WO2013190978A1

WO2013190978A1 - 骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法

Info

Publication number: WO2013190978A1
Application number: PCT/JP2013/065223
Authority: WO
Inventors: 義古元; 浩一仲尾次; 濱田　和彦; 範恭小澤; 雄太稲見; 美咲豊島; 浩祐藤田; 明人前田; 安史金田; 克人玉井
Original assignee: ピアス株式会社; 国立大学法人大阪大学
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-12-27
Also published as: US9486465B2; JP2014001192A; US20150111842A1; HK1203145A1; KR20150024820A; CN104394863A; JP5964670B2; KR102032768B1

Abstract

　シンナムタンニンＢ１、及び、ペンタガロイルグルコースのうちの少なくとも１種を含む骨髄幹細胞の誘引剤、及び、該誘引剤によって骨髄幹細胞を誘引する骨髄幹細胞の誘引方法を提供する。

Description

骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法

関連出願の相互参照

　本願は、日本国特願２０１２－１３９４４２号の優先権を主張し、当該日本国への出願に記載された全ての記載内容を援用するものである。当該日本国への出願の内容は、引用によって本願明細書の記載に組み込まれる。

　本発明は、骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に関する。

　骨髄幹細胞は、骨髄において生じた未だ分化していない細胞であり、様々な体内組織の細胞へ分化し得るものとして知られている。また、骨髄幹細胞は、分化を誘導する分化誘導剤の影響を受けて、機能が失われた組織においてその組織細胞に分化することにより組織の機能を回復させ得るものとして注目されている。

　具体的には、骨髄幹細胞は、例えば、炎症のある組織又は損傷を受けた組織へ血流にのって骨髄から移動した後に、分化誘導剤の影響を受けてその組織細胞へ分化し得るものとして注目されている。

　ところで、従来、骨髄幹細胞を各種の細胞に分化させ得る分化誘導剤としては、様々なものが知られており、例えば、骨髄幹細胞を心臓の筋肉細胞に分化させ得る線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor　ＦＧＦ）や血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor　ＰＤＧＦ）などが知られている（特許文献１）。

国際公開第２００５／０６３９６７号

　しかしながら、この種の分化誘導剤は、骨髄幹細胞を所定の組織細胞へと分化させる性能を有するものの、骨髄幹細胞を誘引する性能、例えば、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞を所定の体内組織へ誘引する性能が、必ずしも十分なものではないという問題がある。

　本発明は、上記の問題点等に鑑み、骨髄幹細胞の誘引性能に優れた骨髄幹細胞の誘引剤を提供することを課題とする。また、骨髄幹細胞の誘引性能に優れた骨髄幹細胞の誘引方法を提供することを課題とする。

　本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤は、シンナムタンニンＢ１、及び、ペンタガロイルグルコースのうちの少なくとも１種を含むことを特徴としている。

　本発明に係る骨髄幹細胞の誘引方法は、前記誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することを特徴としている。

生体外における細胞誘引試験の様子を模式的に示した図。生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。生体外における細胞誘引試験の結果を示す図。マウス生体における細胞誘引試験の結果を示すグラフ。

　以下に、本発明に係る骨髄幹細胞の誘引剤の実施形態について説明する。

　本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤は、シンナムタンニンＢ１、及び、ペンタガロイルグルコースのうちの少なくとも１種を含むものである。

　前記シンナムタンニンＢ１は、下記式（１）の分子構造を有する化合物である。

　前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるシンナムタンニンＢ１の濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１～１００重量％が挙げられる。

　前記骨髄幹細胞の誘引剤は、シンナムタンニンＢ１以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。

　前記シンナムタンニンＢ１を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているシンナムタンニンＢ１を適当な溶媒に溶解させることにより製造される。

　また、前記シンナムタンニンＢ１を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、ゲッケイジュ（Laurus nobilis L.）、コケモモ（Vaccinium vitis-idaea）、arameria laevigata、シナモン（Cinnamomum zeylanicum）、クロモジ（Lindera umbellate）、又はMetaxya rostrataなどの植物におけるシンナムタンニンＢ１を含む部分を抽出処理することにより製造される。

　一方、前記ペンタガロイルグルコースは、下記式（２）の分子構造を有する化合物である。

　前記骨髄幹細胞の誘引剤に含まれるペンタガロイルグルコースの濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、０．００１～１００重量％が挙げられる。

　前記骨髄幹細胞の誘引剤は、ペンタガロイルグルコース以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。

　前記ペンタガロイルグルコースを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、市販されているペンタガロイルグルコースを適当な溶媒に溶解させることにより製造される。

　また、前記ペンタガロイルグルコースを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、例えば、月見草の種子や芍薬などを抽出処理することにより製造される。

　なお、前記骨髄幹細胞の誘引剤は、シンナムタンニンＢ１又はペンタガロイルグルコースのいずれか一方を含んでいてもよく、シンナムタンニンＢ１及びペンタガロイルグルコースの両方を含んでいてもよい。

　続いて、本発明の骨髄幹細胞の誘引方法の実施形態について説明する。本実施形態の骨髄幹細胞の誘引方法は、前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引するものである。

　骨髄幹細胞は、骨髄組織に含まれており、さらに骨髄組織内で分化したり又は血流にのって骨髄組織から他の体内組織へ移動したりし得る。
　前記骨髄幹細胞としては、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞などの中胚葉性組織の細胞へ分化し得る骨髄間葉系幹細胞、赤血球や白血球などの血液細胞へ分化し得る造血幹細胞などが挙げられる。
　前記骨髄幹細胞のなかでも骨髄間葉系幹細胞は、中胚葉性組織の細胞に分化するだけでなく、神経などの外胚葉性組織、肝臓などの内胚葉性組織の細胞へも分化し得る。本発明の誘引方法において誘引される骨髄幹細胞としては、誘引された後に、より多様な細胞に分化し得るという点で、骨髄間葉系幹細胞が好ましい。

　前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、生体外において、又は生体において前記骨髄幹細胞の誘引剤により骨髄幹細胞を誘引することができる。

　具体的には、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、厚み方向に貫通する微細孔を有するメンブレン（膜）を備えた装置を用い、メンブレンの一方側に骨髄幹細胞を配し、他方側に前記骨髄幹細胞の誘引剤を配し、所定時間をおいて骨髄幹細胞をメンブレンの他方側へ誘引する方法などを実施することができる。
　また、生体外での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、スライドグラス上に播種した骨髄幹細胞の一部を掻き取り、掻き取った部分に骨髄幹細胞の誘引剤を含む培地を塗布して骨髄幹細胞の培養条件下におくことにより、掻き取った部分へ骨髄幹細胞を誘引する方法などが実施され得る。

　このような生体外での骨髄幹細胞の誘引方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体での骨髄幹細胞の誘引方法における誘引剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施され得る。

　なお、上記のような骨髄幹細胞の誘引方法における骨髄幹細胞の誘引の程度は、骨髄幹細胞を染色し、染色度を測定することにより評価できる。また、誘引された骨髄幹細胞を目視にて確認することにより評価できる。

　一方、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、前記骨髄幹細胞の誘引剤を含む水性ゲルを通常のマウスの皮下に埋め込み、マウスの骨髄幹細胞をこのマウスの静脈に注入し、所定期間マウスを飼育することにより、骨髄幹細胞を水性ゲルに誘引する方法などが実施され得る。
　また、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、マウスの骨髄幹細胞を、創傷モデルマウスの骨髄に移植するとともに、該マウスの創傷部に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布することにより、創傷部に骨髄幹細胞を誘引する方法などが実施され得る。

　なお、上記のような骨髄幹細胞の誘引方法における骨髄幹細胞の誘引の程度は、骨髄幹細胞として、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein，以下ＧＦＰともいう）を発現させたマウスの骨髄幹細胞を用いて、誘引された骨髄幹細胞における蛍光の強度を測定することにより評価できる。

　さらに、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、所定の体内組織に骨髄幹細胞の誘引剤を含有させる処置を施し、その体内組織に骨髄幹細胞を誘引する方法などが実施され得る。より具体的には、生体での骨髄幹細胞の誘引方法においては、例えば、皮膚の表皮組織（角質層など）に前記骨髄幹細胞の誘引剤を塗布などにより含有させて、血液中に存在する骨髄間葉系幹細胞を表皮組織に誘引する方法などが実施され得る。
　なお、生体での誘引方法において骨髄幹細胞が誘引されて来る体内組織としては、表皮組織の他に、筋肉組織、軟骨組織、肝臓組織などの各種組織が挙げられる。

　生体での骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、骨髄幹細胞を各種の組織細胞へ分化させる前に、骨髄幹細胞をその組織へ集積させる目的で実施される。

　前記骨髄幹細胞の誘引方法は、ヒトの生体又はヒト以外の動物の生体において実施され得る。好ましくは、前記骨髄幹細胞の誘引方法は、ヒトの生体において、例えば美容上の目的で、非治療的に実施する。

　前記骨髄幹細胞の誘引方法においては、前記シンナムタンニンＢ１又は前記ペンタガロイルグルコースが適当な濃度に希釈された誘引剤を用いることができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、骨髄幹細胞の培養液などを用いることができる。
　例えば、前記シンナムタンニンＢ１を含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、１～１００μｇ／ｍＬのシンナムタンニンＢ１濃度、より好ましくは、１０～４０μｇ／ｍＬのシンナムタンニンＢ１濃度にて使用される。
　また、例えば、前記ペンタガロイルグルコースを含む骨髄幹細胞の誘引剤は、好ましくは、０．０１～１０００μｇ／ｍＬのペンタガロイルグルコース濃度、より好ましくは、０．９４～９４μｇ／ｍＬのペンタガロイルグルコース濃度にて使用される。

　本実施形態の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法に限定されるものではない。また、本発明では、一般の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。

　次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
　シンナムタンニンＢ１（ＥＮＺＯ社製　型番「ALX-350-365-M005」）を１０μｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ダルベッコ変法イーグル培地　ＤＭＥＭ）に溶解させ、シンナムタンニンＢ１を含む誘引剤を製造した。

（実施例２）
　シンナムタンニンＢ１の濃度が２０μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例１と同様にして誘引剤を製造した。

（実施例３）
　シンナムタンニンＢ１の濃度が４０μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例１と同様にして誘引剤を製造した。

（実施例４）
　ペンタガロイルグルコース（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製　型番「G7548」）を９４ｎｇ／ｍＬ濃度となるように溶媒（ＤＭＥＭ）に溶解させ、ペンタガロイルグルコースを含む誘引剤を製造した。

（実施例５）
　ペンタガロイルグルコースの濃度が０．９４μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例４と同様にして誘引剤を製造した。

（実施例６）
　ペンタガロイルグルコースの濃度が９．４μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例４と同様にして誘引剤を製造した。

（実施例７）
　ペンタガロイルグルコースの濃度が９４μｇ／ｍＬ濃度となるようにした点以外は、実施例４と同様にして誘引剤を製造した。

　製造した各実施例の骨髄幹細胞の誘引剤を使用し、生体外における細胞誘引試験による評価を行った。図１は、該評価方法の様子を模式的に示したものである。以下、図１を参照しながら評価方法の詳細を説明する。

＜生体外における細胞誘引試験＞
　各実施例の骨髄幹細胞の誘引剤を試験用サンプルとして用意した。これに対し、陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルも用意した。
　下記において、ＦＢＳは、ウシ胎児血清を示している。また、Ｐ／Ｓは、１００ユニットペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを示している。また、（－）の記号は、配合していないことを示している。
　陰性対照サンプルとしては、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）「ＦＢＳ（－）、Ｐ／Ｓ（－）」を用意した。即ち、ＦＢＳもＰ／Ｓも含まないＤＭＥＭを用意した。
　また、陽性対照サンプルとしては、２０ｎｇ／ｍＬ　ＰＤＧＦ－ＢＢ（血小板由来成長因子　ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ社製）濃度のＤＭＥＭ溶液を用意した。即ち、ＰＤＧＦ－ＢＢを２０ｎｇ／ｍＬとなるようにＤＭＥＭで希釈した溶液を用意した。
　一方で、マウス骨髄間葉系幹細胞（以下、ｍＭＳＣともいう）をコンフルエントまで培養して回収し、該幹細胞を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように液体に懸濁することにより、細胞懸濁液を用意した。細胞を懸濁するための液体としては、１０容量％　ＦＢＳ／ＤＭＥＭ「Ｐ／Ｓ（－）」を用いた。即ち、該液体としては、ＦＢＳを１０容量％濃度となるようにＤＭＥＭで希釈した、Ｐ／Ｓを含まない液体を用いた。
　次に、複数の独立したウェルを備え、図１（ａ）に示すようにメンブレンＭによってウェルが上部ウェルＰと下部ウェルＱとに仕切られているボイデンチャンバーＢ（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ社製）を用意した。各試験用サンプルのいずれか１種と陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルとが同一のボイデンチャンバーＢにおいて試験できるように条件を設定し、該チャンバーＢの各下部ウェルに各サンプルをそれぞれ２８μＬずつアプライした。なお、ボイデンチャンバーＢのメンブレンＭとしては、商品名「Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ社製　細孔サイズ８μｍ）を用いた。
　続いて、上部ウェルＰに上記細胞懸濁液を５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４時間の培養を行った（図１（ｂ）を参照）。
　４時間培養後、図１（ｃ）に示すように、移動していないｍＭＳＣを付属のフィルターワイパーＲによってはぎ取った。そして、メンブレンＭの下側へ移動したｍＭＳＣのみをディフ・クイック染色（Ｓｙｓｍｅｘ社製キットを使用）によって染色した。
　さらに、染色像をデジタル化してコンピュータに取り込み、画像を黒と白に２値化すべく青色に染色された部分が白色になるように変換した。そして、各ウェル範囲内の輝度の平均値を画像編集ソフトウェア（商品名「フォトショップ」）の機能を用いて測定した。陰性対照サンプルおよび陽性対照サンプルにおける輝度と各試験用サンプルにおける輝度とを比較することにより、骨髄幹細胞の誘引剤のｍＭＳＣ誘引活性を評価した。

　実施例１～３の誘引剤における評価結果を輝度のグラフによって図２に示す。また、実施例４～７の誘引剤における評価結果を同様に図３に示す。
　図２及び図３から把握されるように、実施例１、２、７の骨髄幹細胞の誘引剤は、骨髄幹細胞の誘引性能において特に優れている。

＜マウスの生体における細胞誘引試験＞
　マウスの生体において骨髄幹細胞の誘引剤が骨髄幹細胞を誘引する性能を評価するために、マウスの生体を使って以下のようにして実験を行った。なお、マウス生体において創が発生すると、骨髄幹細胞が血流にのって創部分に集まり得る。そして、創部分に集まった骨髄幹細胞がサイトカインを分泌したり、創部分に集まった骨髄幹細胞が創部分の細胞へ分化したりすることにより、創が治癒し得る。従って、創部分に骨髄幹細胞の誘引剤を塗布することにより、創部分に骨髄幹細胞が誘引され、創の治癒が促進されることが予想される。

（皮膚再生試験（創傷治癒試験）方法）
１．実験材料
１－ａ．動物
　C57BLKs/J-dbm 系の遺伝的糖尿病マウス（BKS.Cg-+ Leprdb/+ Leprdb/Jcl* 、db/db マウス、メス、８週齢）を日本クレア社より６匹購入した。マウスを、水道水と固形飼料とを自由に摂取させつつ１週間以上予備飼育し、その後、９週齢のマウスを試験に供した。
１－ｂ．創傷被覆剤
・ポリウレタン製フィルムドレッシング：製品名「３Ｍテガダームトランスペアレントドレッシング１６２０」６ｃｍ×７ｃｍ（住友スリーエム社製）
１－ｃ．伸縮性包帯：製品名「シルキーテックス」（アルケア社製）
１－ｄ．被験物質
・塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）　トラフェルミン　－陽性対照
　　　　　　　製品名「フィブラストスプレー２５０」（科研製薬社製）
　　　　　　　濃度１００μｇ／ｍＬ
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）－陰性対照
・シンナムタンニンＢ１（１２０μｇ／ｍＬ濃度、４０μｇ／ｍＬ濃度）ＰＢＳ溶液
２．方法
２－ａ．皮膚全層欠損創の作製
　マウスに対する処置は、全てイソフルラン吸入麻酔下で行った。創傷作成の前日に電気バリカンと電気シェーバーとを用いて、マウスを剪毛した。
　背部皮膚を消毒用エタノールで清拭し、外科用はさみを用いて背部中央部に円形（φ１．５ｃｍ）の皮膚全層欠損創を作製した。
２－ｂ．被験物質の投与
　皮膚切除後、ｂＦＧＦ（トラフェルミン）、ＰＢＳ、又は、シンナムタンニンＢ１を創面にサイト当たり２０μＬ滴下投与した。投与は、１つの投与群あたり３匹を用いて行った。
　投与後、創面を上記のポリウレタン製フィルムドレッシングにより密封し、その上から上記の伸縮性包帯を巻いた。被覆剤の交換、及び、被験物質の投与は、週に３回、４週間にわたって実施した。そして、創作製約６０日後まで被覆剤の交換を週に１回行った。上皮が形成された後においては、被覆剤の貼付を行わなかった。
２－ｃ．観察
・創面積測定：週３回、４週間背部を写真撮影し、イメージをＰＣに取り込み、画像解析ソフト（製品名「Image J」）で創の面積を測定した。その後、創の面積を、創作製約６０日後まで、週１回測定した。

　上記のマウスの生体における創面積測定の結果を図４に示す。
　図４から把握できるように、シンナムタンニンＢ１を含む骨髄幹細胞の誘引剤によって、創部分に骨髄幹細胞が誘引され、創の治癒が促進されたと考えられる。

　以上のように、本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、骨髄幹細胞の誘引性能に優れるという効果を奏する。

　本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、所定の体内組織において骨髄幹細胞を分化させる前に、骨髄で生じた骨髄幹細胞を所定の体内組織に誘引するために使用される。即ち、本発明の骨髄幹細胞の誘引剤及び骨髄幹細胞の誘引方法は、例えば、所定の体内組織に誘引剤を含ませる処置をすることにより、血流にのって体内を循環している骨髄幹細胞をその体内組織に誘引して集積させる目的で好適に使用される。

　Ｂ：ボイデンチャンバー、　Ｐ：上部ウェル、　Ｑ：下部ウェル、　Ｍ：メンブレン、　Ｒ：フィルターワイパー。

Claims

　シンナムタンニンＢ１、及び、ペンタガロイルグルコースのうちの少なくとも１種を含むことを特徴とする骨髄幹細胞の誘引剤。
　シンナムタンニンＢ１、及び、ペンタガロイルグルコースのうちの少なくとも１種を含む骨髄幹細胞の誘引剤によって骨髄幹細胞を誘引することを特徴とする骨髄幹細胞の誘引方法。