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WO2015088286A1 - 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2015088286A1
WO2015088286A1 PCT/KR2014/012289 KR2014012289W WO2015088286A1 WO 2015088286 A1 WO2015088286 A1 WO 2015088286A1 KR 2014012289 W KR2014012289 W KR 2014012289W WO 2015088286 A1 WO2015088286 A1 WO 2015088286A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
stem cells
stem cell
pharmaceutical composition
cerebrovascular disease
cells
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/012289
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English (en)
French (fr)
Inventor
장윤실
박원순
성동경
안소윤
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사회복지법인 삼성생명공익재단 filed Critical 사회복지법인 삼성생명공익재단
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Priority to EP14868825.2A priority patent/EP3081222B1/en
Priority to US15/103,663 priority patent/US10167448B2/en
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    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cerebrovascular disease comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • Stem cells are undifferentiated cells and have the ability to differentiate into two or more different types of cells with self-replicating ability. Stem cells can be classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells according to their differentiation capacity. It can be classified into stem cells and adult stem cells. Embryonic stem cells are derived from preimplantation fertilized eggs or developing fetal genital tissues, while adult stem cells are derived from organs present in the adult, such as bone marrow, brain, liver, and pancreas.
  • stem cells have been attempted to apply stem cells to various diseases such as cerebral infarction, traumatic nerve injury, and musculoskeletal disorders.
  • the current technical level is only to study the extraction and culture / proliferation of stem cells and the degree of injecting them, and until recently, clinical research shows that these stem cell treatments have not shown a clear effect.
  • various genetically engineered stem cells have been researched, but gene therapy using cells has limitations that cannot be applied to the human body due to ethical issues.
  • cerebrovascular disease refers to a neurologic deficit caused by a disorder of normal blood supply to the brain, and includes stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral arteriosclerosis, subarachnoid hemorrhage, cerebrothrombosis, or embolism.
  • cerebrovascular disease especially intraventricular hemorrhage and stem cell-derived exosomes.
  • the present inventors continued to develop new therapeutic agents for cerebrovascular disease, and as a result, stem cell-derived exosomes suppress the ventricle expansion in the ventricular hemorrhagic animal model, inhibit neuronal cell death and inflammatory cells.
  • the present invention was completed by confirming that it has a therapeutic effect on cerebrovascular disease.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cerebrovascular disease comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cerebrovascular disease comprising a stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • Stem cell-derived exosomes according to the present invention has excellent neuronal cell protective effects such as inhibiting the expansion of the ventricles, reducing brain hydrocephalus, inhibiting neuronal cell death and inflammatory cells in the intraventricular hemorrhage (IVH) animal model Therefore, it can be usefully used for the treatment of cerebrovascular diseases including intraventricular hemorrhage.
  • IVH intraventricular hemorrhage
  • FIG. 1 is a diagram confirming the form of the stem cell-derived exosomes isolated in the present invention through SEM image analysis.
  • FIG. 2 is a diagram confirming whether the exosome markers CD63 and CD9 are normally expressed in the stem cell-derived exosomes isolated in the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram confirming whether the growth factors VEGF and HGF are normally expressed in the stem cell-derived exosomes isolated in the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the concentration of thrombin and the viability of the neuron according to time when the neuron is treated with thrombin.
  • FIG. 5 is a diagram showing the viability of neurons when treated with thrombin to the neurons, when treated with the stem cell-derived exosome of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram observing the morphology of neurons when treated with thrombin in the nerve cells, when treated with the stem cell-derived exosome of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an animal experiment design for confirming the effect of intraventricular hemorrhage treatment.
  • FIG. 8 is a view of the degree of ventricular dilatation through brain MRI image analysis 1, 6 and 28 days after IVH induction.
  • FIG. 9 is a view showing the results obtained by calculating the volume of the entire ventricle / the total brain by brain MRI image analysis 1, 6 and 28 days after IVH induction.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of negative voice in the ventricular bleeding animal model.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of the rotarod evaluation in the intraventricular bleeding animal model.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of TUNEL assay in brain tissue of intraventricular hemorrhage animal model.
  • Figure 13 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining using GFAP antibody in the brain tissue of intraventricular hemorrhage animal model.
  • Figure 14 is a diagram showing the immunohistochemical staining results using the ED-1 antibody in the brain tissue of intraventricular bleeding animal model.
  • 15 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining using MBP antibody in the brain tissue of intraventricular hemorrhage animal model.
  • Figure 16 is a diagram showing the results of measuring the concentration of inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ ) using ELISA in brain tissue of intraventricular bleeding animal model.
  • IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ inflammatory cytokines
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cerebrovascular disease comprising a stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • stem cells refers to cells that have the ability to differentiate into two or more different types of cells while having self-replicating ability as undifferentiated cells.
  • Stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, may be from any type of animal, including humans and non-human mammals, and is not limited to whether the stem cells are derived from adults or embryos Do not.
  • Stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, preferably adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, multipotent stem cells or amniotic epithelial cells, preferably mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amnion, and placenta, but is not limited thereto.
  • exosome refers to a small vesicle of membrane structure secreted from various cells.
  • the diameter of the exosome is approximately 30-100 nm, which means that the vesicle is released into the extracellular environment due to the fusion of the polycystic body and the plasma membrane.
  • Cerebrovascular disease includes stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral arteriosclerosis, subarachnoid hemorrhage, cerebrothrombosis or cerebral embolism, which is preferably intraventricular hemorrhage (IVH), but is not limited thereto. .
  • IVH intraventricular hemorrhage
  • Stem cell-derived exosomes according to the present invention has excellent neuronal cell protective effects such as inhibiting the expansion of the ventricles, reducing brain hydrocephalus, inhibiting neuronal cell death and inflammatory cells in the intraventricular hemorrhage (IVH) animal model have.
  • IVH intraventricular hemorrhage
  • stem cell-derived exosomes according to the present invention can be usefully used for the treatment of cerebrovascular diseases including intraventricular hemorrhage.
  • composition of the present invention may further contain at least one known active ingredient having a therapeutic effect of cerebrovascular disease with stem cell-derived exosomes.
  • compositions of the present invention can be administered in a dosage form, formulated in a unit dosage form suitable for administration in the body of a subject according to conventional methods in the pharmaceutical art.
  • Formulations suitable for this purpose include parenteral injectables such as injectable ampoules, injectables such as infusion bags, sprays such as aerosol preparations and the like.
  • the injection ampoule may be mixed with the injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, Ringer's solution, etc. may be used as the injection solution.
  • the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene.
  • composition of the present invention may further comprise a suitable carrier commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • a suitable carrier commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • a preservative, a painless agent, a solubilizer, or a stabilizer may be further included, and in the case of a topical administration, a base, an excipient, a lubricant, or a preservative may be further included.
  • compositions of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections, preferably directly in the ventricles of the subject in need of treatment. It is possible to engraft or transplant, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the treatment of cerebrovascular diseases.
  • the present invention also provides a method for treating cerebrovascular disease by administering a pharmaceutically effective amount of stem cell-derived exosomes to a subject.
  • the pharmaceutically effective amount can be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific pharmaceutically effective amount for a particular subject may be determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet, time of administration, Different applications are desired depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, the drug used in conjunction with or concurrently with the specific composition and similar factors well known in the medical arts.
  • the mesenchymal stem cells were diluted to a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and then cultured for 1 week by dispensing 3 ml in a 60 mm culture dish. After confirming that the cells were fully proliferated in the culture dish, the culture medium in which thrombin was diluted at a concentration of 50 U / ml was replaced, and cultured again for 24 hours. Thereafter, the culture solution was divided into 2 ml centrifuge tubes, centrifuged at 4 ° C. and 10000 g for 30 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube to remove cell debris. The supernatant was ultracentrifuged again at 4 ° C., 100,000 g for 2 hours, the supernatant was removed and exosomes were separated.
  • Exosomes isolated through the above procedure were observed through SEM images, and Western blots were used to confirm the expression of known exosome markers CD63 and CD9 (System Bioscience, Mountain View, CA, USA).
  • the proteins in the exosomes were separated, and the growth factors in the exosomes HGF and VEGF using the Procarta immunoassay kit (affymatrix, Santa Clara, CA, USA) The amount of was measured. The results are shown in FIGS. 1 to 3, respectively.
  • the exosomes obtained through the above method normally expresses the exosome markers CD63 and CD9, confirming the presence of growth factors VEGF and HGF in the exosomes It was.
  • Example 1 In order to verify the neuronal protective effect of the stem cell-derived exosomes obtained in Example 1 in vitro , the following experiment was performed.
  • the fetus was removed from the white paper at 18.5 days of gestational age, the cerebral cortex was isolated, and the neurons were cultured for 7 days. Cultured neurons induced cell death by varying the thrombin treatment concentration (10-80 U / ml) and time (8 or 16 hours). Cell viability was measured using a cell count kit (Dojindo, Kumamoto, Japan). The results are shown in FIG.
  • Example 2-1 After treatment with thrombin in the same manner as in Example 2-1 treated with 1 ml of the stem cell-derived exosomes obtained in Example 1 at a concentration of 15 ⁇ g / ml to the neuron induced cell death, cell Cell viability was measured using a count kit. The results are shown in FIGS. 5 and 6.
  • Example 1 In order to verify the cerebrovascular disease therapeutic effect of the stem cell-derived exosomes obtained in Example 1 in vivo , the following experiment was performed.
  • Brain MRI images of white papers obtained 1, 7 and 28 days after IVH induction were analyzed.
  • the extent of expansion of the ventricles was analyzed using the Image J program, and the volume of the whole ventricles / volume of the whole brain was obtained. The results are shown in FIGS. 8 and 9.
  • the ventricles of the white paper were enlarged and hydrocephalus was induced by IVH induction, whereas the group receiving mesenchymal stem cell-derived exosomes had a significant effect of reducing brain hydrocephalus. It appeared to appear.
  • the fibroblast-derived exosomes were not significantly different from the IVH induction group (IC).
  • Negative geotaxis evaluation was analyzed by placing the head of the white paper down on the inclined plate according to a conventionally known method and recording the time it takes for the head to face upwards of the inclined plane. P25, and P32 respectively.
  • rotatod evaluation to analyze the effect on long-term motor function was performed continuously from P30 to P32 according to a conventionally known method. The results are shown in FIGS. 10 and 11, respectively.
  • the IVH induction group showed significantly impaired sensory motor function compared to the normal group, and the group administered with mesenchymal stem cell-derived exosomes improved both negative appetite and rotarod evaluation It confirmed the effect.
  • TUNEL terminal deoxynycleotidyltransferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling
  • the number of TUNEL-positive cells in the IVH-induced group was significantly increased compared to the normal group, and the group to which the mesenchymal stem cell-derived exosomes were administered was the IVH-induced group and the fibroblast-derived exosomes.
  • the number of TUNEL positive cells was statistically significant. Through this, it was confirmed that mesenchymal stem cell-derived exosomes had an effect of inhibiting the increased brain cell death by intraventricular hemorrhage.
  • the IVH induction group was increased in the degree of GFAP staining compared to the normal group, the group administered with mesenchymal stem cell-derived exosomes statistically compared to the group administered with IVH-induced group and fibroblast-derived exosomes It was confirmed that the degree of GFAP staining was significantly lower. Through this, it was confirmed that the mesenchymal stem cell-derived exosomes had an effect of reducing the reactive glialization increased by intraventricular hemorrhage.
  • ED-1 antibodies mouse monoclonal, Millipore, Immunohistochemical analysis was performed using Concord Road, MA, USA; 1: 100 dilution. The results are shown in FIG.
  • the number of ED-1 positive cells in the IVH induction group was significantly increased compared to the normal group, and the group in which the mesenchymal stem cell-derived exosomes were administered was treated with the IVH induction group and fibroblast-derived exosomes. Compared with the group, the number of ED-1 positive cells was statistically significant. Through this, it was confirmed that mesenchymal stem cell-derived exosomes have an effect of reducing inflammatory cells increased by intraventricular hemorrhage.
  • myelin basic protein (MBP) antibody (rabbit polyclonal, Abcam, Cambridge, MA, USA; 1: 1000 dilution) in brain tissue sections obtained in the same manner as in Example 3-4 Immunohistochemical analysis was performed using The results are shown in FIG.
  • the degree of MBP staining was decreased in the IVH induction group compared with the normal group, and the group administered with the mesenchymal stem cell-derived exosomes was statistically compared with the group administered with the IVH induction group and fibroblast-derived exosomes. MBP staining was shown to be significantly higher. Through this, it was confirmed that mesenchymal stem cell-derived exosomes have an effect of improving myelination, which is reduced by intraventricular hemorrhage.
  • the IVH induction group was increased in the concentration of inflammatory cytokines compared to the normal group, the mesenchymal stem cell-derived exosomes group was administered to the IVH-induced group and fibroblast-derived exosomes group In comparison, the concentration of inflammatory cytokines was significantly reduced. Through this, it was confirmed that mesenchymal stem cell-derived exosomes have an effect of reducing the inflammatory response increased by intraventricular hemorrhage.
  • the stem cell-derived exosomes according to the present invention is excellent in inhibiting the expansion of the ventricles, reducing brain hydrocephalus, neuronal cell death and inflammatory cells in the intraventricular hemorrhage (IVH) animal model It has a neuronal protective effect, it was confirmed that it can be useful for the treatment of cerebrovascular diseases including intraventricular hemorrhage.
  • Stem cell-derived exosomes according to the present invention has excellent neuronal cell protective effects such as inhibiting the expansion of the ventricles, reducing brain hydrocephalus, inhibiting neuronal cell death and inflammatory cells in the intraventricular hemorrhage (IVH) animal model Therefore, it can be usefully used for the treatment of cerebrovascular diseases including intraventricular hemorrhage.
  • IVH intraventricular hemorrhage

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈(IVH) 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 뇌 수두증을 감소시키며, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 신경 세포 보호 효과를 가지고 있어, 뇌실 내 출혈 등을 비롯한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물
본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있으며, 세포학적 유래에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 분류할 수 있다. 배아 줄기세포는 착상 전 수정란이나 발생중인 태아 생식기 조직 등에서 유래하는 반면, 성체 줄기세포는 성체 내에서 존재하는 각 기관, 예를 들면 골수, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다.
최근 줄기세포를 뇌경색, 외상성 신경손상, 근골격계 질환 등 다양한 질환에 적용한 전임상, 임상 연구가 시도되고 있다. 그러나 현재 기술적인 수준은 단순히 줄기세포의 추출 및 배양/증식과 이를 주입하는 정도에 관한 연구까지만 미치고 있으며, 최근까지의 임상 연구 결과 이러한 줄기세포 치료는 아직 뚜렷한 효과를 보이지 못하고 있는 것으로 알려졌다. 이에 치료 효과를 증진하기 위한 다양한 유전자 조작 줄기세포에 대한 연구가 진행되고 있으나, 유전자를 이용한 세포 치료는 윤리적인 문제 때문에 인체에서 적용하기 불가능한 한계점이 있다.
그 외에도 줄기세포를 이용하는 치료 방법을 임상에 적용하는데 몇 가지 문제점이 있다. 예를 들어, 줄기세포가 조직에 생착한 다음 종괴 형성의 위험성이 있으며, 줄기세포 자체의 큰 크기로 인해 동맥패색을 유발하여 뇌경색을 초래할 가능성이 있고, 급성기와 같이 뇌-혈관장벽이 열린 상태에서는 뇌 내로 이동이 용이하나 만성기에서는 큰 크기로 인해 이동에 제한이 있다.
한편, 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease)은 뇌의 정상적인 혈액공급 장애에 의한 신경 질환(neurologic deficit)을 말하는 것으로, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌동맥경화증, 지주막하출혈, 뇌혈전증 또는 뇌색전증 등을 포함한다.
최근 저출산 문제는 국가적으로 가장 심각한 문제 중의 하나인데 출산산모의 평균 연령 증가와 불임으로 인한 보조생식술 이용의 증가로 인해, 태어나는 신생아들 중 미숙아 출산이 현저히 증가하고 있다. 미숙아의 삶의 질을 결정짓는 가장 주요한 인자는 치료 후 뇌신경 발달로 이 중 미숙아 뇌실 내 출혈(Intraventricular hemorrhage of premature infants)은 미숙아 출생 후 첫 1주내 흔히 발생하여, 출혈 후 수두증을 비롯한 뇌성마비, 정신지체, 청각, 시력 소실 등의 심각한 후유증을 야기하는 가장 중요하고도 위험한 질환이다. 뇌실 내로 출혈은 미숙한 주위의 뇌조직을 손상시키고 출혈 후 수두증을 야기하여 심한 뇌손상을 야기하나 현재까지 이에 대한 뚜렷한 치료법이 없어 이에 대한 치료법 개발이야 말로 미숙아 치료에 있어 가장 절실하고 시급한 과제이다.
현재까지 뇌혈관 질환 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 뇌혈관 질환, 특히 뇌실 내 출혈과 줄기세포 유래 엑소좀의 관계에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 새로운 뇌혈관 질환 치료제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 줄기세포 유래 엑소좀이 뇌실 내 출혈 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 뇌혈관 질환 치료 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈(IVH) 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 뇌 수두증을 감소시키며, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 신경 세포 보호 효과를 가지고 있어, 뇌실 내 출혈 등을 비롯한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 줄기세포 유래 엑소좀의 형태를 SEM 이미지 분석을 통해 확인한 도이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9가 정상적으로 발현되는지를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 줄기세포 유래 엑소좀에서 성장인자인 VEGF 및 HGF가 정상적으로 발현되는지를 확인한 도이다.
도 4는 신경세포에 트롬빈을 처리하였을 때, 트롬빈의 처리 농도 및 시간에 따른 신경 세포의 생존능을 나타낸 도이다.
도 5는 신경세포에 트롬빈을 처리한 후, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀을 처리하였을 때, 신경 세포의 생존능을 나타낸 도이다.
도 6은 신경세포에 트롬빈을 처리한 후, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀을 처리하였을 때, 신경 세포의 형태를 관찰한 도이다.
도 7은 뇌실 내 출혈 치료 효과를 확인하기 위한 동물 실험 디자인을 나타낸 도이다.
도 8은 IVH 유도 1, 6 및 28일 후, 뇌 MRI 이미지 분석을 통해 뇌실 확장의 정도를 관찰한 도이다.
도 9는 IVH 유도 1, 6 및 28일 후, 뇌 MRI 이미지 분석을 통해 전체 뇌실의 부피/전체 뇌의 부피를 구한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 뇌실 내 출혈 동물모델에서 음성 주지성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 뇌실 내 출혈 동물모델에서 로타로드 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 뇌실 내 출혈 동물모델의 뇌 조직에서 TUNEL 어쎄이 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 뇌실 내 출혈 동물모델의 뇌 조직에서 GFAP 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 뇌실 내 출혈 동물모델의 뇌 조직에서 ED-1 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 뇌실 내 출혈 동물모델의 뇌 조직에서 MBP 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 뇌실 내 출혈 동물모델의 뇌 조직에서 ELISA를 이용하여 염증성 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "줄기세포"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
본 발명에서 "뇌혈관 질환"은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌동맥경화증, 지주막하출혈, 뇌혈전증 또는 뇌색전증을 포함하며, 상기 뇌출혈은 바람직하게는 뇌실 내 출혈(IVH, intraventricular hemorrhage)이나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈(IVH) 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 뇌 수두증을 감소시키며, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 신경 세포 보호 효과를 가지고 있다.
따라서, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈 등을 비롯한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 함께 뇌혈관 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 뇌실 내에 직접 생착 또는 이식하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 뇌혈관 질환 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에 약학적 유효량의 줄기세포 유래 엑소좀을 투여하여 뇌혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 약학적 유효량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 개체에 대한 구체적인 약학적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 유래 엑소좀의 분리
줄기세포 유래 엑소좀을 분리하기 위하여, 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 중간엽 줄기세포를 1×105 세포/ml의 농도가 되게 희석한 후, 60 mm 배양접시에 3 ml씩 분주해 1주일간 배양하였다. 배양접시에 세포가 가득 증식된 것을 확인한 후, 50 U/ml 농도의 트롬빈(thrombin)이 희석되어있는 배양배지로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 2 ml 원심 분리 튜브에 나누어 담아 4°C, 10000 g에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 부스러기(debris)를 제거하였다. 상기 상층액을 다시 4°C, 100,000 g에서 2시간 동안 초원심분리하였으며, 상층액을 제거하고 엑소좀을 분리하였다.
상기 과정을 통해 분리한 엑소좀을 SEM 이미지를 통해 관찰하였으며, 웨스턴 블랏을 이용하여 알려진 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 확인하였다. 또한, 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 엑소좀 막을 용해한 후, 엑소좀 내의 단백질을 분리하고, Procarta immunoassay kit(affymatrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 엑소좀 내 성장인자인 HGF와 VEGF의 양을 측정하였다. 그 결과를 각각 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 방법을 통해 수득된 엑소좀은 약 100 nm 지름의 구형을 나타내는 정상적인 형태를 보임을 확인하였다.
또한, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 방법을 통해 수득된 엑소좀은 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9를 정상적으로 발현하고 있으며, 엑소좀 내에 성장인자인 VEGF 및 HGF가 존재함을 확인하였다.
실시예 2. 줄기세포 유래 엑소좀의 신경 세포 보호 효과 검증
상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 유래 엑소좀의 신경 세포 보호 효과를 in vitro에서 검증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
2-1. 트롬빈 처리 농도 확인
임신 주령 18.5일이 된 백서에서 태아를 꺼내 대뇌 피질을 분리한 후, 신경세포를 7일간 배양하였다. 배양된 신경세포에 트롬빈 처리 농도 (10 내지 80 U/ml) 및 시간 (8 또는 16시간)을 달리하여 세포 사멸을 유도하였다. Cell count kit(Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 신경세포에 트롬빈을 80 U/ml의 농도로 8시간 처리하거나, 40 U/ml의 농도로 16시간 처리하였을 때, 신경세포의 생존율이 50% 정도가 됨을 확인하였으며, 이 두 가지 조건으로 이후 실험을 진행하였다.
2-2. 신경 세포 보호 효과 검증
상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 트롬빈을 처리하여 세포 사멸이 유도된 신경세포에 상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 15 μg/ml의 농도로 1 ml을 처리한 후, cell count kit를 이용하여 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 트롬빈을 처리하여 세포 사멸이 유도된 신경세포에 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 처리할 경우, 신경 세포의 사멸 정도가 현저하게 억제되었다. 상기 결과를 통하여, 줄기세포 유래 엑소좀이 신경세포 보호 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 3. 줄기세포 유래 엑소좀의 뇌실 내 출혈 동물모델에서의 치료 효과 검증
상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 유래 엑소좀의 뇌혈관 질환 치료 효과를 in vivo에서 검증하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
3-1. 뇌실 내 출혈 동물모델 및 실험 디자인
실험 동물로는 수컷 SD 백서(Sprague-Dawley rats, Orient Co, Seoul, Korea)를 이용하였으며, 실험은 출생 4일째(P4)부터 32일(P32)까지 진행되었다. 뇌실 내 출혈(IVH)을 유도하기 위하여, P4의 백서를 1.5% 내지 2% 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 마취시킨 후, 어미 백서의 미정맥으로부터 채취한 200 μL의 혈액을 stereotaxic guidance (Digital Stereotaxic Instrument with Fine Drive, MyNeurolab, St. Louis, MO; coordinates: x=±0.5, y=+1.0, z=+2.5 mm relative to bregma)를 이용하여 천천히 양측 뇌실 내로 투여하였다(오른쪽, 왼쪽 뇌실에 각각 100 μl씩 투여). 대조군(NC)의 경우, 혈액 투여 없이 동일한 수술만 수행하였다. IVH 유도 1일 후인, 출생 5일째(P5) 백서의 뇌를 7-teslar MRI를 이용하여 촬영하여, 뇌실 내 출혈이 정상적으로 유도되었는지를 확인하였다. IVH 유도 2일 후인, 출생 6일째(P6) 백서를 1.5% 내지 2% 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 마취시킨 후, 식염수(saline)(IC), 20 μg 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(IM exo), 또는 20 μg 섬유아세포(fibroblast) 유래 엑소좀(IF exo)을 각 백서의 오른쪽 뇌실 내로 천천히 투여하였다. IVH 유도 7 및 28일 후(P11 및 P32)에 백서의 뇌 MRI 이미지를 수득하였으며, IVH 유도 28일 후 백서를 희생시켜 뇌 조직을 분석하였다. 이상의 구체적인 실험 디자인을 도 7에 나타내었다.
3-2. 뇌 MRI 이미지 분석
IVH 유도 1, 7 및 28일 후 수득한 백서의 뇌 MRI 이미지를 분석하였다. Image J 프로그램을 이용하여 뇌실의 확장 정도를 분석하였으며, 전체 뇌실의 volume/전체 뇌의 volume을 구하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, IVH 유도에 의해 백서의 뇌실이 확장되고 뇌 수두증(hydrocephalus)이 유발된 반면, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 현저하게 뇌 수두증의 감소 효과가 나타남을 확인하였다. 한편, 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군(IC)과 유의한 차이가 나타나지 않았다.
3-3. 감각 운동 행동 평가
음성 주지성(Negative geotaxis) 평가는 종래 공지된 방법에 따라 경사판 위에 백서의 머리가 하방을 향하도록 놓아두고, 상기 머리가 경사면 위쪽을 향하게 되는데 소요되는 시간을 기록함으로써 분석하였으며, 평가는 P11, P18, P25, 및 P32에 각각 수행하였다. 또한, 장기적인 운동 기능에 미치는 영향을 분석하기 위한 로타로드(rotatod) 평가는 종래 공지된 방법에 따라 P30에서 P32까지 연속하여 수행하였다. 그 결과를 각각 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 유의하게 손상된 감각 운동 기능을 보였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 음성 주지성 및 로타로드 평가에서 모두 호전된 효과를 보임을 확인하였다.
3-4. 세포 사멸 정도 분석
실험 종료 후, 뇌를 분리하여 파라핀에 포매시킨 후, 4 μm 두께의 파라핀을 제거한 뇌 조직 절편을 제조하였다. 뇌실 주위 백색물질 (periventricular white matter)에서의 세포 사멸을 분석하기 위하여, TUNEL(terminal deoxynycleotidyltransferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling) technique(kit S7110 ApopTag, Chemicon, Temecula, CA)를 이용한 면역형광 분석을 수행하였다. 이 때, 뇌 브레그마(Bregma)에서 +0.95 mm 내지 -0.11mm 위치(coronal section)에서 3개의 섹션을 무작위로 선정하고, 이 중 현미경으로 무작위 부위를 각각 3회 검사하여, 이들의 평균치로 통계적 분석을 시행하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다
도 12에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 TUNEL 양성 세포의 수가 크게 증가하였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군 및 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 TUNEL 양성 세포의 수가 적게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈에 의해 증가된 뇌 세포 사멸을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
3-5. 반응성 아교화 분석
반응성 아교화(reactive gliosis) 정도를 분석하기 위하여, 상기 실시예 3-4와 동일한 방법으로 수득한 뇌 조직 절편에서 종래 공지된 방법에 따라 GFAP(neuronal specific glial fibrillary acidic protein) 항체(rabbit polyclonal, Dako, Glostrup, Denmark; 1:1000 dilution)를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다
도 13에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 GFAP 염색 정도가 증가하였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군 및 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 GFAP 염색 정도가 낮게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈에 의해 증가된 반응성 아교화를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
3-6. 활성화된 미세아교세포 분석
뇌 염증 반응에서 특징적으로 관찰할 수 있는 활성화된 미세아교세포(activated microglia)를 분석하기 위하여, 상기 실시예 3-4와 동일한 방법으로 수득한 뇌 조직 절편에서 ED-1 항체 (mouse monoclonal, Millipore, Concord Road, MA, USA; 1:100 dilution)를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다
도 14에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 ED-1 양성 세포의 수가 크게 증가하였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군 및 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 ED-1 양성 세포의 수가 적게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈에 의해 증가된 염증 세포를 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
3-7. 수초화 분석
수초화(myelination) 정도를 분석하기 위하여, 상기 실시예 3-4과 동일한 방법으로 수득한 뇌 조직 절편에서 MBP(myelin basic protein) 항체 (rabbit polyclonal, Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:1000 dilution)를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다
도 15에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 MBP 염색 정도가 감소하였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군 및 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 MBP 염색 정도가 높게 나타남을 확인하였다. 이를 통해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈에 의해 손상되어 감소한 수초화를 호전시키는 효과가 있음을 확인하였다.
3-8. 염증성 사이토카인 분석
뇌 조직의 균질 현탁액에서 Milliplex MAP ELISA Kit(Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 염증성 사이토카인인 IL(Interleukin)-1α, IL-1β, IL-6 및 TNF(tumor necrosis factor)-α의 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다
도 16에 나타낸 바와 같이, IVH 유도군은 정상군에 비해 염증성 사이토카인의 농도가 증가하였으며, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군은 IVH 유도군 및 섬유아세포 유래 엑소좀을 투여한 군에 비해 통계적으로 유의하게 염증성 사이토카인의 농도가 감소됨을 확인하였다. 이를 통해, 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈에 의해 증가된 염증 반응을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈(IVH) 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 뇌 수두증을 감소시키며, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 신경 세포 보호 효과를 가지고 있어, 뇌실 내 출혈 등을 비롯한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 뇌실 내 출혈(IVH) 동물모델에서 뇌실의 확장을 억제하고, 뇌 수두증을 감소시키며, 신경세포의 사멸 및 염증 세포를 억제하는 등 우수한 신경 세포 보호 효과를 가지고 있어, 뇌실 내 출혈 등을 비롯한 뇌혈관 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 줄기세포 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막 상피세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 뇌동맥경화증, 지주막하출혈, 뇌혈전증 및 뇌색전증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 뇌실 내 출혈(IVH, intraventricular hemorrhage)인 것을 특징으로 하는, 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물.
PCT/KR2014/012289 2013-12-12 2014-12-12 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물 WO2015088286A1 (ko)

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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6295341B2 (ja) * 2014-03-18 2018-03-14 サムソン ライフ パブリック ウェルフェア ファウンデーション 幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用組成物
HK1252568A1 (zh) * 2015-06-12 2019-05-31 Hudson Institute of Medical Research 一種治療方法
KR20170085010A (ko) * 2016-01-12 2017-07-21 주식회사 강스템바이오텍 고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀
KR101843634B1 (ko) * 2016-04-15 2018-03-30 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 만성폐질환 치료용 조성물
WO2017188614A1 (ko) * 2016-04-27 2017-11-02 사회복지법인 삼성생명공익재단 미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법
KR101860266B1 (ko) * 2016-07-01 2018-05-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
WO2018004237A1 (ko) * 2016-07-01 2018-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
TWI601741B (zh) * 2016-07-11 2017-10-11 財團法人國家衛生研究院 利用前列腺素受體ｅｐ４－拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法及其應用
US20210283183A1 (en) * 2016-08-05 2021-09-16 Exostemtech Co., Ltd. Composition for preventing or treating pulmonary fibrosis containing exosome isolated from adipose-derived stem cell as active ingredient
KR101973284B1 (ko) * 2017-01-16 2019-04-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 신생아 ｈｉｅ 치료용 조성물
CN106676064A (zh) * 2017-01-20 2017-05-17 深圳中健生物技术有限公司 一种脐带血间充质干细胞培养液
KR102144593B1 (ko) * 2017-06-07 2020-08-13 주식회사 엑소스템텍 인간줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포 배양용 무혈청 배지 조성물
CN107349220A (zh) * 2017-07-26 2017-11-17 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种包含成纤维细胞外泌体的制剂及其用途
WO2019040790A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Merakris Therapeutics, Llc COMPOSITIONS CONTAINING AMNIOTIC COMPONENTS AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE
KR101980453B1 (ko) * 2017-11-29 2019-08-30 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
WO2019118817A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Purified exosome products, method of making, and methods of using
CN108823159B (zh) * 2018-07-13 2022-08-09 上海齐昔生物科技集团有限公司 Pdgf-bb对间充质干细胞释放的外泌体的影响
KR20190063453A (ko) 2019-01-15 2019-06-07 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
EP3950060A4 (en) 2019-04-04 2023-04-19 Nissan Chemical Corporation Composition for promoting secretion of extracellular vesicles
KR102268589B1 (ko) 2019-04-29 2021-06-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
WO2020222503A1 (ko) * 2019-04-29 2020-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
US20230000920A1 (en) 2019-11-28 2023-01-05 Korea Institute Of Science And Technology Novel use of milk exosomes
KR20210127510A (ko) * 2020-04-14 2021-10-22 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 당뇨병성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물
JP6967308B1 (ja) * 2020-06-30 2021-11-17 国立大学法人高知大学 胎児付属物由来組織細胞培養上清を含む脳神経障害治療剤
WO2022218443A1 (zh) * 2021-04-16 2022-10-20 卓越细胞工程(香港)有限公司 间充质干细胞来源的外泌体治疗脑卒中的方法和组合物
WO2023080413A1 (ko) * 2021-11-02 2023-05-11 주식회사 디자인셀 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN114904043B (zh) * 2022-04-28 2023-07-21 深圳市儿童医院 复合水凝胶及其制备方法和应用
KR20240019971A (ko) 2022-08-05 2024-02-14 주식회사 엠제이바이오젠 엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법
KR20240058028A (ko) * 2022-10-24 2024-05-03 주식회사 디자인셀 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN118772245B (zh) * 2024-08-06 2024-12-27 广州飞来爱生命科技有限公司 一种治疗脑梗的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013150303A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
US20130273011A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Medistem, Inc. Stem cells and stem cell generated nanoparticles for treatment of inflammatory conditions and acute radiation syndrome

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060084082A1 (en) * 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
CA2403508A1 (en) * 2000-04-18 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US8537656B2 (en) 2000-07-19 2013-09-17 Ipr Licensing, Inc. Method for compensating for multi-path of a CDMA reverse link utilizing an orthogonal channel structure
PL378334A1 (pl) 2002-12-13 2006-03-20 Celogos Kompozycja podłoża hodowlanego, sposób hodowli i sposób produkcji mioblastów, oraz ich zastosowanie
US8518390B2 (en) * 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
EP1758987A4 (en) 2004-05-03 2009-12-16 Peter Maccallum Cancer Inst METHODS FOR EXPANSION AND DIFFERENTIATION OF STEM CELLS
US8034762B2 (en) * 2004-09-02 2011-10-11 Cognosci, Inc. Treatment of subarachnoid hemorrhage with Apo E analogs
CA2623950C (en) 2005-09-30 2016-01-26 Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. Activating agent of stem cells and/or progenitor cells
WO2007049096A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) A method of expansion of endothelial progenitor cells
KR100926975B1 (ko) * 2007-08-01 2009-11-17 리젠프라임 주식회사 알지네이트로 코팅된 피브린／ｈａ 혼합체 스캐폴드를이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법
KR20180108887A (ko) * 2008-08-20 2018-10-04 안트로제네시스 코포레이션 단리된 태반 세포를 사용한 뇌졸중 치료
JP5869342B2 (ja) * 2008-11-19 2016-02-24 アンスロジェネシス コーポレーション 羊膜由来接着細胞
KR20100116812A (ko) 2009-04-23 2010-11-02 서울대학교산학협력단 세포응집을 이용한 심장줄기세포의 유도, 배양 방법 및 이 방법에 의해 제조된 줄기세포
CN103648509B (zh) 2011-03-11 2019-02-22 儿童医学中心公司 与间充质干细胞外来体相关的方法和组合物
EP2745840B1 (en) * 2011-08-16 2017-07-12 Samsung Life Public Welfare Foundation Composition including stem cell-derived microvesicles for use in promoting neurogenesis
US20140341882A1 (en) 2011-09-13 2014-11-20 Takahiro Ochiya Pharmaceutical product for preventing or treating alzheimer's disease
JP6548897B2 (ja) 2011-12-30 2019-07-24 パテル、アミット 同種異系細胞の医療用途の誘導のための方法及び組成物並びに治療的利用
KR20150059168A (ko) * 2012-07-19 2015-05-29 레뉴런 리미티드 줄기 세포 마이크로입자
US20140056842A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Jonathan Sackner-Bernstein Cellular therapeutic approaches to traumatic brain and spinal cord injury

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013150303A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
US20130273011A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Medistem, Inc. Stem cells and stem cell generated nanoparticles for treatment of inflammatory conditions and acute radiation syndrome

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAHMOOD, A. ET AL.: "Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury", JOURNAL OF NEUROTRAUMA, vol. 21, no. 1, 2004, pages 33 - 39, XP055348832 *
TEIXEIRA, F. G. ET AL.: "Mesenchymal stem cells secretome: a new paradigm for central nervous system regeneration?", CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 70, no. 20, 1 March 2013 (2013-03-01), pages 3871 - 3882, XP035325020 *
XIN, H. ET AL.: "Systemic administration of exosomes released from mesenchymal stromal cells promote functional recovery and neurovascular plasticity after stroke in rats", JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW & METABOLISM, vol. 33, no. 11, 21 August 2013 (2013-08-21), pages 1711 - 1715, XP055226654 *

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JP6190536B2 (ja) 2017-08-30
US20160333317A1 (en) 2016-11-17
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