WO2010050528A1

WO2010050528A1 - 抗ｍｕｃ１抗体

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Publication number: WO2010050528A1
Application number: PCT/JP2009/068531
Authority: WO
Inventors: 西村　紳一郎; 洋比能; 義人沼田; 順二小野田; 正一内藤; 巨樹大藪
Original assignee: 塩野義製薬株式会社; 国立大学法人北海道大学
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2009-10-28
Publication date: 2010-05-06
Also published as: CA2741798A1; JPWO2010050528A1; EP2351777A1; US20120040375A1; JP5773352B2; EP2351777A4; US8722856B2; EP2351777B1; CN102264765A; CN102264765B

Abstract

本発明は、正常細胞には結合せず、がん細胞に特異的な抗体を提供することを課題とする。上記課題は、本発明者らが、２，３ＳＴ糖ペプチドを抗原として用いて動物を免疫することによって得られた抗体が、予想外にも、顕著に特異的にがんに特異的な糖鎖を認識し、ひいてはそのようながん細胞特異的な糖鎖を有するＭＵＣ１を発現するがん細胞を認識し、殺傷することができることを見出したことによって、解決した。本発明は例えば、ＭＵＣ１のがん関連構造に対する特異性が、ＭＵＣ１の正常組織関連構造に対するものに比べ１００倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

Description

抗ＭＵＣ１抗体

　本発明は、抗体分野の技術に関する。より特定すると、ムチン－１に対する抗体およびこれを用いたがん治療技術に関する。

　ムチンの一種であるムチン－１（Ｍｕｃｉｎ１、本明細書以下ＭＵＣ１とも記載する）は、腫瘍関連抗原であり、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。このタンパク質は、不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（本明細書以下「Ｔｎ２０マー」とも称する；ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）、の３０～９０タンデム型反復から主として構成されることを教示する。「Ｔｎ２０マー」は、個体によって発現される反復数は、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。

　ほとんどのＭＵＣ１反応性モノクローナル抗体全ての最小配列認識は、ＡＰＤＴＲＰＡＰ内に存在し、タイプ１β-ターンであると考えられる。ＭＵＣ１タンデム型反復中の配列ＳＡＰＤＴＲＰは、免疫優性Ｂ細胞エピトープであり、タンデム型反復のＴ細胞エピトープは、五量体ＰＤＴＲＰに位置付けられている。

　腫瘍ＭＵＣ１は、一般には低グリコシル化されていて、グリコシル化部位はしばしば異常型糖鎖伸長を有する。この異常型グリコシル化が正常な潜在的(cryptic)ペプチドエピトープの露出および新規炭水化物エピトープの創出という結果を生じる。それらの高分子量（２×１０^５～５×１０^７ダルトン）ならびに広範囲なグリコシル化のために、細胞膜ムチンは柔軟な杆状体として存在し、細胞表面から比較的大きな距離で突出している。したがって、ムチンは、多糖外皮の重要な成分を形成し、おそらく抗体と免疫系の細胞との細胞接触の第１のポイントである。

　加えて、特許文献１は、抗ＭＵＣ１抗体ＤＦ３－Ｐを記載する。このＤＦ３－Ｐは、脱糖鎖ＭＵＣ１と反応し、糖鎖特異性が明らかでない。

　特許文献２は、抗ＭＵＣ１抗体７Ｆ１１，１Ｅ４を記載する。７Ｆ１１，１Ｅ４は、糖鎖付加ＭＵＣ１と結合するが、糖鎖特異性が明らかでない。

　特許文献３は、抗ＭＵＣ１抗体Ａｌｔ－１を記載する。Ａｌｔ－１は、糖鎖に依存せず結合し、糖鎖特異性が明らかでない。

　非特許文献１は、抗ＭＵＣ１抗体Ｐａｎｋｏ１，Ｐａｎｋｏ２を記載する。抗ＭＵＣ１抗体Ｐａｎｋｏ１，２は、タンデムリピートが短いとが結合が弱い。抗ＭＵＣ１抗体Ｐａｎｋｏ１，２は糖鎖特異性が明らかでない。

　非特許文献２は、免疫原に糖ペプチドを用いている点で同様の手法により作製した抗ＭＵＣ１抗体ＶＵ－２Ｇ７を開示する。糖鎖特異性認識する能力を有することが記載される。

　特許文献４が開示するＰａｎｋｏモノクローナル抗体では、まだ選択性が十分とは言えず、したがって、いまだなお、腫瘍関連ＭＵＣ１に選択的に結合し、癌におけるその影響を低減、逆転または予防することができる新規治療用組成物が必要とされている。したがって、ペプチドおよび腫瘍特異的炭水化物の両方を含むＭＵＣ１のエピトープに結合することができる結合剤を含む治療用組成物が特に必要とされている。

特許第３６９８３７０号明細書特表２００２－５０２５２１公報特表２００３－５１９０９６公報米国特許出願公開2006／0292643

Cancer Immunol Immunother 55: 1337-1347 (2006) Tumor Biology Vol. 21, No. 4, 197-210, (2000)

　本発明は、正常細胞には結合しにくく、がんに特異的な抗体を提供することを課題とする。

　上記課題は、本発明者らが、２，３ＳＴ糖ペプチド（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープ）を抗原として用いて動物を免疫することによって得られた抗体が、予想外にも、顕著に特異的にがんに特異的な糖鎖を特異的に認識し、ひいてはそのようながん細胞特異的な糖鎖を有するＭＵＣ１を発現するがん細胞を認識し、殺傷することができることを見出したことによって、解決した。

　したがって、１つの局面において、本発明は、抗体依存的細胞傷害活性を有する、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　別の局面において、本発明は、正常組織関連構造に比べ少なくとも１０００倍がん関連構造に特異性を有する、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　別の局面において、本発明は、ＭＵＣ１のがん関連構造に対する特異性が、ＭＵＣ１の正常組織関連構造に対するものに比べ１００倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　ここで、１つの実施形態において、本発明において使用される正常組織関連構造は、Neu5Acα2→3Galβ1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R（２，３ＳＴ６Ｌ）およびNeu5Acα2→3Galβ1→3[Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R（２，３ＳＴ６ＳＬ）からなる群より選択される。ここで、Neu5AcはN-アセチルノイラミン酸であり、Galはガラクトースであり、GlcNAcは、N-アセチルグルコサミンであり、GalNAcはN-アセチルガラクトサミンであり、Rは非糖部分である。

　１つの実施形態において、本発明において使用されるがん関連構造は、Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα-R（２，３ＳＴ），GalNAcα-R（Ｔｎ）およびGalβ1→3GalNAcα-R（Ｔ）からなる群より選択される。

　別の実施形態において、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子のがん関連構造への特異性は、２，３ＳＴに対する交差反応性によって表現することができる。交差反応性は、（２，３ＳＴに対するＩＣ５０／比較する糖鎖構造に対するＩＣ５０）×１００（％）の計算式で求められる。１つの実施形態において、本発明の抗体は、前記正常組織関連構造についての交差反応性が０．１％以下であり、がん関連構造（１００％）に対して、１０００倍以上の特異性を有することが示される。

　さらに別の実施形態では、この特異性は、前記がん関連構造に対して、ＩＣ_５０が１００ｎＭ以下であるものをさす。

　別の局面では、本発明は、がん細胞に対する特異性が正常細胞に対するものより少なくとも１００倍強い抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　別の局面では、本発明は、がん細胞に対する特異性が正常細胞に対するものより少なくとも１００倍強い抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　好ましい実施形態では、このがん細胞は、ＭＵＣ１発現細胞である。

　さらに別の具体的な実施形態では、使用されるがん細胞は、Ｔ－４７Ｄ株である。

　別の局面において、本発明は、ＭＵＣ１に特異的に結合しまたはこれと相互作用し、がん細胞を殺傷する能力を有する抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　１つの実施形態では、使用されるがん細胞は、腫瘍関連ＭＵＣ１を発現するものである。

　別の実施形態では、Ｔｎ１００マービオチンに対する解離定数が、１．０×１０^－９（Ｍ）よりも低いものである。好ましい実施形態では、この抗体は、１Ｂ２である。

　好ましい局面では、本発明は、Tn20マータンデム構造断片に対して結合する能力を有する、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに別の局面では、本発明は、Tn20マービオチンを用いた場合の450nmの吸光度(A20)と、Tn100マービオチンを用いた場合の450nmの吸光度(A100)の比(A100/A20)が2以下である、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに他の局面では、本発明は、Tn20マービオチンを用いた場合の450nmの吸光度(A20)と、Tn100マービオチンを用いた場合の450nmの吸光度(A100)の比(A100/A20)が2以下である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに別の局面では、本発明は、正常組織関連構造に比べ少なくとも１００倍がん関連構造に特異性を有する抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、該抗体は、ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープに対して特定のものであり、該エピトープは位置９が糖鎖結合しており、がん細胞に対して通常のＩｇＧ２ａよりも少なくとも１０％細胞傷害性が高いことを特徴とする抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに別の局面において、本発明は、２，３ＳＴ糖ペプチド（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープ）に対して特異的に惹起される、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに他の局面において、本発明は、２，３ＳＴ糖ペプチド（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープ）に対して特異的に惹起される、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　特定の実施形態では、本発明は、抗体１Ｂ２の全長配列（配列番号２および３を含む）またはその一部を有する抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子に関する。

　さらに特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体であって、該重鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、ＮＹＧＬＳ（配列番号４）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２は、ＥＮＨＰＧＳＧＩＩＹＨＮＥＫＦＲＧ（配列番号５）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３は、ＳＳＧＴＲＧＦＡＹ（配列番号６）という配列またはその改変体からなり、該軽鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２’は、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３’は、ＦＱＧＳＨＧＰＷＴ（配列番号９）という配列またはその改変体からなる、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに他の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体であって、該重鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、ＮＹＧＬＳ（配列番号４）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２は、ＥＮＨＰＧＳＧＩＩＹＨＮＥＫＦＲＧ（配列番号５）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３は、ＳＳＧＴＲＧＦＡＹ（配列番号６）という配列またはその改変体からなり、該軽鎖可変ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２’は、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３’は、ＦＱＧＳＨＧＰＷＴ（配列番号９）という配列またはその改変体からなる、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を提供する。

　さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む医薬に関する。

　さらに別の局面では、本発明の医薬は、抗がん剤である。

　別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子をコードする核酸分子（たとえば、ＤＮＡなど）を提供する。

　さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断剤に関する。

　さらに別の局面では、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む診断キットに関する。

　さらに別の局面では、本発明は抗ＭＵＣ１抗体を生産する方法であって、
Ａ）２，３ＳＴ糖ペプチド（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ(配列番号１）のアミノ酸配列に従ったエピトープ）を提供する工程；
Ｂ）該２，３ＳＴ糖ペプチドで動物を免疫して、ハイブリドーマを得る工程；および
Ｃ）該動物から２，３ＳＴ（糖）に親和性を示すハイブリドーマのクローンを選択する工程；を包含する、方法を提供する。

　本発明の抗体は、タンデム依存性が低いが、これは以下の理由で有用である。すなわち、MUC1には、多種の糖鎖が付いているが、タンデムリピート依存性の低い抗体の方がMUC1に多くの抗体が結合し、多くの抗体が結合する方が癌の治療効果は高いことが予想されるからである。

　すなわち、タンデム依存性が高い抗体は、エピトープ構造(○)が繰り返される部分にしか強く結合できないが、(○-○-○-○-○への親和性は高いが、□-△-○-■-▲への親和性は低い（ここで、▲、△、■および□は互いに異なりそれぞれ○とは異なる別のエピトープ構造を示す。）)タンデム依存性が低い抗体は、エピトープ構造(○)が1つでも強く結合できる(○-○-○-○-○への親和性は高く、□-△-○-■-▲への親和性も高い)と説明することができる。

　これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。

正常細胞にあまり結合せずにがん細胞に特異的に結合する抗体が提供された。この抗体は、さらにがん細胞殺傷能力すら有し、副作用の少ない抗がん剤として期待される。

抗体１Ｂ２とＢｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐１００(表１の化合物番号２１)の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。黒菱形は、２，３ＳＴを示し、アステリスクはＴを示し、白菱形はＴｎを示し、黒三角は２，３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。抗体ＰａｎｋｏＭａｂとＢｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐１００（表１の化合物番号２１）の結合に対する各種ＭＵＣ１糖ペプチドによる置換曲線を示す。縦軸は、各種ＭＵＣ１糖ペプチドを添加しない場合の４５０ｎｍの吸光度を１００％とした時の、各種ＭＵＣ１糖ペプチド添加した場合の４５０ｎｍの吸光度の割合を示し、横軸は各種ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。黒菱形は、２，３ＳＴを示し、アステリスクはＴを示し、白菱形はＴｎを示し、黒三角は２，３ＳＴ６Ｌを示し、白三角は２，３ＳＴ６ＳＬを示す。抗体１Ｂ２のＭＵＣ１タンデムリピート依存性を示す。縦軸は、４５０ｎｍの吸光度を示し、横軸は、ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。白菱形は２０マーを示し、黒菱形は、４０マーを示し、黒丸は６０マーを示し、アステリスクは８０マーを示し、白丸は１００マーを示す。抗体ＰａｎｋｏＭａｂのＭＵＣ１タンデムリピート依存性を示す。縦軸は、４５０ｎｍの吸光度を示し、横軸は、ＭＵＣ１糖ペプチドの濃度を示す。白ぬきは２０マーを示し、水玉は、４０マーを示し、横線は６０マーを示し、黒ぬりは１００マーを示す。抗体１Ｂ２によるヒト乳癌免疫組織の染色像を示す。左側はコントロールIgGを示し、右側は抗体１Ｂ２を示す。上パネルは腫瘍部分を示し、下パネルは、隣接する正常部分を示す。抗体１Ｂ２による抗体依存性細胞傷害活性を示す。縦軸は、抗体依存的に細胞死した細胞の割合を示し、横軸は、抗体の濃度を示す。黒菱形は抗体１Ｂ２を示し、白三角はＩｇＧ２ａを示す。癌細胞膜表面に発現するＭＵＣ１タンパク質と１Ｂ２抗体が結合するかどうかを、ＦＡＣＳにて調べた実験結果を示す。ＦＡＣＳＡｒｉａで解析した結果を示す。上は、乳癌細胞Ｔ－４７Ｄに対する結果を示し、下は、コントロールである乳腺上皮細胞１８４Ａに対する結果を示す。点線はコントロール抗体を示し、実線は、１Ｂ２抗体を示す。この結果から、１Ｂ２抗体は、乳癌細胞と強く反応するが、乳腺上皮細胞とは、ほとんど反応しないことが示された。抗体１Ｂ２の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４および１５）を示す。上２列は重鎖（配列番号１４）を示し、下２列は軽鎖（配列番号１５）を示す。下線は各ＣＤＲ部位を示す。抗体１Ｂ２の可変領域（配列番号２および３）とＰａｎｋｏ１の可変領域（配列番号１０および１１）およびＰａｎｋｏ２の可変領域（配列番号１２および１３）との間のアラインメントを示す。上２列は重鎖を示し、下２列は軽鎖を示す。下線は各ＣＤＲ部位を示す。サンドイッチイムノアッセイによるＭＵＣ１の定量のための標準曲線を示す。

　以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　（用語の定義）
　　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

　本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

　本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。

　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。

　本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。

　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。

　本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「糖」、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。代表的には、約２０種類の単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体など）が鎖状につながった物質で、生体の細胞内外のタンパク質または脂質に付いている。単糖の配列によって機能が異なり、通常は複雑に枝分かれしていて、人体には数百種類以上の多様な構造の糖鎖があると予想されており、さらに、人体において有用な構造は数万種類以上あると考えられている。細胞間での分子・細胞認識機能などタンパク質や脂質が生体内で果たす高次機能に関係していると見られているが、そのメカニズムは未解明の部分が多い。核酸、タンパク質に次ぐ第３の生命鎖として現在のライフサイエンスで注目されている。とりわけ、細胞認識におけるリガンド（情報分子）としての糖鎖の機能が期待され、その高機能材料開発への応用が研究されている。

　本明細書において「糖鎖基」とは、糖鎖が別の基と結合したときに付される名称である。糖鎖基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、糖鎖基としては、シアリルルイスＸ基、Ｎ－アセチルラクトサミン基、α１－６マンノビオース基が挙げられる。

　本明細書で使用される糖の略称のうち、Neu5AcはN-アセチルノイラミン酸であり、Galはガラクトースであり、GlcNAcは、N-アセチルグルコサミンであり、GalNAcはN-アセチルガラクトサミンであり、Rは非糖部分（たとえば、ペプチド、タンパク質、脂質など）である。

　また、糖鎖の特定の名称については、以下のように定義される。
２，３ＳＴ６Ｌ：Neu5Acα2→3Galβ1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R２，３ＳＴ６ＳＬ：Neu5Acα2→3Galβ1→3[Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R
２，３ＳＴ：Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα-R
Ｔｎ：GalNAcα-R
Ｔ：Galβ1→3GalNAcα-R
　本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも８０％同一である場合、好ましくは少なくとも９０％同一である場合、より好ましくは少なくとも９５％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

　本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ　２．２．９（２００４．５．１２　発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。

　本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＭＵＣ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

　本明細書において「フラグメント」または「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用な断片の長さは、その断片の基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。

　本明細書において、「改変体」、「改変配列」または「アナログ」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、８０％以上の相同性、より好ましくは、９０％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。

　本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよいが、天然のアミノ酸が好ましい。

　このようなポリペプチドをコードする核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

　本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子においてはＭＵＣ１への結合など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＭＵＣ１への結合など）が保持される限り、制限されない。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの５％以内、または２５個以下などであり得る。

　本明細書において「類似するアミノ酸」とは、保存的置換の関係にあるアミノ酸をいい、以下のアミノ酸が該当する。そして、本発明の特定の配列（たとえば、１Ｂ２）から、以下の置換が行われた改変体もまた、本発明の範囲内に入ることが理解される。
Ａ：Ｇ，Ｉ，Ｖ，Ｌ
Ｃ：Ｍ（含Ｓアミノ酸）
Ｄ：Ｎ、ＱまたはＥ
Ｅ：Ｎ、ＱまたはＤ
Ｆ：Ｙ、Ａなど
Ｇ：Ａ
Ｈ：Ｗなど
Ｉ：Ａ，Ｌ，Ｖ，（Ｇ）
Ｋ：Ｒ
Ｌ：Ａ，Ｉ，Ｖ，（Ｇ）
Ｍ：Ｓなど
Ｎ：Ｅ、ＤまたはＱ
Ｐ：ＨｙＰ
Ｑ：Ｎ、ＥまたはＤ
Ｒ：Ｋ
Ｓ：Ｔ、Ｙ
Ｔ：Ｓ，Ｙ
Ｖ：Ｉ，Ｌ，Ａ、（Ｇ）
Ｗ：Ｈ
Ｙ：Ｆ、Ｓ，Ｔ
　これらのアミノ酸の間の置換は、本明細書において「保存的置換」ともいう。

　本明細書において「ＭＵＣ１」とは、ムチンの一種であるムチン１のタンパク質またはその遺伝子、ＤＮＡ、核酸をいう。腫瘍関連抗原であり、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。このタンパク質は、不可欠な膜糖タンパク質の細胞外ドメインは、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（本明細書以下「Ｔｎ２０マー」とも称する；ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ（配列番号１）の３０～９０タンデム型反復から主として構成されることを教示する。「Ｔｎ２０マー」は、個体によって発現される反復数は、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。

　（抗体）
　本明細書において「抗体」とは、免疫反応において、抗原の刺激によって生体内でつくられ、抗原と特異的に結合したり反応したりするタンパク質またはそれらと同じ配列を有するものを化学合成等で生産したものを総称していう。実体は免疫グロブリンであり、Ａｂとも称する。

　本明細書において抗体の「抗原結合性断片」とは、ある抗体について、その抗体の抗原と同じ抗原に対して結合性を有する断片をいう。そのような「抗原結合性断片」の範囲に入るかどうかは、本明細書に記載される親和性のアッセイによって評価することができる。本明細書中においては、そのような親和性は、抗体に対する標識ＭＵＣ１分子の結合量を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を指標として示すことができ、ＩＣ５０値は、例えばｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＲＩＡ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐ１６５，Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ，１９７４）で算出することができる。

　本明細書において「抗ＭＵＣ１抗体」とは、ＭＵＣ１に対して惹起されたか、あるいは、それと同等の結合能を有する抗体をいう。

　本明細書において「抗体依存的細胞傷害活性」とは、抗体に依存して細胞を殺傷する能力をいう。この能力を測るためには、たとえば、本明細書において記載されるクロミウム遊離試験などを用いることができる。

　本明細書において「正常組織関連構造」とは、がん化していない正常細胞または正常組織において高発現している構造（例えば、糖鎖構造）をいう。この構造は、がん組織やがん細胞において発現量が低いことが知られている。このような正常組織関連構造の糖鎖としては、たとえば、Neu5Acα2→3Galβ1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R（２，３ＳＴ６Ｌ）およびNeu5Acα2→3Galβ1→3[Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα-R（２，３ＳＴ６ＳＬ）などをあげることができる。

　本明細書において「がん関連構造」とは、がん組織またはがん細胞において高発現している構造（例えば、糖鎖構造）をいう。この構造は、正常組織や正常細胞において発現量が低いことが知られている。このようながん関連構造の糖鎖としては、たとえば、Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα-R（２，３ＳＴ），GalNAcα-R（Ｔｎ）およびGalβ1→3GalNAcα-R（Ｔ）を挙げることができる。ここで、Neu5AcはN-アセチルノイラミン酸であり、Galはガラクトースであり、GlcNAcは、N-アセチルグルコサミンであり、GalNAcはN-アセチ
ルガラクトサミンであり、Rは非糖部分である。

　本明細書において正常組織関連構造に比べたがん関連構造に対する「特異性」とは、正常組織関連構造に比べて、がん関連構造により親和性の高い性質をいう。

　このような特異性は、交差反応性の違いによって表現することができる。交差反応性は、（がん関連構造２，３ＳＴに対するＩＣ５０／比較する糖鎖構造に対するＩＣ５０）×１００（％）の計算式で求められる。本明細書において特異性があるとは、２倍以上の差があることをいう。

　また、本明細書においてＩＣ_５０とは、５０％阻害濃度のことで、ある抗体と抗原の結合を５０％阻害するのに必要な濃度をいう。ＩＣ５０値はｌｏｇｉｓｔｉｃ曲線による回帰モデル（Ｒｏｄｂａｒｄら、Ｓｙｎｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＲＩＡ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐ１６５，Ｉｎｔ．Ａｔｏｍｉｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ，１９７４）で算出することができる。

　本明細書において「がん細胞」とは、腫瘍細胞と同じ意味で用いられ、悪性の細胞をいう。本発明が対象とする代表的ながん細胞としては、ＭＵＣ１発現細胞が挙げられる。具体的には、Ｔ－４７Ｄ細胞株、を挙げることができる。対照細胞としては、正常乳腺細胞の１８４Ａ１株を使用することができる。なお、ＭＵＣ１を発現していない乳がん細胞としては、たとえば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＣＦ－７細胞を挙げることができる。

　本明細書においてある抗原と「相互作用」するとは、結合をしないまでも、相互に何らかの影響を及ぼしあうことをいう。

　本明細書において「がん細胞を殺傷する能力」とは、ある抗体ががん細胞を殺傷する能力をいう。このような能力は、実施例に記載されているようながん細胞を対象とした、クロミウム遊離試験（実験医学別冊　すべてのバイオ研究に役立つ免疫学的プロトコール）により実施することができる。

　本明細書において「タンデム依存性」とは、ＭＵＣ１のタンデム構造のリピートが多いものほど抗体が強く結合する性質のことをいう。タンデム依存性は、たとえば、Ｔｎ２０マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ２０）と、Ｔｎ１００マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ１００）の比（Ａ１００／Ａ２０）が２以下であることを調べることによって判定することができる。

　本明細書において「Ｔｎ１００マービオチンに対する親和性」とは、Ｔｎ２０マーを５回リピートさせたタンデム構造（Ｔｎ１００マー）にビオチンを結合したものに対する親和性をいい、実施例において記載されている方法で試験することができる。

　本明細書において「Ｔｎ２０マータンデム構造断片」とは、単一のＴｎ２０マータンデム構造をさしていう。「タンデム依存性がない」とは、このタンデム構造の数にかかわらず（一つであっても）反応することができることを意味する。

　本明細書において免疫グロブリン「重鎖可変ドメイン（ＶＨ）」および「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられる。免疫グロブリンは、基本構造は同じで２本のＬ鎖（軽鎖、ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）と２本のＨ鎖（重鎖、ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）がＳ－Ｓ結合でつながり、Ｈ鎖はＣ末端側のＦｃ（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）とＮ末端側のＦａｂ（ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）の２断片がヒンジ部（ちょうつがい部）で折れ曲ってつながり、全体としてＹ字形をとる。Ｌ鎖およびＨ鎖ともにＮ末端から約１１０個のアミノ酸(Ｌ鎖の約半分の長さ)の配列は、抗原特異性に応じて部分的に異なった配列の仕方をしている。この部分を可変部(可変領域、Ｖ部）とよび、抗原特異性の決定にはＬ鎖とＨ鎖の両方の可変部（ＶＬ、ＶＨ）が関係している．可変部以外の部分は各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定であり、定常部（定常領域ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ、Ｃ部）とよぶ。定常部は約１１０個のアミノ酸からなるポリペプチド単位（相同単位）がＬ鎖では一つ（ＣＬ）、Ｈ鎖では、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤで３個（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ＩｇＭ、ＩｇＥで４個つながっていて、各単位あるいは向かいあった部位と結合して生じた部域をドメイン（ｄｏｍａｉｎ）という。

　（抗体分子の表現方法、抗原結合性断片、結合分子）
　本明細書では、格別に他の意味であると指示しない限り、抗体などの任意のポリペプチド鎖は、Ｎ終末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）で開始しＣ終末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）で終結するアミノ酸配列を有するものとして記載する。抗原結合部位がＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメイン両方を含むとき、これらは同一ポリペプチド分子に位置し得るか、好ましくは、各ドメインは別の鎖に位置し得、この場合、Ｖ_Ｈドメインは免疫グロブリンすなわち抗体の重鎖またはその断片の一部であり、またＶ_Ｌは免疫グロブリンすなわち抗体の軽鎖またはその断片の一部である。

　本明細書において「ＭＵＣ１結合分子」とは、単独または他の分子と関連して、いずれかでＭＵＣ１抗原に結合し得る任意の分子をいう。したがって、ＭＵＣ１結合分子には定義上抗体および抗体の抗原性結合断片のほか、結合部分を含む他の分子が含まれることが理解される。このような結合反応は、抗体の親和性の試験と同様の試験で判定することができる。

　本明細書において使用される「抗体または抗原結合性断片」の例には、Ｂ細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体およびキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体もしくはヒトの抗体またはその任意の断片、例えばＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片、単鎖抗体および単一ドメイン抗体が含まれる。したがって、本明細書において使用される「ＭＵＣ１結合分子」の例には、これらのＢ細胞またはハイブリドーマにより産生されるような抗体およびキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体もしくはヒトの抗体またはその任意の断片、例えばＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片、単鎖抗体および単一ドメイン抗体に他の分子が結合したものなどが含まれることが理解される。

　単鎖抗体は、１０から３０アミノ酸、好ましくは１５から２５アミノ酸からなるペプチドリンカーにより共有結合する抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインからなる。そのため、その構造は重鎖および軽鎖の定常部分を含まず、小さなペプチドスペーサーは全定常部分よりも抗原性が低いと考えられている。「キメラ抗体」とは、重鎖もしくは軽鎖またはその両方の定常領域がヒト由来である一方、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは非ヒト由来(例えば、マウス)であるか、またはヒト由来であるが、別のヒト抗体から誘導される抗体を意味する。「ＣＤＲ移植抗体」とは、超可変部位領域(ＣＤＲ)が、非ヒト(例えば、マウス)抗体または別のヒト抗体のようなドナー抗体から誘導される一方、免疫グロブリンの他の部分すべてまたは実質的にすべて、例えば定常領域および可変ドメインの高保存部分、すなわち、フレームワーク領域が、アクセプター抗体、例えば、ヒト由来の抗体から誘導される抗体を意味する。しかし、ＣＤＲ移植抗体は、フレームワーク領域中、例えば超可変領域に隣接するフレームワーク領域の一部にドナー配列の数アミノ酸を含む。「ヒト化抗体」とは、重鎖および軽鎖両方の定常および可変領域がすべてヒト由来であるか実質的にヒト由来配列と同一であり、必ずしも同一抗体由来である必要はなく、そしてマウス免疫グロブリン可変部分および定常部分の遺伝子がヒト対応物(counterpart)、例えば欧州特許０５４６０７３Ｂ１、米国特許５５４５８０６等において一般の用語で記載されるようなものにより置換えられるマウス産生抗体が含まれる抗体を意味する。

　したがって、好ましい抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、重鎖および軽鎖の可変ドメインはヒト由来であり、例えば、配列番号２、３、１４または１５の改変体（たとえば、１または数個のアミノ酸の置換・挿入、付加もしくは欠失を含むものが挙げられるがこれに限定されない。）において示される配列を有しうる。定常領域ドメインはまた、好ましくは、適当なヒト定常領域ドメイン、例えば、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈに記載されているものが含まれる。可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見いだすことが出来る。ＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する生物学的活性（たとえば、結合活性または中和活性）が保持される範囲内であれば、少なくとも１つの付加・挿入、置換または欠失による改変体も本発明に含まれる。また、各ＣＤＲ領域との相同性が９０～１００％の配列であるものが挙げられる。

　本明細書において「抗体価（ｔｉｔｅｒ）」とは、血清反応において、抗血清の単位容量中に含まれている、抗原に対して結合する抗体量をいう。実際の測定は抗血清の希釈系列に対して一定量の抗原を加えて行い、測定値は反応の生じる終末点における希釈倍数であらわす。

　本明細書において「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは抗体とその認識物質間の結合力をいう。本明細書中においては、抗体と抗原などその認識物質の解離定数を指標として親和性（Ｋ_Ｄ）を示した。親和性（Ｋ_Ｄ）の測定方法は、この分野の当業者にとって常識であり、たとえば、センサーチップを用いても求めることができる。

　フレームワークは、任意の種類のフレームワーク領域に関連し得るが、好ましくはヒト由来のものである。適当なフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。好ましい重鎖フレームワークは、ヒト重鎖フレームワークであり、例えば、配列番号２または配列番号１４において示される抗ＭＵＣ１抗体のフレームワークである。それは、配列番号２または配列番号１４に示す配列から、上記文献を参照して決定することができ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４領域の配列からなる。同様の方法で、抗ＭＵＣ１軽鎖フレームワークについては、配列番号３または配列番号１５に示す配列から、上記文献を参照して決定することができ、ＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’およびＦＲ４’領域の配列からなる。

　好ましい実施形態では、本発明はまた、配列番号２もしくは配列番号１４（１Ｂ２のＶＨ配列）のフレームワークと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第１のドメイン、または配列番号３もしくは配列番号１５（１Ｂ２のＶＬ配列）のフレームワークと実質的に同一のアミノ酸配列を有する第２のドメイン、のいずれかを含む少なくとも１つの抗原結合部位を含むＭＵＣ１結合分子を提供する。

　すべてのヒトに天然に見られるタンパク質に対し生ずるモノクローナル抗体は、典型的に、非ヒト系、例えばマウスで生産することができる。この直接の結果として、ヒトに投与されたとき、ハイブリドーマにより産生されるような異種個体抗体は、異種個体免疫グロブリンの定常部分により優勢的に仲介される望ましくない免疫応答を顕在化する。これは、長期間にわたり投与できないような抗体の使用を明らかに制限する。そのため、単一鎖、単一ドメイン、キメラ、ＣＤＲ移植、または特に、ヒトに投与したときに実質的なアレルギー応答を示さないと予測されるヒトの抗体の使用が特に好ましい。

　本発明のより好ましい抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片、またはＭＵＣ１結合分子は、少なくともａ）（ｉ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＴＮＹＧＬＳ（配列番号４）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＥＮＨＰＧＳＧＩＩＹＨＮＥＫＦＲＧ（配列番号５）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＳＳＧＴＲＧＦＡＹ（配列番号６）を有する、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）またはその断片および（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはその断片、そしてｂ）（ｉ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、この場合、ＣＤＲ１’はアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）を有し、ＣＤＲ２’はアミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を有し、ＣＤＲ３’はアミノ酸配列ＦＱＧＳＨＧＰＷＴ（配列番号９）を有する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインまたはその断片および（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはその断片、ならびにそれらの直接の等価物を含む抗体から選択される。

　他に、本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、ａ）配列中に超可変領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、当該超可変領域は、配列番号２または配列番号１４に示すようなアミノ酸配列を有する、第１のドメイン、ｂ）配列中に超可変部位、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’を含み、この場合、当該超可変領域は、配列番号３または配列番号１５に示すようなアミノ酸配列を有する、第２のドメイン、ｃ）第１のドメインのＮ終末端および第２のドメインのＣ終末端に、または第１のドメインのＣ末端および第２のドメインのＮ末端に、いずれかに結合するペプチドリンカーおよびそれらの直接の等価物を含む抗原結合部位を含む単一鎖結合分子から選択され得る。

　周知のように、１アミノ酸もしく複数のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換のようなのマイナーチェンジによって、実質的に同一性を有するオリジナルタンパク質に対応するタンパク質を生産することができる。

　本明細書において上記「直接の等価物」は、抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、（ｉ）超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、全体として、配列番号４，５または６に示す超可変領域に対し、少なくとも８０％以上の相同性、好ましくは少なくとも９０％以上の相同性、より好ましくは少なくとも９５％以上の相同性がある、任意の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、（ｉ）超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’およびＣＤＲ３’は、全体として、配列番号７，８または９に示す超可変領域に対し、少なくとも８０％以上の相同性、好ましくは少なくとも９０％以上の相同性、より好ましくは少なくとも９５％以上の相同性がある分子のいずれかを意味する。本明細書では、複数のアミノ酸配列には、当該配列を最適に並べると同様な位置で少なくとも８０％以上同一アミノ酸残基を有する場合、お互いに対し少なくとも８０％以上相同性があり、この場合、アミノ酸配列中のギャップまたは挿入が非同一残基として数えられる。

　ヒト重鎖の定常部分は、γ_１、γ_２、γ_３、γ_４、μ、α_１、α_２、δまたはεタイプ、好ましくはγタイプ、より好ましくはγ_１タイプであり得、一方、ヒト軽鎖の定常部分は、κまたはλタイプ（λ_１、λ_２およびλ_３サブタイプを含む）であり得るが、好ましくはκタイプである。すべてこれら定常部分のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔらより提供される。

　通常の手法において、従って、（ｉ）本発明の単一ドメインＭＵＣ１結合分子、本発明の単一鎖ＭＵＣ１結合分子、本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の重鎖もしくは軽鎖またはその断片をコードするＤＮＡ分子（ｉｉ）組換え手段による本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の産生のための本発明のＤＮＡ分子の使用が提供される。

　本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、以下の配列を参考にして、その配列の情報を採用することができる。たとえば、好ましくは、本発明の抗体において使用される好ましいフレームワーク配列は、以下の表において、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）では、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３およびＦＨＲ４に対応する配列であり、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）では、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３およびＦＲＬ４に対応する配列である。ＣＤＲの配列は、配列番号４～９であり、本明細書において別の箇所においても詳述されている。Ｖ_Ｈとしては、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４から構成されることができ、Ｖ_Ｌは、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４から構成されることができる。表中のＬは軽鎖、Ｈは重鎖を示し、アミノ酸は一文字表記である。Ｌ１０６Ａなどの、Ａとは軽鎖の１０６番目のアミノ酸と１０７番目のアミノ酸の間にアミノ酸が挿入されていることを意味する。

　（抗体の作製）
　本発明の抗体は、当該分野において周知の任意の方法を用いて生産することができる。そのような方法の例示は、実施例に記載されるがそれに限定されない。まず、抗原を用いて動物を免疫することによって、抗体が産生される。

　ここで、抗原の調製は、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したＭＵＣ１の一部のアミノ酸配列の一部のペプチドおよびその糖鎖結合ペプチドなどが挙げられる。そのような方法は、実施例において例示されている。得られたヒトＭＵＣ１は、アジュバントと混合し抗原として用いる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。

　また、モノクローナル抗体は、それらの哺乳動物から脾臓またはリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。細胞融合の方法は既知の方法で行うことができ、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５－４９７（１９７５））に従って作製することができる。目的タンパク質を認識する特異抗体を作製するために、上記に記載した方法に従って目的動物（たとえば、マウス）を免疫する。十分に血中抗体力価が上昇していることを確認し、採血または脾臓細胞を分離する。モノクローナル抗体、特に、Ｃ末端やリングを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、このようにして分離した脾臓細胞とミエローマ細胞を融合して作製し得る。脾臓細胞は前記で免疫した動物、好ましくはマウス由来である。ミエローマ細胞は、哺乳類由来であり、好ましくはマウスミエローマ細胞である。細胞の融合にはポリエチレングリコールなどを用い得る。融合により得られたハイブリドーマをスクリーニングおよびクローニングすることにより、望ましいハイブリドーマを選択し得る。モノクローナル抗体を作製するには、得られたハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養する。好ましくは、インビボで培養する。例えば、マウスモノクローナルを含む腹水を産生させるために、マウスの腹腔内に前記ハイブリドーマを投与する。モノクローナル抗体は、産生された腹水から、当業者に公知の方法により容易に精製され得る。最終免疫後３～１０日目に免疫動物から脾臓細胞を採取することが好ましいがこれに限定されない。

　得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂　堀江武一ら１９９４）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、センダイウイルス、ポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞は公知のものを利用できる。

　ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択し、コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。

　スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、例えば実施例に例示されるように、ハイブリドーマの培養上清について、ＭＵＣ１糖ペプチドとの反応性を指標とするＥＬＩＳＡ法に従い実施される。このスクリーニングによって、がん細胞に特異的な糖鎖を有するＭＵＣ１と特異的に反応する目的抗体産生株をスクリーニングすることができる。

　スクリーニングの結果得た目的抗体産生株のクローニングは、通常の限界希釈法、軟寒天法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。本発明の抗体産生ハイブリドーマの培養上清およびマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。またこれらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法などにより精製して、精製抗体とすることができる。

　ポリクローナル抗体は、例えば免疫原で免疫した哺乳動物から採血することにより得られる。該方法において、免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。

　免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２～３週間間隔で数回投与する。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり５０～１００μｇ程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後３～１０日目に哺乳動物の採血を行うことによって、抗血清を得ることができる。抗血清についてはそのままでも、また精製してポリクローナル抗体としても使用できる。

　ポリクローナル抗体の精製方法としては非特異的精製法と特異的精製法が挙げられる。非特異的精製法とは塩析法やイオン交換クロマトグラフィー法などにより主にイムノグロブリン画分を取得することを目的とする。特異的精製法としては固定化抗原によるアフィニティークロマトグラフィー法などが挙げられる。

　本明細書において抗体を作製するときに使用される「免疫原」とは、本明細書で使用される場合、生物において免疫応答を生じる、または引き起こす能力を有する物質を表す。本発明の抗体の製造に用いられる免疫原は、活性化ハプテンとキャリアタンパク質を用いて、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている活性エステル法により作製することができる。またＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等に記載のその他の方法、例えば、カルボジイミド法やグルタルアルデヒド法やジアゾ法によっても作製できる。

　本明細書において抗体を作製するときに使用される「キャリアタンパク質」には、抗原性を高めることが知られている各種のタンパク質をいずれも使用できる。その例としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチオグロブリン（ＢＴＧ）、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの高分子物質のほかに合成ポリペプチドなどを例示できる。

　本明細書において抗体を作製するときに使用される「ハプテン」とは、部分的な、または不完全な抗原である。ハプテンは主として低分子量の物質であり、単独では抗体の産生を刺激する能力はないが、化学的方法や架橋剤によりキャリアタンパク質と結合させて人工抗原として免疫するとハプテンに対する抗体を得ることができる。本発明においてはＭＵＣ1糖ペプチド単独で抗体を産生することは難しいと考えられることから通常は異種のタンパク質や合成ポリペプチドなどのキャリアタンパク質との複合体を調製して免疫原に用いた。

　（免疫学的測定法）
　本免疫測定方法に用いる単一特異的な抗体としては、安定的に供給しうるモノクローナル抗体が望ましいがそれに限定されず、任意の分子を用いることができる。以下、モノクローナル抗体を用いて例示する。抗体（第１のモノクローナル抗体）を固相に固定し、抗原を含む資料と共にインキュベートする工程、さらに標識した第２のモノクローナル抗体を加えて、得られた混合物をインキュベートする工程、および混合物中の生成した標識された抗原抗体複合体を検出する工程を包含するサンドイッチ免疫学的測定法が例示される。また、本発明の免疫学的測定法では、試料と、固相化した第１のモノクローナル抗体および標識した第２のモノクローナル抗体とを同時にインキュベートしてもよい。サンドイッチ免疫学的測定法としては、その検出方法により、サンドイッチ放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、サンドイッチ蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、サンドイッチ発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、サンドイッチ発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が応用しうる。定量のためには、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法が好ましい。

　本明細書において「交差反応性（以下、ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙともいう。）」は、免疫交差反応性のことをいう。ある抗原で免疫することにより得られた抗体が別の抗原（関連抗原）とも結合反応を示すときに、この反応を交差反応という。目的とする抗原とその抗体の反応量を基準とした場合に関連抗原とその抗体との反応量の程度を交差反応性として示すことができる。本明細書中においては代表的には１％、または２％、３％、あるいは０．５％、０．２％、０．１％などの親和性の相対値（％）で示すものであれば交差反応性が低いといえる。値が低いほど交差反応性が低く、目的の抗原に対して特異性を有することを示す。主に目的抗原と関連抗原の構造が非常に類似しているために起こることが多い。

　本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、メンブレン、濾紙、プラスチック性カップなどの担体に固相することができ、特に、ポリエチレンビーズが好適に用いられる。測定する試料は、ヒトの血漿、血清、血液、尿などヒトＭＵＣ１を含む試料であり得る。本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片または、ＭＵＣ１結合分子は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、または目視判定可能な官位測定法などでは金コロイドや着色ラテックスなどにより標識され得る。標識に用いられる放射性同位元素としては、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどであり、特に、¹²⁵Ｉが好適に用いられる。これらは、クロラミンＴ法、ペルオキシダーゼ法、Ｉｏｄｏｇｅｎ法、ボルトハンター法などにより、モノクローナル抗体に結合され得る。標識に用い得る酵素としては、例えば、βガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などを含む。これらは、過ヨウ素酸架橋法（仲根法）、石川らの方法（医学書院；酵素免疫測定法，第３版，７５－１２７，（１９８７）．）などによりモノクローナル抗体に結合され得る。標識に用いる蛍光物質としては、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。標識に用いる発光物質としては、ルシフェリン、ルミノール誘導体、アクリジニウムエステルなどがある。簡易測定法などでは、金コロイドや着色ラテックスを用いてもよい。

　好ましい実施態様によれば、サンドイッチＲＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＲＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固相したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、例えば¹²⁵Ｉで標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃～４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体／抗体複合体を形成する（第２反応）。洗浄後、ビーズに結合した抗原抗体複合体の放射活性をガンマーカウンターなどで検出することによりの量を測定し得る。他の好ましい実施態様によれば、サンドイッチＥＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＥＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃～４５℃、好ましくは２５℃～３７℃で、１～４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体－抗体からなる免疫複合体を形成する（第２反応）。ビーズ上の酵素活性を、酵素に特異的な基質、例えば、標識酵素がＨＲＰであればテトラメチルベンヂチン（ＴＭＢ）を介して比色法により測定し、それによりビーズ上の捕獲された量を測定し得る。比色定量は、通常の分光光度計などで行われ得る。

　抗原結合能の測定は、次のようにして測定することができる。抗原結合測定のためのＣｅｌｌ　ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製する。ヒト乳癌細胞Ｔ-47Ｄ（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ－１３３）を、細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０^６個の細胞数で播き込む。これをＣＯ_２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させる。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄する。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化する。ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングする。ＭＵＣ１抗体１００μｌを各穴に加え、室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合第２抗体１００μｌを加える。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で測定する。

　中和活性は、抗体依存性細胞傷害活性を指標に測定することが出来る。

　抗体依存性細胞傷害活性は以下のようにして測定することができる。すなわち、クロミウム遊離試験による抗体依存性細胞傷害活性を解析することができる。ヒト末梢血単核球（Ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、健常者の末梢血からＦｉｃｏｌｌ‐ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて添付文書に従って分離する。分離したＰＢＭＣは、４×１０^６個／ｍｌになるように１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを加える。

　１×１０^６個のヒト乳癌細胞株（たとえば、Ｔ‐４７Ｄ）あるいはヒト乳腺上皮細胞株（たとえば、１８４Ａ１）を含むＤＭＥＭに、^５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｎｅｒ社製）を含む生理食塩水を加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ＤＭＥＭで適宜洗浄し、規定化された量（たとえば、５×１０^４個/ｍｌ）になるようにＤＭＥＭを加える。この細胞に１Ｂ２またはマウスＩｇＧ２ａ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加え、３７℃で１時間反応させ、適量（たとえば、１００μｌ／ウェル）になるように９ウェルｖ底プレートに加える。その後、適量、たとえば１００μｌのＰＢＭＣを加え、３７℃で２時間反応させる。その後、ｐｌａｔｅを５分間、５００×ｇ、室温で遠心し、１００μｌの上清のγ線を測定器（たとえば、ＡＲＣ‐７００１（アロカ社製））にて測定する。抗体特異的な細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）は、次の計算式を用いる。

　細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）＝（実験値－自然遊離）／（最大遊離－自然遊離）×１００

　当該分野での技術水準によれば、当業者は、例えばＣＤＲグラフティング法（例えば、EP 239400）により、ヒト化抗体を作製することが出来る。

　本発明は、以下に記載のような抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子の産生のための第１および第２のＤＮＡ構成物を含む。

　第１のＤＮＡ構成物は、重鎖またはその断片をコードし、ａ)フレームワークおよび超可変領域を含み、この場合、超可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列であり、そのアミノ酸配列が配列番号４，５または６で示される、可変ドメインをコードするＶＨ領域、；このＶＨ領域は、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、そしてｂ)重鎖の定常領域の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりその定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる重鎖定常領域またはその断片、その後に続くストップコドンを含む。

　たとえば、この第１のＤＮＡ構成物は、上述のＶＨ領域と、ヒト重鎖の定常領域、より好ましくはヒトγ１鎖の定常領域をコードする。この定常領域は、ゲノム由来のＤＮＡ断片（イントロンを含む）またはｃＤＮＡ断片（イントロンを伴わない）であり得る。

　第２のＤＮＡ構成物は、軽鎖またはその断片をコードし、ａ）フレームワークおよび超可変領域を含み、この場合、超可変領域は、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’であり、そのアミノ酸配列が配列番号７，８または９で示される、可変ドメインをコードするＶＬ領域、；このＶＬ領域は、可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンから始まり可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、そしてｂ）軽鎖の定常領域の最初のアミノ酸をコードするコドンで始まりその定常領域またはその断片の最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる軽鎖定常領域またはその断片、その後に続くストップコドンを含む。好ましくは、定常領域は、ヒト軽鎖の定常領域、より好ましくは、ヒトκ鎖の定常領域をコードする。

　本発明はまた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’またはＣＤＲ３’のうちの１つ以上の残基が、例えば、変異、例えば対応するＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発により、配列番号２または配列番号１４に示される残基から誘導された抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む。本発明は、その変化した抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子をコードするＤＮＡ配列を含む。特に、本発明は、ＣＤＲ１’またはＣＤＲ２’の１つ以上の残基が配列番号７または８に示される残基から変化した抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を含む。

　第１および第２のＤＮＡ構成物では、第１および第２の部分は、イントロンで分離され得、エンハンサーは、通常、第１および第２の部分の間のイントロン中に位置し得る。転写されるが翻訳されないエンハンサーの存在は、効果的な転写を補助し得る。特定の実施態様では、第１および第２のＤＮＡ構成物は、有利にはヒト起源の重鎖遺伝子のエンハンサーを含む。

　本発明の抗体は、キメラ抗体として作製することができ、そのようなキメラ抗体の発現ベクターは、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされれば、これらのマウスＶ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結して発現させることによってキメラ抗ヒト抗体が得られる。キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡに存在するリーダー配列およびＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含んでなる。あるいは、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列およびＶ領域配列をヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを包含する。

　ヒト抗体Ｃ領域の断片は、任意のヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域のものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについてはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４、およびＬ鎖のものについてはＣλまたはＣκを各々挙げることができる。

　各ＤＮＡ構成物は、適当な制御配列の制御下、特に適当なプロモーターの制御下に置かれる。任意の種類のプロモーターが使用され得るが、ただし、それは、ＤＮＡ構成物が発現のため移される宿主生物に適用されるものである。キメラ抗体の製造のためには、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域のもとてマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびにエンハンサー／プロモーター系のような発現制御領域による制御のもとてマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含む単一の発現ベクター（例えば、ＷＯ９４／１１５２３参照）を作製する。次に、この発現ベクターにより哺乳類細胞のような宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をインビトロまたはインビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、ＷＯ９１／１６９２８参照）。

　望ましい抗体が細胞培養中またはトランスジェニック動物で産生され得る。適当なトランスジェニック動物は、適当な制御配列の下に置かれる第１および第２のＤＮＡ構成物を卵にマイクロインジェクションし、調製された卵を適当な偽妊娠の雌に移し、そして望ましい抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的方法に従い得られ得る。

　抗体鎖が細胞培養中で産生されるとき、当該ＤＮＡ構成物は、最初に、単一の発現ベクター中にまたは２つ別々であるが適合性の発現ベクター中に挿入されなければならないが、後者の場合のほうが好ましい。

　従って、本発明はまた、上記のうちの少なくとも１つのＤＮＡ構成物を含む原核細胞系または真核細胞系で複製できる発現ベクターを提供する。

　次いで、ＤＮＡ構成物を含む各発現ベクターは、適当な宿主生物に移される。ＤＮＡ構成物が２つの発現ベクターに別々に挿入されるとき、それらは、別々に、すなわち、細胞あたりの１つの型のベクターで移され得るか、共に移され得る(co-transfer)。適当な宿主生物は、微生物、酵母、または哺乳類細胞系であり、後者が好ましい。より好ましくは、哺乳類細胞系は、リンパ球由来、例えば、骨髄腫、ハイブリドーマまたは通常の不死化Ｂ細胞であり、それらは、通常、任意の内因的抗体重鎖または軽鎖を発現しない。

　したがって、本発明の抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子は、（ｉ）上記のような発現ベクターで形質転換される生物を培養すること、および（ｉｉ）当該培養物から抗ＭＵＣ１抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子を回収すること、によって作製することができる。

　ＤＮＡの精製および塩基配列の決定のために、以下の方法を用いることができる。ＰＣＲ産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするＤＮＡ断片を切り出した後、ＤＮＡの回収および精製を行い、ベクターＤＮＡに連結する。ＤＮＡの精製は、フェノールおよびクロロホルムで抽出するか（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、市販のキット（例えばＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩ；ＢＩ０１０１）を用いて行われる。ＤＮＡ断片を保持するためのベクターＤＮＡには公知のもの（例えばｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることができる。

　このようなＤＮＡとベクターＤＮＡとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン）等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターＤＮＡを調製する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記ベクターＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ　ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。本発明では、自動塩基配列決定装置（たとえば、ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　３７３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることができる。

　本発明は、ヒト化抗体としても提供されうる。そのようなヒト化抗体の作製のためにまず、ヒト抗体との相同性検索を行う。

　すなわち、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒトＴＦモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域を、データベースを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のＶ領域と比較する。また、同時にＫａｂａｔらにより、抗体のＦＲの長さ、アミノ酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグループ（ＨＳＧ：Ｈｕｍａｎ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ）（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、ＵＳ　Ｄｅｐ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆｆｉｃｅｓ，１９９１）との比較を行う。

　ヒトＨ鎖Ｖ領域の場合は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ～ＩＩＩに分類することができる。一方、ヒトＬ鎖κ鎖Ｖ領域は、ＫａｂａｔらによるＨＳＧ分類により、ＨＳＧＩ～ＩＶに分類することができる。

　従来の技術によりマウス抗体をヒト化する場合には、必要によっては、ヒト化Ｖ領域のＣＤＲの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、ＣＤＲを支持しているマウス抗体のＶ領域のＦＲの一部のアミノ酸配列をヒトＶ領域のＦＲに移植する場合がある。しかしながら、マウス抗体のＶ領域ＦＲのどのアミノ酸をヒト抗体Ｖ領域のＦＲに移植すべきかについては、一定の法則がない。従って、ＣＤＲの構造を保持するために必須のアミノ酸を特定することは、多くの努力を必要とすることが、他方、ＣＤＲが特定されると、一定の結合特異性を有することが推測されることから、本発明においては、１Ｂ２が有するＣＤＲの配列を有するものであれば、他の配列が変更されていてもよいことが理解される。

　（医薬）
　本発明の化合物またはその製薬上許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。

　投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口または例えば、直腸内、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口をあげることができる。投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。

　非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性製剤からなる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。

　局所製剤は、活性化合物を１種もしくはそれ以上の媒質、例えば鉱油、石油、多価アルコール等または局所医薬製剤に使用される他の基剤中に溶解または懸濁させて調製する。腸内投与のための製剤は、通常の担体、例えばカカオ脂、水素化脂肪、水素化脂肪カルボン酸等を用いて調製し、座剤として提供される。

　本発明では、非経口剤においても、経口剤で例示したグリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤（抗酸化剤を含む）、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。

　本発明の化合物もしくはその製薬上許容される塩の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、１日当たり０．０１～１０００μｇ／人、好ましくは５～５００μｇ／人であり、投与回数は、１日１回または分割して投与するのが好ましい。

　（診断）
　１つの局面において、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子を用いるがんの診断法、本発明の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子を含む診断剤、あるいは抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子を含む診断キットを提供する。本発明のがんの診断法、診断剤または診断キットにおいて含まれる抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子は、上述した本発明の抗体その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子の任意の実施形態でありうることが理解される。本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子は、特定のがんに特異的に結合することから、これらのがんの診断に使用されうる。

　本発明の抗体およびその断片には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合された修飾抗体でありうる。この修飾剤としては、例えば、糖鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子などが挙げられる。

　また、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子は、標識されうる。この場合、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイで使用されうる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。

　なお、一般に診断用に用いる抗体は、マウス、ウサギ、ヤギなどのヒト以外の動物を免疫して作成される。しかし、動物の免疫系では、自己の体を構成する分子に結合する抗体を産生するリンパ球は、排除または不活性化される。つまり、動物を免疫して作成した本発明の抗体のうち、ヒトのものと動物のものとで酷似した部分を抗原決定領域とした抗体は含まれない。

　本発明の抗体、抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子は、がんの診断のためまたは患者における疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用され得る。１つの実施態様において、患者のがんは、患者から得られる生物学的サンプルを、ＭＵＣ１レベルについて、あらかじめ決定されたカットオフ値と比較して評価することにより診断され得る。本明細書中で使用される適切な「生物学的サンプル」は、血液、血清、尿および/またはがん組織分泌物を含む。

　サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するための結合パートナーを使用することに関して、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。ある実施態様において、アッセイは、サンプルの残余物からのポリペプチドに結合し、そしてそれを除去するための固相支持体上に固定された結合パートナーの使用を含む。次いで、結合ポリペプチドは、レポーター基を含む第２の結合パートナーを使用して検出され得る。適切な第２の結合パートナーは、結合パートナー/ポリペプチド複合体に結合する抗体を含む。あるいは、競合アッセイが利用され得、ここでは、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そして結合パートナーとサンプルとのインキュベーション後に固定された結合パートナーに結合し得る。サンプルの成分が標識ポリペプチドの結合パートナーへの結合を阻害する程度は、サンプルと固定された結合パートナーとの反応性の指標である。

　固相支持体は、抗原が付着し得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固相支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック物質）であり得る。支持体はまた、例えば米国特許第5,359,681号に開示されるような磁性粒子または光学繊維センサーであり得る。結合因子は、当業者に公知の種々の技術（これは、特許および科学文献において十分に記載されている）を使用して、固相支持体上に固定され得る。本発明の状況において、用語「固定」は、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは抗原と支持体上の官能基との間の直接の結合であり得るか、または架橋剤を介する結合であり得る）の両方をいう。吸着によるマイクロタイタープレート中のウェルへのまたは膜への固定を用いてもよい。このような場合、吸着は、結合因子を、適切な緩衝液中で固相支持体と適切な時間量の間で接触させることにより達成され得る。接触時間は温度とともに変化するが、代表的には約１時間～約１日の間である。一般に、プラスチック製のマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルと、約10ng～約10μg、そして好ましくは約100ng～約１μgの範囲の量の結合因子との接触は、適切な量の結合因子を固定するのに十分である。

　結合因子の固相支持体への共有結合的な付着は、一般に、支持体および結合因子上の官能基（例えば、ヒドロキシルまたはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることにより達成され得る。例えば、結合因子は、ベンゾキノンを使用するかまたは支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合により、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９１　Ａ１２－Ａ１３を参照のこと）。

　特定の実施態様において、アッセイは２抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、固相支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定された抗体とサンプルとを最初に接触させ、それによりサンプル中のポリペプチドを固定された抗体に結合させることにより行われ得る。次いで、非結合のサンプルを固定されたポリペプチド－抗体複合体から除去し、そしてポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む）が添加される。次いで、固相支持体に結合して留まる第２の抗体の量が、特定のレポーター基に適切な方法を使用して決定される。

　より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定されると、支持体上の残存するタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロッキング試薬は、例えばウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ　２０^ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。次いで、固定された抗体はサンプルとともにインキュベートされ、そしてポリペプチドは抗体に結合され得る。サンプルは、インキュベーション前に、例えばリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）のような適切な希釈剤で希釈され得る。一般に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、がんを有する個体から得られたサンプル中のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間の期間である。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡において達成されるレベルの少なくとも約95％である結合のレベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡に達するのに必要な時間が、ある時間に渡って生じる結合のレベルをアッセイすることにより容易に決定され得ることを認識する。室温において、約30分のインキュベーション時間は、一般に十分である。

　次いで、非結合サンプルは、固相支持体を適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０^ＴＭを含むＰＢＳ）で洗浄することにより除去され得る。次いで、レポーター基を含む第２の抗体が固相支持体に添加され得る。例示的なレポーター基は、酵素、（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基およびビチオンを含む。抗体のレポーター基への結合は、当業者に公知の標準的な方法を使用して達成され得る。

　次いで、第２の抗体は、固定された抗体-ポリペプチド複合体とともに、結合ポリペプチドを検出するのに十分な時間量の間、インキュベートされる。適切な時間量は一般に、ある時間に渡って生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、非結合の第２の抗体は除去され、そして結合した第２の抗体がレポーター基を使用することにより検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基については、シンチレーションカウンティング法またはオートラジオグラフ法が一般に適切である。分光学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（通常は、放射性基もしくは蛍光基または酵素）と結合したアビジンを使用して検出され得る。酵素のレポーター基は一般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）、それに続く反応産物の分光学的分析または他の分析により検出され得る。

　がんの存在または非存在を決定するために、固相支持体に結合して留まるレポーター基から検出されるシグナルは、一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの実施態様において、カットオフ値は、固定された抗体ががんを有さない患者からのサンプルとともにインキュベートされた場合に得られるシグナルの平均値である。一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値を上回る３つの標準偏差であるシグナルを生じるサンプルは、がんについて陽性であると考えられる。別の実施態様において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，１９８５，１０６－７頁の方法によるＲｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒ　Ｃｕｒｖｅを使用して決定される。簡潔には、この実施態様において、カットオフ値は、診断試験結果のそれぞれの可能なカットオフ値に対応する真の陽性の割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（100％－特異性）の組のプロットから決定され得る。上部左隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最大領域を含む値）は最も正確なカットオフ値であり、そして本発明の方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プロットに沿って、偽陽性の割合を最小にするために左にシフトし得るか、または偽陰性の割合を最小にするために右にシフトし得る。一般に、本方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは、そのがんについて陽性であるとされる。

　関連する実施態様において、アッセイは、フロースルーまたはストリップ試験形式において実施され、ここで抗体は、膜上（例えば、ニトロセルロース）に固定化されている。フロースルー試験において、サンプルが膜を通過する際にサンプル内のポリペプチドは固定化抗体に結合する。次いで、第２の抗体を含む液体が膜を通過する際に、第２の標識抗体は、抗体-ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合された第２の抗体の検出は、上記のように実施され得る。ストリップ試験形式において、抗体が結合している膜の一端はサンプルを含む溶液に浸される。第２の抗体を含む領域を通る膜に沿ってそして固定化抗体の領域にまでサンプルが移動する。固定化抗体の領域における第２の抗体の濃度は、がんの存在を示す。代表的には、この部位における第２の抗体の濃度は、パターン（例えば、線）を形成し、これは、視覚的に読まれ得る。このようなパターンの非存在は、陰性の結果を示す。一般に、膜上の固定化抗体の量は、上記の形式において２抗体サンドイッチアッセイにおける陽性シグナルを生成するのに十分なレベルのポリペプチドを生物学的サンプルが含む場合、視覚的に認識し得るパターンを生成するように選択される。好ましくは、膜上の固定化抗体の量は、約25ng～約１μgの範囲であり、そしてより好ましくは、約50ng～約500ngである。このような試験は代表的には、非常に少量の生物学的サンプルと共に実施され得る。

　もちろん、本発明の抗体または抗体との使用に適切な多数の他のアッセイプロトコルが存在する。上記は、単なる例示であることが意図される。

　本発明はまた、本発明の医薬組成物を製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。

　本発明はまた、本発明の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの水和物等プロドラッグを使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。以下に示した実施例において使用した試薬、樹脂等は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ等から得ることができる。

　本実施例で用いられる略語は以下の意味を有する。
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DCM：ジクロロメタン
HBTU:1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドヘキサフルオロホスファート
HOBt：N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA：ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc:(9H-フルオレン-9-イル)メトキシカルボニル
TIS：トリイソプロピルシラン
CMP-NANA:シチジン-5’-モノホスホ-N-アセチルノイラミン酸2ナトリウム
UDP-Gal:ウリジン-5’-ジホスホ-N-ガラクトース2ナトリウム
本実施例のマイクロ波照射下における反応は、マイクロ波式有機化学合成装置グリーン・モチーフ・Ｉ（東京電子株式会社製）を用いた。

　（実施例１：ＭＵＣ１Tn20マー糖ペプチドの合成）
　実施例化合物1の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Galβ1→3GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(1)
　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてＲｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ－ＰＥＧＡ樹脂（０．０５ｍｍｏｌ／ｇ，５００ｍｇ，２５μｍｏｌ）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（７５μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（７５μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（７５μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１５０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で５分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ６　ｃｏｒｅ１）－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－［Ｏ－（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）］－４，６－ジ－Ｏ－アセチル－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル｝－Ｌ－スレオニンを１．５等量使用して同様の条件下２０分間反応した。１３ｍＭ
　ＨＯＢｔの無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（４．７５：２．２５：９３　ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下５分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＳ（９３：５：２　ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過し溶媒を留去した後、得られた残渣にエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、糖のアセチル保護体を得た。得られた保護体をメタノールに溶解して、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ　１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１を得た。
凍結乾燥粉末 (26 mg, 収率 46 %). MALDI-TOF MS: m/zcalcd for C₉₄H₁₅₂N₂₇O₃₇[M+H]⁺2251.1, found 2250.7. ESI-HRMS: m/z calcd for C₉₄H₁₄₉N₂₇O₃₇[M-2H]^2-1124.0304, found 1124.0325 [M-2H]^2-. Amino acid analysis:Ala(4) 3.9,Asp(1) 1.0, Arg(1) 1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 1.1, Pro(5) 5.4, Ser(2)1.7, Thr(3)2.8, Val(1) 1.0.。

　実施例化合物2の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(2)
　化合物１（２２．５ｍｇ）、ＣＭＰ－ＮＡＮＡ（３２．９ｍｇ）とα２，３－（Ｏ）－シアル酸糖転移酵素（４４ｍＵ）の５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２，０．１％ＢＳＡ，ｐＨ７．０）（５．０ｍｌ）溶液の条件下、２５℃で２４時間静置反応した。反応混合物は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製して凍結乾燥粉末として化合物２を得た。
凍結乾燥粉末 (20 mg, 収率 80 %). MALDI-TOF MS: m/zcalcd for C₉₄H₁₅₂N₂₇O₃₇[M+H]⁺2251.1, found 2250.7. ESI-HRMS: m/z calcd for C₉₄H₁₄₉N₂₇O₃₇[M-2H]^2-1124.0304, found 1124.0325 [M-2H]^2-. Amino acid analysis:Ala(4) 3.9,Asp(1) 1.0, Arg(1) 1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 1.1, Pro(5) 5.4, Ser(2)1.7, Thr(3)2.8, Val(1) 1.0.。

　実施例化合物3の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(3)
　化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ３Ｔｎ）－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－（３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－Ｌ－スレオニンを用い合成した。
凍結乾燥粉末 (15 mg, 収率 14 %). MALDI-TOFMS: m/z calcd for C₈₈H₁₄₁N₂₇O₃₂[M+H]⁺2089.0, found　2089.1. ESI-HRMS: m/z calcdfor C₈₈H₁₄₃N₂₇O₃₂[M+3H]³⁺697.0157, found 697.0174. Aminoacid analysis: Ala(4) 4.0, Asp(1) 1.0,Arg(1) 1.0, Gly(2) 1.9, His(1) 1.0,Pro(5) 5.2, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8, Val(1)1.0.。

　実施例化合物4の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→6GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(4)
　化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ６　Ｓｉａｌｙｌ　Ｔｎ）－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－｛［メチル－（５－アセトアミド－４，７，８，９－テトラ－Ｏ－アセチル－３，５－ジデオキシ－α－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロピラノシル）オナト－（２→６）］－３，４－ジ－Ｏ－アセチル－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル｝－Ｌ－スレオニンを用いて、合成した。糖部分の脱アセチル化を行った後、水に溶解して１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ　１２．０以下に調整して室温下６時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、精製を行い凍結乾燥粉末として化合物４を得た。
凍結乾燥粉末(2 mg, 収率15 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₉₉H₁₅₈N₂₈O₄₀[M+H]⁺2380.1, found 2380.1. ESI-HRMS: m/z calcd for C₉₉H₁₅₈N₂₈O₄₀[M+3H]³⁺794.0475, found 794.0494. Amino acid analysis: Ala(4) 3.9, Asp(1)1.0, Arg(1) 1.0, Gly(2) 1.9,His(1) 0.8, Pro(5) 5.1, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8,Val(1) 1.0.。

　実施例化合物5の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Galβ1→3[GlcNAcβ1→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(5)
　化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ７　ｃｏｒｅ２－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－｛（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－Ｏ－［２－アセトアミド－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→６）］－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル｝－Ｌ－スレオニンを用いて化合物５を得た。
凍結乾燥粉末 (51 mg, 収率： 52 %). MALDI-TOFMS: m/z calcd for C₁₀₂H₁₆₅N₂₈O₄₂[M+H]⁺2454.2, found 2454.5. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₀₂H₁₆₃N₂₈O₄₂[M-H]^-2452.1479, found 2452.1475. Amino acid analysis: Ala(4) 3.7, Asp(1)1.0, Arg(1)1.0, Gly(2) 1.9, His(1) 0.9, Pro(5) 5.2, Ser(2) 1.6, Thr(3) 2.6,Val(1) 0.9.。

　実施例化合物6の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3[GlcNAcβ1→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(6)
　化合物５およびＣＭＰ－ＮＡＮＡとα２，３－（Ｏ）－シアル酸転移酵素（５ｍＵ／ｍｌ）の５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２，０．１％ＢＳＡ，ｐＨ７．０）溶液で反応して化合物６を得た。
凍結乾燥粉末(6 mg, quant.), MALDI-TOFMS: m/z calcd for C₁₁₃H₁₈₂N₂₉O₅₀:[M+H]⁺2745.3,found 2745.8. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₁₃H₁₈₀N₂₉O₅₀[M-H]^-2743.2434, found 2743.2410.。

　実施例化合物７の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3[Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(7)
　化合物５およびＵＤＰ－Ｇａｌ，ＣＭＰ－ＮＡＮＡ、β１，４－ガラクトース転移酵素（１００ｍＵ／ｍｌ）とα２，３－（Ｏ）－シアル酸転移酵素（５ｍＵ／ｍｌ）の５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２，０．１％ＢＳＡ，ｐＨ７．０）溶液で反応して化合物７を得た。
凍結乾燥粉末(7 mg, quant.), MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₁₉H₁₉₂N₂₉O₅₅[M+H]⁺2907.3, found 2906.5. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₁₉H₁₉₀N₂₉O₅₅[M-H]^-2905.2962, found 2905.2922.。

　実施例化合物8の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3[Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(8)
　化合物５およびＵＤＰ－Ｇａｌ，ＣＭＰ－ＮＡＮＡ、β１，４－ガラクトース転移酵素（１００ｍＵ／ｍｌ）、α２，３－（Ｏ）－シアル酸転移酵素（５ｍＵ／ｍｌ）とα２，３－（Ｎ）－シアル酸転移酵素（７４ｍＵ／ｍｌ）の５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＭｎＣｌ_２，０．１％ＢＳＡ，ｐＨ７．０）溶液で反応して化合物８を得た。
凍結乾燥粉末(7 mg, 収率46 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₃₀H₂₀₉N₃₀O₆₃[M+H]⁺3198.4, found 3198.0. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₃₀H₂₀₇N₃₀O₆₃[M-H]^-3196.3916, found 3196.3899.。

　実施例化合物9の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GlcNAcβ1→6GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(9)
　化合物４と同様の条件下、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ５　ｃｏｒｅ６）－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－｛［３，４，６－トリ－Ｏ－アセチ－２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１→６）］－３，４－ジ－Ｏ－アセチル－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル｝－Ｌ－スレオニンを用いて合成した。凍結乾燥粉末(17 mg, 収率 30 %). MALDI-TOF MS: m/zcalcd for C₉₆H₁₅₅N₂₈O₃₇[M+H]⁺2292.1, found 2290.6. ESI-HRMS: m/z calcd for C₉₆H₁₅₄N₂₈O₃₇[M+2H]²⁺1146.5593, found 1146.5568. Amino acid analysis: Ala(4) 4.1, Asp(1)1.0, Arg(1) 1.0, Gly(2) 2.0,His(1) 1.0, Pro(5) 5.4, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8,Val(1) 1.0.。

　実施例化合物10の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Galβ1→3[NeuAcα2→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(10)
　化合物１と同様にして、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（Ａｃ６　２，６－Ｓｉａｌｙｌ　Ｔ）－ＯＨ：Ｎ－α－Ｆｍｏｃ－Ｏ－｛［（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）］－Ｏ－［メチル－（５－アセトアミド－４，７，８，９－テトラ－Ｏ－アセチル－３，５－ジデオキシ－α－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクト－２－ノヌロピラノシル）オナト－（２→６）］－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル｝－Ｌ－スレオニンを用いて化合物８を得た。
凍結乾燥粉末 (6 mg, 収率 39 %). MALDI-TOF MS: m/zcalcd for C₁₀₅H₁₆₉N₂₈O₄₅[M+H]⁺2542.2, found 2452.6. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₀₅H₁₇₀N₂₈O₄₅[M+2H]²⁺1271.5937, found 1271.5945. Amino acid analysis:Ala(4) 3.8, Asp(1) 1.0,Arg(1) 1.0, Gly(2) 1.9, His(1) 0.9, Pro(5) 5.2, Ser(2)1.6, Thr(3) 2.7, Val(1)0.9.。

　実施例化合物11の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(NeuAcα2→3Galβ1→3[NeuAcα2→6]GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(11)
　化合物2と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(2 mg, quant.). MALDI-TOFMS: m/z calcd for C₁₁₆H₁₈₆N₂₉O₅₃[M+H]⁺2833.3, found 2833.2. ESI-HRMS:m/z calcd for C₁₁₆H₁₁₈₇N₂₉O₅₃[M+2H]²⁺1417.1415, found 1417.1446. Amino acid analysis: Ala(4) 3.8, Asp(1)1.0,Arg(1) 1.0, Gly(2) 1.9, His(1) 0.8, Pro(5) 5.2, Ser(2) 1.6, Thr(3) 2.7,Val(1)0.9.。

　実施例化合物12の合成
H-His-Gly-Val-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα)-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(12)
化合物2と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(2 mg, 収率14 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₀₅H₁₆₉N₂₈O₄₅[M+H]⁺2542.2, found 2451.6. ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₀₅H₁₆₈N₂₈O₄₅[M+3H]³⁺848.0651, found 848.0668. Amino acid analysis: Ala(4) 4.0, Asp(1)1.0,Arg(1) 1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 0.8, Pro(5) 5.3, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8,Val(1)1.0.。

　実施例化合物13の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(13)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(11 mg, 収率20 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₆₀H₂₅₃N₅₁O₅₄[M+H]⁺3753.9, found 3751.1.ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₆₀H₂₅₃N₅₁O₅₄[M+4H]⁴⁺939.2233, found 939.2245. Amino acid analysis: Ala(4) 4.1, Asp(1)1.0, Arg(1)1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 0.9, Pro(5) 5.3, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8,Val(1) 0.9.。

　実施例化合物14の合成
H-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(14)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(4 mg, 収率12 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₂₆₄H₄₁₈N₇₉O₉₆[M+H]⁺　6231.0,found　6233.9.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₂₆₄H₄₂₁N₇₉O₉₆[M+4H]⁴⁺1558.5123, found 1558.5117.。

　実施例化合物15の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Galβ1→3GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(15)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(5 mg, 収率 35 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd forC₁₁₄H₁₈₄N₃₁O₄₃S[M+H]⁺　2707.3, found　2707.7.ESI-HRMS:m/z calcd for C₁₁₄H₁₈₅N₃₁O₄₃SNa[M+Na+2H]³⁺910.4287, found 910.4279. Amino acid analysis: Ala(4) 3.9, Asp(1)1.0, Arg(1)1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 1.2, Pro(5) 5.2, Ser(2) 1.7, Thr(3) 2.8,Val(1) 1.0. 。

　実施例化合物16の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Neu5Acα2→3Galβ1→3GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(16)
化合物2と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末 (3 mg, quant.). MALDI-TOF MS: m/zcalcd for C₁₂₅H₂₀₁N₃₂O₅₁S[M+H]⁺2998.4, found 2998.6.ESI-HRMS: m/z calcd for C₁₂₅H₂₀₃N₃₂O₅₁S[M+3H]³⁺1000.1332, found 1000.1322. Amino acid analysis: Ala(4)3.9, Asp(1) 1.0, Arg(1)1.0, Gly(2) 2.0, His(1) 1.2, Pro(5) 5.1, Ser(2) 1.7,Thr(3) 2.8, Val(1) 1.0.。

　実施例化合物17の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(17)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(3 mg, 収率39 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₀₈H₁₇₄N₃₁O₃₈S[M+H]⁺　2545.2,found　2545.1.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₁₀₈H₁₇₅N₃₁O₃₈S[M+2H]²⁺1273.1218, found 1273.1221. 。

　実施例化合物18の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(18)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(8 mg, 収率35 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₁₉₆H₃₁₂N₅₇O₇₀S[M+H]⁺　4616.2,found　4618.3.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₁₉₆H₃₁₄N₅₇O₇₀S[M+3H]³⁺1539.4161, found 1539.4167. 。

　実施例化合物19の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(19)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(8 mg, 収率24 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₂₈₄H₄₅₀N₈₃O₁₀₂S[M+H]⁺　6687.2,found　6691.5.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₂₈₄H₄₅₃N₈₃O₁₀₂S[M+4H]⁴⁺1672.5633, found 1672.5632. 。

　実施例化合物20の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(20)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(2 mg, 収率10 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₃₇₂H₅₈₈N₁₀₉O₁₃₄S[M+H]⁺　8758.2,found　8763.7.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₃₇₂H₅₉₁N₁₀₉O₁₃₄S[M+4H]⁴⁺2190.3126, found 2190.3124. 。

　実施例化合物21の合成
Biotin-PEG-linker-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(GalNAcα)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-NH₂(21)
化合物1と同様の条件により合成した。
凍結乾燥粉末(2 mg, 収率7 %). MALDI-TOF MS: m/z calcd for C₄₆₀H₇₂₆N₁₃₅O₁₆₆S[M+H]⁺　10830.2,found　10834.7.ESI-HRMS:m/zcalcd for C₄₆₀H₇₂₉N₁₃₅O₁₆₆S[M+4H]⁴⁺2708.0618, found 2708.0586. 。

　以下、実施例化合物１～２１の構造は以下のとおりである。
実施例化合物の化学構造式
化合物1

化合物2

化合物3

化合物4

化合物5

化合物6

化合物7

化合物8

化合物9

化合物10

化合物11

化合物12

化合物13

化合物14

化合物15

化合物16

化合物17

化合物18

化合物19

化合物20

化合物21

化合物番号１から２１までの名称を表１Ｃのように命名した。

　（実施例２：ＭＵＣ１特異的抗体の生産）
　（免疫原の調製）
　５ｍｇの２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(表１の化合物番号２)を０．２ｍｌの蒸留水に溶解し、８６０μｇのＳｕｌｆｏ‐ＳＭＣＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む０．２ｍｌの水溶液および０．２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え室温にて１時間反応させた。反応液に２００μｇのＳｕｌｆｏ‐ＳＭＣＣを２回追加し、マレイミド化化合物２をＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥した。

　１８．２ｍｇのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を０．２ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、６ｍｇのＳｕｌｆｏ‐ＬＣ‐ＳＰＤＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む０．２ｍｌの水溶液を加え、室温にて２時間、さらに、４℃で一晩反応させた。反応液中のＢＳＡ‐ＳＨをＰＤ‐１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にてゲルろ過を行い、精製した。さらに、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＰＤ‐１０カラムにてゲルろ過を行い、５ｍｇのマレイミド化２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０に１０ｍｇのＢＳＡ‐ＳＨ溶液を加えて溶解し、室温にて３時間反応させた。反応液を精製水に対して透析した後に、凍結乾燥し、免疫原とした。
調製した免疫原１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ａ／Ｊ　Ｊｍｓ　Ｓｌｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後および４２日後に免疫原１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに７１日後に免疫原１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。

　（ハイブリドーマの作製）
　最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３‐Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地で選択した。

　（ＭＵＣ１抗体の選定）
　細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＳＩＡは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本住友製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１０μｌのハイブリドーマ培養上清と１０μｌの緩衝液Ａ（０．５％　ウシ血清アルブミン、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％　Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）および０．０１ｎｇのＢｉｏｔｉｎ‐２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(表１の化合物番号１６)と２ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む１０μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＴＭＢ＋‐Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ‐Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、２５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０と強い親和性を示すクローン（１Ｂ２）を得た。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１Ｂ２のアイソタイプはＩｇＧ２ａであった。

　（実施例３：抗体の特異性の測定）
　（糖鎖特異性）
　抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートに、ＭＵＣ１抗体を含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、室温で３時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰとＢｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐１００(表１の化合物番号２１)、およびＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号１)、２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号２)、Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号３)、ＳＴｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号４)、２，３ＳＴ６Ｇ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号６)、２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号７)、２，３‐ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号８)、Ｃ６（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号９)、ＳＴ２‐６（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号１０)、ｄＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０(化合物番号１１)、２，３ＳＴ（ＶＴ＊Ｓ）‐２０(化合物番号１２)、４０(化合物番号１３)をそれぞれ含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋－Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ‐Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１Ｂ２は、癌細胞で高発現する糖鎖構造（Ｔ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０）に対して高い親和性を示すが、正常細胞で高発現する糖鎖構造（２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、２，３‐ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０）との交差反応性は低いことが示された（図１、表２）。

　一方、ＰａｎｋｏＭａｂ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００６年、第５５巻、１３３７－１３４７ページ）は、１Ｂ２よりも癌細胞で高発現する糖鎖構造（Ｔ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、２，３‐ＳＴ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、Ｔｎ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０）に対する親和性が低く、正常細胞で高発現する糖鎖構造（２，３ＳＴ６Ｌ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０、２，３‐ＳＴ６ＳＬ（ＤＴ＊Ｒ）‐２０）との交差反応性は、１Ｂ２よりも高いことが示された（図２、表２）。以上のことから、ＰａｎｋｏＭａｂよりも１Ｂ２の方が、癌細胞で高発現する糖鎖型ＭＵＣ１に対して特異性が高いこと、たとえば、正常組織関連構造に比べ少なくとも１００倍がん関連構造に特異性を有することが示された。あるいは、特異性は、２，３ＳＴを１００％としたときの交差反応性が前記正常組織関連構造について１％以下であるともいえる。あるいは、がん関連構造に対して、ＩＣ５０が１００ｎＭ以下であるともいえる。

　（タンデムリピート依存性）
　３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ*Ｒ)‐２０(化合物番号１７)、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ*Ｒ)-４０(化合物番号１８)、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐６０(化合物番号１９)、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐８０(化合物番号２０)、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐１００(化合物番号２１)をそれぞれ含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、室温で３０分間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、ＭＵＣ１抗体を含む１５μｌの緩衝液Ａを加え、４℃で１６時間反応させた。次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋－Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１Ｂ２は、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐４０、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐６０、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐８０、Ｂｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐１００との反応性はほぼ同じであり、タンデムリピートの長さ依存性が低い抗体であることが示された（図４）。一方、ＰａｎｋｏＭａｂは、ペプチド鎖が長い程、反応性が強いことから、タンデムリピートの長さ依存性が高い抗体であることが示された。したがって、本発明の抗体は、Ｔｎ－１００マービオチンに対する親和性が、１．０×１０^－９（Ｍ）よりも低いものであるといえ、Ｔｎ２０マータンデム構造断片に対して結合する能力を有するものであるといえる。より詳細には、本発明の抗体は、Ｔｎ２０マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ２０）と、Ｔｎ１００マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ１００）の比（Ａ１００／Ａ２０）が２以下であるともいえる。

　このことから、１Ｂ２は、ＭＵＣ１に、エピトープとなる糖鎖構造が１ヵ所あれば結合するのに対して、ＰａｎｋｏＭａｂは、ＭＵＣ１に、エピトープとなる糖鎖構造が複数ヶ所連続していないと結合しない。つまり、ＰａｎｋｏＭａｂよりも１Ｂ２の方が、ＭＵＣ１に対して、多く結合できることが予想される。

　（抗体の親和性）
　センサーチップＳＡ（ＧＥヘルスケア社製）にＢｉｏｔｉｎ‐Ｔｎ(ＤＴ＊Ｒ)‐１００(化合物番号２１)を固相化し、以下のＭＵＣ１抗体、１Ｂ２、現在前臨床段階にあるＰａｎｋｏＭａｂ（ＧＬＹＣＯＰＯＰＥ社製）、糖ペプチド免疫により得られた抗体であるＶＵ‐２Ｇ７（ＭＯＮＯＳＡＮ社製）、０．Ｎ．２７２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、Ｃ５９５（Ａｃｒｉｓ社製）、Ｂ４１６（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、ＶＵ‐３Ｃ６（Ｅｘａｌｐｈａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）についてそれぞれの解離定数をＢｉａｃｏｒｅＴ１００を用いて解析した結果、以下の表３の通りであった。表に示すとおり、解離定数Ｋ_Ｄは１Ｂ２が３．７×１０^－１０（Ｍ）、１７Ｈ２が２．２×１０^－１０（Ｍ）を示し、その他の抗体と比較して小さかった。

また、ヒト乳癌培養細胞株Ｔ‐４７Ｄ（ＡＴＣＣ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＨＴＢ‐１３３）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した上清を、Ａｍｉｃｏｎ　ｕｌｔｒａ‐１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で濃縮し、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）に置換した。２００μｌのＴ‐４７Ｄ培養上清に、Ｓｕｌｆｏ‐ＮＨＳ‐Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え、氷上で２時間反応させた。その後、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）に置換し、ビオチン標識Ｔ‐４７Ｄ培養上清とした。センサーチップＳＡ（ＧＥヘルスケア社製）にビオチン標識Ｔ‐４７Ｄ培養上清を固相化し、同様に各抗体の解離定数を解析した結果、１Ｂ２の解離定数Ｋ_Ｄは、２．６×１０^－９（Ｍ）、１７Ｈ２が２．５×１０^－９（Ｍ）を示し、その他の抗体と比較して小さかった。（表４）。

　より詳細な結果を以下に示す。

　ここで、従来技術の手法により作製した抗体から期待される効果については、VU-2G7（Tumor Biology Vol. 21, No. 4, 2000）を参酌できる。なぜなら、この抗体は従来の手法により、作製された抗体であるからである。そして、上記結果から、糖鎖特異性について、VU-2G7と、本発明の抗体１B２との比較をすると、１B2が、その他の抗体よりも、この点が優れていることを示しているといえる。この結果からも明らかなように、本発明の抗体の優位性は、糖鎖特異性が高い点に顕著性があり、また親和性の顕著性にもあるといえる。

　（免疫組織染色）
　ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト乳癌組織の切片および乳癌周辺正常組織（ＢｉｏＣａｈｉｎ社）に対する１Ｂ２抗体の免疫組織染色をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ　ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣ　ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）とＤＡＢ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて添付マニュアルに従い実施した。その結果、マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）は、乳癌組織および乳癌周辺正常組織の両方で染色像を認められなかったのに対して、１Ｂ２は、乳癌組織に染色像が認められたが、乳癌周辺正常組織では染色像はほとんど認められなかった（図５）。このことから、抗体１Ｂ２は、正常組織とは結合せず、癌組織に結合することが示された。

　（実施例４：細胞傷害性活性）
　本実施例では、実施例２で作製した抗体について、その抗体依存性細胞傷害活性を調べた。

　クロミウム遊離試験による抗体依存性細胞傷害活性を解析した。ヒト末梢血単核球（Ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）は、健常者の末梢血からＦｉｃｏｌｌ‐ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて添付文書に従って分離した。分離したＰＢＭＣは、４×１０^６個／ｍｌになるように１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを加えた。

　１×１０^６個のヒト乳癌細胞株（Ｔ‐４７Ｄ）およびヒト乳腺上皮細胞株（１８４Ａ１）を含む２００μｌのＤＭＥＭに、１．８５ＭＢｑの^５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｎｅｒ社製）を含む５０μｌの生理食塩水を加え、３７℃で１時間反応させた。その後、１０ｍｌのＤＭＥＭで３回細胞を洗浄し、５×１０^４個/ｍｌになるようにＤＭＥＭを加える。この細胞に１Ｂ２またはマウスＩｇＧ２ａ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加え、３７℃で１時間反応させ、１００μｌ／ウェルになるように９６ウェルｖ底プレートに加えた。その後、１００μｌのＰＢＭＣを加え、３７℃で２時間反応させた。その後、ｐｌａｔｅを５分間、５００×ｇ、室温で遠心し、１００μｌの上清のγ線をＡＲＣ‐７００１（アロカ社製）にて測定した。抗体特異的な細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）は、次の計算式を用いた。
細胞傷害活性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，％）＝（実験値－自然遊離）／（最大遊離－自然遊離）×１００
その結果、１Ｂ２によって約１５％の細胞傷害活性が誘導された。

　（ＦＡＣＳによる抗体の癌細胞への結合評価）
　癌細胞膜表面に発現するＭＵＣ１タンパク質と１Ｂ２抗体が結合するかどうかを、FACSにて調べた。Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で剥がした、ヒト乳癌細胞株Ｔ－４７Ｄ（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１３３）およびヒト乳腺上皮細胞１８４Ａ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－８７９８）を、ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒ（５％　ＦＣＳ、０．０５％　アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１回洗浄後に、１０μｇ／ｍｌの１Ｂ２抗体を含む１００μｌのＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで縣濁し、室温で２時間反応させる。ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄した後に２００μｌのＦＩＴＣ－Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社製）で縣濁し、室温で１時間反応させる。ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄した後に、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ社製）で解析した。その結果、Ｔ－４７Ｄでは、コントロールマウスＩｇＧ２ａ抗体（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）と比較して、１Ｂ２抗体はＦＡＣＳの蛍光シグナルが大きくシフトし（約３００倍）、一方、１８４Ａでは、１Ｂ２による蛍光シフトはほとんどなかった（約２倍）。この結果から、１Ｂ２抗体は、乳癌細胞と強く反応するが、乳腺上皮細胞とは、ほとんど反応しないことが示された。

　Ｔ－４７Ｄに対する特異性を示すＦＡＣＳの結果を図７に示す。

　（実施例５：配列決定）
　次に、１Ｂ２について、常法を用いて可変領域の配列を決定した。その手法は以下のとおりである。

　その結果は、図８に１Ｂ２のものを示す。図９には、従来知られた代表的な配列であるＰａｎｋｏ１およびＰａｎｋｏ２の配列とのアラインメントを示す。

　（実施例６：サンドイッチイムノアッセイによるＭＵＣ１の定量）
　ＭＵＣ１を定量するサンドイッチイムノアッセイを以下の方法で行った。

　９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に、１μｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を１００ｕｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを２５０μｌの洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１００ｎｇのビオチン化１Ｂ２抗体を含む１００ｕｌの緩衝液Ａ（０．９％ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％ＰｒｏＣｌｉｎを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５）を加えて、室温で１時間反応させた。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１００ｕｌの標準溶液（Ｔ－４７Ｄ培養上清）を加え、４℃、１６時間静置した。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、５０ｎｇのＨＲＰ標識１Ｂ２抗体を含む１００μｌの緩衝液Ａを加え、１時間反応させる。各ウェルを２５０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１００ｕｌのＴＭＢ＋－Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１００μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

　この結果から、１Ｂ２抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにて、ＭＵＣ１を定量することが可能である。なお、標準溶液（Ｔ－４７Ｄ）の単位（Ｕ／ｍｌ）は、１Ｂ２抗体によるサンドイッチイムノアッセイにて、シアル化糖鎖抗原ＫＬ－６キット(エイテストＫＬ－６、三光純薬株式会社）に付属の標準抗原を測定した際の値から決定した。図１０に標準曲線を示す。

　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

　また、本願は、特願２００８－２７７３４４に対して優先権を主張するものであり、特願２００８－２７７３４４の記載内容は、その全体が、本願において援用され本願を構成することが理解される。

　正常細胞にあまり結合せずがん細胞に特異的に結合する抗体が提供された。この抗体は、さらにがん細胞殺傷能力すら有し、副作用の少ない抗がん剤として期待される。

配列番号１：Ｔｎ２０マーのアミノ酸配列
配列番号２：抗体１Ｂ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：抗体１Ｂ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４：抗体１Ｂ２のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：抗体１Ｂ２のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：抗体１Ｂ２のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７：抗体１Ｂ２のＣＤＲ１’のアミノ酸配列
配列番号８：抗体１Ｂ２のＣＤＲ２’のアミノ酸配列
配列番号９：抗体１Ｂ２のＣＤＲ３’のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｐａｎｋｏ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｐａｎｋｏ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｐａｎｋｏ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｐａｎｋｏ２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１４：抗体１Ｂ２の重鎖可変領域の全長のアミノ酸配列
配列番号１５：抗体１Ｂ２の軽鎖可変領域の全長のアミノ酸配列

Claims

ＭＵＣ１のがん関連構造に対する特異性が、ＭＵＣ１の正常組織関連構造に対するものに比べ１００倍以上である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記正常組織関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα－ＲおよびＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３［Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６］ＧａｌＮＡｃα－Ｒからなる群より選択され、前記がん関連構造は、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα－Ｒ、ＧａｌＮＡｃα－ＲおよびＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα－Ｒからなる群より選択され、ここで、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ－アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミンであり、ＧａｌＮＡｃはＮ－アセチルガラクトサミンであり、Ｒは非糖部分である、請求項１に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記特異性は、１０００倍以上である、請求項１に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記特異性は、がん関連構造Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα－Ｒを１００％としたときの交差反応性が前記正常組織関連構造のいずれについても０．１％以下である、請求項１に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記特異性は、前記がん関連構造に対して、ＩＣ_５０が１００ｎＭ以下である、請求項２に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
がん細胞に対する特異性が正常細胞に対するものより少なくとも１００倍強い、請求項１に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記がん細胞は、ＭＵＣ１発現細胞である、請求項６に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
前記がん細胞は、Ｔ－４７Ｄ株である、請求項６に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
Ｔｎ１００マービオチンに対する解離定数が、１．０×１０^－９（Ｍ）よりも低いものである、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
Ｔｎ２０マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ２０）と、Ｔｎ１００マービオチンを用いた場合の４５０ｎｍの吸光度（Ａ１００）の比（Ａ１００／Ａ２０）が２以下である、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
正常組織関連構造に比べ少なくとも１００倍、がん関連構造に特異性を有する抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子であって、該抗体は、以下の式：

で表される化合物に対して結合するものであり、がん細胞に対して通常のＩｇＧ２ａよりも少なくとも１０％細胞傷害性が高いことを特徴とする抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
以下の式：

で表される化合物に対して特異的に惹起される、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
抗体１Ｂ２の全長配列（配列番号２もしくは１４および３もしくは１５を含む）を有する、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
　免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合部位を有しており、該重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、ＮＹＧＬＳ（配列番号４）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２は、ＥＮＨＰＧＳＧＩＩＹＨＮＥＫＦＲＧ（配列番号５）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３は、ＳＳＧＴＲＧＦＡＹ（配列番号６）という配列またはその改変体からなり、
　該軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’を含み、ＣＤＲ１’は、ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ２’は、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）という配列またはその改変体からなり、ＣＤＲ３’は、ＦＱＧＳＨＧＰＷＴ（配列番号９）という配列またはその改変体からなる、抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子。
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子を含む医薬組成物。
抗がん剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子またはＭＵＣ１結合分子を含む、診断キット。
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、その抗原結合性断片またはＭＵＣ１結合分子をコードする核酸分子。