (2)에서 형성되는 응집체의 품질을 개선시키는 효과가 달성될 수 있으면 특별히 한정되지 않으며, 일반적으로는 0.5∼144시간이다. 단계 (1)에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은 바람직하게는 1시간 이상, 2시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 20시간 이상 또는 24시간 이상이다. 단계 (1)에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은 바람직하게는 96시간 이내, 72시간 이내, 60시간 이내, 48시간 이내 또는 28시간 이내이다. 일 구체예에서, 단계 (1)에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간 범위는 바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예: 24시간)이다. 즉, 제1 단계가 단계 (2)에서 현탁 배양 시작 전 0.5∼144시간 (바람직하게는 12∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간)에 시작되고, 단계 (1)의 완료 후 연속적으로 단계 2가 수행된다. 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 중 어느 하나로 처리한 후 연속적으로 다른 것을 처리할 때, 각 처리시간은 상기 배양 기간 범위 내에 속하도록 독립적으로 설정될 수 있다.
세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 둘 모두로 처리한 후 연속적으로 그들 중 하나로 처리하는 경우, 그리고 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 중 어느 하나로 처리한 후 연속적으로 둘 모두로 처리하는 경우에, 각 처리시간도 역시 상기 배양 기간 범위 내에 속하게 독립적으로 설정할 수 있다.
일 구체예에서, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양하고 그 이후에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양할 수 있다. 이 경우에, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 예를 들어, 3 μM∼10 μM의 SB431542와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도 또는 50 nM∼200 nM의 LDN193189와 동등한 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 활성을 나타내는 농도이고, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 예를 들어 100 nM∼500 nM의 SAG와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도이다.
또 다른 구체예에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 둘 모두와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양하고 이후에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나로 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양할 수 있다. 이 경우에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 예를 들어 3 μM∼10 μM의 SB431542와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도 또는 50 nM∼200 nM의 LDN193189와 동등한 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 활성을 나타내는 농도이고, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 예를 들어 100 nM∼500 nM의 SAG와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도이다.
다른 구체예에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양하고 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542 또는 LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 둘 모두와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양할 수 있다. 이 경우, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 예를 들어 3 μM∼10 μM의 SB431542와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도 또는 50 nM∼200 nM의 LDN193189와 동등한 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 활성을 나타내는 농도이고, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 예를 들어 100 nM∼500 nM의 SAG와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도이다.
단계 (1)에서 배양 조건 예컨대 배양 온도, 및 CO2 농도는 적절하게 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
바람직한 구체예에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에, bFGF를 함유하는 혈청-무함유 배지 (미분화 유지 배지)에서 부착 상태로 배양한다. 부착 배양은 바람직하게는 라미닌 511, 라미닌 511의 E8 단편 또는 비트로넥틴으로 표면 코팅된 세포 용기에서 수행된다. 부착 배양은 바람직하게는 피더-무함유 배지 (미분화 유지 배지)로서 에센셜 8, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지 또는 StemFit (등록 상표) 배지, 더욱 바람직하게는 에센셜 8 또는 StemFit (등록 상표) 배지를 사용하여 수행된다.
일 구체예에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포 부재 하에, bFGF를 함유하는 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양한다. 현탁 배양에서, 인간 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서 얻은 세포는 다능성-유사 특성 (다능성-유사 상태)을 유지하는 세포이고 다능성-유사 특성은 단계 (1)을 통해서 유지된다. 다능성-유사 특성은 다능성을 포함하여 다능성 줄기 세포에 고유하고 공통인 특징의 적어도 일부가 유지되는 것을 의미한다. 다능성-유사 특성은 엄격한 다능성을 요구하지 않는다. 구체적으로, 다능성 특성 (다능성 상태)의 지표가 되는 마커의 전부 또는 일부를 발현하는 상태가 "다능성-유사 특성"에 포함된다. 다능성-유사 특성의 마커로서, Oct3/4 양성, 알칼리 포스파타제 양성 등을 언급할 수 있다. 일 구체예에서, 다능성-유사 특성을 유지하는 세포는 Oct3/4 양성이다. Nanog의 발현 수준이 ES 세포 또는 iPS 세포보다 낮더라도, "다능성-유사 특성을 나타내는 세포"에 포함된다.
일 구체예에서, 단계 (1)에서 얻은 세포는 적어도 망막 세포 또는 망막 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 가진 줄기 세포이다. 일 구체예에서, 단계 (1)에서 얻어지는 세포는 적어도 망막 세포 및 망막 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 가진 Oct3/4 양성 줄기 세포이다. 일 구체예에서, 단계 (1)에서 얻어지는 세포는 Oct3/4 양성 줄기 세포를 60% 이상, 예를 들어 90% 이상으로 함유한다.
바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포, ES 세포)는 피더 세포의 부재 하에, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 bFGF을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 부착 배양된다.
단계 (1)에서 상기 부착 배양은 바람직하게는 라미닌 511 또는 라미닌 511의 E8 단편으로 표면 코팅된 세포 용기에서 수행된다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542 A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189, Chordin, Noggin) 또는 이들의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189)이다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 더욱 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 또는 이들의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189)이다. 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 Shh 단백질, SAG 또는 퍼모프아민 (PMA), 보다 바람직하게는 SAG이다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189)과 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)을 조합하여 사용할 수 있다. 배양 기간은 0.5∼144시간 (바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간, 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예를 들어, 24시간))이다. 배양 과정에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189), Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 또는 이의 조합을 변경할 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 둘 모두와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양될 수 있고, 이후에 TGFβ 패밀리 신호 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양될 수 있고, 이후에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 둘 모두 또는 어느 하나와 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양될 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포는 단계 (1)의 시작 전에 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지에서 유지 배양시키고, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 배양물에 첨가하고 배양을 계속하여 단계 (1)을 수행한다. 구체적으로는, 예를 들어, 단계 (1)이 유지 배양의 완료 후에 시작될 때, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가한 미분화 유지 배지가 첨가될 수 있거나 또는 미분화 유지 배지의 일부 또는 전부를 교환할 수 있고 배양을 계속한다.
예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에, bFGF를 포함하는 혈청-무함유 배지에서 유지 배양한다. 유지 배양은 바람직하게 부착 배양으로 수행된다. 부착 배양은 바람직하게 비트로넥틴, 라미닌 511 또는 라미닌 511의 E8 단편으로 표면 코팅된 세포 용기에서 수행된다. 유지 배양 기간은 특별히 한정되지 않는다. 다능성 줄기 세포는 분화 능력을 유지하는 증식 (바람직하게, 자가 복제)을 할 수 있는 세포이고, 유지 배양은 다능성을 유지할 수 있는 배양 방법이다. 따라서, 적절하게 조작하면 무한하게 유지 배양이 가능하다. 일부 구체예에서, 유지 배양 동안, 다능성 줄기 세포를 냉동시켜 냉동 세포 스톡을 제조하고, 냉동 세포 스톡을 배양하여 유지 배양을 계속할 수 있다. 배양 이후 유지 배양을 계속할 수 있다. 그 배양이후에 배양 기간은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 약 1일∼1000일, 바람직하게는 약 7일∼150일, 보다 바람직하게는 약 10일∼90일이다. 일부 구체예에서, 유지 배양 동안 세포의 계대 작업을 수행할 수 있다.
단계 (1)에서, 상기와 같이 유지 배양된 인간 다능성 줄기 세포를 함유하는 배지에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하고 배양을 계속한다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 바람직하게는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189)이다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 더욱 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189)이다. 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 Shh 단백질, SAG 또는 PMA이다. TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189)과 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)을 조합하여 사용할 수 있다. 첨가 후, 0.5∼144시간 (바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간, 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예를 들어, 24시간)) 동안 배양을 계속한다. 배양 동안 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189), Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 또는 이의 조합을 변경할 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 둘 모두를 사용하여 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양될 수 있고, TGFβ 패밀리 신호 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나를 사용하여 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나를 사용하여 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 배양될 수 있고, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, LDN193189) 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 중 어느 하나 또는 둘 모두를 사용하여 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 더 배양될 수 있다.
2-2. 단계 (2)
단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 단계 (2)를 설명한다.
본 발명의 단계 (2)에서 현탁 배양이 시작되는 시점은 다음의 작업을 수행할 때의 시점이다.
· 작업 : 단계 (1)에서 사용된 미분화 유지 배지 (즉, 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지)의 배지 교환 및 현탁 배양으로의 진행을 포함하는 작업.
상기 작업에서 배지 교환은 미분화 유지 배지 이외의 배지로 교환되는 것이고 배지가 본 발명의 망막 세포 및/또는 망막 조직 또는 이의 중간체로 분화를 유도할 수 있다면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, "미분화 유지 인자" 예컨대 후술하는 기초 배지를 함유하지 않는 배지를 언급할 수 있다. 단계 (2)의 시작 시점에, 즉 배지 교환 시점에, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유할 수도 있거나 또는 함유하지 않을 수도 있고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 후술하는 바와 같이 배지 교환 이후에 첨가될 수 있다.
단계 (2)에서 사용되는 배지 (기초 배지)는 특별히 한정되지 않고 상기 정의 부문에서 기술한 기초 배지가 적절하게 선택할 수 있다. 단계 (2)에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 혈청-무함유 배지일 수 있다. 화학적으로 불확정된 성분의 오염을 피하기 위해서, 혈청-무함유 배지가 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 복잡한 준비를 피하기 위해서, 예를 들어 적절한 양의 시판 혈청 대체물 예컨대 KSR 등이 보충된 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 IMDM 및 F-12의 1:1 혼합물 배지, 또는 5%∼20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-머캅토에탄올이 보충된 GMEM 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 다능성 줄기 세포의 경우에 혈청-무함유 배지에 첨가되는 KSR의 양은 일반적으로 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% (예를 들어, 약 5%, 약 10%)이다.
단계 (2)에서 사용되는 배지는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유한다. 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지) 중에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 그리하여 응집체의 품질을 더욱 개선시키고, 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체 및 망막 세포로 분화에 적합한 응집체가 고효율로 형성시킬 수 있다. 이렇게 얻은 세포 응집체는 예를 들어 구형이고 부드러운 표면, 붕괴되지 않은 형상 및 내부 조밀성을 갖는 특징을 나타낼 것으로 기대된다.
단계 (2)에 사용되는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 Wnt에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고 임의의 단백질, 핵산, 저분자량 화합물 들일 수 있다. Wnt에 의해 매개되는 신호는 Frizzled (Fz) 및 LRP5/6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)의 이종이량체로서 존재하는 Wnt 수용체를 통해 전달된다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 예는 제한없이, Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질 (항-Wnt 중화 항체, 항-Wnt 수용체 중화 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들면, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt의 결합을 저해하는 물질 (가용성 Wnt 수용체, 우성 음성 Wnt 수용체, Wnt 길항제, Dkk1, Cerberus 단백질 등) 및 Wnt 수용체에 의한 신호 전달에 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질 [저분자량 화합물 예컨대 CKI-7 (N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-설폰 아미드), D4476 (4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), IWR-1-엔도 (IWR1e) (4-[(3aR, 4S, 7R, 7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-옥소-4,7-메탄올-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드) 및, IWP-2 (N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세타미도) 등] 등을 포함한다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 이들 중 하나 이상의 종류가 함유될 수 있다. CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2 등은 공지의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이며, 시판 제품 등을 적절하게 이용할 수 있다. 바람직하게 IWR1e가 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 사용된다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 오직 양호한 세포 응집체의 형성을 유도할 수 있는 농도가 요구된다. 예를 들어, IWR-1-엔도는 농도가 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 바람직하게는 약 0.3 μM 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 10 μM, 더욱 바람직하게는 약 3 μM이 되도록 배지에 첨가된다. IWR-1-엔도 이외의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 사용될 때, 상기 농도에서 IWR-1-엔도와 동증한 Wnt 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 배지에 첨가하는 시점은 상기 효과를 달성할 수 있으면 특별히 제한되지 않지만, 보다 빨리 첨가하는 경우에 더 높은 효과를 얻을 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작부터, 일반적으로 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 단계 (2)의 현탁 배양 시작시 배지에 첨가된다. 구체적으로는, 예를 들어, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가된 기초 배지에 첨가하거나, 또는 기초 배지에 배지의 일부 또는 전부를 교환하는 것이 가능하다. 단계 (1)에서 얻은 세포를 단계 (2)에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로 처리하는 기간은 상기 효과가 달성될 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 단계 (2)에서 현탁 배양이 시작될 때 배지에 첨가되어 단계 (2) 종료 시 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 직전)까지 작용한다. 더욱 바람직하게는, 후술하는 바와 같이, 세포는 단계 (2) 완료 후 (즉, 단계 (3)의 기간 동안)에도 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질에 계속적으로 노출된다. 일 구체예에서, 후술하는 바와 같이, 신경상피 조직 및/또는 신경조직이 형성될 때까지 단계 (2) 완료 후 (즉, 단계 (3)의 기간 동안)에도 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 계속적으로 작용하게 할 수 있다. 신경상피 조직 및/또는 신경 조직의 형성은 전술된 방법으로 확인할 수 있다.
응집체의 형성을 위해, 단계 (1)에서 얻은 세포의 분산 작업을 먼저 수행하여 분산된 세포를 제공한다. 분산 작업으로 얻은 "분산된 세포"는 예를 들어, 세포의 70% 이상이 단일 세포이고, 세포의 30% 이하가 2-50개 세포 덩어리인 상태를 의미한다. 바람직하게, 분산된 세포로서, 세포의 80% 이상이 단일 세포이며, 세포의 20% 이하가 2∼50 세포 덩어리인 상태를 언급할 수 있다. 분산된 세포는 세포의 상호 부착 (예를 들어, 평면 부착)이 거의 없는 상태를 의미한다. 일부 구체예에서, 분산된 세포는 세포-세포 접합 (예를 들어, 부착 결합)이 거의 없는 상태를 의미한다.
단계 (1)에서 얻은 세포의 분산 작업은 전술한 기계적 분산 처리, 세포 분산 용액 처리, 및 세포 보호제 처리를 함유할 수 있다. 이들 처리는 조합하여 수행할 수 있다. 바람직하게, 세포 분산 용액 처리는 세포 보호제 처리와 동시에 수행되고 이어서 기계적 분산 처리를 수행한다.
세포 보호제 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 신호 전달 경로 활성화 물질, 혈청 및 혈청 대체물을 언급할 수 있다. 또한, 분산으로 유도된 다능성 줄기 세포의 세포 사멸 (특히, 인간 다능성 줄기 세포의 세포 사멸)을 저해하는 세포 보호제로서, ROCK (Rho-associated coiled-coil kinase) 억제제 또는 미오신 억제제를 첨가할 수 있다. 분산으로 유도된 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포)의 세포 사멸을 억제하고, 세포를 보호하기 위해서, ROCK 억제제 또는 미오신 억제제가 단계 2의 배양 시작부터 첨가될 수 있다. ROCK 억제제로서, Y-27632, 파수딜 (HA1077), H-1152 등을 언급할 수 있다. 미오신 억제제로서, 블레비스타틴을 언급할 수 있다.
세포 분산 용액 처리에 사용되는 세포 분산 용액으로서, 임의의 효소 예컨대 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DNase, 파파인 등, 및 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산을 함유하는 용액을 언급할 수 있다. 시판되는 세포 분산 용액 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 제품)및 TrypLE Express (Life Technologies 제품)를 또한 사용할 수 있다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 파이펫팅 처리 또는 스크래퍼에 의한 스크래핑을 언급할 수 있다.
분산된 세포는 상기 배지에 현탁된다. 예를 들어, 분산된 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (및 필요에 따라 세포 보호제 예컨대 ROCK 억제제)을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에 현탁하여, 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작부터 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질에 의한 처리가 가능하다.
다음으로, 분산된 세포의 현탁액을 상기 배양 용기에 파종하고, 분산된 세포를 세포 용기에 비부착된 조건 하에서 배양하여, 다수 세포를 집합시켜 응집체를 형성시킨다.
이 경우에서, 다수 세포 응집체는 비교적 큰 배양 용기 예컨대 10 cm 디쉬에 분산된 세포를 파종하여 하나의 배양 용기에서 동시에 형성될 수 있다. 그러나, 이 경우에 응집체의 크기가 다양하다. 따라서, 예를 들어, 소정 개수의 분산된 세포를 멀티웰 플레이트 (U-바닥, V-바닥, M-바닥) 예컨대 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 위치시키고 정치 배양을 수행하여, 세포가 신속하게 응집되어 각 웰에 하나의 응집체가 형성된다. 응집체를 다수의 웰로부터 회수하여, 균일한 응집체 개체군을 얻을 수 있다.
단계 (2)에서 세포의 농도는 세포 응집체가 보다 균일하고 효율적으로 형성될 수 있도로 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 인간 세포 (예를 들어, 단계 (1)에서 인간 iPS로부터 얻은 세포)가 96웰 마이크로웰 플레이트를 사용하여 현탁 배양되는 경우에, 웰 당 약 1 x 103 내지 약 1 x 105 세포, 바람직하게는 약 3 x 103 내지 약 5 x 104 세포, 보다 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 2 x 104 세포, 더욱 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 1.6 x 104 세포, 보다 더 바람직하게는 약 8 x 103 내지 약 1.2 x 104 세포를 획득하도록 제조된 액체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치시켜 응집체를 형성시킨다.
단계 (2)의 배양 조건 예컨대 배양 온도, CO2 농도 등은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
단계 (2)에서, 배지 교환 작업을 수행할 경우, 예를 들면, 기존 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 기존 배지의 대략 절반량을 버리고 (기존 배지 부피의 약 30∼90%, 예를 들어 40∼60%), 대략 절반량의 새로운 배지 (기존 배지 부피의 30∼90%, 예를 들어 약 40∼60% 정도)를 첨가하는 작업 (배지-절반 교환 작업), 및 기존 배지의 대략 전체량을 버리고 (기존 배지량의 90% 이상), 대략 전체량의 새로운 배지 (기존 배지량의 90% 이상)를 첨가하는 작업을 언급할 수 있다.
일정 시점에 특정 성분 (예를 들어, 분화-유도 인자)이 첨가될 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 기존 배지의 대략 절반량을 버리고, 최종 농도보다 더 높은 농도로 구체적으로 최종 농도의 1.5∼3배, 예를 들면, 최종 농도의 약 2 배 농도로 특정 성분을 함유하는 새로운 배지의 대략 절반량을 첨가하는 작업을 수행할 수 있다.
일정 시점에 기존 배지에 함유된 특정 성분의 농도가 유지될 때, 예를 들어 기존 배지의 대략 절반량을 버리고 기존 배지에서와 같은 농도로 특정 성분을 함유하는 새로운 배지의 대략 절반량을 첨가하는 작업이 수행될 수 있다.
일정 시점에, 기존 배지에 함유된 성분의 농도를 희석을 통해 감소시키려는 경우, 예를 들어, 배지 교환 작업이 1일 당 수회, 바람직하게는 1시간 내에 수회 (예를 들어, 2 내지 3회) 수행될 수 있다. 또한, 일정 시점에, 기존 배지에 함유된 성분의 농도를 희석으로 감소시키려는 경우, 세포 또는 응집체는 다른 배양 용기로 옮겨질 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 파이펫터, 마이크로파이펫, 멀티채널 마이크로파이펫, 연속 분배기 등을 언급할 수 있다. 예를 들면, 배양 용기로 96웰 플레이트가 사용되는 경우, 멀티채널 마이크로파이펫을 사용할 수 있다.
세포 응집체를 형성하기 위해 필요한 현탁 배양의 기간은 세포가 균일하게 응집될 수 있도록, 사용하려는 세포에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 균일한 응집체를 형성하기 위해, 가능한 짧은 것이 바람직하다. 분산된 세포가 세포 응집체를 형성하는 단계는 세포를 집합시키는 단계, 집합된 세포로부터 세포 응집체를 형성하는 단계로 나눌 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 단계 (1)에서 인간 iPS로부터 얻은 줄기 세포)의 경우에서 세포를 집합시키기 위해 분산된 세포를 파종하는 단계 (즉, 현탁 배양의 시작 시)에서, 예를 들어, 집합된 세포는 바람직하게 약 24시간 이내, 보다 바람직하게는 약 12시간 이내에 형성된다. 분산된 세포를 파종하는 시점 (즉, 현탁 배양 시작 시)부터 응집체를 형성할 때까지의 기간, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)의 경우에서, 응집체는 예를 들어, 바람직하게 약 72시간 이내, 보다 바람직하게는 약 48시간 이내에 형성된다. 세포 응집체 형성을 위한 기간은 세포를 응집시키기 위한 도구, 원심분리 조건 등을 제어하여 적절하게 조정할 수 있다.
세포 응집체의 형성 및 이의 균일도는 응집체의 크기 및 세포수, 거시적 형태, 미시적 형태 및 조직 염색 분석에 의한 이의 균일도, 분화 및 미분화 상태에 대한 마커의 발현 및 이의 균일도, 분화 마커 발현의 제어 및 이의 동시성, 응집체 간 분화 효율의 재현성 등을 기초로 결정될 수 있다.
응집체 형성 후, 응집체가 그대로 계속적으로 배양될 수 있다. 단계 (2)에서 현탁 배양시간은 일반적으로 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼3일, 더욱 바람직하게는 약 24시간 내지 48시간이다.
일 구체예에서, 단계 (2)에서 사용되는 배지는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 더 함유할 수 있다. 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 그리하여 응집체의 품질이 더욱 개선되고, 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체 (예를 들어, 구형의 표면이 부드럽고, 붕괴되지 않고, 내부 조밀한, 미분화 특성을 유지하는 세포의 응집체)를 고효율로 형성시킬 수 있을 것으로 기대된다.
소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 상술한 것들을 사용할 수 있다. 바람직하게는 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 SAG, 퍼모프아민 (PMA) 또는 Shh 단백질이다. 일 구체예에서, 단계 (1)에서 사용한 것과 동일한 종류의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 단계 (2)에서 사용할 수 있다. 배지의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수 있는 범위 내에 속하도록 적절하게 결정할 수 있다. SAG는 일반적으로 1∼2000 nM, 바람직하게는 10 nM∼1000 nM, 보다 바람직하게는 10 nM∼700 nM, 더욱 바람직하게는 50 nM∼700 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM∼600 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM∼500 nM의 농도로 단계 (2)에서 사용된다. 다른 구체예에서, SAG는 일반적으로 1∼2000 nM, 바람직하게는 3 nM∼100 nM, 보다 바람직하게는 5 nM∼50 nM, 더욱 바람직하게는 10 nM∼30 nM의 농도로 단계 (2)에서 사용된다. PMA는 일반적으로 0.002∼20 μM, 바람직하게는 0.02∼2 μM의 농도로 단계 (2)에서 사용된다. Shh 단백질은 일반적으로 20∼1000 ng/mL, 바람직하게는 50∼300 ng/mL의 농도로 단계 (2)에서 사용된다. SAG, PMA, Shh 단백질 이외의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우에, 상기 언급된 농도 (예를 들어, 5 nM∼50 nM)의 SAG와 동등한 소닉 헤지호그 신호 전달 촉진 활성을 나타내는 농도에서 사용되는 것이 바람직하다.
소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 배지 첨가 시점은 상기 효과를 달성할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 보다 일찍 첨가하는 경우에 더 높은 효과를 얻을 수 있다. 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작으로부터, 일반적으로 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 단계 (2)의 현탁 배양 시작 시에 배지에 첨가된다. 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 단계 (2)의 종료 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 첨가 직전)까지 임의 기간 (예를 들어, 약 24시간, 약 48시간, 단계 (2) 종료까지) 동안 배지에 함유될 수 있다. 일 구체예에서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질과 동시에 첨가되고 단계 (2)의 동일 기간 (예를 들어, 단계 (2)의 종료까지) 동안 배지에 함유된다.
일 구체예에서, 단계 (2)에서 사용되는 배지는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 더 함유할 수 있다. 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고, 제2 단계에서, 제1 단계에서 얻은 세포에 대해서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지) 또는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 그리하여 응집체의 품질을 더 개선시키고, 미분화 상태를 유지하는 세포 응집체 (예를 들어, 구형의, 표면이 부드럽고, 붕괴되지 않고, 내부 조밀한, 미분화 특성을 유지하는 세포의 응집체)가 고효율로 형성될 수 있을 것으로 기대된다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서, 상술된 것들을 사용할 수 있다. 바람직하게는, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 SB431542 또는 A83-01이다. 일 구체예에서, 단계 (1)에서 사용한 것과 동일 종류의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 단계 (2)에서 사용할 수 있다. 배지의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 상기 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 적절하게 결정할 수 있다. SB431542는 일반적으로 0.1∼200 μM, 바람직하게는 2∼50 μM, 보다 바람직하게는 3∼10 μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 일반적으로 0.05∼50 μM, 바람직하게는 0.5∼5 μM의 농도로 사용된다. SB431542 또는 A-83-01 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 사용하는 경우, 상기 언급된 농도의 SB431542의 것과 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 배지 첨가 시점은 상기 효과를 달성할 수있는 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 보다 일찍 첨가하는 경우에 더 높은 효과를 얻을 수 있다. TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작으로부터, 일반적으로 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 단계 (2)의 현탁 배양 시작 시에 배지에 첨가된다. 단계 (2)에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 단계 (2) 종료 (BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 첨가 직전)까지 임의 기간 (예를 들어, 약 24시간, 약 48시간, 단계 (2) 종료까지) 동안 배지에 함유된다. 일 구체예에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질과 동시에 첨가되고 동일 시기 (예를 들어, 단계 (2)의 종료까지) 동안 배지에 함유된다.
단계 (2)에서 사용되는 배지는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 명세서에서, 단계 (1)에서 사용하는 배지가 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 경우, 및 배지 교환 (예를 들어, 대략 전량의 배지 교환) 동안 단계 (1)에서 단계 (2)로 옮겨가는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도가 이의 생물학적 활성 (즉, TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, SB431542의 경우 5 nM 이하)까지 억제되는 경우, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 실질적으로 없는 배지로서 간주될 수 있다. 본 명세서에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 이외의 물질이 또한 유사하게 해석된다. 예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 없는 배지의 배지 교환 작업에 의해, 단계 (1)로부터 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542)의 이월을 단계 (1)에서 사용하는 배지 중 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542) 농도의 3% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.03% 이하, 또는 0.01% 이하로 억제하고, 배지의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도를 이의 생물학적 활성 (즉, TGFβ 신호 전달 경로 억제 활성)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, SB431542의 경우 5 nM 이하)까지 억제하여, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 실질적으로 없는 배지를 얻을 수 있다. 배지 내 성분의 새로운 배지로의 이월은 배지 교환 (예를 들어, 대략 전량의 배지 교환) 동안, 구 배지를 제거하고 세포 및 배양 용기를 1회 또는 다수 회 새로운 배지로 사전 세척하여 최소로 억제할 수 있다.
단계 (2)에서 사용되는 배지는 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 없다. 본 명세서에서, 단계 (1)에서 사용하는 배지가 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 경우, 및 배지 교환 (예를 들어, 대략 전량의 배지 교환) 동안 단계 (1)에서 단계 (2)로 이월되는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 이의 생물학적 활성 (즉, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, SAG의 경우 0.03 nM 이하)까지 억제된 경우, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 없는 배지로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 배지의 배지 교환 작업에 의해서, 단계 (1)로부터 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG)의 이월을 단계 (1)에서 사용하는 배지 중 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 농도의 3% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.03% 이하, 또는 0.01% 이하로 억제하고, 배지의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도를 이의 생물학적 활성 (즉, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, SAG의 경우 0.03 nM 이하)까지 억제하여, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 없는 배지를 얻을 수 있다. 배지 성분의 새로운 배지로의 이월은 배지 교환 (예를 들어, 대략 전량의 배지 교환) 동안, 구 배지를 제거하고 세포 및 용기를 새로운 배지로 1회 또는 다수회 사전 세척하여 최소로 억제할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 인간 세포 (예를 들어, 단계 (1)에서 인간 iPS 세포로부터 얻은 세포)에 대해 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양하여, 응집체를 형성시킨다. 배지는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 더 포함할 수 있다. Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 바람직하게는, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 둘 모두 바람직하게 현탁 배양의 시작 시점부터 배지에 함유된다. ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632)가 역시 배지에 첨가될 수 있다. 단계 (2)에서 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
예를 들어, 단계 (1)에서 얻은 인간 세포 (예를 들어, 단계 (1)에서 인간 iPS 세포로부터 얻은 세포)를 회수하고, 단일 세포 또는 이에 가까운 상태로, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2), 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 분산시키고, 현탁 배양을 수행한다. 이 혈청-무함유 배지는 ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632)를 포함할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)의 현탁액을 상기 언급된 배양 용기에 파종하고 분산된 다능성 줄기 세포를 그들이 배양 용기에 부착하지 않는 조건 하에 배양하여, 다수의 다능성 줄기 세포가 집합되어 응집체를 형성한다. 단계 (2)에서 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 바람직하게는, 단계 (1)에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서 SB431542를 사용할 수 있다. 단계 (2)의 배양시간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
바람직한 일 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 BMP 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 바람직하게는 단계 (1)에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질로서, LDN193189 또는 돌소몰핀, 보다 바람직하게는 LDN193189을 사용할 수 있다. 단계 (2)의 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
바람직한 일 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하고 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 BMP 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 바람직하게는 단계 (1)에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG를 사용할 수 있다. 단계 (2)의 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
바람직일 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포)를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합을 함유하는 배지 중에서 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) (일 구체예에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하지 않음)을 함유하는 배지, 또는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2), 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 단계 (2)의 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
다른 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포)를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01) 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합을 함유하는 배지에서 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 소닉 헤지 호그 시그널 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 배지; 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 배지: 또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 단계 (2)에서 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
다른 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포)를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189)과 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합을 함유하는 배지에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 이후에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)을 함유하는 배지에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 더 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하며, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 배지; 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예 CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 배지: 또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하지 않지만, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 단계 (2)의 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
다른 구체예에서, 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포)를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189)과 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합을 함유하는 배지에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 이후에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)을 함유하는 배지에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 더 배양 (바람직하게는, 부착 배양)하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 현탁 배양을 수행한다. 단계 (2)의 배양 기간은 24시간∼6일, 바람직하게는 24시간∼48시간이다. 형성되는 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
임의 구체예에서, 단계 (2)의 배지는 바람직하게는 ROCK 억제 물질 (예를 들어, Y-27632)을 함유한다.
이러한 방식으로 단계 (2)를 수행함으로써, 단계 (1)에서 얻어진 세포, 또는 이로부터 유래하는 세포의 응집체를 형성시킨다. 본 발명은 이러한 응집체의 제조 방법을 제공한다. 단계 (2)에서 얻은 응집체는 단계 (1)에서 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 처리를 수행하지 않은 경우에 형성된 것보다 높은 품질을 갖는다. 구체적으로는, 예를 들어, 표면이 매끄럽고 내부가 조밀하고, 붕괴되지 않은 형성을 갖는 구형 세포 응집체를 높은 비율로 갖는 응집체 개체군을 얻을 수 있다. 일 구체예에서, 제2 단계의 시작부터 6일에 무작위적으로 응집체 (예를 들어, 100개 이상)를 선택한 경우, 미붕괴 응집체 및/또는 비낭종 응집체의 비율의 합은 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이다.
단계 (2)에서 얻은 응집체는 망막 세포 및 망막 조직 (예를 들어, 망막 조직, 망막 전구 세포 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 갖는다.
일 구체예에서, 단계 (1)에서 얻은, 적어도 망막 세포 및 망막 조직 (예를 들어, 망막 조직, 망막 전구 세포 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 가진 줄기 세포 (바람직하게는, 적어도 망막 세포 및 망막 조직 (예를 들어, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 가진, Oct3/4 양성 줄기 세포)를 단계 (2)에서 사용함으로써, 적어도 망막 세포 및 망막 조직 (예를 들어, 망막 조직, 망막 전구 세포 또는 망막층-특이적 신경 세포)으로 분화하는 능력을 가진 줄기 세포 (바람직하게는 Oct3/4 양성 줄기 세포)를 함유하는 응집체를 얻을 수 있다. 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 적절한 분화 조건 하에서 배양하여 망막 세포 및 망막 조직을 높은 효율로 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체는 단계 (1) 완료 시에 얻은 다능성-유사 특성을 유지하는 (구체적으로는, Oct3/4를 발현하는) 세포와, 망막 세포 및 망막 조직 사이의 중간 단계의 세포에 해당하는 세포를 함유한다. 이들 세포는 (i) 다능성 특성 마커 Oct3/4, 및 (ii) 상기 망막 세포 마커 (Rx, PAX6, Chx10, Crx, Blimp1) 및/또는 상기 망막층-특이적 신경 세포 마커 중 어느 하나를 발현한다. 즉, 일 구체예에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체는 임의의 (i) 다능성 특성 마커 Oct3/4, 및 (ii) 상기 망막 세포 마커 (Rx, PAX6, Chx10, Crx, Blimp1) 및/또는 상기 망막층-특이적 신경 세포 마커를 발현하는 세포의 혼합물을 함유한다. 즉, 단계 (2)에서 얻어진 응집체는 적어도 망막 세포 또는 망막 조직으로 분화하는 능력을 가진 줄기 세포, 및/또는 망막 세포 또는 망막 조직의 전구 세포를 함유한다. 전구 세포는 그들을 공지의 적절한 배양 조건 하에서 배양하는 경우 상기 망막 세포 또는 망막층-특이적 신경 세포 마커를 발현하는 능력 (컴피턴스)을 나타내는 것을 특징으로 한다. 따라서, 일 구체예에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체는 적어도 망막 세포 또는 망막 조직으로 분화하는 능력을 갖는 Oct3/4 양성 줄기 세포 및/또는 망막 세포 또는 망막 조직의 전구 세포를 함유한다. 단계 (2)에서 얻은 응집체에 함유된 세포의 일부는 상기 망막층-특이적 세포 마커를 발현할 수 있다. 일 구체예에서, 단계 (2)에서 얻은 응집체는 전체 세포의 50% 이상, 예를 들어 70% 이상의 비율로 Oct3/4 양성 세포를 함유할 수 있다.
2-3. 단계 (3)
단계 (2)에서 얻은 응집체로부터 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를가 유도되는 단계 (3)에 대해 설명한다.
단계 (3)에서 사용되는 배지 (기초 배지)는 특히 한정되지 않고, 상기 정의에 기술된 기초 배지를 적절하게 선택할 수 있다. 단계 (3)에서 사용되는 배지는 예를 들어, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 보충된 혈청-무함유 배지 또는 혈청 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)이다.
이러한 배지체 사용되는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지는 상술한 바와 같은 것이면 특별히 한정되지 않는다. 복잡한 준비를 피하기 위해서, 예를 들어 시판되는 KSR 등과 갖는 혈청 대체물을 적절한 양으로 첨가한 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 IMDM 및 F-12의 1:1 혼합물의 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포)의 경우에 혈청 배지에 첨가되는 KSR의 양은 일반적으로 약 1% 내지 약 20%이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
단계 (3)에서 사용되는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)로서, 단계 (2)에서 사용한 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)를 직접적으로 사용할 수 있거나, 또는 새로운 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)로 대체할 수도 있다. 단계 (2)에서 사용한 BMP 신호 전달 경로 물질이 없는 혈청-무함유 배지가 단계 (3)에서 직접 사용되는 경우에, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
단계 (3)에 사용하려는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 예는 BMP 단백질 예컨대 BMP2, BMP4, BMP7 등, GDF 단백질 예컨대 GDF7 등, 항-BMP 수용체 항체, BMP 부분 펩티드 등을 포함한다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R & D Systems에서 입수할 수 있고, GDF7 단백질은 예를 들면 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 입수할 수 있다. BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 바람직하게는 BMP4이다.
BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도일 수 있다. 예를 들어, 인간 BMP4의 경우, 약 0.01 nM 내지 약 1 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5 nM (55 ng/mL)의 농도로 배지에 첨가한다. BMP4 이외의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용하는 경우에, 상기 농도의 BMP4와 동등한 BMP 신호 전달 촉진 활성을 발휘하는 농도에서 사용하는 것이 바람직하다.
배지의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 단계 (3) 기간 동안 변화 될 수 있다. 예를 들어, 단계 (3)의 시작 시에 상기 범위 내에 속하도록 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 제공하고, 농도는 2∼4일 당 40∼60%의 비율로 단계적으로 또는 점차적으로 감소될 수 있다. 일 구체예에서, 단계 (3)의 시작부터 소정 기간 (예를 들어, 4∼10일) 동안 소정 농도 (예를 들면, 약 1.5 nM)의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질로 배양하고, 농도는 2∼4일 당 40∼60%의 비율로 단계적으로 또는 점차적으로 감소될 수 있다.
BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 오직 단계 (2)의 현탁 배양의 시작으로부터 약 24시간 또는 그 이후에 첨가될 필요가 있고, 또한 현탁 배양의 시작부터 수 일 이내 (예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 단계 (2)의 현탁 배양의 시작으로부터 1일 내지 15일, 바람직하게는 1일 내지 9일, 1일 내지 8일, 1일 내지 7일, 1일 내지 6일, 1일 내지 5일, 또는 1일 내지 4일, 더욱 바람직하게는 1일 내지 3일의 임의 시점에 배지에 첨가된다. 본 명세서에서 "단계 (2)의 현탁 배양의 시작부터 N일"은 단계 (2)의 현탁 배양 시작 이후 N 일 (N × 24시간 후)에서 N + 1일 ((N + 1) × 24시간)의 진행 직전까지의 기간을 의미한다. 예를 들어, 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작부터 2일은 기준으로서 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작으로부터 48시간에서 72시간의 진행 직전을 의미한다.
특정 구체예에서, 배지는 예를 들어 단계 (2)의 현탁 배양의 시작 이후 1 내지 9일, 바람직하게는 1 내지 3일에, BMP4을 함유하는 배지로 부분적으로 또는 전체적으로 교환하여 BMP4의 최종 농도를 약 1∼10 nM로 조정하고, 세포를 BMP4의 존재 하에서 예를 들면 1∼12일, 바람직하게는 2∼9일, 더욱 바람직하게는 2∼5 일 동안 배양할 수 있다. BMP4의 농도를 동일 수준으로 유지하기 위해, 배지를 BMP4를 함유하는 배지로 1회 또는 2회, 부분적으로 또는 전체적으로 교환할 수 있다. 대안적으로, 상기에 언급된 바와 같이, BMP4의 농도를 단계적으로 감소시킬 수도 있다.
BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 배지에 첨가하고 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화 유도가 시작된 후에, 배지에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가가 필요하지는 않고, 배지는 각각 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지로 교환할 수 있다. 일 구체예에서, 망막 세포로의 분화 유도가 시작된 후, 배지 중 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 배지를 각각 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는, 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지로 교환시켜 2∼4일 당 40∼60%의 비율로 점차적으로 또는 단계적으로 감소시킨다. 망막 세포로의 분화 유도가 시작된 세포는 예를 들어, 세포에서 망막 전구 세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx 유전자 (일명 Rax), Pax6 유전자, Chx10 유전자)의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. 형광발광 리포터 단백질 유전자 예컨대 GFP 등이 Rx 유전자 자리에 넉인된 다능성 줄기 세포를 사용하여 단계 (2)에서 형성된 응집체를 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하고, 발현된 형광 리포터 단백질에서 나오는 형광을 검출함으로써 망막 세포로의 분화 유도가 시작된 시기를 확인할 수도 있다. 단계 (3)의 일 구체예로서, 단계 (2)에서 형성된 응집체를 망막 전구 세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx 유전자 Pax6 유전자 Chx10 유전자)를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하여, 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 단계를 언급할 수 있다.
단계 (3)에서, 배지 교환 작업을 수행하는 경우, 예를 들면, 기존 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 기존 배지의 대략 절반량을 버리고 (기존 배지 부피의 약 40∼80%), 대략 절반량의 새로운 배지 (기존 배지 부피의 40∼80%)를 첨가하는 작업 (배지-절반 교환 작업), 및 대략 전체량의 기존 배지를 버리고 (기존 배지량의 90% 이상), 대량 전량의 새로운 배지 (기존 배지량의 90% 이상)를 첨가하는 작업 (전량 배지 교환 작업)을 언급할 수 있다.
일정 시점에, 특정 성분 (예를 들어, BMP4)을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 기존 배지의 대략 절반량을 버리고, 특정 성분을 최종 농도 보다 높은 농도 (구체적으로는, 최종 농도의 1.5∼3.0 배, 예를 들면 최종 농도의 약 2배)로 함유하는 대략 절반량의 새로운 배지를 추가하는 작업 (배지-절반 교환 작업, 배지-절반 교환)을 수행할 수 있다.
기존 배지에 함유된 특정 성분의 농도가 일정 시점에서 유지되는 경우, 예를 들어 기존 배지의 대략 절반량을 버리고 기존 배지의 것과 동일한 농도로 특정 성분을 함유하는 대략 절반량의 새로운 배지를 첨가하는 작업을 수행할 수 있다.
기존 배지에 함유된 성분의 농도가 일정 시점에 희석으로 감소시키려는 경우, 예를 들어, 배지 교환 작업은 1일 다수회, 바람직하게 1시간 이내에 다수회 (예를 들어, 2 내지 3회) 수행될 수 있다. 또한, 기존 배지에 함유된 성분의 농도를 일정 시점에 희석으로 감소시키려는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 파이펫터, 마이크로파이펫, 멀티채널 마이크로파이펫, 연속 분배기 등을 언급할 수 있다. 예를 들면, 96 웰 플레이트가 배양 용기로서 사용되는 경우, 멀티채널 마이크로파이펫을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (2)에서 배지에 첨가되는 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 비교적 낮은 경우 (예를 들어, SAG의 경우 300 nM 이하, 바람직하게는 30 nM 이하, 더욱 바람직하게는 3 nM 이하이고, 다른 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 경우 상기 농도의 SAG와 동등하거나 또는 그 이하의 Shh 신호 전달 촉진 활성을 부여하는 농도), 배지를 교환할 필요는 없고, 단계 (2)에서 사용되는 배지에 BMP 신호 전달 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 첨가하면 된다. 다른 한편, Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 상대적으로 높은 경우 (예를 들어, SAG의 경우 700 nM 이상, 또는 1000 nM 이상, 및 다른 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 경우 상기 농도의 SAG와 동등한 Shh 신호 전달 촉진 활성을 부여하는 농도)에는, BMP 신호 전달 활성화 물질이 첨가될 때 잔존하는 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 영향을 억제하기 위해 BMP 신호 전달 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하고 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 새로운 배지로 배지를 교환하는 것이 바람직하다.
바람직일 구체예에서, 단계 (3)에서 사용되는 배지의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 망막 전구 세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 주지 않는 농도이다. 구체적으로는, SAG의 Shh 신호 전달 촉진 활성에 대해서 계산 시, 700 nM 이하, 바람직하게는 300 nM 이하, 보다 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 nM 이하, 더 더욱 바람직하게는 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 없다. "Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 없는 배지"는 배지의 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도가 이의 생물학적 활성 (즉, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, SAG의 경우, 0.03 nM 이하)까지 억제되는 배지를 의미한다. "Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는" 배지는 또한 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 실질적으로 보충되지 않은 배지, 예를 들어 이의 생물학적 활성 (즉, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화)이 발현되는 농도로, 즉, 망막 전구 세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 미치는 농도로 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질이 보충되지 않은 배지를 포함한다.
단계 (3)에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)에서 배양한다. 즉, 단계 (3)에서 사용하는 배지는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4) 이외에, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유할 수도 있거나 또는 함유하지 않을 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)에서 배양한다. 즉, 이러한 구체예에서, 단계 (3)에서 사용하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4) 및 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유한다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서, 임의의 상기 언급된 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (2)에서 사용되는 것과 동일한 종류의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 단계 (3)에서 사용된다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 망막 전구 세포 및 망막 조직을 유도할 수 있는 농도인 것이 필요하다. 예를 들어, IWR-1-엔도는 농도가 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 바람직하게는 약 0.3 μM 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 약 1 μM 내지 10 μM, 더욱 바람직하게는 약 3 μM이 되도록 배지에 첨가된다. IWR-1-엔도 이외의 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 사용하는 경우에는, 상기 농도의 IWR-1-엔도의 것과 동등한 Wnt 신호 전달 경로 억제 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 단계 (3)의 배지에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 단계 (2)의 배지에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 농도를 100이라고 할 때, 바람직하게는 50∼150, 보다 바람직하게는 80∼120, 더욱 바람직하게는 90∼110이고, 단계 (2)의 배지에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 농도와 동등한 것이 보다 바람직하다.
배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기는 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체가 형성될 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 보다 일찍 첨가하는 것이 더 바람직하다. 바람직하게는. 단계 (3)의 시작 시에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 배지에 첨가한다. 보다 바람직하게는. 단계 (2)에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가되고 단계 (3)에서도 계속해서 (즉, 단계 (3)의 시작에서) 배지에 함유된다. 더욱 바람직하게는, 단계 (2)의 현탁 배양 시작 시에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가되고 단계 (3)에서 계속해서 배지에 함유된다. 예를 들어, 단계 (2)에서 얻어진 배양물 (Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중 응집체의 현탁액)에 BMP 신호 전달 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)이 첨가된다.
Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 작용 기간은 상기 효과를 달성할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 단계 (2)에서 현탁 배양 시작 시에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가되는 경우, 그 기간은 단계 (2)의 현탁 배양 시작시간을 출발점으로 하여, 2일 내지 30일, 보다 바람직하게는 6일 내지 20일, 8일 내지 18일, 10일 내지 18일, 또는 10일 내지 17일 (예를 들어, 10일)이다. 다른 구체예에서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작 시점에 첨가되는 경우에, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 작용하는 기간은 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작 시간을 출발점으로 하여, 바람직하게 3일 내지 15일 (예를 들어, 5일, 6일, 7일), 보다 바람직하게는 6일 내지 10일 (예를 들어, 6일)이다.
일 구체예에서, 단계 (3)에서 사용되는 배지는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 더 함유할 수 있다. 특히, 단계 (2)의 현탁 배양에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지를 사용하는 경우, 단계 (3)에서도 역시 계속하여 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서, 임의의 상기 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 단계 (2)에서 사용한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질과 동일한 종류의 것을 단계 (3)에서 사용한다.
TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 망막 전구 세포 및 망막 조직을 유도할 수 있는 것이어야 한다. 예를 들어 SB431542는 일반적으로 0.1∼200 μM, 바람직하게는 2∼50 μM, 보다 바람직하게는 3∼10 μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 일반적으로 0.05∼50 μM, 바람직하게는 0.5∼5 μM의 농도로 사용된다. SB431542 또는 A-83-01 이외의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 사용하는 경우에, 상기 농도의 SB431542와 동등한 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 단계 (3)의 배지의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 단계 (2)의 배지의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도가 100일 때, 바람직하게는 50∼150, 보다 바람직하게는 80∼120, 더욱 바람직하게는 90∼110이며, 단계 (2)의 배지의 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도와 동등한 것이 보다 바람직하다.
배지에 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기 및 작용 기간은 망막 세포 또는 망막 조직을 포함 응집체 형성을 달성할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 단계 (2)에서 현탁 배양의 시작 시에 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가되는 경우, 단계 (2)에서 현탁 배양 시작시간을 출발점으로 하여, 바람직하게 2일 내지 30일, 보다 바람직하게는 6일 내지 20일, 8일 내지 18일, 10일 내지 18일, 또는 10일 내지 17일 (예를 들어, 10일)이다. 바람직한 구체예에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기 및 노출 기간은 상기 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 시기 및 작용 기간과 동일하다. 즉, 구체예에서, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질과 동시에 배지에 첨가되어 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질과 같은 기간 동안 배지에 함유된다.
예를 들어, 단계 (1)에서 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻어진 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지), 또는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 (바람직하게는 혈청 배지)에서 현탁 배양하여 응집체를 형성시키고, 단계 (3)에서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 하에 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)에서 배양한다. 즉, 이러한 구체예에서, 단계 (3)에서 사용하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지)는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4), TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유한다.
일 구체예에서, 단계 (3)의 현탁 배양 후, 단계 (3)의 배지를 외생성 BMP 신호 전달 활성화 물질이 실질적으로 없고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로 교환하고 현탁 배양을 계속할 수 있다. 단계 (1)에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지이고, 임의로 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 더 함유함) 중에서 현탁 배양하여 응집체를 형성시키고, 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지이고, 임의로 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 더 함유할 수 있음) 중에서 소정 기간 동안 배양하고, 배지를 외생성 BMP 신호 전달 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)이 실질적으로 없고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로 교환하여 배양을 계속한다. 즉, 이러한 구체예에서, 단계 (3)의 배양 후, 배지는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 배지 (바람직하게는, 혈청-무함유 배지이고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 더 함유할 수 있음)에서 외생성 BMP 신호 전달 활성화 물질이 실질적으로 없고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로 교환된다.
혈청으로서, 예를 들어, 포유동물의 혈청 예컨대 소 혈청, 송아지 혈청, 소 태아 혈청, 말 혈청, 새끼말 혈청, 말 태아 혈청, 토끼 혈청, 새끼 토끼 혈청, 토끼 태아 혈청, 인간 혈청 등을 사용할 수 있다. 혈청은 약 1∼30%, 바람직하게는 약 3∼20%, 보다 바람직하게는 약 10%의 농도로 첨가된다. 이러한 구체예에서, 적정량의 혈청 대체물 예컨대 시판되는 KSR 등을 혈청 대신 사용할 수도 있다.
소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서, 임의의 상기 언급된 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용할 수 있고, 바람직하게는 SAG이다. 예를 들면, SAG의 경우에, 일반적으로 약 0.1 nM∼10 μM, 바람직하게는 약 10 nM∼1 μM, 보다 바람직하게는 약 100 nM의 농도로 첨가된다.
단계 (3)으로부터 이월되는 BMP 신호 전달 작용 물질 (예를 들어, BMP4)의 농도가 이의 생물학적 활성 (즉, BMP 신호 전달 활성)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, BMP4 경우, 0.01 nM 미만의 농도)까지 억제되는 경우에, BMP 신호 전달 활성화 물질이 실질적으로 없는 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, BMP 신호 전달 작용 물질이 없는 배지를 사용한 배지 교환 작업에 의해서, 단계 (3)으로부터 BMP 신호 전달 작용 물질 (예를 들어, BMP4)의 이월이 단계 (3)에서 사용하는 배지의 BMP 신호 전달 작용 물질 (예를 들어, BMP4) 농도의 3% 이하, 바람직하게는 1% 이하, 0.3% 이하, 0.1% 이하, 0.03% 이하, 또는 0.01% 이하로 억제되고, 배지의 BMP 신호 전달 활성화 물질 농도는 이의 생물학적 활성 (즉, BMP 신호 전달 활성)이 발현되지 않는 수준 (예를 들어, BMP4 경우 0.01 nM 미만의 농도)까지 억제되어서, BMP 신호 전달 활성화 물질이 실질적으로 없는 배지를 얻을 수 있다.
일 구체예에서, 외생성 BMP 신호 전달 활성화 물질이 실질적으로 없고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로의 교환은 현탁 배양 (단계 (2))의 시작으로부터, 7일 이후, 보다 바람직하게는 9일 이후 (예를 들어, 10일)에 수행된다. 여기서, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로의 교환은 또한 신경상피의 형성이 시작될 때 수행할 수 있다. 신경상피의 형성은 현미경을 사용한 명시야 이미지 관찰을 통해 세포의 형상· 배열을 관찰하여 확인할 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청을 함유하는 배지로 교체한 후 3일 내지 20일, 바람직하게는 5일 내지 15 일, 7일 내지 10일 동안 배양한다.
본 발명의 방법에서, 바람직하게, 현탁 배양은 기저막 제제의 부재 하에서 단계 (2) 및 단계 (3)을 통해 수행된다.
단계 (3)에서 배양 조건 예컨대 배양 온도, CO2 농도 등은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
이러한 배양에 의해서, 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 형성하는 세포에서 망막 전구 세포로의 분화가 유도되고, 그리하여 망막 전구 세포를 함유하는 응집체를 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 망막 전구 세포를 함유하는 이러한 응집체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 망막 전구 세포를 포함하는 응집체가 얻어진 것은 예를 들어, 응집체에서, 망막 전구 세포 마커인 Rx, PAX6 또는 Chx10을 발현하는 세포의 존재를 검출하여 확인할 수 있다. 단계 (3)의 일 구체예는 Rx 유전자를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 망막 세포로 분화 유도하는데 필요한 농도로 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 단계 (2)에서 형성된 응집체를 현탁 배양하고, 그리하여 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 단계이다. 일 구체예에서, 단계 (3)의 배양은 응집체에 함유된 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상)이 Rx를 발현할 때까지 수행된다. 이러한 구체예에서, Rx 발현 세포는 바람직하게는 Chx10을 공동 발현한다.
일 구체예에서, 단계 (3)에서 얻은 응집체는 망막 조직을 함유하고 비신경 두부 외배엽이 실질적으로 없다. 망막 조직을 함유하고 비신경 두부 외배엽이 실질적으로 없는 응집체는, 예를 들어 상기 응집체 동결절편의 면역염색 이미지에서 Rx-양성 조직이 관찰되고 Rx-음성 조직은 이의 외측에서 관찰되지 않는다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에 있어서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포 부재 하에 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예 SB431542, A-83-01) 및 bFGF을 함유하는 혈청 배지 중에서 바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 부착 배양하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 의 존재 하에, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하지 않거나 또는 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 현탁 배양하고, 단계 (3)에서, 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들면, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 현탁 배양한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에 있어, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에, BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 및 bFGF를 함유하는 혈청-무함유 배지에서 바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 부착 배양하고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 의 존재 하에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면 SAG, PMA)을 함유하지 않거나 또는 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 현탁 배양시키고, 단계 (3)에서, 응집체는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양시킨다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에 있어서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면, SAG, PMA) 및 bFGF를 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 바람직하게는 2∼96시간, 6∼72시간, 6∼60시간, 12∼60시간, 18∼60시간, 18∼48시간 또는 18∼28시간 (예를 들어, 24시간) 동안 부착 배양시키고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476 , IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)의 존재 하에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면 SAG, PMA)을 함유하지 않거나 또는 함유하는 혈청 배지 중에서 현탁 배양시키며, 단계 (3)에서, 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양시킨다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합; 및 bFGF을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 부착 배양시키고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않음) 중에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 단계 (3)에서, 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면 BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)를 함유하거나 또는 함유하지 않음)에서 현탁 배양하여 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포) 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 얻는다.
단계 (2)의 배지는 바람직하게는 ROCK 억제 물질 (예를 들어, Y-27632)을 함유한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합; 및 bFGF을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 부착 배양, 및 이후에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 및 bFGF을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 18시간∼30시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 부착 배양시키고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)을 함유하거나 또는 함유하지 않음) 중에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 단계 (3)에서, 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01)를 함유하거나 또는 함유하지 않음) 중에서 현탁 배양하여 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포) 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
단계 (2)의 배지는 바람직하게는 ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632)를 함유한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합; 및 bFGF를 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 부착 배양시키고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 혈청-무함유 배지 또는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질)을 함유하거나 또는 함유하지 않음) 중에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 단계 (3)에서, 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들면, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지에서 10일 동안 현탁 배양하고, 배지를 외생성 BMP 신호 전달 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하지 않고 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG) 및 혈청을 함유하는 배지로 교환하고 현탁 배양을 계속하여 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포) 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 얻는다.
단계 (2)의 배지는 바람직하게는 ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632)를 함유한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구체예에서, 단계 (1)에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포)를 피더 세포의 부재 하에 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), 노달/액티빈 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, LDN193189) 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA)의 조합; 및 bFGF을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 부착 배양시키고, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 얻은 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 의 존재 하에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키고, 단계 (3)에서 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2) 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들면 BMP4)의 존재 하에 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty)을 함유하는 혈청-무함유 배지 중에서 현탁 배양하여 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포) 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 얻는다.
단계 (2)의 배지는 바람직하게는 ROCK 억제제 (예를 들어, Y-27632)를 함유한다.
망막 전구 세포를 함유하는 얻어진 응집체는 그대로 독성 또는 약효 평가를 위한 시약으로서 사용할 수 있다. 망막 전구 세포를 함유하는 응집체를 분산 처리 (예를 들면, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리)하고, 얻은 세포를 FACS 또는 MACS를 사용하여 선별하여서, 고순도의 망막 전구 세포를 얻을 수 있다.
게다가, 상기 단계 (1)∼단계 (3)에서 얻은 망막 전구 세포를 함유하는 응집체를 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 연속하여 배양하여 망막 전구 세포가 더욱 분화되게 하여, 신경상피 구조-유사 망막 조직을 제조할 수 있다.
이러한 배지 (기초 배지)는 특별히 한정되지 않고, 상기 정의에서 기술된 기초 배지가 적절하게 선택될 수 있다. 이러한 배지에 사용되는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지는 상기 언급된 바와 같으면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 10% 소 태아 혈청, N2 보충제, 100 μM 타우린 및 500 nM 레티노산이 보충된 DMEM-F12 배지인 혈청-함유 배지 또는 시판되는 혈청 대체물 예컨대 KSR 등이 적절한 양으로 보충된 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 IMDM과 F-12의 1:1 혼합물 배지) 등을 언급할 수 있다.
망막 전구 세포로부터 망막 조직을 유도하기 위한 배양 기간은 의도하는 망막층-특이적 신경 세포에 따라서 다양하지만, 예를 들어 약 7일 내지 200일이다.
망막 조직은 응집체의 표면을 덮도록 존재한다. 현탁 배양의 완료 후, 응집체를 고정제 예컨대 파라포름알데히드 용액 등으로 고정할 수 있고, 동결절편을 제조하여, 층구조를 갖는 망막 조직의 형성을 면역염색 등으로 확인할 수 있다. 망막 조직의 개별 층은 상이한 망막 전구 세포 (광수용기 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포)로 구성되므로, 층구조의 형성은 면역염색에 의해 이들 세포에서 발현되는 상기 마커에 대한 항체를 사용해 확인할 수 있다. 일 구체예에서, 망막 조직은 Rx- 또는 Chx10-양성 신경상피 구조이다.
응집체의 표면에 존재하는 망막 조직을 핀셋 등을 사용하여 응집체로부터 물리적으로 절제할 수 있다. 이 경우에서, 망막 조직 이외의 신경 조직은 각 응집체의 표면에 형성될 수 있으므로, 응집체로부터 절제된 신경 조직의 일부를 잘라내어 하기 언급하는 면역염색 등에 의해 확인하여, 조직이 망막 조직이라는 것을 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (3)에서 얻어지는 응집체는 망막 조직을 함유하고 실질적으로 비신경 두부 외배엽이 없다. 망막 조직을 함유하고 비신경 두부 외배엽이 실질적으로 없는 응집체에서, 예를 들어 상기 응집체 동결절편의 면역염색 이미지에서 이의 외측상에 Rx-음성 조직은 관찰되지 않고 Rx-양성 조직은 관찰된다.
단계 (3)의 일 구체예는 단계 (2)에서 형성된 응집체를 망막 전구 세포를 포함하는 응집체가 제공되도록, Rx 유전자 및/또는 Chx10 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 (상기 언급한 바와 같이, 임의로 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유) 중에서 현탁 배양하고, 후속하여 망막 조직이 형성될 때까지 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 망막 전구 세포를 함유하는 응집체를 현탁 배양하여, 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는 단계이다. 망막 전구 세포를 함유하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지 후속하여 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하는 경우, 망막 전구 세포를 유도시키기 위해서 배지 중 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 각각 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질 (예를 들어, BMP4)이 없는, 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지로 배지를 교환하여 2∼4 일 당 40∼60%의 비율로 점차적으로 또는 단계적으로 감소될 수 있다. 이러한 경우에서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질과 같은 비율로 감소될 수 있으며, 바람직하게는 일정한 수준으로 유지시킬 수 있다. 일 구체예에서, 망막 전구 세포를 함유하는 응집체의 현탁 배양은 응집체에 함유된 세포의 20% 이상 (바람직하게는 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상)이 Chx10을 발현할 때까지 수행된다.
단계 (3)의 일 구체예에서, 단계 (2)에서 얻은 응집체, 또는 단계 (2)에서 얻어진 응집체를 상기 방법으로 현탁 배양하여 얻은 응집체는 부착 배양되어 부착된 응집체를 형성할 수 있다. 부착된 응집체는, 망막 전구 세포를 함유하는 부착된 응집체를 제공하도록, Rx 유전자 및/또는 Chx10 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 (이 배지는 임의로 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 함유함) 중에서 부착 상태로 배양된다. 망막 전구 세포를 함유하는 응집체는 망막 조직이 형성될 때까지 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부착된 상태로 계속 배양되어서, 망막 조직을 함유하는 응집체가 얻어진다. 일 구체예에서, 망막 전구 세포를 함유하는 응집체의 부착 배양은 세포의 10% 이상 (바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상)이 Chx10을 발현할 때까지 수행된다.
본 발명의 제조 방법에 의해, 망막 조직은 고효율로 다능성 줄기 세포로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 망막 조직은 각각의 망막층에 특별한 뉴런 (뉴런 세포)을 함유하므로, 망막 조직, 예컨대 광수용기 세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 또는 이의 전구 세포 등을 구성하는 세포를 얻는 것이 또한 가능하다. 어떠한 세포가 얻어진 망막 조직으로부터 얻어졌는지는 자체 공지된 방법, 예를 들어, 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
망막 조직을 함유하는 얻어진 응집체는 또한 독성 또는 효능을 평가하기 위한 시약으로서 직접 사용할 수 있다. 망막 조직을 함유하는 응집체를 분산 처리 (예를 들면, 트립신/EDTA 처리)하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS를 사용하여 선별하여, 고순도의 망막 조직 구성 세포, 예를 들어 고순도의 광수용기 세포를 얻는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 제조 방법, 즉 상기 단계 (1)∼단계 (3)에서 얻은 망막 조직을 함유하는 세포 응집체로부터 공지의 방법 (예를 들면, WO15/087614), 구체적으로는 하기의 단계 (A) 및 단계 (B)에 의해서, 모양체 주변부-유사 구조를 함유하는 망막 조직을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (1)∼(3)에서 얻은 망막 조직을 함유하는 세포 응집체인 응집체로서, 단계 (2)의 현탁 배양의 시작으로부터 6∼30일, 10∼20일 (10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일)에 망막 조직을 함유하는 세포 응집체로부터 하기 단계 (A) 및 단계 (B)에 의해 모양체 주변부-유사 구조체를 제조할 수 있다.
본 명세서에서 모양체 주변부-유사 구조는 모양체 주변부와 유사한 구조를 의미한다. "모양체 주변부 (ciliary marginal zone; CMZ)"의 예는 망막의 조직 줄기 세포 (망막 줄기 세포)를 함유하는 영역인, 생체 내 망막에서 망막 조직 (특히, 신경 망막)과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직을 포함한다. 모양체 주변부는 모양체 주변 또는 망막 주변이라고도 하고, 모양체 주변부, 모양체 주변 및 망막 주변은 동등한 조직이다. 모양체 주변부는 망막 조직에 망막 전구 세포 또는 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 모양체 주변부의 마커 유전자의 예는 Rdh10 유전자 (양성) 및 Otx1 유전자 (양성) 및 Zic1 (양성) 등을 포함한다.
단계 (A)는 본 발명의 제조 방법, 즉 단계 (1)∼단계 (3)에 의해 얻은 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로서, Chx10 양성 세포가 망막 조직의 20% 이상 및 100% 이하의 비율로 존재하는 것인 세포 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질, 및/또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 각각 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 RPE65 유전자-발현 세포의 출현 이전 기간 동안만 배양하는 단계를 포함한다.
여기서, 단계 (A)의 바람직한 배양으로서, 현탁 배양을 언급할 수 있다.
단계 (A)에서 사용하는 혈청 배지로서, N2 또는 KSR이 보충된 기초 배지인 혈청-무함유 배지를 언급할 수 있다. 보다 구체적으로, N2 보충물 (Life Technologies 제품)이 보충된 DMEM/F-12 배지인 혈청-무함유 배지를 언급할 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 소 태아 혈청이 보충된 기초 배지인 혈청-함유 배지를 언급할 수 있다.
단계 (A)의 배양 조건 예컨대 배양 온도, CO2 농도 등을 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃의 범위, 바람직하게는, 예를 들어, 대략 37℃ 주변이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%의 범위, 바람직하게, 예를 들어 약 5% 주변이다.
단계 (A)에서, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를 배지 중에 배양할 때, 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 함유되는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질은 Wnt에 의해 매개되는 신호 전달이 증강될 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 구체적인 예는 Wnt 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체, Wnt 수용체 효현제, GSK3β 억제제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, 켄파울론) 등을 포함한다.
통상의 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 예컨대 CHIR99021의 경우에서 단계 (A)에서 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에 함유되는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 예를 들어, 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 범위, 바람직하게는, 예를 들어 약 1 μM 내지 약 30 μM의 범위, 보다 바람직하게는, 예를 들어 3 μM 전후이다.
상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를 배지에서 배양할 때 단계 (A)에서 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에 함유되는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질은 FGF에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. FGF 신호 전달 경로 억제 물질의 예는 FGF 수용체, FGF 수용체 억제제 (예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나제 캐스케이드 억제제 (예를 들어, MEK 억제제, MAPK 억제제 ERK 억제제), PI3 키나제 억제제, Akt 억제제 등을 포함한다.
단계 (A)에서 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에 함유된 FGF 신호 전달 경로 억제 물질의 농도는 모양체 주변부-유사 구조로 응집체의 분화를 유도할 수 있는 농도여야 한다. 예를 들어, SU-5402의 경우, 배지에 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30 μM, 보다 바람직하게는 약 5 μM의 농도로 첨가된다.
단계 (A)에서 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현 전 기간 동안만 배양"은 RPE65 유전자-발현 세포의 출현 전 기간 전체 또는 일부에서만의 배양을 의미한다. 즉, 배양 시스템에 존재하는 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"가 RPE65 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 세포로 구성되어 있는 동안, 그 기간의 전체 또는 일부 (임의 기간)에서만의 배양이면 충분하다.
이러한 특정 기간을 결정하기 위해서, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"는 샘플로서 사용되며, 샘플에 함유된 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 이의 수준은 일반적인 유전자 조작 방법 또는 생화학 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로, 예를 들면, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"의 동결절편에 대해서 RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역염색 방법을 수행해서 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 이의 수준을 조사할 수 있다.
단계 (A)에서 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현전 기간"으로서, 예를 들어 상기 망막 조직에 존재하는 Chx10 양성 세포의 비율이 각각 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 상기 세포 응집체의 배양 시작 시점에 비해 감소되어, 30% 내지 0%의 범위가 될 때까지의 기간을 언급할 수 있다. "RPE65 유전자-발현 세포가 출현하지 않은 세포 응집체"는 Chx10 양성 세포가 상기 망막 조직에서 조직의 30% 내지 0%의 비율로 존재하는 세포 응집체를 언급할 수 있다.
단계 (A)에서 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현전 기간"의 일수는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질의 종류, 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 다양하지만, 예를 들어, 14일 이내이다. 보다 구체적으로는 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 기초 배지에 N2가 보충된 혈청-무함유 배지)가 사용되는 경우, 상기 기간은 바람직하게, 예를 들어 10일 이내 (예를 들면, 단계 (2)의 시작을 출발점으로 하여, 약 20일부터 10일 이내), 보다 바람직하게는, 예를 들어 3일 내지 6일이다. 혈청-함유 배지 (예를 들어, 기초 배지에 소 태아 혈청이 보충된 혈청-함유 배지)가 사용되는 경우, 상기 기간은 바람직하게는, 예를 들어 12일 이내 (예를 들면, 단계 (2)의 시작을 출발점으로 한 경우, 약 20일부터 12일 이내), 보다 바람직하게는, 예를 들어, 6일 내지 9일이다.
다음으로, 단계 (B)로서, 상기 언급한 바와 같이 얻어진 "RPE65 유전자-발현 세포가 출현하지 않은 세포 응집체"는 각각이 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 배양된다.
단계 (B)에서 바람직한 배양으로서, 현탁 배양을 언급할 수 있다.
단계 (B)의 혈청-무함유 배지는 바람직하게는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질이 없다.
단계 (B)에서 혈청-무함유 배지로서, 기초 배지에 N2 또는 KSR이 보충된 배지를 언급할 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 기초 배지에 소 태아 혈청이 보충된 배지를 언급할 수 있다. 보다 구체적으로는 DMEM/F-12 배지에 소 태아 혈청이 보충된 혈청-함유 배지를 언급할 수 있다.
단계 (B)에서 상기 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지는 성장을 촉진하는 기지 성장 인자, 첨가제 및 화학 물질 등을 함유할 수 있다. 기지 성장 인자의 예는 EGF, FGF, IGF, 인슐린 등을 포함한다. 성장을 촉진하는 첨가제의 예는 N2 보충물 (Life Technologies 제품), B27 보충물 (Life Technologies 제품), KSR (Life Technologies 제품) 등을 포함한다. 성장을 촉진하는 화학 물질의 예는 레티노이드류 (예를 들어, 레티노산) 및 타우린을 포함한다.
단계 (B)에서 바람직한 배양 기간은 예를 들어, 상기 망막 조직에 존재하는 Chx10 양성 세포의 비율이 각각 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질이 없는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 상기 세포 응집체의 배양 시작 시점에 비해 증가되고, 30% 또는 그 이상에 도달하는 배양 시기이다. 구체적으로는, 예를 들어, 출발점을 단계 (A)의 시작으로 하여, 약 3일로부터, 약 3일∼60일, 바람직하게는 약 35일, 약 3일을 언급할 수 있다.
단계 (B)에서 배양 조건 예컨대 배양 온도, CO2 농도 등은 적절하게 설정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃의 범위, 바람직하게는, 예를 들어 대략 약 37℃이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%의 범위, 바람직하게는 예를 들어 대략 약 5%이다.
단계 (B) "모양체 주변부-유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"가 얻어질 때까지 상기 배양 일수가 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 다양하지만, 예를 들어, 100일 이내이다. 상기 배양 일수는 바람직하게, 예를 들어 20일 내지 70일, 보다 바람직하게, 예를 들어 30일 내지 60일이다.
상기 단계 (A), (B)에 의해 제조된 "모양체 주변부-유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"에서, 동일 세포 응집체 내에서 모양체 주변부-유사 구조체에 인접하여 망막 색소 상피 및 망막 조직 (특히, 신경 망막)이 존재한다. 구조는 현미경 관찰 등으로 확인할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 현미경 관찰을 통해서, 높은 투명도를 갖는 망막 조직과 색소침착을 보이는 망막 색소 상피 사이에 형성되는, 두꺼운 망막 측면 및 얇은 망막 색소 상피 측면을 갖는 상피 구조로서 모양체 주변부-유사 구조의 존재를 확인할 수 있다. 또한, 모양체 주변부-유사 구조의 존재는 응집체의 동결절편의 면역염색을 통해 Rdh10 양성, Otx1 양성, 또는 Zic1 양성 세포를 식별하여 확인할 수 있다.
추가 구체예에서, 상기 단계 (A), (B)에 의한 응집체에 함유된 망막 조직 (신경상피)의 분화가 진행되고, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 추상 광수용기 세포, 간상 광수용기 세포, 수평 세포, 개재 뉴런 (아마크린 세포, 신경 세포 등)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 복수, 더욱 바람직하게는 모든 세포를 함유하는 성숙한 망막 조직 및 상기 세포를 생산할 수 있다.
망막 색소 상피 세포를 함유하는 망막 조직은 본 발명의 제조 방법, 즉 상기 단계 (1)∼단계 (3)에 의해 얻어진 망막 조직을 함유하는 세포 응집체로부터 하기 단계 (C)에 의해 제조될 수 있다. 망막 색소 상피 시트는 하기 단계 (C)에서 얻은 망막 색소 상피 세포로부터 하기 단계 (D)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 "망막 색소 상피 세포"는 생체 내 망막에서 신경 망막 조직의 외부에 존재하는 상피 세포를 의미한다. 그것이 망막 색소 상피 세포인지 여부는 예를 들어, 세포 마커 (RPE65 (성숙한 망막 색소 상피 세포), Mitf (미숙 또는 성숙한 망막 색소 상피 세포) 등)의 발현, 멜라닌 과립의 존재, 다각형의 특징적인 세포 형태 등을 기초로 하여 당업자가 확인할 수 있다.
먼저, 단계 (C)에서, 본 발명의 제조 방법으로 얻은 망막 조직을 함유하는 세포 응집체를 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 없지만 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 현탁 배양하여 망막 색소 상피 세포를 함유하는 응집체를 얻는다.
단계 (C)에서 사용하는 혈청-무함유 배지로서, 기초 배지에 N2 또는 KSR가 보충된 혈청-무함유 배지를 언급할 수 있다. 보다 구체적으로는 DMEM/F12 배지에 N2 보충물 (Life Technologies 제품)이 보충된 혈청-무함유 배지를 언급할 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 기초 배지에 소 태아 혈청이 보충된 혈청-함유 배지를 언급할 수 있다.
단계 (C)에서 사용하는 혈청-무함유 배지는 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 이외에도, 상기 노달/액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질 및/또는 상기 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유할 수 있다.
단계 (C)에서 바람직한 배양은 현탁 배양이다.
본 발명의 단계 (C)에서 얻은 응집체를 분산시키고 얻은 세포를 부착 상태로 배양하는 단계 (D)를 설명한다.
단계 (D)는 단계 (C)의 시작 이후, 60일 이내, 바람직하게는 30일 이내, 보다 바람직하게는 3일에 수행된다.
단계 (D)에서 배지 (기초 배지)는 특별히 한정되지 않고, 상기 정의에서 기술하는 기초 배지가 적절하게 선택될 수 있다. 단계 (D)에서 부착 배양을 위해 사용되는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지로서, 상기 배지들을 언급할 수 있다. 복잡한 제조를 피하기 위해서, 적절한 양의 시판되는 혈청 대체물 예컨대 KSR 등이 보충된 혈청-무함유 배지 (예를 들어, 1/2 x N2 보충물, 1/2 x B27 보충물 및 100 μM 2-머캅토에탄올이 보충된 DMEM/F-12 및 Neurobasal의 1:1 혼합물 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 혈청-무함유 배지에 첨가되는 KSR의 양은 인간 iPS 세포로부터 유래된 세포의 경우에, 예를 들어, 일반적으로 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
단계 (D)에서, ROCK 억제 물질을 함유하는 상기의 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
단계 (D)에서, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질, FGF 신호 전달 경로 억제 물질, 액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질 및 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 더 함유하는 혈청-무함유 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 세포를 배양하는 것이 보다 바람직하다.
액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질은 액티빈에 의해 매개되는 신호를 증강할 수 있는 물질이다. 액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질의 예에는 액티빈 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB 등), 액티빈 수용체, 및 액티빈 수용체 효현제가 포함된다.
단계 (D)에서 사용되는 액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 망막 색소 상피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도라면 임의 농도일 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간/마우스/래트 액티빈 A (R & D systems, # 338-AC)는 약 1 ng/mL 내지 약 10 μg /mL, 바람직하게는 약 10 ng/mL 내지 약 1 μg /mL, 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL의 농도로 첨가된다. 액티빈 신호 전달 경로 활성화 물질은 단계 (D)의 시작으로부터, 예를 들어, 18일 이내, 바람직하게는 6일에 첨가된다.
단계 (D)에서, 부착 배양은 바람직하게 그 표면이 배양 기질로 처리된 배양 용기 상에서 수행된다. 단계 (D)에서 배양 용기의 처리를 위해 사용되는 배양 기질로서, 응집체-유래 세포의 부착 배양 및 망막 색소 상피 시트의 형성을 가능하게 하는 세포 배양 기질을 언급할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 단계 (1)∼단계 (3) 이외에도 단계 (A) 및 단계 (B) 또는 단계 (C) 및 단계 (D)를 함유하는 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법이 또한 본 발명의 범주에 속한다. 단계 (3)은 상기 단계 (A) 및 단계 (B) 또는 단계 (C) 및 단계 (D) 등을 포함할 수 있다.
4. 독성 또는 효능을 평가하기 위한 방법
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 약물의 스크리닝, 또는 독성 평가에서 질환 연구 또는 약물 개발용 재료로서 유용하므로, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 망막 조직의 장애에 따른 질환, 특히 유전 질환이 있는 인간 환자로부터 iPS를 제조하고, 이 iPS 세포를 사용하여, 본 발명의 방법에 의해 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)를 제조한다. 망막 조직 또는 망막 세포는 시험관내에서 환자의 질환을 야기하는 망막 조직의 장애를 재현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)와 시험 물질을 접촉시키는 단계, 및 세포 또는 조직에 대한 물질의 영향을 검출하는 단계를 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 특정 장애 (예를 들어, 유전성 장애)를 갖는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)를 시험 물질의 존재 또는 부재 (음성 대조군) 하에서 배양한다. 이후에, 시험 물질을 처리한 망막 조직 또는 망막 세포의 장애 중증도를 음성 대조군의 것과 비교한다. 그 결과로, 장애의 중증도를 감소시킨 시험 물질이 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 약물의 후보 물질로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제조 방법으로 제조한 망막 세포의 생리적 활성 (예를 들어, 생존 촉진 또는 성숙화)을 향상시키는 시험 물질은 약학 생성물의 후보 물질로서 조사될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제조 방법에 따라서, 망막 세포는 특정 장애 예컨대 망막 질환 등을 야기하는 유전자 돌연변이를 갖는 체세포로부터 제조된 유도 다능성 줄기 세포의 분화를 유도시켜 제조된다. 장애에 대한 약물 또는 예방적 약물로서 유효한 시험 물질의 후보를 시험 물질이 첨가된 망막 세포가 지표로서 상기 장애를 나타내는지 여부를 기초로 조사할 수 있다.
독성 평가를 위해, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)를 시험 물질의 존재 또는 부재 (음성 대조군) 하에서 배양한다. 그후, 시험 물질로 처리된 망막 조직 또는 망막 세포에 대한 독성의 중증도를 음성 대조군과 비교한다. 그 결과로서, 음성 대조군과 비교하여 독성을 나타내는 시험 물질은 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)에 대해 독성을 갖는 물질로서 판단될 수 있다.
즉, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 독성 평가 방법을 포함한다.
(단계 1) 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 생존가능한 배양 조건 하에서 소정시간 동안 시험 물질의 존재 하에서 배양시키고, 세포 손상의 중증도를 평가하는 단계,
(단계 2) 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 생존가능한 배양 조건 하에서 소정시간 동안 시험 물질의 부재 하에 또는 양성 대조군의 존재 하에 배양시키고, 세포 손상의 중증도를 측정하는 단계,
(단계 3) (단계 1) 및 (단계 2)에서 측정한 결과의 차이를 기초로, 단계 1의 시험 물질의 독성을 평가하는 단계.
본 명세서에서, "시험 물질의 부재 하에서"는 시험 물질을 첨가하는 대신 시험 물질을 용해시키는데 사용되는 용매 또는 배지만을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, "양성 대조군"은 독성을 갖는 기지 화합물을 의미한다. 세포 손상의 중증도를 측정하기 위한 방법의 예는 생존 세포수를 측정하는 방법, 예를 들어, 세포내 ATP 양을 측정하는 방법, 세포 염색 (예를 들어, 핵 염색) 및 형태 관찰에 의한 생존 세포수를 측정하는 방법을 포함한다.
단계 3에서, 시험 물질의 독성을 평가하기 위한 방법으로서, 단계 1의 측정값 및 단계 2의 음성 대조군의 측정값을 비교하고, 단계 1에서 세포 손상의 중증도가 높을 때, 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다. 또한, 단계 1의 측정값 및 단계 2에서 양성 대조군의 측정값을 비교하고, 단계 1에서 세포 손상의 중증도가 동일하거나 또는 높으면, 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다.
5. 약학 조성물
본 발명은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)의 유효량을 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
약물 조성물은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)의 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다.
약학적으로 허용가능한 담체로서, 생리적 수성 용매 (염수, 완충제, 혈청-무함유 배지 등)를 사용할 수 있다. 필요한 경우, 이식 요법에서, 이식하려는 조직 또는 세포를 함유하는 약물은 통상적으로 사용되는 보존제, 안정화제, 환원제, 등장화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 적절한 생리적 수성 용매에 현탁하여 현탁액으로서 제조할 수 있다. 필요한 경우, 조성물은 동결보존제를 첨가하고, 동결보존될 수 있고, 사용시 해동되어, 완충제로 세척되어, 이식 요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 제조 방법으로 얻어진 망막 조직은 또한 핀셋 등으로 적절한 크기로 잘려서 시트 제제가 제공될 수도 있다.
본 발명의 제조 방법으로 얻어진 세포는 또한 분화 유도를 위해 단계 (3)에서 부착 배양되어 시트-유사 세포를 형성하여 시트 제제가 제공될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)의 장애로 인한 질환에 대한 약물로서 유용하다.
6. 치료제 (약물)
본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환의 이식 용법에 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)를 함유하는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 약물을 제공한다. 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 약물로서 또는 망막 조직의 손상 상태에서 해당 손상 부위를 보충하기 위해, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포, 망막층-특이적 신경 세포)를 사용할 수 있다. 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환, 및 망막 조직의 손상 상태는, 망막 세포 또는 장애가 있는 망막 조직 그 자체를 보충하기 위해, 이식을 요구하는, 망막 조직의 손상 상태, 또는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 갖는 환자에게 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 이식함으로써 치료될 수 있다. 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환의 예는 안과 질환인 황반 변성, 황반변성, 나이-관련 황반 변성, 망막 색소 변성, 백내장, 녹내장, 각막 질환, 망막증 등을 포함한다.
이식 요법에서, 조직적합성 앙원의 차이로 인한 거부가 종종 문제가 된다. 그러나, 이러한 문제는 이식 수용자의 체세포로부터 수립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포)를 사용하여 해결할 수 있다. 즉, 바람직한 구체예에서, 수용자의 체세포로부터 수립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포)를 본 발명의 방법에서의 다능성 줄기 세포로서 사용하고, 수용자에게 면역학적으로 자기 것인 망막 조직 또는 망막 세포를 제조하여 수용자에게 이식한다.
또한, 동종이계 망막 조직 또는 망막 세포를 수용자와 면역적으로 적합 (HLA 형 및 MHC 형이 적합)한 다른 사람의 체세포로부터 수립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포)로부터 제조하여, 수용자에게 이식할 수 있다.
[실시예]
본 발명을 실시예 및 약리학적 실시예를 참조하여 하기에서 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예를 제한적인 것으로 해석해서는 안된다.
실시예 1 : 단계 1 (사전조건화라고도 함) 이후 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 사용하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수함)를 문헌 [Scientific Reports, 4, 3594 (2014)]에 기재된 방법에 따라서 피더-무함유로 배양하였다. 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N, Ajinomoto Co., Inc.)를 사용하였고, 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하였다.
구체적인 유지 배양 작업으로서, 먼저 서브컨플루언스 (subconfluence)의 인간 iPS 세포 (1231A3 세포주)를 PBS로 세척한 후 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. 그 후에, 단일 세포로 분산시킨 상기에 언급된 인간 iPS 세포를 라미닌 511-E8로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬에 파종하였고, Y27632 (ROCK 억제제, 10 μM)의 존재 하에 StemFit (등록 상표) 배지 중에서 피더-무함유 조건하에 배양하였다. 플라스틱 배양 디쉬로서 6웰 플레이트 (Iwaki 제품, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠)를 사용한 경우에, 단일 세포로 분산된 상기에 언급된 인간 iPS 세포에 대한 파종된 세포의 수는 1.0 x 104 으로 조정하였다. 파종 후 1일에, 배지의 전체량을 Y27632를 함유하지 않은 StemFit (등록 상표) 배지로 교체하였다. 이후에, 1일 내지 2일에 1회씩, 배지의 전체량을 Y27632를 함유하지 않는 StemFit (등록 상표) 배지로 교체하였다. 그 후에, 파종 후 6일까지 그들이 서브컨플루언스 (배양 면적의 60%가 세포로 덮힘)가 될 때까지 세포를 배양하였다.
본 발명의 제조 방법의 제1 단계 (사전조건화)의 구체적인 예로서, 다음의 작업을 수행하였다. 서브컨플루언스의 인간 iPS 세포 (1231A3 세포주)를 PBS로 세척하였고, TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 라미닌 511-E8로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬 (Iwaki 제품)에 파종하였고, Y27632 (ROCK 억제제, 10 μM)의 존재하에 StemFit (등록 상표) 배지에서 피더-무함유 조건 하에 배양하였다. 상기에 언급된 플라스틱 배양 디쉬로서 6웰 플레이트 (Iwaki 제품, 배양 면적 9.4 ㎠)를 사용한 경우에, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포의 파종된 세포수는 1.0 x 104 으로 조정하였다. 상기에 언급된 플라스틱 배양 디쉬로서 60 mm 디쉬 (Iwaki 제품, 세포 배양 용, 배양 면적 21 ㎠)를 사용한 경우, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포의 파종된 세포수는 2.0x 104 으로 조정하였다. 파종 후 1일에, 배지의 전체량을 Y27632를 함유하지 않는 StemFit (등록 상표) 배지로 교환하였다. 1일 내지 2일에 1회씩, Y27632를 함유하지 않는 StemFit (등록 상표) 배지로 배지의 전체량을 교환하였다. 그후에, 세포를 파종 후 5일까지, 즉 서브컨플루언스 (배양 면적의 50%가 세포로 덮힘) 1일 전까지 배양하였다. 파종 후 6일 동안 배양했을 경우에도, 유사한 결과를 얻었다.
서브컨플루언스 이전 1일까지 상기 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 존재 (단계 1: 사전조건화 처리, 도 1 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 또는 이의 부재 (단계 1: 사전조건화 미처리, 도 1 "미처리 대조군") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다. 배양된 세포를 도립 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)를 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 피더-무함유 배양 동안 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (SB431542) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 처리가 인간 iPS 세포의 형태에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 처리하지 않은 인간 iPS 세포 및 사전조건화 처리한 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업에 의해 단일 세포로 더욱 분산시켰다. 그 이후에, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)에 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청 무함유 배지에 현탁시켰고, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청 무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물을 사용하였다.
현탁 배양의 시작 시(현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 언급한 혈청-무함유 배지에 첨가하였고, 세포를 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 (IWR-1e, 3 μM)을 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지에서 더욱 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 2 일까지 사전조건화되거나 또는 사전조건화되지 않은 조건 하에서 세포 응집체를 형성시켰다 (단계 2 완료, 및 단계 3 시작).
현탁 배양 시작 이후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고 외생성 IWR-1e의 농도는 변하지 않도록 Y27632를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며, IWR-1e를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 2 내지 4일 마다 1회씩 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고, IWR-1e를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양 시작 이후 17일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation 제품, ECLIPSE Ti)을 사용해서 명시야 관찰을 수행하였다 (도 1). 그 결과로서, 사전조건화 없고 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가가 없는 조건 하에서, 응집체 성장은 불충분하였고 이의 형상은 붕괴되었다 (도 1A). 대조적으로, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 첨가된 조건 하에서 응집체가 변형되지 않고 조밀한 내부를 갖는 세포가 수득되었고, 신경 조직이 형성된 것을 확인하였다 (도 1B). 더 나아가서, 사전조건화하고 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하지 않은 조건 (도 1C), 또는 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가한 조건(도 1D) 하에서, 응집체의 조밀한 내부와 부드러운 표면을 갖는 변형되지 않은 둥근 세포 응집체가 수득되었고, 신경 조직이 형성된 것이 확인되었다.
현탁 배양의 시작 이후 17일에 상기 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 각각 고정시켰고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 면역염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 2).
그 결과로서, 단계 1에서 SB431542 및 SAG로 사전조건화하지 않고, 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e를 첨가하지 않은 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서는, 전체 세포에 대한 Rx 양성 세포의 비율이 약 3% 이하인 것으로 확인되었다(도 2A).
단계 1에서 SB431542 및 SAG로의 사전조건화를 포함하지 않고 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e의 첨가를 포함하는 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율은 약 40%였다 (도 2B). 연속 절편 분석에서, 이들 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서 약한 Chx10 양성도가 관찰되었다 (도 2F).
단계 1에서 SB431542 및 SAG로 사전조건화를 포함하고, 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e의 첨가가 없는 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율은 약 40%였다 (도 2C). 연속 절편 분석에서, 이들 조건 하에서 제조된 세포 응집체는, 약 40%의 Chx10 양성 (강한 양성) 세포가 관찰되었다 (도 2G).
더 나아가서, 단계 1에서 SB431542 및 SAG로 사전조건화를 포함하고 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e의 첨가를 포함하는 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율은 약 60%였다 (도 2D). 연속 절편 분석에서, 이들 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서, 약 60%의 Chx10 양성 (강한 양성) 세포가 관찰되었다 (도 2H).
이들 결과로부터, 신경 조직은 사전조건화를 포함하지 않고 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 억제제의 첨가를 포함하지 않는 조건 하에서는 거의 형성되지 않는데 반해, 임의의 다른 조건 하에서는 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
사전조건화가 없고 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 억제제의 첨가가 없는 조건과 비교하여, 사전조건화는 없고 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하는 조건 하에서 망막 조직 형성이 어느 정도 촉진되는 것을 확인하였다 (도 1A, B, 도 2A, B, E, F). 다른 한편으로, 단계 1에서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및 Shh 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화하고, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 더 첨가하여 망막 조직을 고도로 효율적으로 형성시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (도 2B, D, F, H).
실시예 2 : 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일까지 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 존재 (단계 1: 사전조건화 처리, 도 3 "사전조건화: Shh") 또는 이의 부재 (단계 1: 사전조건화-미처리 조건, 도 3 "미처리 대조군") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화-처리된 인간 iPS 세포, 및 사전조건화-미처리 조건 하의 인간 iPS 세포를 각각 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더욱 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작 시점 (현탁 배양의 시작 이후 0일, 단계 2의 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고, 세포를 하기의 5가지 조건 1 내지 5 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 1에서 사전조건화 처리를 포함하지 않고, 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 또는 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가를 포함하지 않는 조건 (도 3A).
· 조건 2. 단계 1에서 사전조건화 처리를 포함하고, 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 또는 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가를 포함하지 않는 조건 (도 3B).
· 조건 3. 단계 1에서 사전조건화 처리를 포함하고, 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)를 첨가하고 외생성 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 첨가하지 않는 조건 (도 3C).
· 조건 4. 단계 1에서 사전조건화 처리를 포함하고, 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 첨가하지 않고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)를 첨가하는 조건 (도 3D).
· 조건 5. 단계 1에서 사전조건화 처리를 포함하고, 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)를 첨가하고 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)를 첨가하는 조건 (도 3E).
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체는 임의의 조건 1 내지 5 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632와 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도변화를 피하기 위해 2일 내지 4일마다 1회씩, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양 시작 이후 17일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation 제품, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다 (도 3). 그 결과로서, 단계 1에서 사전조건화없는 조건 1 하에서 응집체가 성장하지 않았고 신경 조직이 형성되지 않았던데 반해 (도 3A), 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 처리한 조건 2 내지 5 하에서 응집체가 성장하였고 신경 조직이 형성될 수 있는 것으로 확인되었다 (도 3B-E). 특히, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 작용할 수 없게 하는 조건 2 및 4 (도 3B, D)와 비교하여, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질이 작용할 수 있게 하는 조건 3 및 5 (도 3C, E) 하에서, 신경 조직의 형성 효율이 양호한 것으로 확인되었다.
현탁 배양의 시작 후 17일에 상기 세포 응집체를 각각 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 동결절편을 제공하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 면역염색되니 절편은 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 4).
그 결과로서, 사전조건화없는 조건 1 하에서 신경 조직이 형성되지 않은데 반해, SAG로 사전조건화 처리한 조건 2 내지 5 중 임의 조건 하에서는 신경 조직이 형성되는 것으로 확인되었다.
이들 중에서, 단계 1에서 SAG로 사전조건화하고 단계 2 및 단계 3에서 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가하지 않은 조건 2 하에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율이 약 40%였다 (도 4A). 연속 절편의 분석에서, 상기 조건 하에서 제조된 세포 응집체의 망막 조직에서, Rx 양성 세포는 Chx10 공동-양성인 것으로 확인되었다 (도 4E).
다른 한편으로, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율은 단계 1에서 SAG로 사전조건화하고, 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e를 첨가한 조건 3 하에서 제조된 세포 응집체 중에서 약 90%인 것으로 확인되었다 (도 4B). 연속 절편의 분석에서, 상기 조건 하에서 제조된 세포 응집체의 망막 조직에서, Rx 양성 세포는 Chx10 공동-양성인 것으로 확인되었다 (도 4F).
즉, 조건 2 및 조건 3의 비교로부터, 망막 조직은 단계 1에서 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 추가 처리에 의해 약 90%의 효율로 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
단계 1에서 SAG로 사전조건화를 포함하고 단계 2에서 SAG를 첨가하는 조건 4를 포함하는 조건 4 하에서 제조된 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포의 비율은 약 60%였다 (도 4C). 연속 절편의 분석에서, 상기 조건 하에서 제조된 세포 응집체의 망막 조직에서, Rx 양성 세포는 Chx10 공동-양성인 것으로 확인되었다 (도 4G).
다른 한편으로, 단계 1에서 SAG로 사전조건화 및 단계 2에서 SAG를 첨가하고, 단계 2 및 단계 3에서 IWR-1e를 첨가하는 조건 5를 포함하는 조건 하에서 제조된 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx 양성 세포 비율은 약 90%였다 (도 4D). 연속 절편의 분석에서, 상기 조건 하에서 제조된 세포 응집체의 망막 조직에서, Rx 양성 세포는 Chx10 공동-양성인 것으로 확인되었다 (도 4H).
즉, 조건 4 및 조건 5의 비교로부터, 망막 조직은 단계 1에서 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 추가 처리에 의해 약 90%의 효율로 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질에 의한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일까지 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM)를 첨가하고, 외생성 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질은 첨가하지 않은 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i) 처리, 도 5 "사전조건화: TGFβR-i") 하에, 또는 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 존재 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 5 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i)-처리된 인간 iPS 세포, 및 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 각각 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업을 통해서 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지를 사용하였다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기에 언급된 혈청-무함유 배지에 첨가하였고 세포를 다음의 3가지 조건 1 내지 3 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
·조건 1. 단계 1에서 사전조건화 (TGFβR-i) 처리 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 5A).
·조건 2. 단계 1에서 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 5B).
· 조건 3. 단계 1에서 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 5C).
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체는 상기 조건 1-5 중 임의 조건 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지에 50 ㎕ 만큼을 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 이후 17일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 조건 1-3 중 임의 조건 하에서 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 이후 17일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정시켜서 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 면역염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과로서, 조건 1 내지 3 중 임의 조건 하에서 신경 조직이 형성되었고 신경 조직 중 Chx10 양성 비율이 약 90%인 것으로 확인되었다 (도 5A-C). 연속 절편의 분석으로, 망막 조직 중 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성인 것으로 확인할 수 있었다.
즉, 망막 조직은 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질을 사용한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 형성될 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질을 사용하는 사전조건화및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서는 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품), 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고, 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 LDN193189 (BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (BMPR-i), 100 nM)를 첨가하고 외생성 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 첨가하지 않은 조건 (단계 1: 사전조건화 (BMPR-i) 처리, 도 6 "사전조건화: BMPR-i") 하에, 또는 LDN193189 (BMP 신호 전달 경로 억제 물질, 100 nM, BMPR-i) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 존재 (단계 1: 사전조건화 (BMPR-i + Shh) 처리, 도 6 "사전조건화: BMPR-i + Shh") 하에, StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (BMPR-i)-처리된 인간 iPS 세포, 및 사전조건화 (BMPR-i + Shh)-처리한 인간 iPS 세포를 각각 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더욱 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지를 사용하였다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고 세포를 다음의 3가지 조건 1-3 하에서 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
·조건 1. 단계 1에서 사전조건화 (BMPR-i) 처리 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 6A).
·조건 2. 단계 1에서 사전조건화 (BMPR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무함유를 포함하는 조건 (도 6B).
·조건 3. 단계 1에서 사전조건화 (BMPR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 6C).
현탁 배양의 시작 후 2 일까지, 세포 응집체가 상기 조건 1-3 중 임의 조건 하에서 형성되었다 (단계 2 완료, 및 단계 3 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되게 하고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 및 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고, IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 2 내지 4일 마다 1회씩 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용한 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 17일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직은 조건 1-3 중 임의 조건 하에서 형성될 수 있는 것으로 확인되었다.
상기 현탁 배양의 시작 후 17일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정시켜서 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 면역염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과로서, 조건 1 내지 3 중 임의 조건 하에서 신경 조직이 형성되었고 신경 조직 중 Chx10 양성 비율이 약 90%인 것으로 확인되었다 (도 6A-C). 연속 절편 분석으로, 망막 조직에서, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성인 것으로 확인할 수 있었다.
즉, 망막 조직은 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질을 사용한 사전조건화, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5 : 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용한 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 단계 3에서 BMP 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 및 혈청의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품), 및 피더-무함유 스캐폴드로는 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 외생성 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 무첨가 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 7 "사전조건화: Shh"), 및 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 7 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포 또는 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업에 의하 단일 세포로 더 분산시키고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무혐유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작 시점 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고 세포를 하기 4가지 조건 1-4 하에서 혈청-무함유 배지 중에 배양하였다.
· 조건 1. 단계 1에서 사전조건화 (Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가, 및 외생성의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 7A).
· 조건 2. 단계 1에서 사전조건화 (Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 7B).
· 조건 3. 단계 1에서 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 7C).
· 조건 4. 단계 1에서 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 및 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 7D).
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체가 상기 조건 1 내지 4 중 임의 조건 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 50 ㎕ 만큼 더 첨가하였다. 그 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
다음으로, 현탁 배양의 시작 후 10일에, 상기 혈청-혈청-무함유 배지에 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (100 nM) 및 혈청으로서 소 태아 혈청 (10%)을 첨가하여 수득된 Shh 혈청-함유 배지 (도 7 "Shh + 혈청")를 사용하여, 배지의 약 80%를 교환하는 작업 (80% 교환 작업)을 3회 반복하고, 그리하여 배지를 Y27632, 인간 재조합 BMP4 또는 IWR1-e를 함유하지 않고, SAG 및 혈청을 함유하는 상기 Shh 혈청-함유 배지로 교환하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 상기 Shh 혈청-함유 배지를 사용한 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 17일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 조건 1 내지 4 중 임의 조건 하에서 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 17일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 면역염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과로서, 조건 1 내지 4 중 임의 조건 하에서 신경 조직이 형성되었고 신경 조직 중 Chx10 양성 비율이 약 80%인 것으로 확인되었다 (도 7A-D). 연속 절편 분석으로, 망막 조직에서, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성인 것을 확인할 수 있었다.
즉, 망막 조직은 단계 1에서 사전조건화, 단계 2에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 및 단계 3에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가 후에, Shh 혈청-함유 배지에서의 배양을 포함하는 조건 하에서 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 6 : 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 사용한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품), 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 8 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업을 통해 단일 세포로 더욱 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작 시(현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고 세포를 하기 4가지 조건 1 내지 4 하에서 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 8A).
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 8B).
· 조건 3. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로 SB431542 (5 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 8C).
· 조건 4. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서 SB431542 (5 μM) 및 소닉 헤지 호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 8D).
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체는 조건 1 내지 4 중 임의 조건 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고, IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 배지 교환 이전과 비교하여 외생성 IWR-1e 및/또는 SB431542의 농도가 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 1회씩, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4, IWR-1e 및 SB431542가 없는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 19일에 이렇게 제조된 세포에 대해서 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 조건 1 내지 4의 임의 조건 하에서 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 대비 염색으로서, 핵산을 DAPI로 염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 8).
그 결과로서, 조건 1 내지 4 중 임의 조건 하에서 신경 조직이 형성되는 것으로 확인되었다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 70%였고, 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 70%였고, 조건 3에서는, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 70%였으며, 조건 4에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였다. 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포라는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 조건 1 및 조건 2에서 처럼, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 망막 조직으로의 효율적인 분화가 또한 획득된다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 3 및 4처럼, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서도 역시 망막 조직으로의 효율적인 분화가 획득되는 것으로 확인되었다.
실시예 7 : 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 LDN193189 (BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (BMPR-i), 100 nM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (BMPR-i + Shh) 처리, 도 9 "사전조건화: BMPR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (BMPR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분선된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기의 2가지 조건 1 내지 2 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무함유를 포함하는 조건 (도 9A).
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로 SB431542 (5 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 9B).
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체가 조건 1과 조건 2 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e 및 SB431542을 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하거나 또는 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 배지 교환 이전과 비교하여 외생성 IWR-1e 및 또는 SB431542의 농도가 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4, IWR-1e 및 SB431542가 없는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 19일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1 및 조건 2 하에서 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 대비 염색으로서 핵산을 DAPI로 염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 9).
그 결과로서, 조건 1 및 조건 2에서 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였고, 조건 2에서 Chx10 양성 망막 조직의 비율은 약 90%였다. 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포라는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 조건 1에서, 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 조직으로의 효율적인 분화를 획득한다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 2에서, 단계 1에서 BMPR 억제제 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서도 역시 망막 세포로의 효율적인 분화를 획득한다는 것을 확인하였다.
또한, 단계 1이 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화 또는 BMPR 억제제 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화를 포함할 때 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 첨가함으로써 망막 세포로의 효율적인 분화를 획득한다는 것를 실시예 6 및 실시예 7로부터 확인하였다.
실시예 8 : 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하고 단계 1에서 사전조건화 및 단계 2에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (TFH-R1-10-2 세포주 및 TFH-R2-10-F8 세포주, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.에서 수립)는 아래와 같이 수립하였다. 그들은 Life Technologies의 공개 프로토콜 (iPS 2.0 센다이 리프로그래밍 키트, 공개 번호 MAN0009378, 개정판 1.0) 및 교토 대학의 공개 프로토콜 (establish·maintenance culture of human iPS cells, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310 http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)에 기재된 방법에 따르고, 출발 재료로서 기지 방법으로 제조된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 시판되고 있는 센다이 바이러스 벡터 (Oct3/4, Sox2, KLF4 L-Myc의 4개 인자, DNAVEC Corporation (현 ID Phrma Co., Ltd.) 제품인 CytoTune 키트), 및 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품), 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 수립하였다.
인간 iPS 세포 (TFH-R1-10-2 주 및 TFH-R2-10-F8 주)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 8 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포들을 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)를 첨가하였으며 (도 10 "Wnt-i (0일-17일)"), 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)를 첨가 (도 10 "Shh 0일")하였고 세포를 배양하였다. 임의의 TFH-R1-10-2 세포주 및 TFH-R2-10-F8 세포주의 인간 iPS 세포를 출발 재료로서 사용하여 현탁 배양의 시작 후 2일까지 세포 응집체를 형성시켰다 (단계 2 종료 단계 3 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되게 하고 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고, IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 17일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 출발 재료로서 임의의 TFH-R1-10-2 세포주 및 TFH-R2-10-F8 세포주 중 인간 iPS 세포를 사용하여 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 17일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 10).
그 결과로서, 출발 재료로서 TFH-R1-10-2 세포주 및 TFH-R2-10-F8 세포주 중 인간 iPS 세포를 사용하여 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 TFH-R1-10-2 세포주가 출발 재료인 경우 Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 70%인 것으로 확인되었다 (도 10A). 또한 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포라는 것을 확인할 수 있었다 (도 10B). 또한 TFH-R2-10-F8 세포주가 출발 재료인 경우 Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%인 것으로 확인되었다 (도 10C). 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포인 것을 확인할 수 있었다 (도 10D).
이들 결과로부터, 출발 재료로서 센다이바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포가 역시 단계 1에서 사전조건화 처리 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함한 조건 하에서 망막 조직으로 효율적으로 분화된다는 것을 확인하였다.
그러므로, 에피솜 벡터를 사용하여 수립된 iPS 세포 (예를 들어, 1231A3 세포주) 및 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포 (예 TFH-R1-10-2 세포주 및 TFH-R2-10-F8 세포주)로부터 iPS 세포의 수립 방법과 무관하게 본 출원의 제조 방법에 의해 망막 세포 및/또는 망막 조직이 제조될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 9 : 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 광수용기 세포를 함유하는 망막 세포의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리) 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지를 사용하였다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)를 첨가하였으며, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)를 첨가하였고, 세포를 배양하였다. 세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성시켰다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포의 일부를 추출하여, 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 그 결과로서, 상기 현탁 배양의 시작 후 20일의 세포가 신경 조직을 함유하였고 그 신경 조직은 Chx10 및 Rx 공동-양성 망막 조직이라는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포의 일부를 추출하고 문헌 [Nature Communications 6, 6286 (2015)]에 기재된 방법에 따라서 분화 배양을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)로 옮기고, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 (CHIR99021, 3 μM) 및 FGF 신호 전달 경로 억제 물질 (SU5402, 5 μM)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (1% N2 보충물이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2에서 3일 동안, 즉 현탁 배양의 시작 후 23일까지 배양하였다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 상기 CHIR99021 및 SU5402를 함유하는 10 mL 혈청-무함유 배지 중에서 약 50개 응집체를 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 23일에, 얇은 신경상피가 형성되었고, 망막 색소 상피 (RPE)-유사 조직이 형성되었다.
현탁 배양의 시작 후 23일에 세포 응집체를 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충물, 0.5 μM 레티노산 및 100 μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2, 대기 산소 농도 (약 20%)에서 현탁 배양의 시작 후 58일 (35일)까지 현탁 배양하였다. 현탁 배양 시작 이후 20일부터 현탁 배양 종료까지, 상기 혈청-함유 배지로 2 내지 4일 마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이 기간 동안, 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 약 30개의 응집체를 15 mL의 상기 혈청-함유 배지 중에서 현탁 배양하였다. 신경 망막-유사 조직이 현탁 배양의 시작 후 35일부터 존재하였다.
현탁 배양의 시작 후 58일에 세포 응집체를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직뿐만 아니라 염료 침착된 망막 색소 상피 세포가 형성될 수 있는 것이 확인되었다 (도 11, A, 화살촉으로 표시).
현탁 배양의 시작 후 58일에 이렇게 제조된 세포 응집체를 각각 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rax/Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 신경 망막 전구 세포 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 Crx (항-Crx 항체, Takara 제품, 토끼)에 대해 면역염색하였고, 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과로서, 상기 현탁 배양의 시작 후 58일에 세포 응집체에서 약 90%의 Rx 양성 망막 조직이 형성된 것을 확인하였다 (도 11, B). 또한, Rx 양성 망막 조직은 Chx10 양성 신경 망막 전구 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 11, C). 또한, Rx 양성 망막 조직은 Crx 양성 광수용기 전구 세포를 함유하는 것을 확인하였다 (도 11, D). 형태적 관찰로부터, Rx 양성 망막 조직이 모양체 주변부-유사 구조를 함유하는 것을 확인하였다 (도 11, E 화살표로 표시). 형태학적 관찰로부터, Rx 양성 및 Chx10 음성 및 Crx 음성 내층 망막 신경 세포 (예를 들어, 신경절 세포 및 아마크린 세포)가 망막 조직의 내부에 함유된 것을 확인할 수 있었다 (도 11).
이들 결과로부터, 출발 재료로서 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포가 단계 1에서 사전조건화 처리 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 망막 조직으로 효율적으로 분화되는 것으로 확인되었다. 더 나아가서 망막 세포 (또는 망망층 특이적 신경 세포), 예를 들어 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 망막 색소 상피 세포, 내층 망막 신경 세포, 모양체 주변부-유사 구조가 제조된 망막 조직의 분화 배양을 계속함으로써 제조될 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 내층 망막 신경 세포가 상기 망막 조직에 층구조를 갖는 연속 상피 구조를 형성하는 것으로 확인되었다.
즉, 재생 의료·세포 이식 치료 및 유효성·안정성 평가 연구에 유용한 망막 조직·망막 세포가 본 출원의 제조 방법에 의해 피더-무함유 배양된 인간 다능성 줄기 세포로부터 제조될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 10: 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질에 의한 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 12 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 상기 혈청-무함유 배지에 첨가하였고 세포를 하기 조건 1 내지 3의 3가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 12A-C "조건 1").
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 12D-F "조건 2").
· 조건 3. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 12G-I "조건 3").
세포 응집체가 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에 현탁 배양의 시작 이후 2일 까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 12일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교시 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에서 신경 조직이 형성된 것으로 확인되었다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그) 또는 망막 조직을 포함하는 신경 조직 마커 중 하나인 Pax6에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 12).
그 결과로서, 조건 1, 조건 2 및 조건 3에서 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 95% (도 12A)였고, 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 95% (도 12D)였으며, 조건 3에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 85%였다 (도 12G). 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 및 Pax6 공동-양성 세포인 것을 확인할 수 있었다.
즉, 조건 1에서, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 망막 조직으로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 2 및 조건 3에서, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서도 망막 세포로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 11: 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주식 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 실시예 1 기재 방법으로 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양한 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 13 "사전조건화: Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다 (즉, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 분화 시작 이전 2일 동안 작용될 수 있게 하였음).
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포에 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지를 사용하였다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 1 내지 3의 3가지 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 13A-C "조건 1").
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가, 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 13D-F "조건 2").
· 조건 3. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 13G-I "조건 3").
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지, 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에서 신경 조직이 형성되는 것으로 확인되었다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 또는 망막 조직을 포함하는 신경 조직 마커 중 하나인 Pax6에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 13).
그 결과로서, 조건 1, 조건 2 및 조건 3에서 신경 조직이 형성되는 것으로 확인되었다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 95%였고, 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였으며, 조건 3에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율은 약 70%였다. 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 및 Pax6 공동-양성 세포라는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 조건 1에서 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 조직으로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 2 및 조건 3에서, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 또한 망막 세포로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 12: 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 광수용기 세포를 함유하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 1의 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건.
세포 응집체는 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에서 현탁 배양의 시작 후 2일 까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며, IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포의 일부를 추출하였고 문헌 [Nature Communications 6, 6286 (2015)]에 기재된 방법에 따라서 분화 배양을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD. 제품)로 옮겼고, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 (CHIR99021, 3 μM) 및 FGF 신호 전달 경로 억제 물질 (SU5402, 5 μM)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (1% N2 보충물이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에, 37℃, 5% CO2에서 3일 동안, 즉 현탁 배양의 시작 후 23일 까지 배양하였다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 약 50개 응집체를 상기 CHIR99021 및 SU5402를 함유하는 10 mL의 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 23일에, 얇은 신경상피가 형성되었고, 망막 색소 상피 (RPE)-유사 조직이 형성되었다.
해당 현탁 배양의 시작 후 23일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)에서 Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 또는 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충물, 0.5 μM 레티노산 및 100 μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에, 37℃, 5% CO2 대기 산소 농도 (20% 정도)에서 현탁 배양의 시작 후 85일까지 (62일)까지 현탁 배양하였다. 현탁 배양 시작 이후 23일부터 현탁 배양 종료까지, 2일 내지 4일 마다 한번, 배지-절반 교환 작업을 2일 내지 4일마다 1회씩 상기 혈청-함유 배지로 수행하였다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 약 30개 응집체를 15 mL의 상기 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 35일부터 신경 망막-유사 조직이 존재하였다.
현탁 배양의 시작 후 85일에 세포 응집체를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 연속 상피 구조를 갖는 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다 (도 14A).
현탁 배양의 시작 후 85일에 이렇게 제조된 세포 응집체를 각각 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 Crx (항-Crx 항체, Takara 제품, 토끼), 신경 망막 전구 세포 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rax/Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 광수용기 세포 마커 중 하나인 리커버린 (항-리커버린 항체, Proteintech 제품, 토끼), 간상 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 NRL (항-NRL 항체, R and D 제품, 염소), 추상 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 RXR-감마 (항-RXRG 항체, R and D 제품, 염소), 신경 조직 마커 중 하나인 N-카데린 (항 N-카데린 항체, BD 사의 마우스), RPE 및 모양체 주변부 마커 중 하나인 Aqp1 (항-Aqp1 항체, Millipore 제품, 토끼)에 대해 면역염색하였고, 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 대비 염색으로서 핵산을 DAPI로 염색하였다.
그 결과로서, 상기 현탁 배양의 시작 후 85일에 상기 세포 응집체에서 Chx10 양성 신경 망막 전구 세포 및 Crx 양성 광수용기 전구 세포를 함유하는 망막 조직이 약 90%로 형성된 것을 확인하였다 (도 14, B). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 Rx 양성 망막 조직이고 리커버린 양성 광수용기 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 14, C). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 NRL 양성 간상 광수용기 전구 세포 및 RXR-감마 양성 추상 광수용기 전구 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 14, D). 또한, 망막 조직이 N-카데린 양성 신경 조직이라는 것을 확인하였다 (도 14E).
이들 결과로부터, 출발 재료로서 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포는 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 처리 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 망막 조직으로 효율적으로 분화된다는 것을 확인하였다. 또한 제조된 망막 조직의 분화 배양을 계속함으로써 망막 세포 (또는 망막 특이적 신경 세포), 예를 들어 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 추상 광수용기 전구 세포 , 간상 광수용기 전구 세포를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포는 상기 망막 조직에서 층구조를 갖는 연속 상피 구조를 형성하는 것으로 확인되었다.
실시예 13 : 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 광수용기 세포를 함유하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 15) 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다 (즉, 분화 시작 전 2일 동안 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질이 작용할 수 있게 하였음).
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지를 사용하였다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건의 3가지 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건.
세포 응집체는 조건 1, 조건 2 및 조건 3 하에서 현탁 배양의 시작 후 2일 까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고, IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 9일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후, 배지-절반 교환 작업을 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지를 사용해 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 19일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포의 일부를 추출하여 문헌 [Nature Communications 6, 6286 (2015)]에 기재된 방법에 따라서 분화 배양을 수행하였다.
해당 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)로 옮기고, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 (CHIR99021, 3 μM) 및 FGF 신호 전달 경로 억제 물질 (SU5402, 5 μM)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (1% N2 보충물이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2에서 3일 동안, 즉 현탁 배양의 시작 후 22일까지 배양하였다. 이 기간 동안, 약 50개 응집체를 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 상기 CHIR99021 및 SU5402를 함유하는 10 mL의 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 22일에, 얇은 신경상피가 형성되었고, 망막 색소 상피 (RPE)-유사 조직이 형성되었다.
현탁 배양의 시작 후 22일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)에서, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 및 FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충물, 0.5 μM 레티노산 및 100 μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2 대기 산소 농도 (약 20%)에서 현탁 배양의 시작 후 92일 (70일)까지 현탁 배양하였다. 현탁 배양 시작 이후 20일부터 현탁 배양 종료까지, 2일 내지 4일 마다 한번, 배지-절반 교환 작업을 2일 내지 4일마다 1회씩 상기 혈청-함유 배지로 수행하였다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 약 30개 응집체를 15 mL의 상기 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 35일부터 신경 망막-유사 조직이 존재하였다.
현탁 배양의 시작 후 92일에 세포 응집체를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 연속 상피 구조를 갖는 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다 (도 15A).
현탁 배양의 시작 후 92일에 이렇게 제조된 세포 응집체를 각각 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 Crx (항-Crx 항체, Takara 제품, 토끼), 신경 망막 전구 세포 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양), 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rax/Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그), 광수용기 세포 마커 중 하나인 리커버린 (항-리커버린 항체, Proteintech 제품, 토끼), 간상 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 NRL (항-NRL 항체, R and D 제품, 염소), 추상 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 RXR-감마 (항-RXRG 항체, R and D 제품, 염소), 신경 조직의 마커 중 하나 인 N-카데린 (항 N-카데린 항체, BD 사의 마우스), RPE 및 모양체 주변부 마커 중 하나인 Aqp1 (항-Aqp1 항체, Millipore 제품, 토끼)에 대해 면역염색하였고, 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다. 대비 염색으로서 핵산을 DAPI로 염색하였다.
그 결과로서, 현탁 배양의 시작 후 92일에 세포 응집체에는, Chx10 양성 신경 망막 전구 세포 및 Crx 양성의 시세포 전구 세포를 함유하는 약 80%의 망막 조직이 형성된 것으로 확인되었다 (도 15, B). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 Rx 양성 망막 조직이고, 리커버린 양성 광수용기 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 15, C). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 NRL 양성 간상 광수용기 전구 세포 및 RXR-감마 양성의 추상 광수용기 전구 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 15, D). 또한, 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 N-카데린 양성 신경 조직인 것으로 확인되었다 (도 15, E). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 Aqp1 양성 모양체 주변부-유사 구조를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 15, E).
이들 결과로부터, 출발 재료로서 피더-무함유 배양한 인간 iPS 세포는 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 처리, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 망막 조직으로 효율적으로 분화된다는 것을 확인하였다. 또한, 제조된 망막 조직의 분화 배양을 계속하여 망막 세포 (또는 망막 특이적 신경 세포), 예를 들면 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 추상 광수용기 전구 세포, 간상 광수용기 전구 세포, 모양체 주변부-유사 구조를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포가 상기 망막 조직에서 층구조를 갖는 연속 상피 구조를 형성한다는 것을 확인하였다.
실시예 14: 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 16 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 6% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (30 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 16 A, B).
현탁 배양의 시작 후 2일까지,세포 응집체가 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포를 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고, IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 현탁 배양의 시작 후 6일에 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고, IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에서 배양 후, 세포를 다음과 같이 더 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 12일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 18일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 18일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 16A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건일 때, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소, 및 상기 혈청-무함유 배지 중에 함유된 6%의 KSR의 농도를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 15 : 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주식 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 실시예 1 기재 방법으로 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (+Shh) 처리, 도 16 "사전조건화: Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 상기 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 6% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물을 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 16C, D).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포를 하기 조건 C 및 D의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건 C. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 D. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 C 및 D의 2가지 조건 하에 배양 후, 세포를 다음과 같이 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 12일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 18일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 C 및 조건 D 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 18일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 16C, D).
그 결과로서, 조건 C 및 조건 D 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 C에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였고, 조건 D에서 Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 C 및 조건 D 중 임의 조건일 때, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소, 및 상기 혈청-무함유 배지에 함유된 6%의 KSR의 농도를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 16 : 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 LDN193189 (BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (BMPR-i), 100 nM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh) 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (BMPR-i + Shh) 처리, 도 17 "사전조건화: BMPR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (BMPR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 17A, B).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포는 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 또한 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에서 배양 후, 세포를 다음과 같이 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 17A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건인 경우, 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일째)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 17: 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였고, 그리하여 서브컨플루언스 전 1일의 인간 iPS 세포를 제조하였다. 더 나아가서, 서브컨플루언스 전 1일의 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i 24h + Shh 48h) 처리, 도 18).
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i 24h + Shh 48h)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 18A, B).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포를 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 또한 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에서 배양 후, 세포를 다음과 같이 더 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 18A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건인 경우, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 18 : 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였고, 그리하여 서브컨플루언스 전 1일의 인간 iPS 세포를 제조 하였다. 더나아가서, 서브컨플루언스 전 1일의 인간 iPS 세포를 LDN193189 (BMP 신호 전달 경로 억제 물질 (BMPR-i), 100 nM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다 (단계 1: 사전조건화 (BMPR-i 24h + Shh 48h) 처리, 도 19).
이렇게 제조된 사전조건화 (BMPR-i 24h + Shh 48h)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지 중에서 배양하였다.
· 조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 19A, B).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포를 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고, IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에서 다음과 같이 세포를 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 19A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 50%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 70%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건인 경우, 단계 1에서 BMP 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에, 망막 조직으로의 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 19 : 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 20 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고, 세포를 하기 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
·조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로 SB431542 (5 μM)의 첨가 및 외생성의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 20 A, B).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e (3 μM) 및 SB431542 (5 μM)의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e (3 μM) 및 SB431542 (5 μM)의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품), IWR-1e 및 SB431542를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서, Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
세포를 상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 배양 후 하기에 따라 더 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 실시 했다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4, IWR-1e 및 SB431542를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 20A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 또한 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 95%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 95%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건인 경우, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일)에, 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득되는 것을 확인하였다.
실시예 20: 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 21 "사전조건화: Shh 48 h") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에 2 일간 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.0 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고, 세포를 혈청-무함유 배지에서 배양하였다. 세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다.
· 조건. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM) 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질로서 SB431542 (5 μM)의 첨가 및 외생성의 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 21 A, B).
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
더 나아가서, 세포는 하기 조건 A, B의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 A. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e (3 μM) 및 SB431542 (5 μM)의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e 및 SB431542을 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일 마다 한번, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
· 조건 B. 현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e (3 μM) 및 SB431542 (5 μM)의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e 및 SB431542를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 더 나아가서, 현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 농도 및 외생성 IWR-1e의 농도가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품) 및 IWR-1e 및 SB431542를 함유하는 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 배지-절반 교환 작업을 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
상기 조건 A, B의 2가지 조건 하에서 배양된 세포를 다음과 같이 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e 및 SB431542의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4, IWR-1e 및 SB431542를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 20일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 A 및 조건 B에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 20일에 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 21A, B).
그 결과로서, 조건 A 및 조건 B 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 A에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였고, 조건 B에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 80%였다.
즉, 외생성 BMP의 첨가 조건이 조건 A 및 조건 B 중 임의 조건인 경우, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 10일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 및 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 21 : 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주식 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 실시예 1 기재 방법으로 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 22) 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.3 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 세포를 하기 조건 1과 조건 2 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 22A, B).
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 22C, D).
세포 응집체는 조건 1 및 조건 2 하에서 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 조건 1 및 조건 2 하에서, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다.
현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 18일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1과 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 18일에 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역 염색을 수행하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과로서, 조건 1과 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였고 (도 22A), 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율은 약 80%였다 (도 22C). 연속 절편 분석으로, 조건 1 및 조건 2에서 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포인 것을 확인하였다 (도 22 B, D).
현탁 배양의 출발 이후% 또는 그 이하 즉, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가를 포함하거나 또는 포함하지 않는 조건 하에, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 6일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서, 망막 조직으로의 효율적인 분화가 역시 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 22 : 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 광수용기 전구 세포 및 신경절 세포를 함유하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (QHJI01s04 주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc.)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (Shh) 처리, 도 23) 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.3 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고, 세포를 하기 조건 1 및 조건 2 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 23A-D).
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 23E-H).
세포 응집체는 조건 1 및 조건 2 하에서 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 조건 1 및 조건 2 하에서, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다.
현탁 배양의 시작 후 6일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 11일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1과 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 11일에 응집체의 일부를 추출하였고 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과로서, 조건 1과 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였고 (도 23A), 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율은 약 90%였다 (도 23E). 연속 절편 분석으로, 조건 1 및 조건 2에서 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포인 것을 확인하였다.
조건 1 및 조건 2 하에서, 상기 현탁 배양의 시작 후 11일에 세포의 일부를 추출하였고 문헌 [Nature Communications 6, 6286 (2015)]에 기재된 방법에 따라서 분화 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 11일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)로 옮기고, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 (CHIR99021, 3 μM) 및 FGF 신호 전달 경로 억제 물질 (SU5402, 5 μM)을 함유하는 혈청-무함유 배지 (1% N2 보충물이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2에서 3일 동안, 즉 현탁 배양의 시작 후 14일까지 배양하였다. 이 기간 동안, 약 50개 응집체를 하나의 90 mm 낮은 부착 배양 디쉬 당 상기 CHIR99021 및 SU5402를 함유하는 10 mL의 혈청-무함유 배지에서 현탁 배양하였다. 현탁 배양의 시작 후 14일에, 얇은 신경상피가 형성되었고, 망막 색소 상피 (RPE)-유사 조직이 형성되었다.
해당 현탁 배양의 시작 후 14일에 세포 응집체를 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)에서, Wnt 신호 전달 경로 활성화 물질 또는FGF 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충물 및 100 μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에 37℃, 5% CO2 대기 산소 농도 (약 20%)에서, 현탁 배양의 시작 후 35일까지 (21일)까지 현탁 배양하였다. 현탁 배양 시작 이후 20일부터 현탁 배양 종료까지, 2일 내지 4일마다 1회씩, 배지-절반 교환 작업을 상기 혈청-함유 배지로 2일 내지 4일마다 1회씩 수행하였다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm의 낮은 부착 배양 디쉬 당 약 30개 응집체를 15 mL의 상기 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하였다.
현탁 배양의 시작 후 35일에 세포 응집체를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 망막-유사 조직이 존재하고 연속 상피 구조를 갖는 신경 조직이 형성될 수 있다는 것을 확인하였다.
현탁 배양의 시작 후 35일에 이렇게 제조된 세포 응집체를 각각 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 광수용기 전구 세포 마커 중 하나인 Crx (항-Crx 항체, Takara 제품, 토끼) 또는 신경절 세포 마커 중 하나인 Brn3b (항-Brn3b 항체, Santa Cruz 제품, 염소)에 대해 면역염색하였고, 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다.
그 결과로서, Crx 양성 광수용기 전구 세포를 함유하는 약 90%의 망막 조직이 조건 1 및 조건 2 하에 현탁 배양의 시작 후 35일에 상기 세포 응집체에서 형성된 것을 확인하였다 (도 23C, G). 연속 절편 분석으로, 망막 조직이 Brn3b 양성 신경절 세포를 함유한다는 것을 확인하였다 (도 23 D, H).
이들 결과로부터, 출발 재료로서 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포는 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 처리 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건에서, 단계 2에서 소직 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가가 있거나 또는 없는 조건 하에서 망막 조직으로 효율적으로 분화된다는 것을 역시 확인하였다. 제조된 망막 조직의 분화 배양을 계속하여 망막 세포 (또는 망막 특이적 신경 세포), 예를 들면 광수용기 전구 세포 및 신경절 세포를 제조할 수 있다는 것을 또한 확인하였다. 또한, 광수용기 전구 세포 및 세포절 세포가 상기 망막 조직에서 층구조를 갖는 연속 상피 구조를 형성한다는 것을 확인하였다.
실시예 23: 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하고 단계 1에서 사전조건화 및 단계 2에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (TFH-HA 세포주, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.에서 수립)는 다음과 같이 수립하였다. 그들은 출발 재료로서 기지 방법으로 제조된 말초 혈액 단핵구 (PBMC), 시판되는 센다이 바이러스 벡터 (Oct3/4, Sox2, KLF4 L-Myc의 4개 인자, ID Phrma Co., Ltd. 제품인 CytoTune 키트), 및 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품), 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 수립하였다.
인간 iPS 세포 (TFH-HA 주)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 실시예 1 기재의 방법으로 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 24 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.3 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 하기 조건 1 및 2의 2가지 조건 하에 배양하였다.
· 조건 1. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 24A, B "조건 1").
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 24E, F "조건 2").
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체가 조건 1 및 조건 2 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하고 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 12일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 9일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 조건 1과 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 24).
그 결과로서, 조건 1 및 조건 2에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 1에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였고 (도 24A), 조건 2에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율은 약 90% 였다 (도 24E). 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포인 것을 확인할 수 있었다 (도 24B, F).
즉, 조건 1에서 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하여, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에, 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 조직으로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 2에서 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하여, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 세포로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 24: 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하고 단계 1에서 사전조건화 및 단계 2에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (TFH-HA 세포주, Sumitomo Dinippon Pharma Co., Ltd.에서 수립)는 실시예 23에 기재된 대로 수립하였다. 인간 iPS 세포를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하여 실시예 1에 기재된 방법으로 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 전 2일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 24 "사전조건화: Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 2일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰고, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.3 x 104 세포로 100 ㎕의 혈청-무함유 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 보충된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에, 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고 하기 조건 3 및 4의 2가지 조건 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 3. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 무첨가를 포함하는 조건 (도 24C, D "조건 3").
· 조건 4. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (도 24G, H "조건 4").
현탁 배양의 시작 후 2일까지, 세포 응집체가 조건 3 및 조건 4 하에서 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 3일에, 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 IWR-1e를 더 함유하는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 12일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 9일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서 조건 3 및 조건 4에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 19일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 24).
그 결과로서, 조건 3 및 조건 4 하에서 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 조건 3에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 60%였고 (도 24C), 조건 4에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 50% 였다 (도 24G). 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포인 것을 확인할 수 있었다 (도 24D, H).
즉, 조건 3에서 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하여, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질의 무첨가, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 조직으로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다. 더 나아가서, 조건 4에서 출발 재료로서 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 수립된 인간 iPS 세포를 사용하여, 단계 1에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지 호그 신호 경로 활성화 물질의 첨가, 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 억제 물질의 첨가, 및 단계 3의 과정 중 (현탁 배양의 시작 후 12일)에 외생성 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질 농도의 3% 이하로의 감소를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 세포로의 효율적인 분화가 획득된다는 것을 확인하였다.
실시예 25: 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 사용을 포함하는 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 세포주, 교토 대학에서 입수)를 피더-무함유 배지로서 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 및 피더-무함유 스캐폴드로서 라미닌 511-E8 (Nippi, Inc. 제품)을 사용하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 피더-무함유 배양하였다.
서브컨플루언스 이전 1일에 피더-무함유 배양된 인간 iPS 세포를 SB431542 (TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 (TGFβR-i), 5 μM) 및 SAG (소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질 (Shh), 300 nM)의 첨가를 포함하는 조건 (단계 1: 사전조건화 (TGFβR-i + Shh) 처리, 도 25 "사전조건화: TGFβR-i + Shh") 하에 StemFit (등록 상표) 배지 (AK03N; Ajinomoto Co., Inc. 제품) 중에서 1일 동안 피더-무함유 배양하였다.
이렇게 제조된 사전조건화 (TGFβR-i + Shh)-처리된 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 제품)를 사용하여 세포 분산 용액으로 처리하였고, 파이펫팅 작업으로 단일 세포로 더 분산시켰으며, 단일 세포로 분산된 상기 인간 iPS 세포를 세포 비부착성 96웰 배양 디쉬 (PrimeSurface 96 슬릿 웰 플레이트 SUMITOMO BAKELITE CO. LTD. 제품)의 웰 당 1.3 x 104 세포로 100 ㎕ 혈청 배지에 현탁시켰다. 이후에, 세포를 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양하였다. 이를 위한 혈청-무함유 배지 (gfCDM + KSR)로서, 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 한정된 지질 농축물이 첨가된 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 혈청-무함유 배지가 사용되었다. 현탁 배양의 시작시 (현탁 배양의 시작 후 0일, 단계 2의 시작)에 상기 혈청-무함유 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM)를 첨가하였고, 하기 조건 2 하에 혈청-무함유 배지에서 배양하였다.
· 조건 2. 단계 2의 시작 시에 상기 혈청-무함유 배지에 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질로서 IWR-1e (3 μM)의 첨가 및 외생성 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로서 SAG (10 nM)의 첨가를 포함하는 조건.
세포 응집체는 현탁 배양의 시작 후 2일까지 형성되었다 (단계 2의 완료, 및 단계 3의 시작).
현탁 배양의 시작 후 4일에 외생성 인간 재조합 BMP4의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/mL)이 되고, 외생성 IWR-1e의 농도 (3 μM)가 변하지 않도록 Y27632 또는 SAG를 함유하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R & D 제품)를 함유하며 IWR-1e를 더 함유하는 배지를 50 ㎕ 만큼 첨가하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 외생성 IWR-1e의 농도 변화를 피하기 위해서 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4를 함유하지 않고 또한 IWR-1e를 더 함유하는 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 10일에, 외생성 IWR-1e의 농도가 배지 교환 전과 비교하여 3% 이하가 되도록 상기 혈청-무함유 배지를 사용하여 80% 배지 교환 작업을 3회 수행하였다. 이후에, 2일 내지 4일마다 1회씩 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 및 IWR-1e를 함유하지 않는 상기 혈청-무함유 배지로 배지-절반 교환 작업을 수행하였다.
현탁 배양의 시작 후 17일에 이렇게 제조된 세포를 도립 현미경 (Nikon Corporation, ECLIPSE Ti)을 사용하여 명시야 관찰을 수행하였다. 그 결과로서, 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다.
상기 현탁 배양의 시작 후 17일에 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 동결절편을 제조하였다. 이들 동결절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 제품, 양) 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 제품, 기니 피그)에 대해 면역염색하였다. 이들 염색된 절편을 도립 형광 현미경 (KEYENCE CORPORATION 제품, BIOREVO)을 사용하여 관찰하였다 (도 25).
그 결과로서, 신경 조직이 형성되는 것을 확인하였다. 이 조건에서, Chx10 양성 망막 조직의 비율이 약 90%였다 (도 25, A). 연속 절편 분석으로, 이들 Chx10 양성 세포가 Rx 공동-양성 세포라는 것을 확인할 수 있었다 (도 25, B).
즉, 단계 1에서 TGFβ 신호 전달 경로 억제 물질 및 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질로 사전조건화, 단계 2에서 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 첨가 및 슬릿 웰 플레이트에 파종, 및 단계 2 및 단계 3에서 Wnt 신호 억제 물질의 첨가를 포함하는 조건 하에서 역시 망막 세포로의 효율적인 분화가 획득되는 것을 확인하였다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명에 따라서, 망막 세포 또는 망막 조직, 및 이들을 제조하는데 사용된 세포 응집체는 피더 세포의 부재 하에서 배양된 다능성 줄기 세포로부터 높은 효율로 제조될 수 있다.
특허, 특허 출원 및 과학 문헌을 포함하여, 본 명세서에 명시된 임의 간행물에 개시된 내용들은 그들이 본 명세서에 개시된 정도로, 참조하여 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2016-086602호 (출원일: 2016년 4월 22일)를 기초로 하고, 그 내용은 전체로 본 명세서에 편입된다.
Claims (32)
- 하기 단계 (1)∼(3)을 포함하는 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법:
(1) 1) TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질 및/또는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 함유하는 배지 중에서 피더 세포의 부재 하에 다능성 줄기 세포를 배양하는 제1 단계,
(2) Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중에서 제1 단계에서 수득된 세포를 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제2 단계, 및
(3) BMP 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유하는 배지 중에서 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질의 존재 또는 부재 하에 제2 단계에서 수득된 응집체를 현탁 배양시켜 망막 세포 또는 망막 조직을 함유하는 응집체를 수득하는 제3 단계,
여기서 TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189 및 돌소몰핀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh, SAG 및 퍼모프아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 및 IWP-2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이며, 미분화 상태를 유지하기 위한 인자는 bFGF인 제조 방법. - 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포는 제1 단계에서 0.5시간∼144시간 동안 배양되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 단계에서 배양은 부착 배양에 의해 수행되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포의 다능성-유사 상태가 제1단계에 걸쳐 유지되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 단계에서, 제1 단계에서 수득된 세포를 분산시키고, 분산된 세포는 현탁 배양되는 것인 제조 방법.
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- 제1항에 있어서, 제2 단계에서 현탁 배양에 사용되는 배지는 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질을 더 포함하고, 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질은 Shh, SAG 및 퍼모프아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
- 제8항에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포이고, 제2 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 10 nM∼700 nM의 SAG의 소닉 헤지호그 신호 전달 활성에 해당하는 농도인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, TGFβ 패밀리 신호 전달 경로 억제 물질은 Lefty, SB431542, A-83-01 및 LDN193189로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작으로부터 1일 내지 9일 사이에 배지에 첨가되는 것인 제조 방법.
- 제11항에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작으로부터 1일 내지 6일 사이에 배지에 첨가되는 것인 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 제3 단계에서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 제2 단계의 시작으로부터 1일 내지 3일 사이에 배지에 첨가되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, BMP 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 제3 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는 700 nM의 SAG의 소닉 헤지호그 신호 전달 활성에 해당하는 농도 이하인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 배양은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중에서 제2 단계의 시작으로부터 3일 내지 18일 동안 수행되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 배양은 Wnt 신호 전달 경로 억제 물질을 함유하는 배지 중에서 제2 단계의 시작으로부터 10일 동안 수행되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, Wnt 신호 전달 경로 억제 물질은 IWR-1-엔도인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 제3 단계에서 수득된 응집체는 망막 전구 세포, 신경 망막 전구 세포, 광수용기 전구 세포, 광수용기 세포, 간상 광수용기 세포, 추상 광수용기 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 쌍극 세포, 망막 색소 상피 세포, 및 모양체 주변부 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 균일한 응집체는 제2 단계에서 형성되는 것인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 현탁 배양은 기저막 제제의 부재 하에서 수행되는 것인 제조 방법.
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