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WO2009125604A1 - 嗅覚感度抑制剤のスクリーニング法 - Google Patents

嗅覚感度抑制剤のスクリーニング法 Download PDF

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WO2009125604A1
WO2009125604A1 PCT/JP2009/001677 JP2009001677W WO2009125604A1 WO 2009125604 A1 WO2009125604 A1 WO 2009125604A1 JP 2009001677 W JP2009001677 W JP 2009001677W WO 2009125604 A1 WO2009125604 A1 WO 2009125604A1
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WO
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olfactory
voltage
cation channel
evaluating
channel
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/001677
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English (en)
French (fr)
Inventor
堅太郎 組橋
石田　浩彦
隆 倉橋
Original Assignee
花王株式会社
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Publication date
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Priority to CN200980108210.XA priority patent/CN101960306B/zh
Priority to EP09730226.9A priority patent/EP2270493B1/en
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating or screening an olfactory sensitivity inhibitor using a voltage-dependent cation channel.
  • Odor perception begins when the olfactory nerves present in the olfactory mucosa receive odor molecules present in the air using their own olfactory receptors.
  • An olfactory receptor which is a G protein-coupled receptor, is activated by binding to an odor molecule, and produces cAMP via a G protein and adenylate cyclase.
  • the olfactory cyclic nucleotide gate (CNG) channel is activated by cAMP, and as a result of the inflow of ions from the activated channel, the olfactory nerve depolarizes, opens the voltage-dependent channel, generates action potential, and smell information It is transmitted to the center.
  • CNG olfactory cyclic nucleotide gate
  • Olfactory masking is primarily intended to paralyze or reduce the above response, and is considered to be effective in combination with information processing such as lateral suppression at the central level. It is speculated that the masking of olfaction by the fragrance affects the affinity of the odor-causing substance with the olfactory mucosa. Some fragrance substances are also presumed to have an anesthetic action by inhibiting the enzyme activity of olfactory nerve cells (Non-patent Document 1). However, there is no report on a method for demonstrating or objectively evaluating the effect, and conventionally, in order to obtain a powerful olfactory masking agent, it has been necessary to rely on subjective sensory evaluation.
  • Non-Patent Document 5 antagonists to olfactory receptors
  • Non-Patent Document 6 calcium-dependent potassium channels
  • Inhibition of cAMP-degrading enzyme in the olfactory cilia (Patent Document 3), control of intracellular calcium concentration (Patent Document 4), or use of an odor component compound analog (Patent Document 5) has also been proposed. Yes.
  • Voltage-dependent cation channels present on olfactory cells are involved in olfactory transmission by generating action potentials by depolarization of the olfactory nerve caused by CNG channels.
  • Non-patent Document 7 it has been reported that certain perfume molecules inhibit voltage-gated cation channels.
  • many of these voltage-dependent cation channels are present on the cell body membrane protected by tight junctions, and are exposed on the olfactory ciliary membrane like the CNG channel. Do not mean. Whether or not the voltage-gated cation channel can make any contribution in olfactory masking, which is considered to involve various mechanisms as described above, is still unclear.
  • the present invention provides the following.
  • (II) A method for evaluating or screening an olfactory sensitivity inhibitor comprising the following steps (1) to (4): (1) A step of adding a test substance to a substrate having a voltage-gated cation channel (2) A step of measuring an electric activity generated by the voltage-gated cation channel (3) The electric activity measured in (2) The step of comparing with the electrical activity in the control group (4) The step of evaluating or selecting the test substance that suppresses the electrical activity as an olfactory sensitivity inhibitor based on the result of (3). (III) The method according to (I), wherein the voltage-gated cation channel is an olfactory cell-derived voltage-gated cation channel.
  • the present invention relates to providing a method for objectively evaluating or screening a substance capable of suppressing or regulating olfaction.
  • the present inventor examined a method for objectively evaluating or screening a substance capable of suppressing or regulating olfaction. As a result, the present inventors have found that there is a correlation between the ability of the compound to suppress the olfactory nerve potential-dependent cation channel and its deodorizing effect by subjective sensory evaluation, thereby completing the present invention.
  • the method of the present invention makes it possible to objectively and efficiently perform evaluation or screening of substances having the ability to suppress olfactory sensitivity, which has conventionally relied on subjective sensory evaluation.
  • the method for evaluating or screening an olfactory sensitivity inhibitor of the present invention uses a substrate having a voltage-dependent cation channel, and adds a test substance that is a candidate substance for the olfactory sensitivity inhibitor to the electrical activity generated by the cation channel.
  • the substance which suppresses is evaluated or selected.
  • the olfactory masking effect of those test substances was evaluated by sensory tests.
  • examples of the “substrate having a voltage-dependent cation channel” include a biological substance having a voltage-dependent cation channel.
  • biological substances having voltage-dependent cation channels include olfactory receptors or olfactory cells isolated from living bodies, or cultures thereof; membranes of olfactory cells carrying voltage-dependent cation channels; voltage-dependent cations A recombinant cell or culture thereof genetically engineered to express a channel; a membrane of the recombinant cell; and an artificial lipid bilayer membrane having a voltage-gated cation channel.
  • Voltage-dependent cation channels include those derived from living cells or cultures thereof, those derived from recombinant cells genetically engineered to express voltage-dependent cation channels, synthesized ex vivo. The thing which was done is mentioned.
  • the type of the voltage-dependent cation channel is not particularly limited, and is voltage-dependent Na + channel, voltage-dependent K + channel, voltage-dependent Ca 2+ channel (L-Type, N-Type, P-Type, Q-Type, R-Type and T-Type).
  • the voltage-gated cation channel can also be a part of the channel or a recombinant as long as it retains its function as a voltage-gated cation channel.
  • As the voltage-dependent cation channel those derived from olfactory cells are preferable.
  • the “electrical activity generated by a voltage-gated cation channel” measured in the method of the present invention can be any electric activity caused by a voltage-gated cation channel, which is usually measured in the art, and more specifically. Specifically, it may be a change in current or voltage caused by the opening of the channel. That is, the electrical activity includes the height, width or area of the membrane depolarization potential or action potential peak, the number or firing frequency of action potentials; the height, width or peak of the inward current passing through the channel; Area; and the time until these values change after administration of the test substance and return to the level before administration.
  • the measured electrical activity may be individual channel activity or collective activity.
  • the method of the present invention is performed by the following steps, for example.
  • (1) A step of adding a test substance to a substrate having a voltage-gated cation channel (2)
  • the electric activity measured in (2) The step of comparing with the electrical activity in the control group (4)
  • the substrate having a voltage-gated cation channel is maintained under conditions that allow the channel to remain active and cause electrical activity.
  • the holding conditions vary depending on the type of substrate used, the method for measuring the electrical activity, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art according to a conventional method.
  • the addition of the test substance in the step (1) is performed so that the test substance is brought close to or in contact with the potential-dependent cation channel to such an extent that the inhibitory effect can be exerted.
  • the method of addition varies depending on the type of substrate used, the method for measuring electrical activity, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art according to a conventional method.
  • the addition can be performed by adding a test substance to a liquid soaked with the substrate.
  • the addition can be performed by ejecting a solution of the test substance from a pipette or the like adjacent to the substrate.
  • any electrical activity caused by the voltage-gated cation channel as described above may be measured according to a standard method.
  • the measurement method include a patch clamp method such as an outside-out method, an inside-out method, a perforated patch method, or a whole cell recording method. Whole cell recording is more preferred.
  • patch clamp methods high-throughput assay methods (for example, IonWorks Quattro) have been established, and these high-throughput assay methods can be applied to this test method.
  • a cell membrane having a fixed potential is temporarily depolarized, or a current is temporarily loaded in a cell in a current fixing mode, or a method such as KCl solution is used.
  • a method of adding a solution / drug having the property of depolarizing normal cells to the outside of the cell is conceivable. Details of the procedure of the patch clamp method are described in, for example, “New Patch Clamp Experiment Technology Method” (edited by Yasunobu Okada, Yoshioka Shoten, 2001).
  • fluorescence of electrical activity can also be used.
  • a substrate or cell pre-loaded with a membrane potential sensitive dye is brought into contact with a test substance, and the fluorescence of the test cell in the presence of the test substance is compared with the change in the absence of the test substance. Changes can be monitored to determine the degree of inhibition on voltage-gated cation channels.
  • changes such as fluorescence can be monitored using a fluorescent plate reader (FRIPR) or a voltage imaging plate reader (VIPR), and a calcium sensitive dye or a fluorescent sodium dye can be used as the fluorescent dye.
  • FRIPR fluorescent plate reader
  • VIPR voltage imaging plate reader
  • the electrical activity measured in the method of the present invention is compared with the electrical activity in the control group.
  • Examples of the “comparison with the control group” include comparison before and after administration of the test substance and before and after removal of the test substance, and comparison between the control substance addition group and the substance non-addition group.
  • a test substance that has been shown to have a potential-dependent cation channel inhibitory effect can be evaluated or selected as an olfactory sensitivity inhibitor.
  • a substance having a higher electrical activity suppression effect of a voltage-dependent cation channel exhibits a higher olfactory masking effect in a sensory test, and thus has a higher potential-dependent cation channel suppression effect.
  • the test substance can be evaluated or selected as a better olfactory sensitivity inhibitor.
  • Example 1 (1. Isolation of olfactory cells) Olfactory cells were isolated according to a method known from Akaharai Mori (Kurahashi et al., J. Physiol. (1989), 419: 177-192) and immersed in normal Ringer's solution. To briefly show the isolation method, a double piss is applied to a newt hibernated in ice water, the skull is cut open, and the olfactory mucosa is removed. The removed olfactory mucosa was incubated in a 0.1% collagenase solution at 37 ° C. for 5 minutes to wash away the collagenase, and the tissue was crushed with a glass pipette to isolate cells.
  • KCl 120 mM, HEPES 2 mM, phenol red 0.001% (w / v), pH 7.4 was used.
  • the recording of the membrane current was carried out using a computer connected via a patch clamp amplifier and an A / D converter (Digital 1320, Axon Instrument).
  • a pressure control device was used to stimulate (spray) the test substance on the cells.
  • the pressure control device is a device that reduces the compressed air sent from an air compressor to an arbitrary pressure by computer control and sends the compressed air to a glass pipette tail filled with a test substance for a set time (Ito Et al., Physiological Journal of Japan, 1995, vol. 57, 127-133).
  • each of the test substances listed in Table 1 was mixed in an amount of 1 ⁇ l per 1 ml of normal Ringer's solution, and a glass pipette (tip) set so that the tip was near the olfactory cell (within 20 ⁇ m) It was added to the olfactory cells by spraying through a caliber (diameter of 1 ⁇ m) (720 milliseconds, pressure 50 kPa), and the change in inward current associated therewith was examined. The test substance stimulation was repeated 3 times per olfactory cell, and the average value was calculated. Moreover, it measured by 3 cells per 1 type of test substance, and calculated the average value.
  • the olfactory receptor responded rarely with the test substance stimulation, and an inward current derived from the CNG channel was observed, but such a case was excluded. This case is thought to be caused by the test substance acting as an agonist of the olfactory receptor on the olfactory cells used in the test.
  • the CNG channel current can be easily distinguished from the voltage-dependent channel current from its intensity, peak shape, duration, and the like. An example of current data measured in this experiment is shown in FIG.
  • Example 2 (A. Procedure) An olfactory masking test for sensory evaluation was performed on 20 panelists. 1% isovaleric acid was used as a malodorous substance, and the substances shown in Table 2 were selected as masking materials. 2 ⁇ l of malodor and 4 ⁇ l of the test substance were soaked in separate cotton balls (1 cm in diameter) and evaporated in a separate 50 ml syringe for 12 hours at room temperature. The bad odor vaporized in the syringe and the test substance were poured into a PP container (capacity 500 ml) with a lid and mixed. The panelists themselves opened the PP container lid slightly, sniffed the container, and determined the masking strength.
  • a PP container capacity 500 ml
  • the masking strength was evaluated in six stages as follows, compared with the odor strength in the PP container into which only malodor was injected. 0: Not masked 1: Slight masking effect 2: Slight masking effect 3: Sufficient masking effect 4: Almost masked 5: Completely masked
  • Table 3 shows the results of sensory evaluation. The strength of masking varied with the material. The inward current suppression rates calculated from the experiments shown in Example 1 for these substances are also shown in Table 3. It was clarified that any of the potent suppression effects of voltage-dependent cation channel activity has a strong masking effect. Moreover, as shown in FIG. 2, the inward current suppression rate showed a high correlation with the masking strength. From these results, it was shown that a substance having a higher inhibitory effect on voltage-dependent cation channel activity has a higher olfactory masking effect.

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Abstract

　嗅覚を抑制又は調節し得る物質を、客観的に評価又はスクリーニングするための方法の提供。電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加し、当該カチオンチャネルにより生じる電気的活動を抑制させる物質を評価又は選択することを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法。以下の工程：（１）電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加する工程；（２）前記電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動を測定する工程；（３）（２）で測定された電気的活動を、対照群における電気的活動と比較する工程；（４）（３）の結果に基づいて、電気的活動を抑制させる被験物質を嗅覚感度抑制剤として評価又は選択する工程、を含むことを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法。

Description

嗅覚感度抑制剤のスクリーニング法
　本発明は、電位依存性カチオンチャネルを利用する嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法に関する。
　においの知覚は、嗅粘膜に存在する嗅神経が、自身のもつ嗅覚受容体を用いて空気中に存在するにおい分子を受容するところから始まる。Ｇタンパク質共役型受容体である嗅覚受容体は、におい分子との結合により活性化し、Ｇタンパク質、アデニル酸シクラーゼを介してｃＡＭＰを産生する。すると嗅覚器環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）チャネルがｃＡＭＰにより活性化され、活性化したチャネルからイオンが流入した結果、嗅神経が脱分極し、電位依存性チャネルが開いて活動電位が発生、におい情報が中枢へと伝達される。
　嗅覚のマスキングは、上記応答を一次的に麻痺あるいは低下させるものであり、その他に中枢レベルでの側方抑制などの情報処理との組み合わせにより効力を発揮するものと考えられている。香料による嗅覚のマスキングは、臭気の原因物質の嗅粘膜との親和性に影響を与えていると推測される。一部の香料物質については、嗅神経細胞の酵素活性を阻害することによる麻酔作用を持つことも推測されている（非特許文献１）。しかし、その効果を実証または客観的に評価する手法に関する報告はなく、従来、強力な嗅覚マスキング剤を得るためには、主観的な官能評価に頼らざるを得なかった。
　嗅神経における情報伝達系の阻害は、嗅覚を抑制すると考えられ、実際、嗅細胞Ｇタンパク質Ｇｏｌｆ（非特許文献２）、ＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼ（非特許文献３）、嗅覚器ＣＮＧチャネルサブユニット（非特許文献４）に関するマウスノックアウト試験で、これらのシグナリング分子の欠落が嗅覚を喪失させることが示されている。また、嗅覚器ＣＮＧチャネルは、嗅神経繊毛膜上に露出しており、その活性を調節するのに活性調節物質が細胞膜を通過したり上皮細胞の障壁を通過したりする必要がないことから、嗅覚の調節における重要な標的である（特許文献１）。例えば、カルシウムチャネル阻害剤によるＣＮＧチャネル阻害が、ラットの嗅覚を低下させることが示されている（特許文献２）。嗅粘膜における嗅覚のマスキングに関与し得る他の機構としては、嗅覚受容体へのアンタゴニストを用いた理論（非特許文献５）やカルシウム依存性カリウムチャネルを用いた理論（非特許文献６）が提唱されている。嗅繊毛内のｃＡＭＰ分解酵素阻害（特許文献３）、細胞内カルシウム濃度の制御（特許文献４）、又は臭気成分化合物の類似物の利用（特許文献５）による嗅覚感度の改変法も提唱されている。
　嗅細胞上に存在する電位依存性カチオンチャネルは、ＣＮＧチャネルによって引き起こされる嗅神経の脱分極により活動電位を発生することによって、嗅覚の伝達に関与する。単離された嗅覚受容細胞において、ある種の香料分子が電位依存性カチオンチャネルを阻害することが報告されている（非特許文献７）。しかし、実際の生体内では、これらの電位依存性カチオンチャネルの多くは、タイトジャンクションにより守られた細胞体膜上に存在しており、ＣＮＧチャネルのように嗅神経繊毛膜上に露出しているわけではない。上述のような様々な機構が関与すると考えられている嗅覚マスキングにおいて、電位依存性カチオンチャネルが何らかの貢献をし得るものか否かについては、未だ明らかではない。
特表第２００５－５００８３６号公報 米国特許第７，１３８，１０７号公報 米国特許第５，５２５，３２９号公報 特開第２０００－１５４３９６号公報 特開第２００５－５３８８７号公報
吉儀英記，フレグランスジャーナル（１９７４）第２巻、第３号１２－１７ Ｂｅｌｌｕｓｃｉｏら，Ｎｅｕｒｏｎ（１９９８），ｖｏｌ．２０：６９－８１ Ｗｏｎｇら，Ｎｅｕｒｏｎ（２０００），ｖｏｌ．２７：４８７－４９７ Ｂｒｕｎｅｔら，Ｎｅｕｒｏｎ（１９９６），ｖｏｌ．１７：６８１－６９３ Ａｒａｎｅｄａら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２０００），ｖｏｌ．３：１２４８－１２５５ Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．（２００３），ｖｏｌ．９０：２０２２－２０２８ Ｋａｗａｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７），ｖｏｌ．１０９：２６５－２７２
　本発明は、以下を提供する。
（Ｉ）電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加し、当該カチオンチャネルにより生じる電気的活動を抑制する物質を評価又は選択することを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法。
（ＩＩ）以下の（１）～（４）の工程を含むことを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法：
　（１）電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加する工程
　（２）前記電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動を測定する工程
　（３）（２）で測定された電気的活動を、対照群における電気的活動と比較する工程
　（４）（３）の結果に基づいて、電気的活動を抑制する被験物質を嗅覚感度抑制剤として評価又は選択する工程。
（ＩＩＩ）電位依存性カチオンチャネルが、嗅細胞由来電位依存性カチオンチャネルである、（Ｉ）記載の方法。
試験物質による電位依存性カチオンチャネル活性抑制能の測定実験データ 電位依存性カチオンチャネル抑制能と嗅覚マスキング効果との関係
　本発明は、嗅覚を抑制又は調節し得る物質を、客観的に評価又はスクリーニングするための方法を提供することに関する。
　本発明者は、嗅覚を抑制又は調節し得る物質を客観的に評価又はスクリーニングするための方法について検討した。その結果、化合物の嗅神経電位依存性カチオンチャネル抑制能と主観的な官能評価によるその消臭効果との間に相関関係があることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の方法により、従来主観的な官能評価に頼っていた嗅覚感度抑制能を有する物質の評価又はスクリーニングを、客観的且つ効率的に行うことが可能となる。
　以下、本発明のスクリーニング方法について説明する。
　本発明の嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法は、電位依存性カチオンチャネルを有する基質を用い、ここに嗅覚感度抑制剤の候補物質である被験物質を添加し、当該カチオンチャネルにより生じる電気的活動を抑制する物質を評価又は選択するものである。後述の実施例に示すように、アカハライモリ嗅細胞の電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動に対する試験物質の影響を測定する一方で、それらの試験物質の嗅覚マスキング効果を、官能試験によって評価したところ、電位依存性カチオンチャネル抑制効果の高い物質ほど、より高い嗅覚マスキング効果を発揮することがわかった。この結果は、電位依存性カチオンチャネルによる電気的活動を抑制する物質が嗅覚感度抑制剤として有用であり、且つ電位依存性カチオンチャネルの抑制率を指標として、嗅覚感度抑制剤を評価又はスクリーニングできることを示している。
　ここで、「電位依存性カチオンチャネルを有する基質」としては、電位依存性カチオンチャネルを有する生体由来の物質が挙げられる。電位依存性カチオンチャネルを有する生体由来の物質としては、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞、又はそれらの培養物；電位依存性カチオンチャネルを担持した嗅細胞の膜；電位依存性カチオンチャネルを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、電位依存性カチオンチャネルを有する人工脂質二重膜が挙げられる。
　「電位依存性カチオンチャネル」としては、生体の細胞若しくはその培養物に由来するもの、電位依存性カチオンチャネルを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞に由来するもの、ｅｘ　ｖｉｖｏで合成されたものが挙げられる。電位依存性カチオンチャネルの種類は特に限定されることはなく、電位依存性Ｎａ+チャネル、電位依存性Ｋ+チャネル、電位依存性Ｃａ2+チャネル（Ｌ－Ｔｙｐｅ、Ｎ－Ｔｙｐｅ、Ｐ－Ｔｙｐｅ、Ｑ－Ｔｙｐｅ、Ｒ－Ｔｙｐｅ及びＴ－Ｔｙｐｅを含む）を含み得る。電位依存性カチオンチャネルはまた、その電位依存性カチオンチャネルとしての機能を保持する限り、当該チャネルの部分や組換え体であり得る。電位依存性カチオンチャネルとしては、嗅細胞に由来するものが好ましい。
　本発明の方法において測定される「電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動」とは、当該分野で通常測定される、電位依存性カチオンチャネルにより引き起こされる任意の電気的活動であり得、より具体的には、当該チャネルの開口により引き起こされる電流または電圧の変化であり得る。すなわち、電気的活動としては、膜の脱分極電位または活動電位のピークの高さ、幅若しくは面積、活動電位の発火数若しくは発火頻度；チャネルを通過する内向き電流のピークの高さ、幅若しくは面積；及び、これらの値が試験物質投与後に変化してから投与前の水準に戻るまでの時間等が挙げられる。測定される電気的活動は、個々のチャネルの活動であっても、集団としての活動であってもよい。
　より具体的には、本発明の方法は、例えば、以下の工程により行われる。
　（１）電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加する工程
　（２）前記電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動を測定する工程
　（３）（２）で測定された電気的活動を、対照群における電気的活動と比較する工程
　（４）（３）の結果に基づいて、電気的活動を抑制する被験物質を嗅覚感度抑制剤として評価又は選択する工程。
　上記工程において、電位依存性カチオンチャネルを有する基質は、当該チャネルが活性を維持し、且つ電気的活動を引き起こし得る条件下に保持される。保持条件は、使用される基質の種類や電気的活動の測定方法等によって異なるが、定法に従って当業者が適宜選択することができる。
　工程（１）における被験物質の添加は、電位依存性カチオンチャネルに対して被験物質を、その抑制効果を発揮し得る程度に近接又は接触させるように行われる。添加の方法は、使用される基質の種類や電気的活動の測定方法等によって異なるが、定法に従って当業者が適宜選択することができる。例えば、添加は、基質を浸した液体にさらに被験物質を加えることで行うことができる。あるいは、添加は、基質に近接するピペット等から試験物質の溶液を噴出させることによって行うことができる。
　工程（２）における電気的活動の測定については、上述したような電位依存性カチオンチャネルにより引き起こされる任意の電気的活動を定法に従って測定すればよい。測定法としては、例えば、アウトサイドアウト法、インサイドアウト法、穿孔パッチ法または全細胞記録法などのパッチクランプ法が挙げられる。全細胞記録法がより好ましい。これらのパッチクランプ法は、ハイスループットアッセイ法（例えば、ＩｏｎＷｏｒｋｓ　Ｑｕａｔｔｒｏ）が確立されており、本試験法には、これらのハイスループットアッセイ法を適用できる。電位依存性カチオンチャネルの電気活動誘発法としては、電位を固定した細胞膜を一時的に脱分極させるか、もしくは電流固定モードで一時的に細胞内に電流を負荷する方法、または例えばＫＣｌ溶液のような細胞を脱分極させる性質を有する溶液／薬剤を細胞外に添加する方法が考えられる。パッチクランプ法の手順の詳細については、例えば、「新パッチクランプ実験技術法」（岡田泰伸編、吉岡書店、２００１）に記載されている。
　あるいは、電気的活動の蛍光、発光量計測法、または画像計測法も利用可能である。測定の方法としては、膜電位感受性色素をあらかじめ負荷した基質あるいは細胞を被験物質と接触させ、被験物質の非存在下での変化との比較により、被験物質の存在下での試験細胞の蛍光の変化をモニターして、電位依存性カチオンチャネルへの抑制の程度を決定することができる。本試験方法は、蛍光プレートリーダー（ＦＲＩＰＲ）や電圧画像化プレートリーダー（ＶＩＰＲ）を用いて蛍光などの変化をモニターすることができ、蛍光色素としては、カルシウム感受性色素や蛍光ナトリウム色素が使用できる。
　本発明の方法において測定された電気的活動は、対照群における電気的活動と比較される。「対照群との比較」としては、例えば、試験物質投与前後や被験物質除去前後での比較、及びコントロール物質添加群や物質非添加群との間での比較が挙げられる。
　以上の工程により得られた結果から、電位依存性カチオンチャネル抑制効果を有することが示された被験物質を、嗅覚感度抑制剤として評価又は選択することができる。後述の実施例において示されるように、電位依存性カチオンチャネルの電気活動抑制効果の高い物質ほど、官能試験においてより高い嗅覚マスキング効果を発揮していることから、電位依存性カチオンチャネル抑制効果が高い試験物質ほど、より優れた嗅覚感度抑制剤として評価又は選択することができる。
　以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
（実施例１）
（１．嗅細胞の単離）
　アカハライモリより公知の方法（Ｋｕｒａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８９），４１９：１７７－１９２）に従って嗅細胞を単離し、正常リンガー液に浸した。単離方法を簡単に示すと、氷水中で冬眠状態にしたイモリにダブルピスを施し、頭蓋を切開し嗅粘膜を取り出す。取り出した嗅粘膜を０．１％コラゲナーゼ溶液中で３７℃にて５分間インキュベートし、コラゲナーゼを洗い流したあと、ガラスピペットにて組織を粉砕し細胞を単離した。正常リンガー液としては、ＮａＣｌ　１１０ｍＭ、ＫＣｌ　３．７ｍＭ、ＣａＣｌ2　３ｍＭ、ＭｇＣｌ2　１ｍＭ、グルコース　１５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム　１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　２ｍＭ、フェノールレッド　０．００１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４（ＮａＯＨで調整）を用いた。
（２．電気的活動の測定）
　（Ａ．設定）　単離した嗅細胞を全細胞記録法により膜電位を固定し、膜電流の計測を行った（Ｋａｗａｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７），ｖｏｌ．１０９：２６５－２７２）。電極は、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（直径１．２ｍｍ）を用い、電極作成用プラー（ＰＰ－８３０，成茂科学器械）にて作製した（電極抵抗１０－３０ＭΩ）。電極内には、電極内溶液と銀塩化銀線を挿入し、銀塩化銀線はパッチクランプアンプ（Ａｘｏｐａｔｃｈ　１Ｄ，２００Ｂ，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）と接続し、膜電位の固定、脱分極刺激を行った。電極内溶液としては、ＫＣｌ　１２０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　２ｍＭ、ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅｄ　０．００１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４（ＫＯＨで調整）を用いた。膜電流の記録は、パッチクランプアンプとＡ／Ｄ変換装置（Ｄｉｇｉｄａｔａ　１３２０，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を介して接続されたコンピューターを用いて行った。試験物質の細胞への刺激（吹きかけ）には、圧力制御装置を用いた。圧力制御装置とは、エアーコンプレッサーより送り込まれた圧縮空気を、コンピューター制御にて任意の圧力まで減圧し、設定した時間、その圧縮空気を試験物質を充填したガラスピペット尾部へ送り込む装置である（Ｉｔｏら、日本生理学雑誌，１９９５，ｖｏｌ．５７，１２７－１３３）。
　（Ｂ．手順）　試験物質による電位依存性カチオンチャネル活性への影響を調べるため、単離した嗅細胞の膜電位を－１００ｍＶに固定し、２００ミリ秒間隔で２０ミリ秒間、膜電位を－２０ｍＶへ脱分極させ、脱分極直後に生じる内向き電流のピーク強度を測定した。脱分極刺激を繰り返し続けながら、表１に記載の試験物質の各々を、正常リンガー液１ｍｌあたり１μｌの量で混合し、嗅細胞近傍（２０μｍ以内）に先端が来るようにセットしたガラスピペット（先端口径１μｍ）を通じて吹きかけることにより（７２０ミリ秒間、圧力５０ｋＰａ）嗅細胞に添加し、それに伴う内向き電流の変化を調べた。試験物質刺激は、１つの嗅細胞あたり３回繰り返して行い、その平均値を算出した。また、試験物質１種類あたり３細胞で測定し、平均値を算出した。試験中、稀に試験物質刺激に伴い、嗅覚受容体が応答し、ＣＮＧチャネルに由来する内向き電流が観察される場合が起きるが、このようなケースは除外した。このケースは、試験物質が試験に用いた嗅細胞上の嗅覚受容体のアゴニストとして作用することにより生じたと考えられる。ＣＮＧチャネル電流は、その強度、ピーク形状、持続時間などから電位依存性チャネル電流と容易に区別することができる。本実験で測定された電流データの一例を図１に示す。
　（Ｃ．結果）　試験物質添加によって得られた内向き電流の変化（図１；ｂ）の平均値を、試験物質添加前の５回の脱分極によって生じた内向き電流のピーク強度（図１；ａ）の平均値（対照）と比較し、試験物質による電位依存性カチオンチャネルの電気的活動に対する抑制能を評価した。評価は、以下の式で表される内向き電流抑制率に基づいて行われた。
　　内向き電流抑制率＝（１－ｂ／ａ）×１００（％）
　各試験物質の内向き電流抑制率を表１に併せて示す。一部の試験物質では、嗅細胞における脱分極に伴う内向き電流の発生が完全に抑制されていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）
　（Ａ．手順）　官能評価の嗅覚マスキング試験をパネラー２０名に対して実施した。悪臭物質として１％イソ吉草酸を用い、表２で示した物質をマスキング素材として選択した。悪臭２μｌと試験物質４μｌを別々の綿球（直径１ｃｍ）にしみこませ、別々の５０ｍｌ注射筒内で１２時間、室温で揮発させた。注射筒内で気化した悪臭と試験物質をフタ付きのＰＰ容器（容積５００ｍｌ）内へ注入し、混和させた。評価は、パネラー自身がＰＰ容器のフタをわずかに開け、容器内の匂いを嗅ぎ、マスキング強度を判定した。マスキング強度の評価は、悪臭のみを注入したＰＰ容器内の臭気強度と比較し、以下のとおり６段階で行った。
　　　０：マスキングされていない
　　　１：マスキング効果がごくわずかに認められる
　　　２：マスキング効果がやや認められる
　　　３：マスキング効果が十分認められる
　　　４：ほとんどマスキングされている
　　　５：完全にマスキングされている
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（Ｂ．結果）　官能評価の結果を表３に示す。マスキングの強度は物質により様々であった。これらの物質の、実施例１で示された実験から計算された内向き電流抑制率を、表３に併せて示す。電位依存性カチオンチャネル活動抑制効果の強いものはいずれもマスキング効果が強いことが明らかとなった。また、図２に示されるように、内向き電流抑制率は、マスキング強度と高い相関を示していた。これらの結果から、電位依存性カチオンチャネル活動抑制効果の高い物質ほど、高い嗅覚マスキング効果を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (3)

  1. 　電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加し、当該カチオンチャネルにより生じる電気的活動を抑制する物質を評価又は選択することを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法。
  2. 　以下の（１）～（４）の工程を含むことを特徴とする、嗅覚感度抑制剤の評価又はスクリーニング方法：
    　（１）電位依存性カチオンチャネルを有する基質に被験物質を添加する工程
    　（２）前記電位依存性カチオンチャネルにより生じる電気的活動を測定する工程
    　（３）（２）で測定された電気的活動を、対照群における電気的活動と比較する工程
    　（４）（３）の結果に基づいて、電気的活動を抑制する被験物質を嗅覚感度抑制剤として評価又は選択する工程。
  3. 　電位依存性カチオンチャネルが、嗅細胞由来電位依存性カチオンチャネルである、請求項１記載の方法。
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