WO2012100592A1

WO2012100592A1 - 一种两性离子亲水色谱固定相及其制备方法

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Publication number: WO2012100592A1
Application number: PCT/CN2011/082965
Authority: WO
Inventors: 梁鑫淼; 沈爱金; 郭志谋; 于龙; 曹丽伟
Original assignee: 中国科学院大连化学物理研究所
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2012-08-02
Also published as: US20130324700A1; CN102614847B; US9138721B2; CN102614847A

Description

一种两性离子亲水色谱固定相及其制备方法技术领域

本发明涉及一种新型液相色谱固定相及其制备方法，具体地说是一种键合相末端为两性离子官能团的新型亲水作用色谱固定相。技术背景

亲水作用液相色谱模式（HILIC ) 是近年来发展起来的用于分离强极性化合物的色谱技术 [Alpert, A. J. J. Chromatogr. 1990, 499， 177-196; Strege, M.A. Anal. Chem. 1998， 70, 2439-2445; Strege, M. A. et al， Anal. Chem. 2000, 72, 4629-4633; Wang, X. D. et al, J. Chromatogr. A, 2005, 1083, 58-62]。亲水作用色谱的固定相的研发是亲水作用色谱发展和应用的基础。传统的正相色谱固定相，如硅胶，氨基，氰基等可直接用于亲水作用色谱 [Guo， Y. et al, J. Chromatogr .A, 2005, 1074, 71-80; Garbis, S. D. et al, Anal.Chem. 2001 , 73, 5358-5364] , 但存在着重现性差和使用寿命短的问题。近年来专门用于亲水作用色谱的新型极性固定相得到了较大发展，包括酰胺类、羟基类、两性离子类等 [Guo， Y. et al, J. Chromatogr .A, 2005, 1074, 71-80； Irgum, K. et al, J. Sep. Sci.， 2006, 29, 1784-1821； Jandera, P., J. Sep. Sci.， 2008, 31 , 1421-1431]。发展新型色谱固定相是亲水作用色谱研究和应用的重要方面。

巯基 -烯烃和巯基 -炔烃在自由基引发剂的催化下发生的自由基点击反应在小分子和聚合物的合成和修饰中得到了广泛的应用 [Bowman, C.N. et al, Chem. Soc. Rev, 2010, 39， 1355-1387]。此类点击反应具有简单，高选择性，高转化率等特性，十分适合于制备色谱固定相。

两性离子化合物具有很好的极性和亲水性，十分适合作为亲水作用色谱固定相。传统的两性离子亲水色谱固定相其正负电荷中心垂直分布于固体基质表面，固定相表面电荷状态不容易调节 [W. Jiang et al, J. Chromatogr .A, 2006, 1127, 82-91]。基于末端为两性离子官能团的化合物制备的两性离子亲水作用色谱固定相其正负电荷中心平行于固体基质表面，表面正负电荷可以通过改变 pH值进行调控和优化。当前，尚没有此类两性离子亲水作用色谱固定相的报道和产品。发明内容

本发明的目的是提供一种新型高效液相色谱固定相及其制备方法。该固定相为键合相末端为两性离子官能团的新型亲水作用色谱固定相。该固定相的制备方法简单，用途广泛。

本发明的技术方案是：高效液相色谱固定相，其特征在于结构为：

其中 Si0₂为硅胶， x—K ^ Y是氨基酸、多肽、或者蛋白质中的一种， _n=0〜4，

R₂是乙烯基或乙炔基， X⁺代表氨基正离子， Y—代表羧基负离子。

本发明还提供了上述固定相的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a. 硅胶预处理：硅胶加入浓度为 1〜38^%的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌

1〜48小时，过滤，水洗至中性，于 100〜160°C下干燥至恒重。所得干燥硅胶置于湿度为 20%〜80%的氮气或氩气气氛中 24〜72小时，使硅胶吸水增重原重量的 0.5%〜 10%。

b. 硅胶表面聚合：将步骤 a所得水合硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂，搅拌均匀，滴加烯基或炔基硅烷，保持温度为 20〜200 °C条件下搅拌 2〜48小时。反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，固体产品在 60〜100°C条件下干燥 12〜24小时即得烯基或炔基硅胶。

所用有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷等苯系物和烷烃。有机溶剂的使用量为每克水合硅胶使用 2 mL〜100 mL有机溶剂。

所用的烯基或炔基硅烷试剂具有如下的结构：

si 或其中， n=0〜4。烯基或炔基硅烷的使用量为每克水合硅胶使用 0.5 mmol〜5 mmol。 c. 巯基点击反应：在玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中加入带巯基的两性离子化合物，在氮气氛围下加入水和极性有机溶剂，搅拌使其完全溶解，加入偶氮二异丁氰或偶氮二异庚氰，再加入步骤 b所得烯基或炔基硅胶，保持温度为 20〜200°C条件下搅拌 2〜48小时。反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在 60〜100°C条件下干燥 12小时即得两性离子型亲水作用色谱固定相。

所用的极性有机溶剂为甲醇，乙醇，二甲亚砜，四氢呋喃，丙酮， N、 N-二甲基甲酰胺等极性有机溶剂中的一种。极性有机溶剂和水的比例为 1 : 10〜10: 1.混合溶剂的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 1 mL〜100 mL。所用的带巯基的两性离子化合物为氨基酸、多肽或者由烷基链连接的两性离子化合物。带巯基的两性离子化合物的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 lmm_Ol〜100 mm_Ol。偶氮二异丁氰或偶氮二异庚氰的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 0.01mmol〜l mmoL 本发明具有如下优点：

1. 结构新颖。该固定相结构末端为两性离子官能团，且正负电荷的分布平行于固体基质表面。

2. 表面电荷可调控。本发明提供的两性离子键合相可以通过调节 pH值实现表面正负电荷的调控，从而实现离子交换特性和离子交换容量的控制和优化。

3. 应用范围广。本发明提供的两性离子固定相是一种普适型的亲水作用色谱固定相，对绝大部分极性化合物和离子化合物都具有很好的分离选择性，可广泛用于各类样品分离。

4. 制备过程简单可靠，有利于实现产业化。附图说明

图 1为使用实施例 1固定相用于多肽的分离分析色谱图；

图 2为使用实施例 1固定相用于果寡糖的分离分析色谱图；

图 3为使用实施例 1固定相用于生物碱的分离分析色谱图。具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例 1

称取 10 g球形硅胶（粒径为 5 μηι,孔径为 10 nm，比表面积 305 m²/g)，置于 250 mL玻璃烧瓶中，加入 150 mL体积浓度为 10%的盐酸溶液，加热回流 12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性， 150°C干燥 24小时。将干燥后的硅胶置于 150 mL三口玻璃瓶中，连续通入相对湿度为 50%的氮气 48小时，得到水合硅胶 10.5 g o 在通入干燥的氮气的条件下，往水合硅胶中加入 80 mL干燥的正己烷，搅拌均匀，然后滴 3.9 mL乙烯基三氯硅烷，室温下搅拌反应 24小时。反应体系过滤，依次用甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在 80°C条件下干燥 12小时即得乙烯基硅胶。取 10.9g半胱氨酸置于 250 mL玻璃烧瓶中，加入 100 mL水和 50 mL甲醇，搅拌至完全溶解，加入 200mg偶氮二异丁氰，再加入 10g乙烯基硅胶， 65°C条件下搅拌 48小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在 80°C 条件下干燥 12小时即得两性离子亲水色谱固定相 I。

实施例 2

称取 10 g球形硅胶（粒径为 5 μηι,孔径为 10 nm，比表面积 305 m²/g)，置于 250 mL玻璃烧瓶中，加入 120 mL体积浓度为 20%的硝酸溶液，加热回流 12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性， 150°C干燥 12小时。将干燥后的硅胶置于 150 mL三口玻璃瓶中，连续通入相对湿度为 70%的氮气 48小时，得到水合硅胶 10.6 g。在通入干燥的氮气的条件下，往水合硅胶中加入 50 mL干燥的甲苯，搅拌均匀，然后滴加 5.2mL乙烯基三氯硅烷， 50°C下搅拌反应 24小时。反应体系过滤，依次用甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在 60°C条件下干燥 12小时即得烷基化硅胶。取 3.6g半胱氨酸置于 250 mL玻璃烧瓶中，加入 100 mL水和 80 mL N，N-二甲基甲酰胺，搅拌至完全溶解，加入 160mg偶氮二异丁氰，再加入 10g乙烯基硅胶， 80°C条件下搅拌 24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在 70°C条件下干燥 12小时即得两性离子亲水色谱固定相 II。

实施例 3

与实施例 1不同之处在于使用谷胱甘肽代替半胱氨酸。

实施例 4

与实施例 1不同之处在于使用人血清白蛋白代替半胱氨酸。

实施例 5

与实施例 1不同之处在于使用炔丙基三氯硅烷代替乙烯基三氯硅烷。

实施例 ό

称取 10 g球形硅胶（粒径为 5 μηι, 孔径为 20nm，比表面积 150 m²/g)，置于 150 mL玻璃烧瓶中，加入 80 mL体积浓度为 10%的盐酸溶液，加热回流 8小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性， 150°C干燥 12小时。将干燥后的硅胶置于 150 mL三口玻璃瓶中，连续通入相对湿度为 80%的氮气 48小时，得到水合硅胶 10.3 在通入干燥的氮气的条件下，往水合硅胶中加入 80 mL干燥的正庚烷，搅拌均匀，然后滴加 1.9 mL乙烯基三氯硅烷，室温下搅拌反应 12小时。反应体系过滤，依次用甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在 80°C条件下干燥 12小时即得烷基化硅胶。取 5.5g半胱氨酸置于 250 mL玻璃烧瓶中，加入 100 mL水和 lOOmL甲醇，搅拌至完全溶解，加入 lOOmg偶氮二异丁氰，再加入 10g乙烯基硅胶， 70°C条件下搅拌 48小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在 80°C 条件下干燥 12小时即得两性离子亲水色谱固定相 III。

实施例 7

使用实施例 1所得两性离子亲水色谱固定相 I装填 4.6 X 150 mm色谱柱，用于多肽的分离分析。如图 1所示，（ 1 ) Leu-Gly-Gly， (2) Phe-Gly-Gly-Phe, ( 3 ) Gly-Gly-His, (4) Lys-Gly, ( 5 ) Glu-Glu, ( 6) Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe 6种不同的多肽得到了很好的分离。色谱条件为：

色谱柱： 4.6 X 150 mm

流动相： A， 20mM KH₂PO₄水溶液， pH 3.37; B，乙腈；梯度条件： 0-5 min 25% A, 5-20 min 25%-50% A, 20-25 min 50% A;

流速： l .O mL/min;

柱温： 30 °C ;

检测波长： 220 nm。

实施例 8

使用实施例 1所得两性离子亲水色谱固定相 I装填 4.6 X 150 mm色谱柱，用于果寡糖的分离分析。如图 2所示，不同聚合度的寡糖得到了很好的分离。色谱条件为：色谱柱： 4.6 X 150 mm

流动相： A，水； B，乙腈；梯度条件 0-30 min 30%-50% A， 30-45 min 50% A, 45-50 min 50%-70%A;

流速： l .O mL/min;

柱温： 30 °C ;

检测： ELS detector。实施例 9

使用实施例 1所得两性离子亲水色谱固定相 I装填 4.6X150 mm色谱柱，用于生物碱的分离分析。如图 3所示，（1) 小檗碱，（2) 阿米替林，（3)地昔帕明，（4)普萘洛尔，四种生物碱得到了很好的分离。色谱条件为：

色谱柱： 4.6X150 mm

流动相： 10%甲酸铵（lOOmM, pH3.28), 90%乙腈；

流速： 1.0 mL/min;

柱温： 30 °C;

检测波长： 265nm。

Claims

权利要求书

1 . 一种两性离子亲水色谱固定相，其特征在于：以硅胶为基质，键合相末端为两性离子官能团，其结构式如下：

O 2 其中 Si0₂为硅胶， ^ΧΛΛ^^Κ1— ^Y是氨基酸、多肽和蛋白质中的一种， n=0〜4， R₂ 是乙烯基或乙炔基， X⁺代表氨基正离子， Y—代表羧基负离子。

2. 一种权利要求书 1所述固定相的制备方法，其特征在于：

a. 硅胶预处理：硅胶加入浓度为 1〜38^%的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌 i〜48小时，过滤，水洗至中性，于 100〜160°C下干燥至恒重，所得干燥硅胶置于湿度为 20〜80%的氮气或氩气气氛中 24〜72小时，使硅胶吸水增重原重量的 0.5〜10 wt %，得水合硅胶；

b. 硅胶表面聚合：将步骤 a所得水合硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂，搅拌均匀，滴加烯基或炔基硅烷，保持温度为 20〜200 °C条件下搅拌 2〜48小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并依次用甲苯、二氯甲烷、甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，固体产品在 60〜100°C条件下干燥 12〜24小时即得烯基或炔基硅胶；

c 巯基点击反应：在玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中加入带巯基的两性离子化合物，在氮气氛围下加入水和极性有机溶剂，搅拌使其完全溶解，加入偶氮二异丁氰或偶氮二异庚氰，再加入步骤 b所得烯基或炔基硅胶，保持温度为 20〜200°C条件下搅拌 2〜48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇依次洗涤，固体产品在 60〜100°C条件下干燥 12小时即得两性离子亲水色谱固定相。

3. 按照权利要求书 2所述制备方法，其特征在于：步骤 b中有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，包括苯系物和烷烃中的一种；

步骤 b中有机溶剂的使用量为每克水合硅胶使用 2 mL〜100 mL有机溶剂。

4. 按照权利要求书 2或 3所述制备方法，其特征在于：步骤 b中有机溶剂为甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷中的一种。

5. 按照权利要求书 2所述制备方法，其特征在于：

步骤 b中所用的烯基或炔基硅烷试剂具有如下的结构：

其中， n=0〜4;

步骤 b中烯基或炔基硅烷的使用量为每克水合硅胶使用 0.5 mmol〜5 mmoL

6. 按照权利要求书 2所述制备方法，其特征在于：步骤 c中极性有机溶剂为甲醇，乙醇，二甲亚砜，四氢呋喃，丙酮， N、 N-二甲基甲酰胺中的一种；

极性有机溶剂和水的体积比为 1 _:10〜10:1；

混合溶剂的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 1 mL〜100 mL。

7. 按照权利要求书 2所述制备方法，其特征在于：

步骤 c中所用带巯基的两性离子化合物为半胱氨酸、谷胱甘肽、含有巯基的多肽或蛋白质；

步骤 c 中带巯基的两性离子化合物的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 lmmol〜100 mmol。

8. 按照权利要求书 2所述制备方法，其特征在于：

步骤 c 中偶氮二异丁氰或偶氮二异庚氰的使用量为每克烯基或炔基硅胶使用 0.01mmol〜l mmol。