WO2007032255A1

WO2007032255A1 - Ｔ細胞レセプター及び該レセプターをコードする核酸

Info

Publication number: WO2007032255A1
Application number: PCT/JP2006/317773
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Shiku; Atsunori Hiasa; Satoshi Okumura; Hiroaki Naota; Yoshihiro Miyahara
Original assignee: Mie University; Takara Bio Inc.
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2006-09-07
Publication date: 2007-03-22
Also published as: CN101287831B; JP2013126415A; US8003770B2; JP5276846B2; US20090324566A1; KR101130597B1; US8383401B2; KR20080064833A; EP1930433A4; EP1930433A1; US20110256114A1; JPWO2007032255A1; CN101287831A; EP1930433B1; US8951510B2; US20130115199A1; JP5655233B2

Abstract

　配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該配列に１～数個のアミノ酸残基の欠失、不可、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドを有し、かつ配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ－Ａ２４拘束性のＭＡＧＥ－Ａ４１４３－１５１特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチド。

Description

T細胞レセプター及び該レセプターをコードする核酸

技術分野

[0001] 本発明は、 MAGE—A4 ペプチドに特異的な HLA—A2402拘束性の Τ細

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胞レセプター (TCR) α鎖を構成するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、前記 TCRの β鎖を構成するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、前記 a鎖を構成するポリペプチドと β鎖を構成するポリペプチドで構成される Τ細胞レセプター、前記核酸を含んでなる組換え核酸、該組換え核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを導入された細胞、並びに前記のベクター又は細胞を有効成分として含んでなる制がん剤に関する。

背景技術

[0002] 細胞傷害性 Τ細胞 (CTL)には、主要組織適合性抗原遺伝子複合体 (major hist ocompatibility gene complex ;以下、 MHCと略す）にコードされる主要組織適合性抗原分子（MHC分子、ヒトの場合 human leukocyte antigenと呼ばれ、以下、 HLAと略す）と抗原ペプチドとの結合物である複合体を特異的な T細胞レセプタ一 (T cell receptor ;以下、 TCRと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示して、る細胞を傷害することのできるものがある。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、 1)標的細胞の HLAクラス Iのタイプに特異的な TCRを持った CTLが存在すること、 2) HLA分子に結合して形成される複合体が TCRによる認識を受けることができるような抗原ペプチドが存在すること、が必要である。

[0003] このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が細胞質でプロセスされ、小さいペプチドに分解されることにより生じ、更に HLA分子と会合し、細胞表面に提示される。すなわち、多くのサブユニットよりなるプロテアソーム複合体の中で、タンパク質は 8〜15アミノ酸よりなるペプチドに分解され、そのうちのいくつかが TAPトランスポーターにより細胞質力小胞体に運ばれる。これらのぺプチドは小胞体でクラス IZ j8 2ミクログロブリン（microglobulin)のへテロダイマーに結合できれば、 3分子複合体として安定化され、ゴルジ装置を通って、細胞表面に輸送される。腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原タンパク質を発現している腫瘍細胞は、 T 細胞に認識される HLA拘束性抗原ペプチドを細胞表面に提示できるはずである。

[0004] HLAクラス I分子は主として HLA— A、一 B、一Cがあり、これらに結合して提示される抗原ペプチドは、 8〜10個のアミノ酸よりなり、更に各々の HLA分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も頻度の高い HLA— A2. 1分子に結合するペプチドとしては N末端より 2番目に Leu、且つ C末端に Leu又は Valを有する 9〜10個のアミノ酸よりなるペプチドが最も良く知られているものである。また、日本人を始めとするアジアの人種に多い HLA—A24分子に結合するペプチドは N末端より 2番目に Tyr、 Phe、 Met, Trpのいずれ力、且つ C末端に Leu、 Ile、 Trp、 Pheのいずれかを有する 9〜10個のアミノ酸よりなるものであるぺプチドが最もよく知られて、る。

[0005] 現在までに抗原ペプチドが同定されて、る腫瘍抗原としては、 HLA— A1に対する MAGE— Al、 MAGE— A3、 MAGE— A4、 HLA— A2. 1に対する MAGE— A3 、 MARTI、チロシナーゼ、 gplOO、 HER2Zneu、 CEA等、 HLA— Cwlに対する MAGE— A3、 HLA— B44に対する MAGE— A3、 HLA— B37に対する MAGE —A4、 HLA— A24に対する MAGE— Al、 MAGE—A2、 MAGE— A3、 MAGE — A4、 NY— ESO— 1、 CEA、 HER2/neu,チロシナーゼ、 j8—力テ-ン（cateni n)等がある。これらの中の多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラス I拘束性の CTLを株化し、この CTLの認識する腫瘍抗原を同定し、続いて遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中最小単位を見出し、更に HLAクラス I分子への結合モチーフに関する情報を基に最小単位中のペプチドが見出されている。また、まず前記の HLA クラス I分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に、腫瘍抗原タンパク質中の HLAクラス I分子結合ペプチドを見出し、続ヽて抗原提示細胞を利用して CTLを誘導可能なものを選択した後、最終的に腫瘍細胞に対して傷害性を有する CTLが誘導できて、るかどうかにより抗原ペプチドが決定されて、る。

[0006] 一方、 HLAクラス I分子はいくつかのサブタイプに分類される力その保有サブタイプの種類は人種間で大きく異なり、世界的には HLA— A2が最も多ぐ白色人種の 4 5%が1¾^ー八2陽性でぁる。そして、この HLA—A2拘束性の抗原ペプチドの同定が最も進んでいる。日本人では HLA—A2陽性は 40%を占める力そのサブタイプを見ると白色人種と同じ HLA— A*0201陽性は 20%で、残りの多くは A*0206陽性である。これらのサブタイプへの結合ペプチドは異なり、主として研究されている HL 八ー八2は1¾^\ー八*0201でぁる。一方、日本人では HLA—A24陽性が 60%以上を占めており、アジア人種では他の人種に比べて HLA— A24陽性率が高い。従つて、 HLA—A24拘束性の抗原ペプチドの発見はアジア人種、特に日本人において腫瘍細胞特異的に作用する CTLを誘導する事による、腫瘍治療に有用な CTLの提供に重要な役割を示す。

[0007] 同じ抗原でも、 HLAの違いに基づ、て抗原ペプチドが異なるため、抗原ペプチドを利用した CTLの誘導は煩雑である。この問題を解決するために色々な工夫がなされているが、まだ満足できる成果は得られていない。工夫されていることの一つは、患者自身（自家）由来の抗原提示細胞に抗原遺伝子を形質導入し、これを利用した T細胞誘導方法である。抗原提示細胞として、 B細胞、マクロファージ、榭状細胞が検討され、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られて、る榭状細胞を中心として、ワクチンのアジュバント等として使用する臨床試験が実施されている。しかし、これらの抗原提示細胞は、免疫誘導に必要な量を準備するのに労力を要することが課題である。 B細胞は EBウィルスによる不死化による大量調製が可能である力ウィルスを使用している点力も安全性上問題がある。

[0008] 腫瘍抗原特異的 TCR遺伝子としては、例えば HLA— A2拘束性の MART1特異的 TCR〔非特許文献 1〕、 MAGE— A3特異的 TCR〔非特許文献 2〕、 CAMEL (CT L recognized antigen on melanoma)特異的 TCR〔非特許文献 3〕、 gp 100 特異的 TCR〔非特許文献 4〕、 NY— ESO— 1特異的 TCR〔非特許文献 5〕、 HLA— 24拘束性の WT1 (Wilms tumor 1)特異的 TCR〔非特許文献 6〕、 HLA— Cwl6 拘束性の MAGE— A1特異的 TCR〔非特許文献 7〕等の遺伝子がクローユングされている。

[0009] TCR遺伝子を任意の CTLに導入することにより目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。これに基づき、 MART1〔非特許文献 8〕、 gplOO 〔非特許文献 4〕及び mHAG HA- 2抗原〔非特許文献 9〕を標的とした TCR遺伝子による遺伝子治療が試みられている。

[0010] MAGE— A4はがん精巣抗原ファミリーの MAGEサブファミリーに属する抗原であり、様々ながんにお、て発現して、る上に高、抗原性を有する（食道がんの 60%、頭頸部がんの 50%、非小細胞肺がんの 24%、胃がんの 33%及びホジキン病の 21 %において陽性)ことから、がんワクチン療法の標的抗原として有望視されている。 H LA—A24拘束性の MAGE—A4 ペプチド特異的 CTLクローンが取得されて

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いる〔非特許文献 10〕。

非特許文献 1 :カンサーリサーチ（Cancer Res. )、第 54卷、第 5265— 5268頁（ 1994)

非特許文献 2 :アンチカンサーリサーチ（Anticancer Res. )、第 20卷、第 1793 — 1799頁（2000)

非特許文献 3 :インターナショナルジャーナルォブカンサー（Int. J. Cancer) 、第 99卷、第 7— 13頁（2002)

非特許文献 4:ジャーナルォブィムノロジー、（J. Immunol. )第 170卷、第 218 6— 2194頁（2003)

非特許文献 5 :ジャーナルォブィムノロジー、第 174卷、第 4415— 4423頁（200 5)

非特許文献 6 :ブラッド (Blood)、第 106卷、第 470— 476頁（2005)

非特許文献 7 :インターナショナルィムノロジー（Int. Immunol. )、第 8卷、第 146

3— 1466頁（1996)

非特許文献 8 :ジャーナルォブィムノロジー、第 163卷、第 507— 513頁（1999) 非特許文献 9 :ブラッド（Blood)、第 103卷、第 3530— 3540頁（2003)

非特許文献 10 :タリ-カルカンサーリサーチ（Clin. Cancer Res. )、第 11卷、第 5581— 5589頁（2005)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 腫瘍関連抗原に対する HLA—A24拘束性の TCR遺伝子としては、 WT1に対するものが知られている力 HLA-A2. 1に比べると未だにその解析は遅れており、了ジァ人種、特に日本人の腫瘍治療に有用な TCR遺伝子の提供が不可能である。したがって、種々の腫瘍抗原に対する HLA— A24拘束性の新たな TCR遺伝子の発見が望まれる。

[0012] 生体内で TCRを介した細胞傷害活性を担ってヽるのは抗原特異的な TCRを持つ CTLであるが、これを体外で増殖させてがん等の疾患の治療に使用するには、これらの細胞の取り扱い、例えば採取や拡大培養に問題を有している。したがって、所望の抗原特異性を有する CTLを大量かつ容易に調製するための、腫瘍抗原等に特異的な TCRの遺伝子を提供することが待ち望まれて、る。

課題を解決するための手段

[0013] 本発明者らは、腫瘍抗原に対する CTLについて鋭意研究した結果、腫瘍抗原である MAGE— A4に対する HLA— A24拘束性の CTLから TCR a鎖及び j8鎖をコードする cDNAをクローユングすることに成功した。さらに、 HLA— A24分子を発現する CTL等の細胞にこれらの cDNAから調製した RNAを導入することにより、これらの細胞が HLA— A24拘束性の MAGE— A4由来ペプチド特異的な細胞傷害性を示すことを見出し、本発明を完成した。

[0014] 本発明の第 1の態様は、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な T細

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胞レセプターを構成するポリペプチド、ならびに前記レセプターの可変領域のポリべプチドを有するポリペプチドに関する。

[0015] 本発明の第 2の態様は、本発明の第 1の態様のポリペプチドにより構成されていることを特徴とする、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TCRに関す

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る。

[0016] 本発明の第 3の態様は、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TC

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Rをコードする核酸、ならびに前記レセプターの可変領域のポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸に関する。

[0017] 本発明の第 4の態様は、本発明の第 3の態様の核酸を含んでなる組換え核酸に関する。

[0018] 本発明の第 5の態様は、本発明の第 4の態様の組換え核酸が挿入されてなるベタターに関する。 [0019] 本発明の第 6の態様は、本発明の第 3の態様の核酸が導入されている、又は第 5の態様のベクターで形質転換されてヽることを特徴とする、 HLA— A24拘束性の MA GE-A4 特異的な TCRを発現する細胞に関する。

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[0020] 本発明の第 7の態様は、本発明の第 6の態様の細胞又は第 5の態様のベクターを有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。

[0021] 本発明の第 8の態様は、本発明の第 7の態様の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法に関する

発明の効果

[0022] 本発明により、 HLA—A24拘束性の MAGE—A4 特異的な TCRの α鎖及

143- 151

び j8鎖をコードする核酸が提供される。また、 HLA— A24拘束性ではない、または MAGE-A4 特異性を有しなヽ T細胞をエフェクター細胞として使用する腫瘍

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細胞傷害方法が提供される。前記のエフェクター細胞は、例えばがんの治療において有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0023] 本発明の第 1の態様は、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な T細

143- 151

胞レセプターを構成するポリペプチドであって、前記レセプターの可変領域のポリべプチドを有するものに関する。前記のポリペプチドには、 TCR a鎖及び TCR β鎖の 2種があり、両鎖が組み合わされて HLA— Α24拘束性の MAGE— Α4 特異

143- 151 的な TCRを構成する。

[0024] 前記 α鎖ポリペプチドは、 j8鎖とともに HLA— Α24拘束性の MAGE— Α4

143- 151 特異的な TCRを形成しうるものであって、 α鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号 5に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号 5に示されるアミノ酸配列において、 1〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド;から選択されるものを有するものを意味する。本発明における、 TCRの α鎖由来のポリペプチドは、前記の α鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、 a鎖全体のアミノ酸配列（配列番号 1)もしくはこれに類似した配列、すなわち 1〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するアミノ酸配列力なるポリべプチドは本発明の好適な態様の一つである。

[0025] また、前記 β鎖ポリペプチドは、 a鎖とともに HLA—A24拘束'性の MAGE—A4

14 特異的な TCRを形成しうるものであって、 13鎖可変領域のポリペプチドとして、

3- 151

配列表の配列番号 7に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号 7に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1つのアミノ酸残基の欠失、不可、挿入又は置換を有するポリペプチド；力選択されるものを有するものを意味する。本発明における、 TCRの β鎖由来のポリペプチドは、前記の β鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、 j8鎖全体のアミノ酸配列（配列番号 2)もしくはこれに類似した配列、すなわち 1〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは本発明の好適な態様の一つである。

[0026] ここで、「HLA—A24拘束性の MAGE—A4 特異的な TCR」とは、配列表

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の配列番号 9に示されるアミノ酸配列を有するペプチド (MAGE— A4 、以下、

143- 151

P143と略す）と HLA— A24分子との複合体を特異的に認識し、かつ、該 TCRが T 細胞表面に存在するときに該 T細胞に標的細胞に対する HLA— A24拘束性の P 14 3特異的な細胞傷害活性を付与しうるものである。上記複合体を特異的に認識することは公知の方法によって確認すればよぐ好適な方法として、例えば HLA— A24分子と P143を用いたテトラマー解析および ELISPOTアツセィが挙げられる。 ELISP OTアツセィを行うことにより、該 TCRを細胞表面に発現している T細胞が TCRにより標的細胞を認識し、そのシグナルが細胞内に伝達されたことを確認することができる。上記複合体が T細胞表面に存在するときに該 T細胞に細胞傷害活性を付与しうることの確認も公知の方法によればよぐ好適な方法として、例えばクロムリリースアツセィなどの HLA—A24陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が挙げられる。

[0027] 本発明のポリペプチドは、後述する本発明の核酸を使用して遺伝子工学的に生産することができる。例えば、前記の α鎖ポリペプチドをコードする核酸、 j8鎖ポリぺプチドをコードする核酸の両方を細胞に導入して α鎖、 j8鎖ポリペプチド発現させることにより、当該細胞に HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TCRを

143- 151

発現させることができる。 [0028] 本発明の第 2の態様は、本発明のポリペプチドにより構成されていることを特徴とする、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TCRに関する。前記の TC

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Rは、特に本発明を限定するものではないが、例えば後述の本発明の核酸を使用して、前記核酸にコードされているポリペプチドを人為的に発現させることにより、天然にお、て付随して、る生体成分とは分離された形態で調製することができる。

[0029] 本発明の第 3の態様は、 HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TC

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Rまたはその可変領域をコードする核酸に関する。

[0030] 本発明の核酸とは、 TCR a鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸または TCR β鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸であって、それぞれ、 TCR β鎖ポリペプチドをコードする核酸または TCR a鎖ポリペプチドをコードする核酸とともに細胞に導入した場合に HLA— A24ZMAGE— A4

143- 151複合体特異的に結合する分子が前記の細胞で発現される。なお、 TCR a 鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸には TCR a鎖ポリべプチドをコードする核酸、 TCR o;鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸力 TCR β鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸には TCR |8鎖ポリペプチドをコードする核酸、 TCR |8鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸が含まれ、 TCR a鎖ポリペプチドをコードする核酸と TCR β鎖ポリペプチドをコードする核酸、 TCR a鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸と TCR β鎖可変領域ポリぺプチドをコードする核酸、 V、ずれの組み合わせを細胞に導入した場合にも HLA— Α24 拘束性の MAGE— Α4 特異的な TCRが前記の細胞で発現される。

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[0031] 本発明を限定するものではないが、前記 α鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号 3に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸が例示される。 α鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号 6に示される塩基配列力なる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸が例示される。また、前記 j8鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号 4に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジントな条件下にハイブリダィズしうる核酸が例示される。 β鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号 8に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸が例示される。

[0032] ここで、ストリンジェントな条件としては、 1989年、コールド 'スプリング'ノヽーバ一'ラボラトリー発行、 J.サムブルック (J. Sambrook)ら編集、モレキユラ一'クロー-ング：ァ 'ラボラトリー 'マ-ユアノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Man ual 2nd ed. )等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば 0. 5% S DS、 5 Xデンハルツ溶液、 0. 01 % 変性サケ精子 DNAを含む 6 X SSC中、プロ一ブとともに 65°Cにて 12〜20時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダィズした核酸は、例えば 0. 5% SDSを含む 0. 1 X SSC中、 37°Cで洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。

[0033] 本明細書における核酸とは、 1本鎖あるいは 2本鎖の、 DNA、 RNAあるいは DNA —RNAキメラ、又は DNA—RNAヘテロ 2本鎖を意味する。核酸の全部又は一部が RNAである場合は、 RNA部分の配列については、本願明細書に記載の配列表における Tを Uと読み替えることとする。本発明の好適な態様としては、本発明の TCR a鎖ポリペプチドをコードする核酸または TCR a鎖可変領域ポリペプチドをコードする核酸と、 TCR β鎖ポリペプチドをコードする核酸または TCR β鎖可変領域ポリべプチドをコードする核酸の、 2種の核酸の組合せが例示される。前記の核酸の組み合わせは、細胞において HLA—A24拘束性の、 MAGE—A4 特異的な TCRを

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発現させる目的に有用である。

[0034] 本発明の核酸は、例えば次のようにして得ることができる。 HLA—A24拘束性の Μ AGE—A4 特異的な CTL、例えば非特許文献 10に記載のクローン # 2— 28

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力ゝら常法により RNAを調製し、 cDNAを合成する。これを铸型とし、 TCR o;鎖及び β鎖の定常領域をコードする核酸に相補的なアンチセンスプライマーを用いて 5 '— ラビッドアンプリフィケーシヨンォブ cDNA エンド (RACE)を行う。 5 '—RACE は公知の方法により行えばよぐ例えば CapFishing Full-length cDNA Pre mix Kit (シージーン社製）のような市販のキットを用いて行うことができる。前記手法により増幅された DNAをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。形質転換体力ゝらプラスミドを調製し、挿入された DNAの塩基配列を決定する。

[0035] 得られた塩基配列と既知の TCR a鎖及び /3鎖の遺伝子の配列を比較することにより、 5 '— RACEにより増幅された、 TCR遺伝子とは無関係の DNAを除外することができる。また、 PCRの際に塩基配列に変異が生じた DNAが増幅される可能性があるので、本発明では、複数の大腸菌クローン力も配列を決定し、そのコンセンサス配列カゝら推定される前記 CTLが本来有する TCR a鎖遺伝子及び β鎖遺伝子の配列を使用することが好ましい。

[0036] 配列表の配列番号 3で示される塩基配列を有する、配列番号 1のアミノ酸配列の Τ CR _a鎖をコードする核酸、及び、配列表の配列番号 4で示される塩基配列を有する、配列番号 2のアミノ酸配列の TCR |8鎖をコードする核酸は、上記の方法により得られたものである。

[0037] 本発明には、上記の方法により得られた DNAを使用してもよいし、同じ配列を有する核酸を化学合成して使用してもょヽ。

[0038] 本発明の核酸のうち、 TCRを構成する各鎖の可変領域に相当する部分をコードする核酸は、他の機能性分子、例えば抗体やレセプターをコードする核酸のうちの、定常領域や細胞内領域をコードする領域に接続させることができる。こうして構築された新規核酸は、 HLA— A24拘束性の MAGE— A4 特異的な結合活性が付与

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された、キメラ機能性分子の製造に有用である。

[0039] 本発明の第 4の態様は、本発明の核酸を含んでなる組換え核酸である。前記の組換え核酸とは、特に本発明を限定するものではないが、本発明の核酸を細胞に導入した場合に前記核酸にコードされて、るポリペプチドの翻訳を可能とする種々の要素を付加された核酸が例示される。

[0040] DNAからなる本発明の組換え核酸としては、プロモーター（例えば、ホスホダリセリン酸キナーゼプロモーター、 Xistプロモーター、 j8—ァクチンプロモーター、 RNAポリメラーゼ IIプロモーター等の哺乳類由来プロモーター、 SV40初期プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター、単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼプロモ一ター、各種レトロウイルスの LTRプロモーター等のウィルス由来プロモーター）、ターミネーター、ェンノ、ンサ一やそのほかの転写制御領域を有するものが例示される。さらに、第 1の発明のポリペプチドの翻訳に寄与する配列 (Kozak配列等）をコードしていてもよい。前記の各要素が本発明の核酸からの RNAの転写、ポリペプチドの翻訳に適するよう、機能的に連携する位置に配置されることは当然である。なお、組換え核酸が RNAである場合には転写の制御に関する要素は不要である。

[0041] 本発明の組換え核酸は後述するようにベクターに組み込んで使用する他、 RNAである本発明の核酸を直接細胞に導入することにより TCRの発現に使用することもできる。 RNAの導入方法としては、公知の方法を用いれば良いが、例えば電気穿孔法が好適に使用できる。

[0042] 本発明の第 5の態様は、本発明の組換え核酸が少なくとも 1つ挿入されてなるベタターに関する。前記のベクターは所望の細胞に HLA—A24拘束性の、 MAGE— A 4 特異的な TCRを発現させるうえで有用である。特に好適な態様としては、 ( 1

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)本発明の TCR a鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリべプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸と本発明の TCR β鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター、および（2)本発明の TCR o;鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと本発明の TCR β鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせが例示される。前記の（1)の態様において、 TCR a鎖ポリペプチドをコードする核酸と TCR β鎖ポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターにより転写、翻訳されてもよぐ内部リボソームエントリー部位 (I RES)を使用して一つのプロモーターで転写、翻訳されてもょ、。

[0043] 本発明に使用されるベクターには特に限定はなぐプラスミドベクター、ウィルスべクターなど公知のベクターより目的に応じて適当なものを選択し、使用すればよい。たとえば、前記の組換え核酸をプラスミドベクターに組み込んだ場合には、細胞への導入にはリン酸カルシウム法、カチォニック'リピド法、リボソーム法、エレクト口ポーレーシヨン法等の遺伝子導入法を使用できる。 [0044] 細胞に感染して外来 DNAを導入する能力を有するウィルスベクターは本発明に好適である。本発明には、レトロウイルスベクター（レンチウィルスベクターゃシユードタィプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘルべスウィルスベクター等の公知のウィルスベクターを使用することができる。本発明の組換え核酸を挿入されたウィルスベクターは、各ウィルスに適した条件で目的の細胞に感染させ、本発明の核酸を導入させることができる。挿入された外来の核酸を染色体上に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは本発明に好適である。

[0045] 本発明の第 6の態様は、本発明の核酸が導入されていることを特徴とする、 HLA- A24拘束性の MAGE— A4 特異的な TCRを発現する細胞に関する。ここで、

143- 151

本発明の核酸は、前記の本発明の組換え核酸もしくは本発明のベクターとして所望の細胞に導入されていてもよぐ本発明の細胞の好適な態様としては、 TCR o;鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸と TC R β鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸の両方が導入されてヽる細胞や本発明のベクターで形質転換されて!ヽる細胞が例示される。さらに、前記の核酸が染色体 DNA上に組み込まれている細胞も本発明に包含される。

[0046] TCRは Τ細胞の抗原の認識に重要な役割を示すことから、好適な本発明の態様は本発明の核酸が導入された Τ細胞である。生体より採取された Τ細胞に、前記の手法により本発明の核酸を導入することにより、 HLA— Α24拘束性の、 MAGE— Α4

143- 特異的な TCRを発現する T細胞を得ることができる。さらに、本発明の好適な態様

151

として、 T細胞に分ィ匕しうる細胞に前記の核酸を導入し、その後に細胞を T細胞に分ィ匕させてもよい。 T細胞に分化しうる細胞としては、例えば造血幹細胞、リンパ球系共通前駆細胞及び τ細胞前駆細胞が例示される。なお、核酸が導入される導入対象細胞は単一の細胞種に分画されて!/、る必要はなぐ前記の導入対象細胞を含有する細胞集団を核酸導入の対象とすることができる。

[0047] 前記の、導入対象細胞を含有する細胞集団は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄および臍帯血より採取すればよい。必要に応じ、 T細胞および Zまたは T細胞に分ィ匕しうる細胞を分画もしくは富化して本発明に使用することができる。本発明の TCR遺伝子導入細胞をがんなどの治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象となる患者本人、あるいは患者の HLAタイプと一致したドナー力採取することが好ましい。

[0048] 本発明の核酸を細胞に導入する方法に特に限定はなぐ公知の方法を用いることができる。本発明の核酸または本発明の組換え核酸を導入する場合には、例えばェレクト口ポーレーシヨン法、リン酸カルシウム法、カチォニック'リピド法、リボソーム法を使用する方法を用いることができる。市販のトランスフエクシヨン試薬〔例えば、 Transl Tシリーズ（ミラス社製）、 Genejuice (ノバジェン社製）、 Ribojuice (ノバジェン社製）、 Lipofectamine (インビトロジェン社製)〕を用いることにより、簡便かつ高効率に核酸を導入できる。本発明のベクターを用いる場合には、ベクターがプラスミドベクターであれば前記の核酸と同様の方法により細胞に導入することができる。一方、ベクタ一がウィルスベクターであれば、各々のウィルスベクターに適した感染方法を選択すればよい。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、糸且換えフイブロネクチンフラグメントである CH— 296 (タカラバィォ社製)を用いることにより、各種細胞、特にレトロウィルスベクターの感染効率が低ヽ造血幹細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。

[0049] 本発明の第 7の態様は、本発明の第 5の態様のベクターまたは第 6の態様の細胞を有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。本発明の第 6の態様により得られた、本発明の核酸を導入された T細胞は、 HLA— A24分子と MAGE— A 4 ペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害活性を示す。したがって、前記の

143- 151

本発明のベクターおよび細胞は MAGE— A4を発現する癌に対する制がん剤として使用することができる。

[0050] 前記の、本発明の制がん剤は、本発明のベクターまたは細胞を有効成分として含有することを特徴とする。該制がん剤は、前記のベクターまたは細胞を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば当該べクタ一または細胞の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、 RPMI、 AIM— V、 X- VIVO 10 などの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤には前記の細胞を好ましくは 1 X 10⁴〜1 X 10⁸個/ mL、より好ましくは 5 X 10⁵〜5 X 10⁷個/ m L含有させる。

[0051] 本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤をヒトに投与する場合には、例えば注射器で投与することができ、成人 1人当たりの投与量としては、通常、前記の細胞数が好ましくは 1 X 10⁶〜1 X 10^1(>個となるようにする。なお、前記の値は目安であり、これに限定されるものではない。また、本発明のベクターを有効成分として含有する制がん剤の場合、投与経路やベクターの種類等により制がん剤中のベクター濃度および投与量は大きく異なる。

[0052] 以上のとおり、本発明により癌の治療方法が提供される。前記治療方法は、本発明の第 5の態様のベクターを有効成分として使用する場合には in vivo遺伝子治療である。一方、本発明の細胞を有効成分として使用する場合には、体外に摘出された細胞に HLA— A24拘束性の、 MAGE— A4 特異的な TCRをコードする核酸

143- 151

を導入した後にこれを患者に投与する ex vivo治療である。本発明の治療方法は、投与する個体 (たとえばヒト）由来の細胞、もしくは HLAのタイプが同一である個体由来の細胞に核酸を導入して使用することができるため、毒性は特に認められない。実施例

[0053] 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

[0054] 実施例 1 MAGE— A4特異的 CTLクローン # 2— 28の TCR a鎖及び β鎖遺伝子のクローニングと配列決定

( 1) # 2— 28からの RNA調製、 5， -RACE,クローユング

非特許文献 10記載の、 MAGE -A4 ペプチド (配列表の配列番号 9、以下

143- 151

P143と略す)をパルスした標的細胞に HLA— A2402拘束性に細胞傷害活性を示す CTLクローンである # 2— 28細胞を培養し、 2 X 10⁵個の細胞から RNeasy Mini Kit (キアゲン社製）を用いて RNAを抽出した。この RNAのうち 200ngを铸型に、 C apFishing Full-length cDNA Premix Kit (シージーン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従って cDNAを合成した。なお、配列表の配列番号 10に示すオリゴ dTアダプター、 Reverse Transcriptase M— MLV (RNaseH free) (タカラノィォ社製)及び前記酵素に添付の反応用緩衝液を用いて逆転写反応を行った。

[0055] こうして得られた 1本鎖 cDNAを铸型に、上記キットを用いて PCRを行った。 5 '側プライマーとしてはキット添付の 5 '— RACEプライマー（配列番号 11)を、 3 '側プライマ一としては TCR a鎖 C領域に特異的な 3— TR a Cプライマー（配列番号 12)、 TC R β鎖 C1領域に特異的な 3— TR β CIプライマー（配列番号 13)又は TCR β鎖 C2領域に特異的な 3— TR |8— C2プライマー（配列番号 14)を使用した。これらの反応を、順に PCR— a、 PCR— β 1及び PCR— β 2と呼ぶ。各反応液を 94°Cで 3分間保持したあと、 94°Cで 40秒間、 58°Cで 40秒間、 72°Cで 1分間のサイクルを 30回繰り返し、 72°Cで 5分間保持した。各反応産物の一部をァガロースゲル電気泳動により分析したところ、 PCR— α及び PCR— β 2において約 lkbの DNAが増幅していた。

[0056] PCR- a及び PCR— β 2の残りの反応産物をァガロースゲル電気泳動によって分離し、約 lkbの DNAをゲルから回収した。これらを pT7blue T— Vector (ノバジェン社製)とライゲーシヨンし、大腸菌 DH5 aを形質転換した。

[0057] (2)配列の決定、クラスタリング、クローンの選択

こうして得られた PCR— α及び PCR— β 2に由来する形質転換体からそれぞれ 96 個を選択してそのそれぞれからプラスミドを調製し、自動シークェンサ一を用いて DN Α塩基配列を決定した。配列データ力も pT7blueの配列を除去した後にクラスタリングを行ったところ、最も大きいコンテイダのコンセンサス配列に含まれる最も長いォープンリーディングフレームの配列は配列表の配列番号 3及び配列番号 4に示すとおりであった。これらの配列は順に、 # 2— 28細胞の TCR a鎖遺伝子及び β鎖遺伝子の cDNA配列である。 cDNA塩基配列から推定される TCR a鎖及び /3鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号 1及び配列番号 2に示す。上記のプラスミドの中から TCR a鎖遺伝子及び β鎖遺伝子 cDNAのコンセンサス配列を pT7blueの Τ7プロモーターと同じ向きに持つプラスミドを選択し、それぞれ pBS MAGE TCR α及び pBS MAGE TCR j8と命名した。 [0058] 実施例 2 mRNAトランスフエクシヨンによる MAGE— A4特異的 TCRの発現

( l) mRNAの調製

制限酵素 EcoRIで消化することにより pBS MAGE TCR a及び pBS MAGE TCR j8を直鎖化した。これらを铸型とし、 mMESSAGE mMACHINE T7 Kit ( アンビオン社製)を用いて、キットの取扱説明書に従ってインビトロ転写を行った。その後、 Poly (A) Tailing Kit (アンビオン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従つて、前記転写された RNAにポリ（A)鎖を付カ卩した。こうして MAGE— A4 TCR a mRNA及び MAGE—A4 TCR jS mRN Aを得た。これらをリン酸緩衝生理食塩水（PBS)に溶解し、使用時まで— 80°Cで保存した。

[0059] (2) mRNAトランスフエクシヨン

ms69細胞は SAGE715— 723ペプチド（配列表の配列番号 15、以下 P715と略す)をパルスした標的細胞に HLA— A2402拘束性に細胞傷害活性を示す CTLクローンであり、非特許文献 10記載の # 22細胞と同様の方法により得られた、 # 22とは別のクローンである。 1 X 10⁷個の ms69細胞を X—VIVO20培地（キャンプレックス社製）で 2回洗浄した。実施例 2— ( 1)で調製した MAGE— A4 TCR a mRNA及び MAGE— A4 TCR jS mRNAの各 80 gと上記細胞を X— VIVO20培地中、 1 50 Lとなるように混合し、 ECM830遺伝子導入装置 (BTX社製)を用いて電気穿孔法により RNAの細胞への導入を行った。 mRNA導入後の細胞は、 X— VIVO20 培地中、 5%CO存在下 37°Cで 1日培養した。以下、こうして得られた細胞を RNA

2

導入 ms69細胞と記載する。

[0060] ヒト末梢血から Ficoll遠心法により末梢血単核球（PBMC)を分離し、 0. 5% AB 型血清添加 PBSで 2回洗浄した。これに、抗 CD8抗体を固相化した磁気ビーズである MACS CD8 MicroBeads (ミルテュー社製）を添カ卩して 4°Cで 15分間反応させた後、ビーズを 0. 5% AB型血清添加 PBSで 1回洗浄した。マグネットを装着した力ラムでトラップした磁気ビーズから回収した CD8陽性細胞を 10% AB血清及び 100 U/mLインターロイキン 2 (IL— 2)を添カ卩した RPMI1640培地に 1 X 10⁶個 ZmLとなるように懸濁した。 24ゥエルプレートの各ゥエルに PBSで 1 μ gZmLに希釈した抗 CD3抗体（オルソクローン OKT3、ヤンセンファーマ社製）を 300 μ Lずつ加え、 4°C で 1晚静置したあと上清を捨て、各ゥエルに上記の CD8陽性細胞懸濁液を lmLずつ分注した。培養開始 4日後、 7日後及び 10日後に培地を半量ずつ交換しながら 5% CO存在下 37°Cで培養した。培養開始 12日後の CD8陽性細胞 1 X 10⁷個を X— VI

2

VO20培地（キャンプレックス社製)で 2回洗浄した。 ms69細胞と同様の方法により、この糸田胞に MAGE— A4 TCR a mRNA及び MAGE— A4 TCR jS mRNAを導入した。 mRNA導入後の細胞は X—VIVO20培地中、 5%CO存在下 37°Cで 1

2

日培養した。以下、こうして得られた細胞を RNA導入 CD8陽性細胞と記載する。

[0061] (3)テトラマーアツセィ

HLA— A2402重鎖の C末端にピオチンプロテインリガーゼ BirAの基質となる配列を付加したポリペプチド及び j8 2—ミクログロブリンを不溶性封入体として大腸菌に発現させた。前記の封入体を P 143ペプチド存在下、インビトロでリフオールデイングさせることにより、 HLA—A2402/ j8 2—ミクログロブリン/ P143複合体を形成させた。得られた複合体にピオチンプロテインリガーゼ (アビディティー社製)を作用させ、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン（Streptavidin— PE、インビトロジェン社製）を用いてテトラマーを調製した。

[0062] 上記 RNA導入 ms69細胞及び RNA導入 CD8陽性細胞を 20 μ gZmLテトラマーと 37°Cで 30分間反応させた後、 Tricolor標識マウス抗ヒト CD8抗体 (カルタグ社製）と氷上で 15分間反応させた。細胞を洗浄後、 FACS Calibur(BD社製)を用いてフローサイトメトリー解析を行った。 ms69細胞及び CD8陽性細胞を陰性対象、 # 2— 2 8細胞を陽性対象として使用した。

[0063] その結果、テトラマー陽性率は、陰性対照の ms69細胞では 0. 60%であったのに対して RNA導入 ms69細胞では 66. 65%であり、また、陰性対照の CD8陽性細胞では 23. 1%であったのに対して RNA導入 CD8陽性細胞では 34. 4%であった。 R NAを導入した ms69細胞及び CD8陽性細胞のテトラマーアツセィの結果を図 1及び図 2に示す。この結果から、 # 2— 28細胞からクローユングした TCR a鎖及び TCR β鎖の遺伝子産物は、 P143と HLA— Α2402の複合体を認識することが明らかになった。

[0064] (4) ELISPOTアツセィ標的細胞は次のようにして調製した。 B XTハイブリッド細胞株 174CEM. T2 (以下、 Τ2細胞と略す）に HLA— 2402遺伝子をトランスフエタトして作製された Τ2—Α2 4細胞（Ikuta Y.ら、 Blood,第 99卷、第 3717— 3724頁、 2002年）を 10% ゥシ胎児血清 (FCS)含有 RPMI1640培地で培養し、遠心分離のあと上清を捨てた。その後、 RPMI 1640培地に懸濁し、遠心分離のあと上清を捨てることにより細胞を洗浄した。このようにして細胞の洗浄を合計 3回行ったあと、 lmLの 10 /z M P143あるいは P715含有又はペプチド不含 RPMI1640培地に懸濁して、 5%CO存在下、 3

2

7°Cで 1時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収し、 RPMI1640培地に懸濁したあと遠心分離を行って細胞を洗浄した。 5 X 10⁴個 Z100 μ Lとなるように細胞を RPMI1640培地に懸濁し、 ELISPOTアツセィの標的細胞として使用した。

[0065] マルチスクリーン ΗΑ 96ゥエル濾過およびアツセィプレート（ミリポア社製）の各ゥエルに 2 μ gZmLとなるように PBSで希釈した抗ヒトインターフェロン γ抗体（ 1— D 1 Κ、マブテック社製）を 100 Lずつ分注し、 4°Cで 1晚放置した。ゥエル内の液を捨てた後、各ゥエルに 100 Lの RPMI1640培地を加え、 15分間放置し、液を捨ててプレートを洗浄した。この洗浄を更に 1回行った後、 10% AB型血清含有 RPMI1640 培地を各ゥエルにカ卩え、 37°Cで 1時間放置し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、上清を吸引したあと各ゥエルに 100 μ Lの RPMI1640培地を添カ卩してプレートを洗浄した。この洗浄操作を合計 3回行った。

[0066] 実施例 2— (2)で調製した (a)RNA導入 ms69細胞、（b)陰性対照の ms69細胞及び (c)陽性対象の #2— 28細胞並びに実施例 2— (2)で調製した (d)RNA導入 CD8 陽性細胞及び (e)陰性対照の CD8陽性細胞を遠心分離により回収し、 RPMI1640 培地で 1回洗浄した。（a)、（b)及び（c)は 2000個、 1000個又は 500個 Z100 となるように、（d)及び（e)は 2 X 10⁴個 Z100 μ Lになるように RPMI1640培地に懸濁し、実施例 2— (4)で調製した洗浄済みプレートのゥエルに 100 Lずつ分注した。これに 100 Lの上記標的細胞懸濁液を添加し、 5%CO存在下、 37°Cで 20時間培

2

し 7こ。

[0067] プレートの各ゥエルから液を除去し、 0· 05% Tween20含有 PBS (PBS— T)で 6 回洗浄した。ピオチン化抗ヒトインターフェロン γ抗体 (マブテック社製、クローン名： 7 — B6— 1)を 0. 2 /z gZmLになるように PBSで希釈し、各ゥエルに 100 Lずつ分注したあと、 4°Cで 1晚放置した。

[0068] プレートの各ゥヱルカも液を除去し、 PBS— Tで 6回洗浄した。 1 μ gZmLになるように PBSで希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン (バイオラッド社製)を各ゥエルに 100 Lずつ分注し、室温で 1時間反応させた。プレートの各ゥエル力も液を除去し、 PBS— Tで 3回洗浄した後、 AP発色キット (バイオラッド社製、 170 — 6432)の取扱説明書に従い調製した発色液を各ゥエルに 100 Lずつ分注し、遮光して発色反応を行った。蒸留水で発色を停止した後、プレートの写真を撮影した。

[0069] その結果、 ms69細胞及び CD8陽性細胞に比べて RNAを導入した ms69細胞及び CD8陽性細胞は、標的細胞が P143をパルスされている場合により多数のインタ一フエロン γ陽性スポットを形成した。この結果を図 3及び図 4に示す。図 3は CTLクローンをエフェクター細胞として使用したときの ELISPOTアツセィの結果であり、 ms 69細胞は P715をパルスした標的細胞に対して、 # 2— 28細胞は1³143をパルスした標的細胞に対して、 RNA導入 ms69細胞は、ずれの標的細胞に対しても多数のインターフェロン _Ύ陽性スポットを形成した。図 4は CD8陽性細胞をエフェクター細胞として使用したときの ELISPOTアツセィの結果であり、 RNA導入 CD8陽性細胞は Ρ 143をパルスされた標的細胞に特異的にインターフェロン γ陽性スポットを形成した

[0070] (5)細胞傷害活性

Τ2細胞、 Τ2— Α24細胞及び、 Τ2細胞に HLA— A0201遺伝子をトランスフエタトして作製された Τ2—Α2細胞を RPMI1640培地で 3回洗浄し、 5 Χ 10⁶個/ mLになるように RPMI 1640培地に懸濁した。これらの細胞懸濁液 lmLに終濃度 10 Mの P143又は P715をカ卩え、室温で 15分間静置した後、 10%FCS含有 RPMI1640培地 lmLを添カ卩して 37°Cで 1時間インキュベートした。細胞を FCS不含 RPMI1640 培地で 3回洗浄し、 1 X 10⁶個の細胞を 100 μ Lの10%FCS含有RPMI1640培地に懸濁した。これに 50 /z Lの Na ⁵¹CrO水溶液（3. 7MBq)を添加し、 37°Cで 2時

2 4

間標識した。これを標的細胞として細胞傷害活性の測定に使用した。

[0071] ms69細胞、 RNA導入 ms69細胞、 # 2— 28細胞、 CD8陽性細胞及び RNA導入 CD8細胞を RPMI1640培地で 2回洗浄し、 2 10⁶個 111レ 1 10⁶個 111レ 5 X 10⁵個 ZmL、 2. 5 X 10⁵個 ZmL、 1. 25 X 10⁵個 ZmL及び、 6. 25 X 10⁴個 ZmL となるように 10%FCS含有 RPMI1640培地に懸濁し（エフェクター細胞）、その 100 μ Lを 96穴 V底プレートのゥエルに入れた。 1 X 10⁶個 ZmLとなるように標的細胞を 1 0%FCS含有 RPMI1640培地に懸濁し、エフェクター細胞の入ったゥエルに 100 μ Lずつ添加した。 37°Cで 4時間反応させた後、遠心分離により上清を回収し、 100 ^ Lの上清に遊離された⁵¹ Cr量をガンマカウンターを用いて測定した。放射活性の測定値から、次の式により特異的細胞傷害活性を計算した。

[0072] [数 1] 特異的細胞傷害活性（％) = 〔（各ゥエルの測定値一最小放出値） Z (最大放出値一最小放出値）〕 X 1 0 0

[0073] 上式において、最小放出値とはエフェクター細胞を加えないゥエルにおける⁵¹ Cr遊離量であり、標的細胞力もの⁵¹ Crの自然遊離量を示す。また、最大放出値とはトリトン X— 100を標的細胞に加えて破壊したときの⁵¹ Cr遊離量を示す。

[0074] この結果を図 5及び図 6に示す。図 5は P715でパルスした T2— A24細胞（a)、 P1 43でパルスした T2— A24細胞（b)及び P143でパルスした T2— A2細胞（c)に対する CTLクローンの細胞傷害活性を示す図であり、横軸はエフェクター細胞数 Z標的細胞数比 (EZT比）を、縦軸は特異的細胞傷害活性（％)を示す。 ms69細胞は P71 5でパルスした T2—A24細胞にだけ、 # 2— 28細胞は1³143でパルスした丁2—八2 4細胞にだけ細胞傷害活性を示したのに対して、 RNAを導入した ms69細胞は両方の標的細胞に対して細胞傷害活性を示した。 P143でパルスした T2—A2細胞に対してはどのエフェクター細胞も細胞傷害活性を示さなカゝつた。図 6は P143でパルスした T2細胞（a)、ペプチドパルスして!/、な!/、T2— A24細胞（b)及び P143でパルスした T2— A24細胞 (c)に対する CD8細胞の細胞傷害活性を示す図であり、横軸は E ZT比を、縦軸は特異的細胞傷害活性 (％)を示す。陰性対照の CD8陽性細胞はいずれの細胞に対しても細胞傷害活性を示さなカゝつたのに対して、 RNAを導入した C D8陽性細胞及び陽性対象の # 2— 28細胞は P143でパルスした T2— A24細胞に対して細胞傷害活性を示した。

[0075] 以上の結果から、 # 2— 28細胞の TCR α鎖及び j8鎖をコードする遺伝子は、 P1 43特異的な HLA— A2402拘束性の細胞傷害活性を、 CTLクローン及び末梢血由来 CD8細胞に付与することが明らかになった。

産業上の利用可能性

[0076] 本発明により MAGE— A4に対する HLA— A24拘束性の CTL由来の TCR a鎖及び j8鎖のポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードする核酸が提供される。前記の核酸は HLA—A24分子と MAGE—A4 ペプチドを提示する細胞に対す

143- 151

る細胞傷害活性を T細胞に付与できることから、 MAGE— A4を発現する癌の治療に有用である。

図面の簡単な説明

[0077] [図 1] # 2— 28細胞、 RNA導入 ms69細胞および ms69細胞のテトラマーアツセィの結果を示す図である。

[図 2] # 2— 28細胞、 RNA導入 CD8陽性細胞および CD8陽性細胞のテトラマーァッセィの結果を示す図である。

[図 3] # 2— 28細胞、 RNA導入 ms69細胞および ms69細胞の ELISPOTアツセィの結果を示す図である。

[図 4]RNA導入 CD8陽性細胞および CD8陽性細胞の ELISPOTアツセィの結果を示す図である。

[図 5] # 2— 28細胞、 RNA導入 ms69細胞および ms69細胞の細胞傷害活性を示す図である。

[図 6] # 2— 28細胞、 RNA導入 CD8陽性細胞および CD8陽性細胞の細胞傷害活性を示す図である。

配列表フリーテキスト

[0078] SEQ ID NO:10; Oligo dT adaptor.

SEQ ID NO:ll; 5'— RACE primer.

SEQ ID NO :12; Synthetic primer 3— TRalpha— C to amplify a DNA fragment encoding TCR alpha chain. SEQ ID NO: 13; Synthetic primer 3— TRbeta— CI to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.

SEQ ID NO :14; Synthetic primer 3— TRbeta— C2 to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.

Claims

請求の範囲

[1] 配列表の配列番号 5で示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド又は該配列に 1 〜数個のアミノ酸残基の欠失、不可、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列力なるポリペプチドを有し、かつ配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドとともに HLA—A24拘束性の MAGE—A4 特異的な T細胞レセプタ

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一を構成しうるポリペプチド。

[2] 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド、および該配列に 1〜数個のアミノ酸残基の欠失、不可、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともに HLA—A24ZMAGE—A4 複合体特異的に結合す

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る分子を構成しうる、請求項 1記載のポリペプチド。

[3] 配列表の配列番号 7で示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド又は該配列に 1 〜数個のアミノ酸残基の欠失、不可、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列力なるポリペプチドを有し、かつ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドとともに HLA—A24拘束性の MAGE—A4 特異的な T細胞レセプタ

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一を構成しうるポリペプチド。

[4] 配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド、および該配列に 1〜数個のアミノ酸残基の欠失、不可、挿入又は置換がなされたポリペプチドから選択されるポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともに HLA—A24ZMAGE—A4 複合体特異的に結合す

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る分子を構成しうる、請求項 3記載のポリペプチド。

[5] 請求項 1記載のポリペプチドおよび請求項 3記載のポリペプチドで構成されてなる HLA—A24拘束性の MAGE—A4 特異的な T細胞レセプター。

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[6] 請求項 1記載のポリペプチドをコードする核酸。

[7] 配列表の配列番号 3で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸である請求項 6記載の核酸。

[8] 配列表の配列番号 6で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸である請求項 6記載の核酸。

[9] 請求項 3記載のポリペプチドをコードする核酸。

[10] 配列表の配列番号 4で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸である請求項 9記載の核酸。

[11] 配列表の配列番号 8で示される塩基配列からなる核酸、又は前記の核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうる核酸である請求項 9記載の核酸。

[12] 請求項 6〜1 、ずれか記載の核酸を含有する組換え核酸。

[13] 請求項 12記載の組換え核酸が少なくとも 1つ挿入されてなるベクター。

[14] (1)請求項 6〜8 、ずれか記載の核酸を含有する組換え核酸と請求項 9〜 1 IVヽずれか記載の核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター、および（2 )請求項 6〜8 ヽずれか記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと請求項 9〜1 ヽずれか記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクタ一の組み合わせ、力も選択される請求項 13記載のベクター。

[15] 請求項 6〜： L 1いずれか記載の核酸が導入された、 HLA— A24拘束性の MAGE

-A4 特異的な T細胞レセプターを発現する細胞。

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[16] 請求項 6〜8 、ずれか記載の核酸と請求項 9〜1 、ずれか記載の核酸の両方が導入された請求項 15記載の細胞。

[17] 請求項 13又は 14記載のベクターで形質転換された、 HLA— A24拘束性の MAG

E-A4 特異的な T細胞レセプターを発現する細胞。

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[18] T細胞もしくは T細胞に分ィ匕しうる細胞である請求項 15〜17いずれか記載の細胞

[19] 請求項 13又は 14記載のベクターを有効成分として含有する制がん剤。

[20] 請求項 15〜18いずれか記載の細胞を有効成分として含有する制がん剤。

[21] 請求項 18または 19記載の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法。