JP2001128695A

JP2001128695A - スクリーニング方法

Info

Publication number: JP2001128695A
Application number: JP2000258141A
Authority: JP
Inventors: Kuniji Hinuma; 州司日沼; Masaki Hosoya; 昌樹細谷
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-08-24
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2001-05-15

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】オーファン受容体タンパク質の機能を促進又は
阻害する化合物又はその塩のスクリーニング方法の提
供。【解決手段】（i）オーファン受容体タンパク質発現細
胞又はその細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合
と、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞又は
その細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合におい
て、それぞれの細胞刺激活性を測定し、各試験化合物の
細胞刺激活性を比較することにより、アゴニスト活性を
有する化合物を得、それを利用する該オーファン受容体
タンパク質の機能を促進又は阻害する化合物又はその塩
のスクリーニング方法等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オーファン受容体
タンパク質発現細胞などの活性化を指標として高濃度の
試験化合物をスクリーニングし、アゴニスト活性を有す
る試験化合物の共通構造を利用して、オーファン受容体
タンパク質の機能を促進または阻害する化合物を効率よ
くスクリーニングする方法さらには該共通構造を利用し
て、オーファン受容体タンパク質の（内因性）リガンド
を決定する方法などに関する。

【０００２】

【従来の技術】ホルモンや神経伝達物質など生理活性物
質の多くは、細胞表面に存在する受容体分子に結合して
作用を発揮し、様々な生命現象の調節を行なっている。
これら生理活性物質の作用を補填、増強あるいは阻害す
る物質を探索することは新規な医薬の研究・開発のため
の主要な手段の一つとなっているが、その過程において
特に、作用点となる受容体分子の性状を理解することが
極めて重要である。近年の分子生物学的手法の発達によ
って多くの生理活性物質の受容体を分子レベルで解析す
ることが可能になった。そのような受容体分子の中には
細胞膜を７回貫通する共通の構造的特徴を有する一群の
ものが知られており、７回膜貫通型受容体と呼ばれてい
る。また、細胞内情報伝達系とＧＴＰ結合蛋白質（Ｇ蛋
白質）を介して共役していることから、これらはＧ蛋白
質共役型受容体とも呼ばれている。７回膜貫通型受容体
のリガンドは、蛋白質、ペプチド、アミン、アミノ酸、
ヌクレオチド、ヌクレオシド、エイコサノイド、リン脂
質、匂い物質、光など多岐にわたっている。最近のゲノ
ムあるいはｃＤＮＡ等の解析技術の進歩によって、受容
体をコードする多くの遺伝子が報告されるようになっ
た。これらのうちのあるものは、配列の特徴から７回膜
貫通型受容体のファミリーに属することが推定されるも
のの、対応するリガンドが知られていないことからオー
ファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受
容体のリガンドを同定することができたならば、その受
容体およびリガンドが調節している新たな生理機能ある
いは病態が明らかになることが期待される。そのため、
オーファン受容体のリガンドの探索は新たな医薬品開発
のターゲットを発掘する手段として注目されている。こ
れまでにリガンド既知の受容体にある程度顕著な類似性
を示すオーファン受容体については、既知のリガンドあ
るいはその類縁体をリガンドの候補として検討し、実際
に内因性のリガンドの同定に至ったorphanin FQ/nocice
ptin（Meunier, J.-C. Nature 393:211-212, 1998）の
ような例もあるが、既知のリガンドあるいはその類縁体
の構造上の類似性のみからリガンドの構造を推定するに
は限界がある。多くの場合はオーファン受容体タンパク
質発現細胞のシグナル伝達系の活性化を指標とし、精製
によって内因性リガンドの同定が行われている（Sakura
i, T. et al. Cell 92: 573-585, 1998; Hinuma, S. et
al. Nature 393: 272-276, 1998; Tatemoto,K. et al.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 251: 471-476, 199
8）。しかし、７回膜貫通型受容体を介したシグナル伝
達系は単一ではなく、内因性のリガンドに由来する活性
を検出するためにはいくつものアッセイ系を並列してス
クリーニングする必要があった。また、７回膜貫通型受
容体のリガンドは多岐にわたっており、アッセイに供す
るリガンド候補となるサンプルを合理的に選定すること
は困難であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】効率的でかつ確実なオ
ーファン受容体タンパク質の機能を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法およびオーフ
ァン受容体タンパク質の（内因性）リガンドを決定する
方法の確立が課題とされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、（i）オー
ファン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分
に(好ましくは高濃度の)試験化合物を接触させた場合
と、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞また
はその細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合におい
て、それぞれの細胞刺激活性を測定し、(ii) 各試験化
合物の細胞刺激活性を比較することにより、アゴニスト
活性を有する試験化合物の共通構造を決定し、(iii)
該オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその細
胞膜画分に該共通構造を有するリガンド候補物質を接触
させた場合と該オーファン受容体タンパク質発現細胞ま
たはその細胞膜画分に該オーファン受容体タンパク質の
機能を促進または阻害する化合物の候補物質を接触させ
た場合における細胞刺激活性を比較し、および該オ
ーファン受容体タンパク質と該オーファン受容体タンパ
ク質の機能を促進または阻害する化合物の候補物質との
特異的結合量を測定することによって、オーファン受容
体タンパク質の機能を促進または阻害する化合物または
その塩を効率的にスクリーニングできることを見出し、
さらにこれらの知見に基づいて、検討を重ねた結果、本
発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）（i）オーフ
ァン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に
試験化合物を接触させた場合と、オーファン受容体タン
パク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分に試験化
合物を接触させた場合において、それぞれの細胞刺激活
性を測定し、(ii) 各試験化合物の細胞刺激活性を比較
することにより、アゴニスト活性を有する試験化合物の
共通構造を決定し、(iii) 該オーファン受容体タン
パク質発現細胞またはその細胞膜画分に該共通構造を有
するリガンド候補物質を接触させた場合と該オーファン
受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に該オ
ーファン受容体タンパク質の機能を促進または阻害する
化合物の候補物質を接触させた場合における細胞刺激活
性を比較し、および該オーファン受容体タンパク質
と該オーファン受容体タンパク質の機能を促進または阻
害する化合物の候補物質との特異的結合量を測定するこ
とを特徴とする該オーファン受容体タンパク質の機能を
促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、（２）上記（１）記載のスクリーニング方法に
よって得られうる化合物またはその塩、および（３）
（i）オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその
細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合と、オーファ
ン受容体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜
画分に試験化合物を接触させた場合において、それぞれ
の細胞刺激活性を測定し、(ii) 各試験化合物の細胞刺
激活性を比較することにより、アゴニスト活性を有する
試験化合物の共通構造を決定し、(iii) 該共通構造を有
するリガンド候補物質の該オーファン受容体タンパク質
への特異的結合量を測定することにより、該オーファン
受容体タンパク質のリガンドまたはそのサブタイプを決
定する方法などに関する。より具体的には（４）（i）
オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜
画分に試験化合物(a)を接触させた場合と、オーファン
受容体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜画
分に試験化合物(a)を接触させた場合において、それぞ
れの細胞刺激活性を測定し、(ii) 各試験化合物(a)の細
胞刺激活性を比較することにより、アゴニスト活性を有
する化合物を得、(iii) アゴニスト活性を有する該
化合物が有する共通構造から推定されたリガンド候補物
質を該オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその
細胞膜画分に接触させた場合と試験化合物(b)を該オー
ファン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分
に接触させた場合における細胞刺激活性を比較し、およ
び該オーファン受容体タンパク質と試験化合物(b)と
の特異的結合量を測定することを特徴とする該オーファ
ン受容体タンパク質の機能を促進または阻害する化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（５）上記（４）
記載のスクリーニング方法によって得られうる化合物ま
たはその塩、および（６）（i）オーファン受容体タン
パク質発現細胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)
を接触させた場合と、オーファン受容体タンパク質を発
現しない細胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を
接触させた場合において、それぞれの細胞刺激活性を測
定し、(ii) 各試験化合物(a)の細胞刺激活性を比較する
ことにより、アゴニスト活性を有する化合物を得、(ii
i) アゴニスト活性を有する該化合物が有する共通構造
から推定されたリガンド候補物質の該オーファン受容体
タンパク質への特異的結合量を測定することにより、該
オーファン受容体タンパク質のリガンドまたはそのサブ
タイプを決定する方法などに関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】（Ａ）オーファン受容体タンパク
質について：本明細書において「オーファン受容体タン
パク質」とは、そのリガンドが知られていないタンパク
質のことを意味し、公知のものに加えて未知のものも包
含する。オーファン受容体タンパク質の具体例として
は、例えば、後述の実施例１で用いられたＦＭ−３受容
体タンパク質（Tan, C. P et al, Genomics 52, 223-22
9）またはmas受容体タンパク質(Young D. et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA,85, 5339-5342, 1988)などの
他、Swiss-plotのオーファン受容体のデータベースに記
載されているものなどがあげられる。本発明で用いられ
るオーファン受容体タンパク質は塩を形成していてもよ
く、「オーファン受容体タンパク質」の塩としては、生
理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や
酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ
生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような
塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩な
どが用いられる。本発明で用いられるオーファン受容体
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、オーファン受
容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡで
あればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ヒトや温血動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜
細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β
細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細
胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維
細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファー
ジ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細
胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、
視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、
胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨
髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、
または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、Ｍ
ＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，
ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯ
ＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳ
Ｂ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵ
Ｔ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，Ｊ
Ｋ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に
由来するｃＤＮＡ、該組織・細胞由来のｃＤＮＡライブ
ラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに
使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、
コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。ま
た、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したもの
を用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって
増幅することもできる。

【０００７】本発明で用いられるオーファン受容体タン
パク質をコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法に
よっても製造することができる。オーファン受容体タン
パク質を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段
としては、オーファン受容体タンパク質の部分塩基配列
を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣ
Ｒ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とする
ＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込ん
だＤＮＡを例えばオーファン受容体タンパク質の一部あ
るいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを
用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによっ
て選別することができる。ハイブリダイゼーションの方
法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambr
ook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）
に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライ
ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方
法に従って行う。クローン化されたオーファン受容体タ
ンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、ま
たは所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加
したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’
末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また
３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ
またはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コ
ドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプター
を用いて付加することもできる。

【０００８】（Ｂ）オーファン受容体タンパク質発現細
胞もしくはその細胞膜画分またはオーファン受容体タン
パク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分につい
て：本明細書において、「オーファン受容体タンパク質
発現細胞」とは上記（Ａ）のオーファン受容体タンパク
質を発現した宿主細胞をいう。オーファン受容体タンパ
ク質を宿主細胞において発現させる方法としては、例え
ば、上記（Ａ）のオーファン受容体タンパク質をコード
するＤＮＡを用いて、以下の方法により発現させること
ができる。即ち、オーファン受容体タンパク質の発現ベ
クターは、例えば、（イ）オーファン受容体タンパク質
をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出
し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロ
モーターの下流に連結することにより製造することがで
きる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド
（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵ
Ｃ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現
に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればい
かなるものでもよい。

【０００９】形質転換する際の宿主が動物細胞である場
合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒー
トショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモ
ーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主が
エシェリヒア属菌である場合は、Tｒｐプロモーター、
Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロ
モーター、λＰ_Lプロモーター、ｌｐｐプロモーターな
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロ
モーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモータ
ーなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモータ
ー、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。なお、本発明
においては、オーファン受容体タンパク質を介する細胞
刺激活性を測定するため、宿主は動物細胞もしくは昆虫
細胞であることが好ましい。発現ベクターには、以上の
他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナ
ル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製
オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合があ
る）などを含有しているものを用いることができる。選
択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素
（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソ
トレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝
子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイ
シン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、
Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとし
て使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選
択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル
配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末
側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、
phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿
主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグ
ナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が
酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)
・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、
宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・
シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、
抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。こ
のようにして構築されたオーファン受容体タンパク質を
コードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転
換体を製造することができる。

【００１０】宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細
胞などが用いられるが、上述のとおり、昆虫細胞または
動物細胞が好ましく用いられる。エシェリヒア属菌とし
ては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２
・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，
１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシ
ッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，
３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular B
iology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０
１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，
４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティッ
クス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが
用いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス
・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられ
る。

【００１１】酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，
ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０
Ｂ−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイ
コの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Natu
re），３１５巻，５９２(１９８５)〕。昆虫細胞として
は、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の
幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ
細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Tri
choplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mamestra br
assicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞な
どが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由
来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用い
られる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（AT
CC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、
イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７
頁（１９７７年）〕などが用いられる。動物細胞として
は、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイ
ニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細
胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエロ
ーマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、Ｃ１
２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞など
が用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、
たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２
１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７
(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。バチ
ルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆
General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)な
どに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換する
には、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），７５
巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれ
る。

【００１２】昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、
たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６
巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従
って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえ
ばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７
３)に記載の方法に従って行なわれる。オーファン受容
体タンパク質発現ベクターの細胞への導入方法として
は、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et a
l. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proceedings of The National Academy of Sciences
of The United States ofAmerica），８４巻，７４１３
頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F.
L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virolog
y），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電
気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（E
MBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等
が挙げられる。このようにして、オーファン受容体タン
パク質発現細胞が得られる。なお、動物細胞を用いて、
オーファン受容体タンパク質を安定に発現させる方法と
しては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染
色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択す
る方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標
にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択
マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返し
クローン選択を行なうことによりオーファン受容体タン
パク質の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ること
ができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして
用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株
を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、オー
ファン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを細胞内で
増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもで
きる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形
質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては
液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめら
れる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキスト
リン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たと
えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リ
カー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ
ショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては
たとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩
化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、
ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地
のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００１３】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えるこ
ともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約
３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気
や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転
換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホー
ルダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、
「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。

【００１４】宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace,
T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動
化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなど
が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整す
るのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえ
ば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，Ｄ
ＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６
(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Journal of The American Medical Associatio
n）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロ
シージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ
イオロジカル・メディスン（Proceeding ofThe Society
for The Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。特にＣＨＯ
（dhfr^-）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして
用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ
胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。

【００１５】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画
分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−El
vehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリ
ングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による
破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧し
ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕
などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と
して用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒ
ｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したオー
ファン受容体タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白
質などの膜成分が多く含まれる。該オーファン受容体タ
ンパク質を含有する細胞や膜画分中のオーファン受容体
タンパク質の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であ
るのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適であ
る。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのアゴニスト
（リガンド）結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。オーフ
ァン受容体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞
膜画分とは上記の宿主細胞として列記した細胞で、オー
ファン受容体タンパク質を発現しないもののことをい
う。またその細胞膜画分としては、上記と同様のものな
どが用いられる。

【００１６】（Ｃ）試験化合物または試験化合物(a)に
ついて：本明細書において、「試験化合物」または「試
験化合物(a)」とは、例えば天然・非天然のペプチド、
天然・非天然のタンパク質、天然・非天然の非ペプチド
性化合物、合成化合物、天然・非天然の発酵生産物など
があげられる。これら試験化合物または試験化合物(a)
に用いられるペプチド、タンパク質、化合物または発酵
生産物は塩を形成していてもよく、これらの塩として
は、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属な
ど）や酸（有機酸、無機酸）との塩があげられるが、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩などが好ましい。
このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リ
ン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例
えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などがあげられる。

【００１７】（Ｄ）細胞刺激活性について：オーファン
受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に試験
化合物（具体的には試験化合物(a)）を接触させた場合
と、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞また
はその細胞膜画分に試験化合物（具体的には試験化合物
(a)）を接触させた場合における、それぞれの細胞刺激
活性は、例えば（a）細胞外ｐＨの変動、(b)アラキドン
酸遊離、(c)アセチルコリン遊離、(d)細胞内Ｃａ²⁺遊
離、(e)細胞内ｃＡＭＰの変動、(f)細胞内ｃＧＭＰの変
動、(g)イノシトールリン酸産生、(h)細胞膜電位変動、
(i)細胞内蛋白質のリン酸化、(j)ｃ−ｆｏｓの活性化、
（ｋ）ＧＴＰγＳの結合、（ｌ）レポーター遺伝子の発
現などを指標にして、公知の方法に準じてまたは市販の
測定用キットを用いて測定することができる。本発明の
スクリーニング方法またはリガンド決定方法において行
われる細胞刺激活性の測定は、上記のなかでも、細胞外
ｐＨの変動を指標とする測定方法が好ましく用いられ
る。具体的には、まず、オーファン受容体タンパク質発
現細胞もしくはその細胞膜画分、およびオーファン受容
体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分を
別々にマルチウェルプレート等に培養する。細胞刺激活
性を測定するにあたっては前もって新鮮な培地あるいは
細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、それ
ぞれの細胞に試験化合物（具体的には試験化合物(a)）
を添加して一定時間インキュベートした後、細胞または
その細胞膜画分を抽出あるいは上清液を回収して、生成
した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激
活性の指標とする物質の生成が、細胞が含有する分解酵
素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害
剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭ
Ｐ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなど
で細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞またはそ
の細胞膜画分に対する産生抑制作用として検出すること
ができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行
なうには、適当なオーファン受容体タンパク質を発現し
た細胞またはその細胞膜画分およびオーファン受容体タ
ンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分が必要
である。形質転換体であるオーファン受容体タンパク質
発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。
また、細胞刺激活性を測定するためには、微弱なアゴニ
スト活性も検出することができるように、細胞の特異的
な反応を識別できる範囲で可能な限り高濃度で細胞刺激
活性を測定することが好ましい。この場合の高濃度と
は、通常１０^−８Ｍ〜１Ｍ、好ましくは１０^-6M〜１０
^-2Mのことを言う。試験化合物（具体的には試験化合物
(a)）としては、上記（Ｃ）に記載のものと同様のもの
などがあげられる。

【００１８】上記の細胞刺激活性測定系について、以下
にさらに具体的に記載する。なお、以下（１）〜（７）
の説明中「試験化合物」は具体的には「試験化合物
(a)」を示す。（１）細胞外ｐＨ（acidification rate）の変動を測定
することを特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜
画分がアゴニスト活性を有する試験化合物に反応して変
化する細胞外のpHをサイトセンサー（Ｃｙtｏｓｅｎｓ
ｏｒ）装置（モレキュラーデバイス社など）を使用して
測定することによって、細胞刺激活性を測定することが
できる。サイトセンサー装置を利用した、細胞外ｐＨ変
化の測定をすることによる試験化合物の細胞刺激活性を
測定する具体的な方法を以下に記す。オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその細
胞膜画分を約２時間〜約４８時間、好ましくは約５時間
〜約２４時間（例えば、サイトセンサー装置用のカプセ
ル内などで）培養した後、培地のｐＨを安定させる。培
地のｐＨが安定するまでは、例えば、0.1%ウシ血清アル
ブミンを含むRPMI1640培地（モレキュラーデバイス社
製）などを灌流させるのが好ましい。次に、試験化合物をオーファン受容体タンパク質発
現細胞またはその細胞膜画分に発現したオーファン受容
体タンパク質に試験化合物を接触させる。接触させる方
法としては、試験化合物を含む培地をオーファン受容体
タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に灌流する方
法が一般的である。次に、試験化合物を含む培地をオーファン受容体タ
ンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に発現したオー
ファン受容体タンパク質に接触させることによって生じ
る培地のpH変化を測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞またはその細胞膜画分を用いて実施す
る。

【００１９】（２）ＧＴＰγＳの放射活性を測定するこ
とを特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞がアゴニスト活性
を有する試験化合物によって刺激されると細胞内のＧタ
ンパクが活性化されてＧＴＰが結合する。この現象はオ
ーファン受容体タンパク質発現細胞の膜画分においても
観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと
変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加して
おくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合す
るが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合
した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると
細胞膜に残存した放射活性を測定することによって試験
化合物の受容体発現細胞刺激活性を測定することができ
る。この反応を利用して試験化合物のオーファン受容体
タンパク質発現細胞およびオーファン受容体タンパク質
を発現しない細胞に対する刺激活性を測定・比較するこ
とができる。この方法は、オーファン受容体タンパク質
およびオーファン受容体タンパク質を発現しない細胞を
含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、細胞刺激活性
を測定するものであり、本測定法においてオーファン受
容体タンパク質膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示
し、オーファン受容体タンパク質を発現しない膜画分へ
のＧＴＰγＳ結合促進活性を示さない物質はリガンド候
補物質である。本方法により細胞刺激活性を測定する具
体的な方法を以下に記す。オーファン受容体タンパク質を含む細胞膜画分を、
膜希釈緩衝液（例えば、50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150
mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4など）で希釈す
る。希釈率は、受容体タンパク質の発現量により異な
る。次にで得られた液を適当な容器（例えば、Falcon
2053など）に分注し、試験化合物を加え、さらに終濃度
が約200 pMとなるように[³⁵S]GTPγSを加える。次に、で得られた培地を約25℃で約1時間保温し
た後、洗浄用緩衝液（例えば、氷冷した50 mM Tris, 5
mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHAPS pH
7.4 1.5mlなど）を加えて、（例えば、ガラス繊維ろ紙
GF/Fなどを用いて）ろ過する。ろ紙を保温（例えば、約65℃、約30分）して乾燥
後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った
膜画分に結合した[³⁵S]GTPγSの放射活性を測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
含まない細胞膜画分を用いて実施する。

【００２０】（３）細胞内ｃＡＭＰの変動を測定するこ
とを特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞はアゴニスト活性
を有する試験化合物のアゴニスト刺激によって細胞内cA
MP量が変動する。この反応を利用して試験化合物のオー
ファン受容体タンパク質発現細胞に対する細胞刺激活性
を測定することができる。オーファン受容体タンパク質
を発現させた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラ
ット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cA
MP抗体と¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用すること
によってRIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合
わせた他のEIA系でも測定することができる。また抗cAM
P抗体をprotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物
のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチ
ラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法
による定量も可能である（例えば、アマシャムファルマ
シアバイオテク製のキットを使用する）。本測定系にお
いて、ｃAMP産生の促進活性を測定することができる。
あるいは、フォルスコリンなど細胞内cAMP量を増加させ
るような物質によって細胞内cAMP量を上昇させ、試験化
合物を添加することによって細胞内cAMP量が変化するこ
とを観察することにより、細胞刺激活性（ｃAMP産生抑
制活性）を測定することができる。本方法により細胞刺
激活性を測定する具体的な方法を以下に記す。オーファン受容体タンパク質を発現させた動物細胞
（例えばCHO細胞など）を24穴プレートに適当な濃度
（例えば5 x 10⁴ cell/well）で播種し、約48時間培養
する。次に、オーファン受容体タンパク質を発現させた動
物細胞を緩衝液（例えば、0.2mM ３−イソブチル−メ
チルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンク
スバッファー(pH7.4) （以下、0.2mM ３−イソブチル
−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハ
ンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼
ぶ））で洗浄する。その後適当量（例えば、約0.5ml）の反応用バッフ
ァーを細胞に加えて、約３０分間培養器で保温する。次に、反応用バッファーを除き、新たに適当量（例
えば、約0.25ml）の反応用バッファーを細胞に加えた
後、適当量（例えば、約0.25ml）の反応用バッファー
（ｃAMP産生抑制活性を測定する場合には、2μMフォル
スコリンを含むものが好ましい）に適当量（例えば、約
1 nM）の試験化合物を添加したものを細胞に加え、約３
７℃で約２４分間反応させる。次に、適当量（例えば、約100μl）の20%過塩素酸
を加えて反応を停止させ、次に氷上で約１時間置くこと
により細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャム
ファルマシアバイオテク）などを用いて測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞を用いて実施する。

【００２１】（４）CRE−レポーター遺伝子を導入する
ことを特徴とする細胞刺激活性測定系 CRE（cAMP response element）を含むＤＮＡを、ピッカ
ジーンベイシックベクターまたはピッカジーンエンハ
ンサーベクター（東洋インキ製造（株））などのルシフ
ェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入
し、これをCRE−レポーター遺伝子ベクターとする。CRE
−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションし
た細胞において、cAMP上昇を伴う刺激は、CREを介した
ルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラ
ーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラ
ーゼ活性を測定することにより、CRE−レポーター遺伝
子ベクター導入細胞内のcAMP量の変動を検出することが
できる。CRE−レポーター遺伝子ベクターをオーファン
受容体タンパク質発現細胞にトランスフェクションした
細胞を利用して、細胞刺激活性を測定することができ
る。本方法により細胞刺激活性を測定する具体的な方法
を以下に記す。 CRE−レポーター遺伝子を導入したオーファン受容
体タンパク質発現細胞を24穴プレートに適当な濃度（例
えば、5 x 10³ cell/well）で播種し、約48時間培養す
る。細胞を適当量（例えば、0.2mM）の緩衝液（例え
ば、３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと
20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4) 以下、0.
2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSA
と20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反
応用バッファーと呼ぶ））で洗浄する。その後、適当量（例えば、0.5ml）の反応用バッフ
ァーを細胞に加えて約３０分間培養器で保温する。次に、反応用バッファーを除き、新たに適当量（例
えば、0.25ml）の反応用バッファーを細胞に加えた後、
適当量（例えば、1 nM）の試験化合物と適当量（例え
ば、0.25ml）の反応用バッファー（ｃAMP産生抑制活性
を測定する場合には、2μMフォルスコリンを含むものが
好ましい）を細胞に加え、約３７℃で約２４時間反応さ
せる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造
（株））などで溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ
製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液
体シンチレーションカウンターまたはトップカウンター
などにより測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞またはその細胞膜画分を用いて実施す
る。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例
えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシ
ダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝
子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キ
ットを用いて容易に測定することができる。即ち、アル
カリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-P
hos 530によって、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（chloramphenicolacetyltransferas
e）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenico
l AcｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＫ
ｉＴによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和
光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができ
る。

【００２２】（５）アラキドン酸遊離を測定することを
特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞はアゴニストによ
る刺激の結果アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。
あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取
り込ませておくことによって、この活性を細胞外に放出
された放射活性を測定することによって細胞刺激活性を
測定することができる。このとき、試験化合物を添加し
て、試験化合物のアラキドン酸代謝物放出活性を調べる
ことにより、細胞刺激活性を測定することができる。本
方法により細胞刺激活性を測定する具体的な方法を以下
に記す。オーファン受容体タンパク質発現細胞（例えば、オ
ーファン受容体タンパク質発現CHO細胞など）を24穴プ
レートに適当な濃度（例えば、5 x 10⁴ cell/well）で
播種し、24時間培養する。培養後、[³H]アラキドン酸を適当量（例えば、0.25
μCi/well）となるよう添加する。[³H]アラキドン酸添
加約16時間後、細胞を洗浄液（例えば、0.05% BSAと20
mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)）で洗浄
し、各wellに緩衝液（例えば、0.05% BSAと20mM HEPES
を含むハンクスバッファー(pH7.4)：以降、0.05% BSA
と20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応
用バッファーと呼ぶ。）に溶解した試験化合物を添加す
る。約37℃で約60分間インキュベートした後に、反応用
バッファーを適当量（例えば、400 μl）シンチレータ
ーに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物
の量をシンチレーションカウンターにより測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞を用いて実施する。

【００２３】（６）細胞内Ca²⁺の遊離を測定することを
特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞をアゴニスト活性
を有する試験化合物によって刺激することによって細胞
内のCa²⁺濃度が上昇する。これを利用することによって
細胞刺激活性を測定することができる。本方法により細
胞刺激活性を測定する具体的な方法を以下に記す。オーファン受容体タンパク質発現細胞を、滅菌した
顕微鏡用カバーグラス上に播き、約２日後、培養液を適
当量（例えば、4 mM）の Fura-2 AM（同仁化学研究所）
を縣濁したHBSSに置換し、室温で約2時間30分おく。 HBSSで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセ
ットし、蛍光測定器で、試験化合物を加えたときの励起
波長340nm及び380nmでの505nmの蛍光強度の比の上昇を
測定する。また、以下のようにFLIPR（モレキュラーデ
バイス社製）を使うこともできる。すなわち、細胞
懸濁液にFluo-3 AM（同仁化学研究所製）を添加し、細
胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９
６穴プレートに細胞を播く。 FLIPR装置にセットし、Fura-2の場合と同様に試験
化合物を加え、試験化合物の添加によって観測される蛍
光強度が変化することを測定する。オーファン受容体タ
ンパク質発現細胞にaequorinなどのように細胞内Caイオ
ンの上昇によって発光するようなタンパクの遺伝子を共
発現させておき、細胞内Caイオン濃度の上昇によってae
quorinがCa結合型となり発光することを利用して、試験
化合物の添加によって観測される発光強度が変化するこ
とを測定することにより、細胞刺激活性を測定すること
も可能である。この場合の方法は、蛍光物質を取り込ま
せないこと以外は上記と同様である。また、細胞内Caイ
オン濃度の変動を測定し易くするために、キメラＧタン
パク質などの改変型Ｇタンパク質を同時に発現させた細
胞を使用することもできる。該キメラＧタンパク質と
は、Ｇｉ、Ｇｏ、ＧｓなどCa²⁺をシグナル伝達系として
使用しないＧタンパク質をＧ₄、Ｇ₁₁などのCa²⁺をシグ
ナル伝達系として使用するＧタンパク質の機能ドメイン
で置換したＧタンパク質のことをいう。該キメラタンパ
ク質を使用することによって、あらゆるＧタンパク質の
シグナル伝達系をCa²⁺の変動でモニターすることができ
る。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞を用いて実施する。

【００２４】（７）イノシトールリン酸産生を測定する
ことを特徴とする細胞刺激活性測定系オーファン受容体タンパク質発現細胞にアゴニスト活性
を有する試験化合物を添加すると、細胞内イノシトール
三リン酸濃度が上昇する。試験化合物によって生じるオ
ーファン受容体タンパク質発現細胞におけるこの反応を
観察することにより細胞刺激活性の測定を行なうことが
できる。本方法により細胞刺激活性を測定する具体的な
方法を以下に記す。２４穴プレートに播いて１日目のオーファン受容体
タンパク質発現細胞にmyo-[2-³H]inositol (2.5マイク
ロCi/well)を添加した培地中で１日培養したオーファン
受容体タンパク質発現細胞を、よく洗浄後、試験化合物
を添加し10%過塩素酸を加え反応を止める。適当量（例えば、1.5 M）の KOH, 適当量（例え
ば、60mM）の HEPES溶液で中和し、AG1x8樹脂 (Bio-Ra
d)を詰めたカラムに通し、洗浄した後、適当量（例え
ば、１M ）HCOONH₄ および適当量（例えば、0.1M） H
COOHで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウン
ターで測定する。上記〜の方法をオーファン受容体タンパク質を
発現しない細胞を用いて実施する。

【００２５】（Ｅ）アゴニスト活性を有する（試験）化
合物について：本明細書において、「アゴニスト活性を
有する（試験）化合物」とは、上記（Ｃ）に記載の試験
化合物（例えば天然・非天然のペプチド、天然・非天然
のタンパク質、天然・非天然の非ペプチド性化合物、合
成化合物、天然・非天然の発酵生産物など）または試験
化合物(a)のうち、上記（Ｄ）に記載の細胞刺激活性測
定系のいずれか（好ましくは、細胞外ｐＨ（acidificat
ion rate）の変動を測定することを特徴とする細胞刺激
活性測定系など）によりオーファン受容体タンパク質発
現細胞またはその細胞膜画分を用いた場合に細胞刺激活
性が認められ、オーファン受容体タンパク質を発現しな
い細胞またはその細胞膜画分を用いた場合には細胞刺激
活性が認められない試験化合物（例えば天然・非天然の
ペプチド、天然・非天然のタンパク質、天然・非天然の
非ペプチド性化合物、合成化合物、天然・非天然の発酵
生産物など）のことをいう。より具体的には、例えば、
オーファン受容体タンパク質がＦＭ−３（Tan, C.P. et
al., Genomics 52, 223-229, 1998など）の場合のアゴ
ニスト活性を有する（試験）化合物としては、Ｃ末端に
Ｒ−Ｘ−ＮＨ₂構造（ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ
ｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌ
ｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどの任意のアミ
ノ酸残基を示す。）を有するペプチド、より具体的に
は、配列番号：２、６および２０で表されるアミノ酸配
列を含有するペプチドなどがあげられる。これらアゴニ
スト活性を有する（試験）化合物であるペプチド、タン
パク質、化合物または発酵生産物も塩を形成していても
よく、これらの塩としては、生理学的に許容される塩基
（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）と
の塩があげられるが、とりわけ生理学的に許容される酸
付加塩などが好ましい。このような塩としては例えば無
機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との
塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン
酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン
酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン
酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などがあげられる。上
記（Ｄ）に記載の細胞刺激活性測定系において、試験化
合物（または試験化合物(a)）がアゴニスト活性を有す
る（試験）化合物であるか否かの判断基準の具体例を以
下に示すが、下記の判断基準はあくまでも例示であっ
て、試験化合物（または試験化合物(a)）がアゴニスト
活性を有するか否かが下記の基準によって限定的に解釈
されるものではない。

【００２６】上記（Ｄ）−（１）に記載の細胞外ｐＨ
（acidification rate）の変動を測定することを特徴と
する細胞刺激活性測定系を用いた場合には、試験化合物
を細胞に接触させる前の細胞外ｐＨを100％とした場合
に、試験化合物を細胞に接触させたときの反応のピーク
時の細胞外ｐＨが105％を越えるもので、オーファン受
容体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分
を用いた場合には細胞刺激活性が認められない試験化合
物についてはアゴニスト活性を有する（試験）化合物と
して選定する。上記（Ｄ）−（２）に記載の標識したＧ
ＴＰγＳの放射活性を測定することを特徴とする細胞刺
激活性測定系を用いた場合には、試験化合物を加えなか
った実験区の放射活性を100％とし、試験化合物を加え
た実験区の放射活性が105％を越えるもので、オーファ
ン受容体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜
画分を用いた場合には細胞刺激活性が認められない試験
化合物についてはアゴニスト活性を有する（試験）化合
物として選定する。上記（Ｄ）−（３）に記載の細胞内
ｃＡＭＰの変動を測定することを特徴とする細胞刺激活
性測定系を用いた場合には、ｃAMPの産生抑制作用を指
標にする場合には、フォルスコリン刺激によって産生さ
れたcAMP量を100%とし、試験化合物の添加によって産生
されたcAMP量が95％以下であるもので、オーファン受容
体タンパク質を発現しない細胞またはその細胞膜画分を
用いた場合には細胞刺激活性が認められない試験化合物
については、アゴニスト活性を有する（試験）化合物と
して選定する。一方、ｃAMPの産生促進作用を指標にす
る場合には、試験化合物を添加しない場合のcAMP量を10
0%とし、試験化合物の添加によって産生されたcAMP量が
105％以上であるもので、オーファン受容体タンパク質
を発現しない細胞またはその細胞膜画分を用いた場合に
は細胞刺激活性が認められない試験化合物については、
アゴニスト活性を有する（試験）化合物として選定す
る。上記（Ｄ）−（４）に記載のCRE−レポーター遺伝
子を導入することを特徴とする細胞刺激活性測定系を用
いた場合、ｃAMPの産生抑制作用を指標にする場合に
は、フォルスコリン刺激によって生じた発光量を100％
とし、試験化合物の添加によって生じた発光量が95％以
下であるもので、オーファン受容体タンパク質を発現し
ない細胞またはその細胞膜画分を用いた場合には細胞刺
激活性が認められない試験化合物については、アゴニス
ト活性を有する（試験）化合物として選定する。一方、
ｃAMPの産生促進作用を指標にする場合には、試験化合
物を添加しない場合の発光量を100%とし、試験化合物の
添加によって産生された発光量が105％以上であるもの
で、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞また
はその細胞膜画分を用いた場合には細胞刺激活性が認め
られない試験化合物については、アゴニスト活性を有す
る（試験）化合物として選定する。上記（Ｄ）−（５）
に記載のアラキドン酸遊離を測定することを特徴とする
細胞刺激活性測定系を用いた場合には、試験化合物非添
加反応バッファーによる培地中の[³H]アラキドン酸代謝
物の量を100%とし、試験化合物を添加したときの培地中
の[³H]アラキドン酸代謝物の量が105%以上であるもの
で、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞また
はその細胞膜画分を用いた場合には細胞刺激活性が認め
られない試験化合物については、アゴニスト活性を有す
る（試験）化合物として選定する。上記（Ｄ）−（６）
に記載の細胞内Ca²⁺の遊離を測定することを特徴とする
細胞刺激活性測定系を用いた場合には、試験化合物を添
加しない場合に観測される蛍光強度を100％とし、試験
化合物を添加したときの蛍光強度が105%以上であるもの
で、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞また
はその細胞膜画分を用いた場合には細胞刺激活性が認め
られない試験化合物については、アゴニスト活性を有す
る（試験）化合物として選定する。上記（Ｄ）−（７）
に記載のイノシトールリン酸産生を測定することを特徴
とする細胞刺激活性測定系を用いた場合には、試験化合
物非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を100
％とし、試験化合物を添加したときの培地中の放射活性
が105%以上であるもので、オーファン受容体タンパク質
を発現しない細胞またはその細胞膜画分を用いた場合に
は細胞刺激活性が認められない試験化合物については、
アゴニスト活性を有する（試験）化合物として選定す
る。

【００２７】（Ｆ）アゴニスト活性を有する（試験）化
合物の構造比較について：上記（Ｅ）により、アゴニス
ト活性を有する（試験）化合物を選定した後、各アゴニ
スト活性を有する（試験）化合物の構造を比較すること
により、アゴニスト活性を有する（試験）化合物の共通
構造を推定（または決定）し、該共通構造を有するリガ
ンド候補物質を作成または取得する。該リガンド候補物
質とは、該アゴニスト活性を有する（試験）化合物に共
通の構造を有し、各試験化合物（具体的には試験化合物
(a)）に比し、上記（Ｄ）の細胞刺激活性が強い物質
（例えば天然のペプチド、天然のタンパク質、天然の非
ペプチド性化合物など）のことをいう。アゴニスト活性
を有する（試験）化合物が天然・非天然のペプチド、天
然・非天然のタンパク質などの場合には、それらのペプ
チドまたはタンパク質をコードするアミノ酸配列を比較
し、それらの相同性の高い部分配列、あるいは類似した
立体構造を有する部分が共通構造といえる。具体的に
は、例えば、オーファン受容体タンパク質がＦＭ−３
（Tan, C.P. etal., Genomics 52, 223-229, 1998な
ど）である場合の共通構造としては、配列番号：２、６
および２０で表されるアミノ酸配列を比較すれば、「Ｃ
末端にＲ−Ｘ−ＮＨ₂構造（Ｘは任意のアミノ酸残基を
示す。）を有する」という共通構造が導き出せる。該共
通構造から、本発明のスクリーニング方法またはリガン
ド決定方法において、オーファン受容体タンパク質がＦ
Ｍ−３である場合、共通構造を有するリガンド候補物
質、ひいてはＦＭ−３の（内因性）リガンドはそのＣ末
端にＲ−Ｘ−ＮＨ₂構造を有するペプチドであると考え
られる。Ｃ末端にＲ−Ｘ−ＮＨ₂構造を有するペプチド
としては、哺乳類ではA-18-F-NH₂、F-8-F-NH₂ （Perry,
S. J. et al. FEBS Lett. 409: 426-430, 1997）、pro
lactin-releasing peptide （Hinuma, S. et al. Natur
e 393: 272-276, 1998）などが知られている。また、下
等動物では一群のＲＦアミドペプチドファミリーとして
普遍的に存在している。更に哺乳類についても未知のＲ
−Ｘ−ＮＨ₂ペプチドが下等動物と同様に多様に存在す
ると考えられ、哺乳類における新規なＲ−Ｘ−ＮＨ₂ペ
プチドの中にＦＭ−３の（内因性）リガンドが存在する
と考えられる。アゴニスト活性を有する（試験）化合物
が、天然・非天然の非ペプチド性化合物、合成化合物な
どの場合には、それらの化合物の化学構造を比較し、共
通性のある基本骨格（例えば、特定の環構造、例、「脂
環式炭化水素」としてのシクロアルキル、シクロアルケ
ニル、シクロアルカンジエニルなどの飽和又は不飽和の
脂環式炭化水素、「複素環」としての芳香族複素環、飽
和あるいは不飽和の非芳香族複素環（脂肪族複素環）
等）が共通構造といえる。また、本発明のリガンドの決
定方法は、上記の共通構造を指標として、リガンドを決
定するため、リガンドと構造上の類似性が高いリガンド
のサブタイプを取得することも、従来法に比べ、格段に
容易かつ確実となる。

【００２８】（Ｇ）アゴニスト活性を有する（試験）化
合物が有する共通構造から推定（または決定）されたリ
ガンド候補物質の作成または取得以降の工程について：
以下に上記（Ｆ）によりアゴニスト活性を有する（試
験）化合物が有する共通構造から推定（または決定）さ
れたリガンド候補物質の作成または取得方法について具
体的に説明する。（１）共通構造を有する天然のペプ
チド、天然のタンパク質、天然の非ペプチド性化合物を
検索して、共通構造を有するリガンド候補物質を選定し
たのち、該共通構造を有するリガンド候補物質を作成ま
たは取得する方法。上記（Ｆ）に記載の試験化合物（具
体的には試験化合物(a)）の共通構造をもとに、共通構
造を有する天然のペプチド、天然のタンパク質、天然の
非ペプチド性化合物を検索することによりリガンドまた
はそのサブタイプを推定することができる。利用できる
公知のデータベースなどは種々存在するが、代表的なも
のをあげれば、例えば、Beilstein Handbook of Organi
c Chemistry（Beilstein社）、CROPR(Serwent Crop Pro
tection Registry)ファイル（Derwent社）、Derwent Dr
ugファイル（Derwent社）、The Merck Index（Merck
社）などがあげられる。次に、推定されたリガンドにつ
いて上記（Ｄ）に記載の細胞刺激活性測定系を用いて、
細胞刺激活性を測定し、リガンド候補物質との細胞刺激
活性と比較することにより、リガンドまたはそのサブタ
イプであるか否かを決定することができる。

【００２９】（２）（アゴニスト活性を有する（試
験）化合物が、ペプチド、タンパク質またはそれらの塩
である場合に）共通構造をコードする塩基配列を含有す
るプライマーまたはプローブを作成して、リガンドまた
はそのサブタイプをコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を
クローニングすることによりリガンド候補物質を取得す
る方法。まず、上記（Ｆ）に記載のアゴニスト活性を有
する（試験）化合物の共通構造、即ちアゴニスト活性を
有する（試験）化合物をコードするアミノ酸配列間の相
同性の高い配列部分をコードする塩基配列を含有するプ
ライマーまたはプローブを作成する。次に、該プライマ
ーを用いて、自体公知のＰＣＲ法によって、ヒト、温血
動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒ
ツジ、ウシ、サルなど）および魚類などのあらゆる組織
（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化
管、血管、心臓など）または細胞由来のゲノムＤＮＡラ
イブラリー、ｃＤＮＡライブラリーなどから目的とする
リガンド候補物質をコードするＤＮＡを増幅する。クロ
ーン化されたリガンド候補物質をコードする塩基配列を
含有するｃＤＮＡは目的によりそのまま、または所望に
より制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして
使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側に
は翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ
を有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終
止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加
することもできる。次に、上記（Ａ）および（Ｂ）に記
載したオーファン受容体タンパク質発現細胞の製造方法
に準じて、リガンド候補物質をコードするＤＮＡを含有
する形質転換体を培養し、該培養物から例えば下記の方
法により、リガンド候補物質を分離精製することができ
る。すなわち、培養後、自体公知の方法で、菌体あるい
は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、
リゾチームおよび／または凍結融解によって菌体あるい
は細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により推定される
リガンドまたはそのサブタイプの租抽出液を得る方法な
どが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアジニ
ンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録
商標。以下ＴＭと省略することがある。）などの界面活
性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培
養上清、あるいは抽出液中に含まれるリガンド候補物質
の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行うことができる。これらの公知の分離・精製法とし
ては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方法、
透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の
差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなど
の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグ
ラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速
液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの
等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして
得られるリガンド候補物質が遊離体で得られた場合に
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自
体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体
または他の塩に変換することができる。また、リガンド
候補物質をコードするアミノ酸配列から、自体公知のタ
ンパク質の合成法に従って、あるいはリガンド候補物質
を含有するタンパク質を適当なペプチダーゼで切断する
ことによって製造することができる。タンパク質の合成
法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれに
よっても良い。すなわち、リガンド候補物質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のリガンド候補物質を製造することができ
る。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、
以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白
質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成
広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせてリガンド候補物質を精製
単離することができる。上記方法で得られるリガンド候
補物質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当
な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。リガンド候補物質について上記（Ｄ）に記載の細胞
刺激活性測定系を用いて、細胞刺激活性を測定し、試験
化合物（具体的には試験化合物(a)）との細胞刺激活性
と比較することにより、アゴニスト（リガンド）活性の
有無を確認することができる。アゴニスト（リガンド）
活性が認められたリガンド候補物質が、オーファン受容
体タンパク質の（内因性）リガンドまたはそのサブタイ
プであるか否かは、下記（Ｊ）に記載のリガンド決定方
法により確認することができる。また、ジーントラッパ
ーのように上記プローブを使って目的の遺伝子のｍＲＮ
Ａを精製し、そのｍＲＮＡからリガンド候補物質のｃＤ
ＮＡを取得することもできる。さらに上記（Ａ）に記載
したオーファン受容体タンパク質の製造方法に準じて、
リガンド候補物質をコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによってリガンド候補物質を得るこ
とができる。

【００３０】（３）（アゴニスト活性を有する（試験）
化合物が、ペプチド、タンパク質またはそれらの塩であ
る場合に）共通構造を有するペプチドまたはタンパク質
を配列データーベースを検索することによりリガンド候
補物質を探索する方法。上記（Ｆ）に記載のアゴニスト
活性を有する（試験）化合物の共通構造、即ちアゴニス
ト活性を有する（試験）化合物をコードするアミノ酸配
列間の相同性の高い配列部分をコードする塩基配列を含
有するペプチドまたはタンパク質を配列データーベース
を検索して、リガンド候補物質を決定することができ
る。配列データーベースとしては、例えば、GenBank
（登録商標）ファイル（National Institute of Healt
h）、ＶＴＳ（Virtual Transcribed Sequence）などが
あげられる。リガンド候補物質をコードする塩基配列が
決定されれば、上記（Ｇ）−２に記載の方法に準じて、
リガンド候補物質を取得することが可能である。また、
データーベースでの検索の結果、リガンド候補物質の一
部をコードすると推定される配列が判明した場合には、
該配列をもとにプライマーまたはプローブを作成して、
上記（Ｇ）−２に記載の方法に準じて、リガンド候補物
質を取得することが可能である。

【００３１】（４）共通構造を認識する抗体を作成する
ことによりリガンド候補物質を探索する方法。上記
（Ｆ）に記載のアゴニスト活性を有する（試験）化合物
の共通構造、即ちアゴニスト活性を有する（試験）化合
物をコードするアミノ酸配列間の相同性の高い配列部分
で表されるペプチドを上記のペプチド（タンパク質）合
成方法を用いて、作成する。次に該ペプチドに対する抗
体を下記の方法に従って作成する。なお、抗体は該ペプ
チドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体の何れであってもよい。該ペプチド
に対する抗体は、該ペプチドを抗原として用い、自体公
知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することが
できる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製該ペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が
可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投
与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全
フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン
トを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ず
つ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物と
しては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マ
ウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられ
る。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗
原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認
められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓また
はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を
同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることによ
り、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する
ことができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後
記の標識化ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体
に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうこ
とができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラー
とミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、49
5 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤と
しては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や
センダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥ
Ｇが用いられる。

【００３２】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、ペプチド抗原を直
接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロ
プレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放
射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したペプチドを加え、固相に結合
したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられ
る。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそ
れに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡ
Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添
加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別およ
び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるも
のならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜
２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含む
ＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリド
ーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００３３】（ｂ）モノクロナール抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００３４】〔ポリクローナル抗体の作製〕上記ペプチ
ド抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従
って製造することができる。例えば、免疫抗原（ペプチ
ド抗原）自体、あるいはそれとキャリアーペプチドとの
複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と
同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物からペプチ
ドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行
なうことにより製造することができる。温血動物を免疫
するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との
複合体に関し、キャリアーペプチドの種類およびキャリ
アーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて
免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、ど
の様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例え
ば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモ
シアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２
０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用
いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングに
は、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルア
ルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、
チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル
試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対し
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希
釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高
めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイ
ントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２
〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動
物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取すること
ができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、
上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき
る。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクロ
ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精
製法に従って行なうことができる。かくして得られるア
ゴニスト活性を有する（試験）化合物の共通構造を認識
する抗体の交差反応性を利用して、リガンド候補物質を
検出し、その免疫活性を指標として各種抽出法、クロマ
トグラフィーを組み合わせることによって、リガンド候
補物質を得ることができる。

【００３５】（Ｈ）オーファン受容体タンパク質の機能
を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法につ
いて：上記（Ｇ）において取得されたリガンド候補物質
を用いて、オーファン受容体タンパク質の機能を促進す
る化合物（高活性アゴニスト）またはその機能を阻害す
る化合物（アンタゴニスト）をスクリーニングすること
が可能である。オーファン受容体タンパク質の機能を促
進する化合物を「高活性アゴニスト」と記載するが、
「高活性」とは、上記（Ｅ）に記載の「アゴニスト活性
を有する（試験）化合物」に比べて、より細胞刺激活性
（具体的には、上記（Ｄ）に記載の細胞刺激活性など）
などが強いことを意味する。以下にそのスクリーニング
方法を詳述する。オーファン受容体タンパク質を用いる
か、または組換え型オーファン受容体タンパク質の発現
系を構築し、該発現系を用いた受容体結合アッセイ系を
用いることによって、上記（Ｇ）において取得されたリ
ガンド候補物質とオーファン受容体タンパク質との結合
性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）また
はその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
すなわち、まず、オーファン受容体タンパク質発現細胞
またはその細胞膜画分にリガンド候補物質を接触させた
場合と試験化合物(b)（即ち、該オーファン受容体タン
パク質発現細胞またはその細胞膜画分に該オーファン受
容体タンパク質の機能を促進または阻害する化合物の候
補物質）を接触された場合における上記（Ｄ）に記載し
た（ａ）細胞外ｐＨの変動、(b)アラキドン酸遊離、(c)
アセチルコリン遊離、(d)細胞内Ｃａ²⁺遊離、(e)細胞内
ｃＡＭＰの変動、(f)細胞内ｃＧＭＰの変動、(g)イノシ
トールリン酸産生、(h)細胞膜電位変動、(i)細胞内蛋白
質のリン酸化、(j)ｃ−ｆｏｓの活性化、（ｋ）ＧＴＰ
γＳの結合、（ｌ）レポーター遺伝子の発現などを指標
とした細胞刺激活性を比較する。オーファン受容体タン
パク質発現細胞またはその細胞膜画分にリガンド候補物
質を接触させた場合の細胞刺激活性に比し、試験化合物
(b)（即ち、該オーファン受容体タンパク質発現細胞ま
たはその細胞膜画分に該オーファン受容体タンパク質の
機能を促進または阻害する化合物の候補物質）を接触さ
れた場合の細胞刺激活性が強い場合には、該試験化合物
(b)（または候補物質）は、該オーファン受容体タンパ
ク質の機能を促進する化合物（いわゆるアゴニスト）で
ある可能性が高い。該試験化合物(b)（または候補物
質）が該オーファン受容体タンパク質の機能を（選択的
に、Specificに）促進する化合物（いわゆるアゴニス
ト）であるか否かは、該オーファン受容体タンパク質と
該試験化合物(b)（または候補物質）との特異的結合量
を測定すればよい。特異的結合量の測定方法としては、
例えば、標識した試験化合物(b)（または候補物質）を
オーファン受容体タンパク質に接触させた場合におけ
る、標識した試験化合物(b)（または候補物質）の該オ
ーファン受容体タンパク質に対する結合量を測定する方
法などがあげられる。測定結果、十分な結合量（非特異
結合に対して１％以上の結合量の増加、好ましくは１０
％以上の結合量の増加）が認められれば、該試験化合物
(b)（または候補物質）は該オーファン受容体タンパク
質の機能を促進する化合物（いわゆるアゴニスト）と認
められる。該測定方法の具体的な説明を以下にする。ま
ず、該測定方法に用いるオーファン受容体タンパク質と
しては、前記したオーファン受容体タンパク質を含有す
るものであれば何れのものであってもよい。スクリーニ
ングに用いる大量のオーファン受容体タンパク質を得る
には、組換え体を用いて大量発現させたオーファン受容
体タンパク質などが適している。オーファン受容体タン
パク質を製造するには、前述の方法が用いられるが、オ
ーファン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを前出の
動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが
好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断
片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約
されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡ
を用いてもよい。オーファン受容体タンパク質をコード
するＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率
よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主と
するバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nu
clear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプ
ロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイ
ルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、
ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み
込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査
はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文
献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜
19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことがで
きる。したがって、上記測定方法において、オーファン
受容体タンパク質を含有するものとしては、それ自体公
知の方法に従って精製したオーファン受容体タンパク質
であってもよいし、オーファン受容体タンパク質を含有
する細胞を用いてもよく、またオーファン受容体タンパ
ク質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。オーファ
ン受容体タンパク質を含有する細胞としては、該受容体
タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞と
しては、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜画
分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で
得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞
の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザ
ーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリ
トロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破
砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズ
ルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細
胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法
などの遠心力による分画法が主として用いられる。例え
ば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐ
ｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清を
さらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で
通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とす
る。該膜画分中には、発現したオーファン受容体タンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多
く含まれる。該オーファン受容体タンパク質を含有する
細胞や膜画分中のオーファン受容体タンパク質の量は、
１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１
０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。標識した試験化
合物(b)（または候補物質）としては、例えば〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識された試験
化合物(b)（または候補物質）などが用いられる。該測
定方法を行なうには、まずオーファン受容体タンパク質
を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング
に適したバッファーに懸濁することによりレセプター蛋
白質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０
（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス
−塩酸バッファーなどの候補物質とレセプター蛋白質と
の結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよ
い。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰ
Ｓ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギト
ニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファー
に加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレ
セプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロ
イペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタ
チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもでき
る。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一
定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識し
た試験化合物(b)（または候補物質）を添加する。反応
は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、
約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間
行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バ
ッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射
活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウ
ンターで計測する。一方、オーファン受容体タンパク質
発現細胞またはその細胞膜画分にリガンド候補物質を接
触させた場合の細胞刺激活性に比べ、該オーファン受容
体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に試験化合
物(b)（即ち、該オーファン受容体タンパク質の機能を
促進または阻害する化合物の候補物質）を接触させた場
合の細胞刺激活性が弱いまたは認められない場合には、
該試験化合物(b)（または候補物質）は、該オーファン
受容体タンパク質の機能を阻害する化合物（いわゆるア
ンタゴニスト）である可能性がある。また、オーファン
受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分にリガ
ンド候補物質を接触させた場合の細胞刺激活性に比べ、
試験化合物(b)（または該オーファン受容体タンパク質
発現細胞またはその細胞膜画分に該オーファン受容体タ
ンパク質の機能を促進または阻害する化合物の候補物
質）およびリガンド候補物質を接触させた場合の細胞刺
激活性が弱いまたは認められない場合には、該試験化合
物(b)（または候補物質）は、該オーファン受容体タン
パク質の機能を阻害する化合物（いわゆるアンタゴニス
ト）である可能性がある。該試験化合物(b)（または候
補物質）が該オーファン受容体タンパク質の機能を（選
択的に、Specificに）阻害する化合物（いわゆるアゴニ
スト）であるか否かは、該オーファン受容体タンパク質
との特異的結合量を測定すればよい。特異的結合量の測
定方法としては、例えば、標識した試験化合物(b)（ま
たは候補物質）をオーファン受容体タンパク質に接触さ
せた場合における、標識した試験化合物(b)（または候
補物質）の該オーファン受容体タンパク質に対する結合
量を測定する方法などがあげられる。測定結果、十分な
結合量（非特異結合に対して１％以上の結合量の増加、
好ましくは１０％以上の結合量の増加）が認められれ
ば、該試験化合物(b)（または候補物質）は該オーファ
ン受容体タンパク質の機能を阻害する化合物（いわゆる
アンタゴニスト）と認められる。該測定方法としては、
上記のオーファン受容体タンパク質の機能を促進する化
合物（いわゆる高活性アゴニスト）をスクリーニングす
る際の測定方法と同様の方法などが用いられる。また、
標識したリガンド候補物質を、オーファン受容体タンパ
ク質に接触させた場合と、標識したリガンド候補物質お
よび試験化合物(b)（即ち、オーファン受容体タンパク
質の機能を阻害する化合物の候補物質）をオーファン受
容体タンパク質に接触させた場合における、標識したリ
ガンド候補物質の該オーファン受容体タンパク質に対す
る結合量を測定し、比較することにより、オーファン受
容体タンパク質の機能を阻害する化合物をスクリーニン
グすることも可能である。該スクリーニング方法の具体
的な説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング
方法に用いるオーファン受容体タンパク質としては、前
記したオーファン受容体タンパク質を含有するものであ
れば何れのものであってもよい。スクリーニングに用い
る大量のオーファン受容体タンパク質を得るには、組換
え体を用いて大量発現させたオーファン受容体タンパク
質などが適している。オーファン受容体タンパク質を製
造するには、前述の方法が用いられるが、オーファン受
容体タンパク質をコードするＤＮＡを前出の動物細胞や
昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。
目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補
ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるもの
ではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いても
よい。オーファン受容体タンパク質をコードするＤＮＡ
断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現さ
せるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュ
ロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear poly
hedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモータ
ー、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒー
トショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモ
ーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが
好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自
体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Namb
i，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,
1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。し
たがって、上記スクリーニング方法において、オーファ
ン受容体タンパク質を含有するものとしては、それ自体
公知の方法に従って精製したオーファン受容体タンパク
質であってもよいし、オーファン受容体タンパク質を含
有する細胞を用いてもよく、またオーファン受容体タン
パク質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。オーフ
ァン受容体タンパク質含有する細胞としては、該レセプ
ター蛋白質等を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞
としては、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜
画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法
で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細
胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイ
ザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポ
リトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による
破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノ
ズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。
細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離
法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例
えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐ
ｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清を
さらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で
通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とす
る。該膜画分中には、発現したオーファン受容体タンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多
く含まれる。該オーファン受容体タンパク質を含有する
細胞や膜画分中のオーファン受容体タンパク質の量は、
１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１
０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が
多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が
高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能にな
るばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できる
ようになる。リガンド候補物質とオーファン受容体タン
パク質との結合性を変化させる化合物をスクリーニング
する方法を実施するためには、例えば、適当なオーファ
ン受容体タンパク質画分と、標識したリガンドまたはそ
のサブタイプが必要である。標識したリガンド候補物質
としては、例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵
Ｓ〕などで標識されたリガンド候補物質などが用いられ
る。具体的には、オーファン受容体タンパク質の機能を
阻害する化合物のスクリーニングを行なうには、まずオ
ーファン受容体タンパク質を含有する細胞または細胞の
膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁す
ることによりレセプター蛋白質標品を調製する。バッフ
ァーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリ
ン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガン
ドとレセプター蛋白質との結合を阻害しないバッファー
であればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減さ
せる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−
アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界
面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、
プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑え
る目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド
研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を
添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レ
セプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５００００
０ｃｐｍ）の標識したリガンド候補物質を添加し、同時
に１０^-4Ｍ〜１０^-10Ｍの試験化合物(b)（即ち、オーフ
ァン受容体タンパク質の機能を阻害する化合物の候補物
質）を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るた
めに大過剰の未標識のリガンド候補物質を加えた反応チ
ューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましく
は約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望まし
くは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙
等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス
繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカ
ウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物
質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（Ｎ
ＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％と
した時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０
％以下になる試験化合物(b)（即ち、オーファン受容体
タンパク質の機能を阻害する化合物の候補物質）をオー
ファン受容体タンパク質の機能を阻害する化合物（いわ
ゆるアンタゴニスト）として選択することができる。

【００３６】（Ｉ）上記（Ｈ）に記載の試験化合物(b)
（即ち、オーファン受容体タンパク質の機能を促進また
は阻害する化合物の候補物質）、オーファン受容体タン
パク質の機能を促進または阻害する化合物について：試
験化合物(b)（即ち、オーファン受容体タンパク質の機
能を促進または阻害する化合物の候補物質）としては、
天然・非天然のペプチド、天然・非天然のタンパク質、
天然・非天然の非ペプチド性化合物、合成化合物、天然
・非天然の発酵生産物などから選ばれる。オーファン受
容体タンパク質の機能を促進または阻害する化合物とし
ては、上記（Ｈ）に記載のスクリーニング方法におい
て、オーファン受容体タンパク質の機能を促進する化合
物またはオーファン受容体タンパク質の機能を阻害する
化合物と認められる化合物のことを意味し、該化合物は
塩を形成していてもよい。該化合物の塩としては、生理
学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸
（有機酸、無機酸）との塩があげられるが、とりわけ生
理学的に許容される酸付加塩などが好ましい。このよう
な塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭
化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香
酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩な
どがあげられる。また、上記（Ｈ）の方法で得られうる
オーファン受容体タンパク質の機能を促進（高活性アゴ
ニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物は、
後述の（内因性）リガンドまたはそのサブタイプが有す
る生理活性と同様の作用を有しているので、該リガンド
活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。オ
ーファン受容体タンパク質に対するアンタゴニストは、
オーファン受容体タンパク質に対するリガンドまたはそ
のサブタイプが有する生理活性を抑制することができる
ので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬と
して有用である。オーファン受容体タンパク質に対する
高活性アゴニストは、オーファン受容体タンパク質に対
するリガンドが有する生理活性を増強するための安全で
低毒性な医薬として有用である。

【００３７】本発明の方法を用いて得られうるアンタゴ
ニスト、高活性アゴニストを医薬組成物として使用する
場合、常套手段に従って投与することができる。例え
ば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセ
ル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるの
で、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウ
ス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。該リガンドまたは
そのサブタイプ、およびアンタゴニスト、アゴニストの
投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
より差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、
一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０
〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇであ
る。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与
対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なる
が、例えば、注射剤の形では通常例えば、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００３８】（Ｊ）オーファン受容体タンパク質のリガ
ンドまたはそのサブタイプの決定方法について：本発明
は、上記（Ｈ）に記載のオーファン受容体タンパク質の
機能を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
を提供するのみならず、アゴニスト活性を有する（試
験）化合物の共通構造を指標として、該オーファン受容
体タンパク質のリガンドまたはそのサブタイプをより効
率的に、確実に決定する方法をも提供する。即ち、
（i）オーファン受容体タンパク質発現細胞またはその
細胞膜画分に試験化合物を接触させ、該オーファン受容
体タンパク質を介する細胞刺激活性を測定し、(ii) 各
試験化合物の細胞刺激活性を比較することにより、アゴ
ニスト活性を有する試験化合物の共通構造を決定し、(i
ii) 該共通構造を有するリガンド候補物質の該オーファ
ン受容体タンパク質への特異的結合量を測定することに
より、該オーファン受容体タンパク質のリガンドまたは
そのサブタイプを決定する方法を提供するものである。
より具体的には、（i）オーファン受容体タンパク質発
現細胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触さ
せた場合と、オーファン受容体タンパク質を発現しない
細胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触させ
た場合において、それぞれの細胞刺激活性を測定し、(i
i) 各試験化合物(a)の細胞刺激活性を比較することによ
り、アゴニスト活性を有する化合物を得、(iii) アゴニ
スト活性を有する該化合物が有する共通構造から推定さ
れたリガンド候補物質の該オーファン受容体タンパク質
への特異的結合量を測定することにより、該オーファン
受容体タンパク質のリガンドまたはそのサブタイプを決
定する方法を提供する。該決定方法中、（i）オーファ
ン受容体タンパク質発現細胞またはその細胞膜画分に試
験化合物（具体的には試験化合物(a)）を接触させ、該
オーファン受容体タンパク質を介する細胞刺激活性を測
定し、(ii) 各試験化合物（具体的には試験化合物(a)）
の細胞刺激活性を比較することにより、アゴニスト活性
を有する（試験）化合物を得、アゴニスト活性を有する
該化合物が有する共通構造を推定（または決定）しリガ
ンド候補物質を得る工程に関しては、上記と同様の方法
が用いられる。次に、該共通構造を有するリガンド候補
物質（上述）を用いて、該リガンド候補物質が、（内因
性）のリガンドまたはそのサブタイプであるかを決定す
る方法を以下に詳述する。上記リガンド候補物質がオー
ファン受容体タンパク質のSpecificなリガンドであるか
否かは、リガンド候補物質の該オーファン受容体タンパ
ク質への特異的結合量を測定することにより決定するこ
とができる。すなわち、標識したリガンド候補物質をオ
ーファン受容体タンパク質に接触させた場合における、
標識したリガンド候補物質の該オーファン受容体タンパ
ク質に対する結合量を測定する方法などがあげられる。
測定結果、十分な結合量（非特異結合に対して１％以上
の結合量の増加、好ましくは１０％以上の結合量の増
加）が認められれば、該候補物質は該オーファン受容体
タンパク質の（内因性）リガンドであると認められる。
逆に十分な結合量が認められない場合には、該リガンド
候補物質は細胞刺激活性を有するものの、該オーファン
受容体タンパク質に対する特異的な結合能が低い物質、
即ち、ノンスペシフィックなアゴニスト様物質である可
能性が高い。該決定方法の具体的な説明を以下にする。
まず、該決定方法に用いるオーファン受容体タンパク質
としては、前記したオーファン受容体タンパク質を含有
するものであれば何れのものであってもよい。スクリー
ニングに用いる大量のオーファン受容体タンパク質を得
るには、組換え体を用いて大量発現させたオーファン受
容体タンパク質などが適している。オーファン受容体タ
ンパク質を製造するには、前述の方法が用いられるが、
オーファン受容体タンパク質をコードするＤＮＡを前出
の動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうこと
が好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ
断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制
約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮ
Ａを用いてもよい。オーファン受容体タンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効
率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主
とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリ
ンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウ
イルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に
組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の
検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例え
ば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,1
9555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうこ
とができる。したがって、上記測定方法において、オー
ファン受容体タンパク質を含有するものとしては、それ
自体公知の方法に従って精製したオーファン受容体タン
パク質であってもよいし、オーファン受容体タンパク質
を含有する細胞を用いてもよく、またオーファン受容体
タンパク質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。オ
ーファン受容体タンパク質を含有する細胞としては、該
受容体タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主
細胞としては、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細
胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の
方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したオーファン受容体
タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成
分が多く含まれる。該オーファン受容体タンパク質を含
有する細胞や膜画分中のオーファン受容体タンパク質の
量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好まし
く、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。標識した
リガンド候補物質としては、例えば〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガ
ンド候補物質などが用いられる。該測定方法を行なうに
は、まずオーファン受容体タンパク質を含有する細胞ま
たは細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファ
ーに懸濁することによりレセプター蛋白質標品を調製す
る。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６
〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーな
どの候補物質とレセプター蛋白質との結合を阻害しない
バッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結
合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０
^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレー
トなどの界面活性剤をバッファーに加えることもでき
る。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンド
の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６
４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテア
ーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１
０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ
〜５０００００ｃｐｍ）の標識した候補物質を添加す
る。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３
７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分か
ら３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適
量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存
する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたは
γ−カウンターで計測する。

【００３９】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００４０】Ｇｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸ＨＥＰＥＳ：N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン
-N'-[2-エタンスルホン酸] ＨＢＳＳ：Hank's Balanced Salt Solution

【００４１】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。〔配列番号：１〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：２〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：３〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：４〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：５〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：６〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：７〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：８〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：９〕後述の実施例１で用いられたサンプル
が有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１０〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１１〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１２〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１３〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１４〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１５〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１６〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１７〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１８〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：１９〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：２０〕後述の実施例１で用いられたサンプ
ルが有するアミノ酸配列を示す（表１参照）。〔配列番号：２１〕ヒト型ＦＭ−３をコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す（後述の参考例１）。〔配列番号：２２〕後述の参考例１で用いられたＦＭ３
Ｆ２の塩基配列を示す。〔配列番号：２３〕後述の参考例１で用いられたＦＭ３
Ｒ２の塩基配列を示す。

【００４２】

【実施例】以下に参考例および実施例を示して、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。参考例１ヒト型ＦＭ−３発現ＣＨ
Ｏ細胞の作成（特願2000-52251号実施例１参照）ヒト型ＦＭ−３の取得は以下のように行った。Genomics
52,223-229(1998) に報告されているヒト型ＦＭ−３の
配列に基づき以下の２種類の合成DNAを合成した。 FM3F2:5'-GTCGACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGG-3'（配
列番号：２２） FM3R2:5'-GCTAGCTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTG-3'（配列番
号：２３）これらの合成DNAを用いてヒト胎児脳ｃDNAよりPCRにて
取得した。PCRの反応液はラット視床下部cDNA溶液1 μl
（0.2 ng poly(A)⁺RNA由来）、１ μFM3F2（10μM）、
1 μl FM3R2（10 μM）、5μl添付の10 x反応液、5 μl
dNTP（10mM）、1 μl Ex Taq（タカラ）、36 μl 蒸留
水を加えて合計50μlにした。反応液をThermalCycler96
00を用いてPCR反応にかけた。PCRの条件は95℃・2 分の
変性の後、98℃・10 秒、65℃・10秒、72℃・90秒のサ
イクルを28回繰り返した。PCR産物の一部を用いて電気
泳動で約1,2 kbのPCR産物の増幅を確認した後、PCR産物
をTAクローニングキット（Invitrogen社）を用いて大腸
菌にサブクローニングした。サブクローニングで得られ
た大腸菌からプラスミドをプラスミド抽出機（クラボウ
社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、そ
の配列が上記の文献に報告されているものと同じヒト型
ＦＭ−３cDNA（配列番号：２１）であることを確認し
た。次にそのプラスミドから制限酵素ＳａｌＩおよびＮ
ｈｅＩによって消化後約1.2 kbのヒト型ＦＭ−３cDNA断
片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるｐ
ＡＫＫＯ−１１１Ｈはマルチクローニングサイト部分の
制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化
後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の
操作によって調製したヒト型ＦＭ−３cDNA断片および発
現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換してE. coliＪＭ１０９／ｐＡＫＫ
ＯＦＭ３を得た。形質転換体E. coliＪＭ１０９／ｐＡ
ＫＫＯＦＭ３を培養し、プラスミドｐＡＫＫＯＦＭ３の
ＤＮＡを大量に調製した。そのプラスミドＤＮＡのうち
の２０μgを１mlの生理的食塩水（ＰＢＳ）に溶解後、
ジーントランスファー（和光純薬）のバイアルに注入
し、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌してＤＮ
Ａを含有するリポソームを形成させた。ＣＨＯｄｈｆｒ
^-細胞１ないし２×１０⁶個を直径３５mmの細胞培養用シ
ャーレに播種し、２０時間培養した後に培養液を新鮮な
ものに交換した。各シャーレに対して０.５μgのＤＮＡ
に相当する量（２５μｌ）のリポソーム液を滴下し、１
６時間インキュベーションを行ってプラスミドＤＮＡの
導入を行った。さらに新鮮な培地に交換して１日間培養
した後、選択培地に交換して３日間培養を続け、最後に
トリプシン消化を行って分散させた細胞を低密度で選択
培地（deoxyribonucleosidesおよびribonucleosidesを
含有しないminimum essential medium，alpha mediumに
１０％透析ウシ血清を加えたもの）中に播種し、形質転
換体の選択を行った。形質転換体のみが選択培地中で増
殖することが可能であり、継代を繰り返すことによって
選択を重ね、ＣＨＯ−ＦＭ３細胞を樹立した。

【００４３】実施例１各種ペプチドサンプルを用いた
サイトセンサーアッセイによるFM-3発現CHO細胞に対す
る刺激活性の検出 FM-3発現ＣＨＯ細胞を、2.7x10⁵cells/capsuleの密度で
サイトセンサー用カプセルに播種し、一晩培養した後に
サイトセンサーのワークステーションに装着した。サイ
トセンサーの流路にセットしたアッセイ用の培地（0.1
％のウシ血清アルブミンを含有するlow buffered RPMI1
640 medium）を、ポンプＯＮ（80秒間）ポンプＯＦＦ
（40秒間）のサイクルで細胞に供給し、各サイクルごと
にポンプ停止８秒後から30秒間の細胞外ｐＨの変化率を
acidification rateとして算出した。acidification ra
teの経時変化をモニターし、安定した値を示すようにな
ったところで流路の切り換えによって細胞に表に示した
各ペプチドを７分２秒間暴露した。各ウェルのAcidific
ation Rateの値をペプチドを暴露する直前の３サイクル
の値を100％として標準化し、細胞の反応の比較を行な
った。暴露したサンプルの濃度は1〜10μＭとした。ペ
プチドサンプルのFM-3発現CHO細胞に対する刺激活性の
サイトセンサーアッセイによる検出結果を表１に示す。
反応のピーク時のacidification rateの値が120%を超え
るものについては（○）、120%以下であるが明らかに反
応と認められるものについては（△）、反応が認められ
ないものは（×）、どちらとも言えないものは（？）で
表示した。その結果、FM-3発現ＣＨＯ細胞はH-2980、F-
8-F-NH2 およびアメフラシ（Aplysia）由来のペプチドS
mall Cardioactive Peptide B (SCPB) に反応が検出さ
れた。特にこれらのなかでは、SCPBに対する反応が最も
強かった。

【００４４】

【表１】

【００４５】反応の検出されたペプチド（H-2980、F-8-
F-NH2、SCPB）の構造を比較し、すべてに共通する構造
としてC-末端部分のR-X-NH₂構造を見出した。アミノ酸
配列の共通性を比較したものを図１に示す。SCPBに対す
る反応が最も強いことからFM-3の内因性リガンドはC-末
端R-X-NH₂構造に加えて、他の部分においてもSCPBに類
似の構造をとることが予想された。また、H-2980および
F-8-F-NH2に対しても部分的に類似の構造をとると考え
られる。このような予測のもとに既知のペプチドを検索
した結果、ニューロメジンＵ（ＮＭＵ−８）が見出され
た。

【００４６】

【発明の効果】本発明の方法、即ちオーファン受容体タ
ンパク質発現細胞もしくはその細胞膜画分またはオーフ
ァン受容体タンパク質発現細胞もしくはその細胞膜画分
に発現したオーファン受容体タンパク質に試験化合物を
接触させ、オーファン受容体タンパク質を介する細胞刺
激活性を測定し、各試験化合物の細胞刺激活性を比較す
ることにより、アゴニストを選定した後、各アゴニスト
の構造を比較することによって、オーファン受容体タン
パク質のリガンドまたはそのサブタイプ、アンタゴニス
ト・高活性アゴニストなどを効率的かつ確実に取得でき
る。

【００４７】

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening Method <130> B00227 <150> JP 11-236597 <151> 1999-08-24 <160> 23 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 1 Phe Met Arg Phe 1 4 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 2 Tyr Phe Met Arg Phe 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 3 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Phe 1 5 7 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 Tyr Gly Gly Phe Met Arg Phe 1 5 7 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 5 Pro Gln Arg Phe 1 4 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 6 Phe Leu Phe Gln Pro Gln Arg Phe 1 5 8 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <233> Xaa means pGlu <400> 7 Xaa Asp Pro Phe Leu Arg Phe 1 5 7 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 8 Asp Arg Asn Phe Leu Arg Phe 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 9 Asn Arg Asn Phe Leu Arg Phe 1 5 7 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 10 Thr Asn Arg Asn Phe Leu Arg Phe 1 5 8 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 11 Pro Asp Val Asp His Val Phe Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 12 Lys Asn Glu Phe Ile Arg Phe 1 5 7 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 13 Lys His Glu Tyr Leu Arg Phe 1 5 7 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 14 Leu Pro Leu Arg Phe 1 5 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 15 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Thr Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30 31 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 16 Ser Pro Glu Ile Asp Pro Phe Trp Val Tyr Gly Arg Gly Val Arg Pro 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe 20 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 17 Ser Gly Gln Ser Trp Arg Pro Gln Gly Arg Phe 1 5 10 11 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 18 Leu Ser Ser Phe Val Arg Ile 1 5 7 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 19 Ala Arg Pro Gly Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Met 1 5 10 11 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the C-terminus of the polypeptide is amide (-CONH₂) form <400> 20 Met Asn Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Met 1 5 9 <210> 21 <211> 1209 <212> DNA <213> Human <400> 21 ATGGCTTGCA ATGGCAGTGC GGCCAGGGGG CACTTTGACC CTGAGGACTT GAACCTGACT 60 GACGAGGCAC TGAGACTCAA GTACCTGGGG CCCCAGCAGA CAGAGCTGTT CATGCCCATC 120 TGTGCCACAT ACCTGCTGAT CTTCGTGGTG GGCGCTGTGG GCAATGGGCT GACCTGTCTG 180 GTCATCCTGC GCCACAAGGC CATGCGCACG CCTACCAACT ACTACCTCTT CAGCCTGGCC 240 GTGTCGGACC TGCTGGTGCT GCTGGTGGGC CTGCCCCTGG AGCTCTATGA GATGTGGCAC 300 AACTACCCCT TCCTGCTGGG CGTTGGTGGC TGCTATTTCC GCACGCTACT GTTTGAGATG 360 GTCTGCCTGG CCTCAGTGCT CAACGTCACT GCCCTGAGCG TGGAACGCTA TGTGGCCGTG 420 GTGCACCCAC TCCAGGCCAG GTCCATGGTG ACGCGGGCCC ATGTGCGCCG AGTGCTTGGG 480 GCCGTCTGGG GTCTTGCCAT GCTCTGCTCC CTGCCCAACA CCAGCCTGCA CGGCATCCGG 540 CAGCTGCACG TGCCCTGCCG GGGCCCAGTG CCAGACTCAG CTGTTTGCAT GCTGGTCCGC 600 CCACGGGCCC TCTACAACAT GGTAGTGCAG ACCACCGCGC TGCTCTTCTT CTGCCTGCCC 660 ATGGCCATCA TGAGCGTGCT CTACCTGCTC ATTGGGCTGC GACTGCGGCG GGAGAGGCTG 720 CTGCTCATGC AGGAGGCCAA GGGCAGGGGC TCTGCAGCAG CCAGGTCCAG ATACACCTGC 780 AGGCTCCAGC AGCACGATCG GGGCCGGAGA CAAGTGACCA AGATGCTGTT TGTCCTGGTC 840 GTGGTGTTTG GCATCTGCTG GGCCCCGTTC CACGCCGACC GCGTCATGTG GAGCGTCGTG 900 TCACAGTGGA CAGATGGCCT GCACCTGGCC TTCCAGCACG TGCACGTCAT CTCCGGCATC 960 TTCTTCTACC TGGGCTCGGC GGCCAACCCC GTGCTCTATA GCCTCATGTC CAGCCGCTTC 1020 CGAGAGACCT TCCAGGAGGC CCTGTGCCTC GGGGCCTGCT GCCATCGCCT CAGACCCCGC 1080 CACAGCTCCC ACAGCCTCAG CAGGATGACC ACAGGCAGCA CCCTGTGTGA TGTGGGCTCC 1140 CTGGGCAGCT GGGTCCACCC CCTGGCTGGG AACGATGGCC CAGAGGCGCA GCAAGAGACC 1200 GATCCATCC 1209 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 22 GTCGACCATG GCTTGCAATG GCAGTGCGGC CAGG 34 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 23 GCTAGCTCAG GATGGATCGG TCTCTTGCTG 30

【００４８】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるアミノ酸配列の共通性の比較
図を示す。共通するアミノ酸残基を四角で囲って表示し
た。フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）は立
体構造的に極めて類似の構造を示すため、同様に四角で
囲って表示した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（i）オーファン受容体タンパク質発現細
胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触させた
場合と、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞
またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触させた場
合において、それぞれの細胞刺激活性を測定し、(ii)
各試験化合物(a)の細胞刺激活性を比較することによ
り、アゴニスト活性を有する化合物を得、(iii) ア
ゴニスト活性を有する該化合物が有する共通構造から推
定されたリガンド候補物質を該オーファン受容体タンパ
ク質発現細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と
試験化合物(b)を該オーファン受容体タンパク質発現細
胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における細胞
刺激活性を比較し、および該オーファン受容体タン
パク質と試験化合物(b)との特異的結合量を測定するこ
とを特徴とする該オーファン受容体タンパク質の機能を
促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法。
【請求項２】請求項１記載のスクリーニング方法によっ
て得られうる化合物またはその塩。
【請求項３】（i）オーファン受容体タンパク質発現細
胞またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触させた
場合と、オーファン受容体タンパク質を発現しない細胞
またはその細胞膜画分に試験化合物(a)を接触させた場
合において、それぞれの細胞刺激活性を測定し、(ii)
各試験化合物(a)の細胞刺激活性を比較することによ
り、アゴニスト活性を有する化合物を得、(iii) アゴニ
スト活性を有する該化合物が有する共通構造から推定さ
れたリガンド候補物質の該オーファン受容体タンパク質
への特異的結合量を測定することにより、該オーファン
受容体タンパク質のリガンドまたはそのサブタイプを決
定する方法。