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WO2005103278A1 - タンパク質の製造法 - Google Patents

タンパク質の製造法 Download PDF

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Publication number
WO2005103278A1
WO2005103278A1 PCT/JP2005/007518 JP2005007518W WO2005103278A1 WO 2005103278 A1 WO2005103278 A1 WO 2005103278A1 JP 2005007518 W JP2005007518 W JP 2005007518W WO 2005103278 A1 WO2005103278 A1 WO 2005103278A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
protein
sequence
gene
signal peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/007518
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayo Date
Yoshimi Kikuchi
Hiroshi Itaya
Nami Nakamura
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to JP2006512561A priority Critical patent/JP4730302B2/ja
Priority to EP05734619A priority patent/EP1748077B1/en
Priority to DK05734619.9T priority patent/DK1748077T3/da
Publication of WO2005103278A1 publication Critical patent/WO2005103278A1/ja
Priority to US11/550,972 priority patent/US8597907B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium

Definitions

  • the present invention relates to a method for secretory production of a heterologous protein in a coryneform bacterium.
  • the present invention also relates to a method for secreting and producing a heterologous protein containing an industrially useful enzyme or a physiologically active protein in coryneform bacteria.
  • Coryneform bacteria are very useful bacteria in the fermentation industry as L-glutamic acid, L-lysine and other L-amino acid and nucleic acid-producing bacteria. Coryneform bacteria are purified by secretion and production of heterologous proteins, which have very little extracellular protein compared to molds, yeasts and Bacillus bacteria, which are considered to be suitable for secreting heterologous proteins. Can be simplified and omitted, and grows quickly on simple media such as sugar, ammonia and inorganic salts, and is excellent in medium cost, culture method, and culture productivity. It is considered to be a useful bacterium.
  • the protein secretion pathway of coryneform bacteria known so far is a pathway called the Sec system.
  • the Sec system exists on the cell membrane and acts as a channel for protein secretion.
  • SecY Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-169780
  • SecE Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-277073
  • SecG Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-169182
  • SecA Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 7-107981
  • This system exists widely from prokaryotes such as Escherichia coli and Bacillus subtilis to eukaryotes such as yeast, mold and human.
  • proteins are difficult to secrete and produce by the Sec system in coryneform bacteria.
  • industrially useful proteins such as isomaltodextranase @ protein transdaltaminase.
  • the Tat system was used to form Escherichia coli reductoxidase, nitrate reductase, lipoic acid synthetase of Bacillus'sbutyls, and the common arginine-arginine sequence of phosphodiesterase.
  • Escherichia coli reductoxidase nitrate reductase
  • lipoic acid synthetase of Bacillus'sbutyls
  • the common arginine-arginine sequence of phosphodiesterase has been found to be specifically involved in the secretion of proteins having a signal sequence of [Science, 278, 1467-1470 (1997), US Patent No. 6022952, US Patent No. 6335178] [J. Biol Chem., 275, 41350-41357, International Pamphlet WO 02/22667].
  • tatA GENEBANK cgl03060 1571065-1571382
  • tatB GENEBANK cgl03060
  • tatE Gi
  • the amount of secretion to periplasm in the Tat pathway has been improved by introducing a plasmid that expresses the genes tatA, tatB, and tatC encoding the Tat secretory apparatus. Its accumulated amount is 5-10 mg / L, which is below the industrially practical level.
  • the present invention provides efficient secretion of an industrially useful heterologous protein out of the coryneform bacterium, which was difficult to secrete using the Sec system, which is one of the protein secretion pathways (secretory production).
  • the purpose is to provide a method to make it work.
  • the present invention produces in a coryneform bacterium an industrially useful heterologous protein that was difficult to secrete using the Sec system, which is one of the protein secretion pathways, and Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a heterologous protein by efficiently secreting (secretory production) outside the cells.
  • the present inventors focused on the mechanism of the protein secretory pathway in coryneform bacteria, and found that the Tat system, which is a protein secretory pathway different from the known Sec system, functions in coryneform bacteria.
  • the present inventors have been able to secrete proteins that had been secreted by deleting genes encoding proteins thought to constitute the Tat system, which is the protein secretion pathway of coryneform bacteria. It was confirmed that the Tat system functions in coryneform bacteria.
  • the present inventors have found a Tat system-dependent signal sequence, and a target protein gene sequence that was difficult to secrete by the Sec system, which is a conventional protein secretion pathway, downstream of the sequence encoding the Tat system.
  • the target protein can be efficiently secreted by introducing the expression construct to which the ligation is bound into a coryneform bacterium and culturing the resulting transformed coryneform bacterium.
  • the present inventors have newly discovered in coryneform bacteria.
  • the Tat system which is a known protein secretion pathway
  • the Sec system secretion pathway such as isomaltextranase
  • secretion can be carried out efficiently and completed the present invention.
  • the present inventors have found that in a coryneform bacterium, the amount of secretable protein that can be secreted using the Tat system can be increased by amplifying the gene encoding the Tat system secretion apparatus.
  • the present invention provides an expressed gene comprising a promoter sequence that functions in a coryneform bacterium, a nucleic acid sequence encoding a Tat-dependent signal peptide region, and a nucleic acid sequence encoding a heterologous protein in the 5 'to 3' direction.
  • a method for producing a heterologous protein comprising culturing a coryneform bacterium having a construct, and causing the coryneform bacterium to produce and secrete the heterologous protein.
  • the present invention is a method for producing a heterologous protein, wherein the Tat system-dependent signal peptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 31 or 32 in the above method.
  • the present invention is a method for producing a heterologous protein, wherein the Tat system-dependent signal peptide comprises any of SEQ ID NOS: 28 to 30 in the above method.
  • the present invention is a method for producing a heterologous protein which is a signal peptide of a Tat-dependent signal peptide isomalt-dextranase or a signal peptide of trimethylamine N-oxide reductase in the above method.
  • the present invention relates to the above method, wherein the Tat-dependent signal peptide of the isomaltdextranase has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or the signal peptide of trimethylamine N-oxidoreductase is A method for producing a heterologous protein, characterized by having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a coryneform bacterium is used as a host vector system, and an expression construct in which a gene of a target protein to be secreted downstream of the Tat-dependent signal peptide of the coryneform bacterium is produced, and this is constructed in the coryneform bacterium. And the target protein is secreted out of the cells.
  • secretion of a protein or peptide refers to a protein or peptide. Refers to the transfer of a protein or peptide molecule out of the bacterial cell (extracellularly) and, if the protein or peptide molecule is ultimately completely free in the medium, only a portion. This includes cases in which the cell is present outside the cells and cases in which it is present on the cell surface.
  • secretory proteins are generally translated as prepeptides or prebub peptides, and then become mature proteins. That is, in general, after translation as a peptide or prebub peptide, the signal peptide ("pre-part") is cleaved and converted to the mature or pro-peptide, and the pro-peptide is further cleaved by the protease. It is known that it is matured into a mature peptide.
  • the term “signal sequence” refers to a sequence that is present at the N-terminus of a secretory protein precursor and does not exist in a naturally occurring mature protein. “Signal peptide” refers to such a protein precursor.
  • the signal sequence is cleaved by a protease (generally called a signal peptidase) upon secretion outside the cell.
  • a signal peptide has a certain common sequence characteristic across biological species.
  • a signal peptide exhibiting a secretory function in a powerful biological species is not necessarily exerting a secretory function even in other biological species! / It's not fun! /.
  • a protein having both a signal peptide and a pro moiety that is, a primary translation product may be referred to as a "Preb-mouth protein", and a protein having no signal peptide but having a pro moiety may be referred to as a protein.
  • a protein having no signal peptide but having a pro moiety may be referred to as a protein.
  • proprotein usually referred to as “proprotein”.
  • the pro part of a proprotein is sometimes referred to as a “pro structure” or simply “pro structure”, and the terms “pro structure Z pro structure” of a protein and “pro part” of a protein are used interchangeably in this specification. Is done.
  • the signal peptide may be derived from a different protein or may be a signal peptide naturally present in the target protein, but may be a secretory protein of the host used. Is preferably derived from Alternatively, it may be modified to have an optimal codon according to the codon usage of the host used. Further, the signal peptide that can be used for the purpose of the present invention may contain a part of the N-terminal amino acid sequence of the natural mature protein from which it is derived. Prev if the signal peptide is from a different protein The oral protein may be specifically referred to as "heterologous fusion prebu protein".
  • a protein in which the pro portion has been cleaved is a protein in which at least one or more amino acids constituting the pro portion have been removed by cleaving a peptide bond.
  • a protein that exactly matches the protein, and, as long as it has the activity of the protein, one or more extra amino acids derived from the pro moiety at the N-terminus compared to the native protein, and the native mature form A protein having an amino acid sequence shorter than a protein is also included.
  • Tit system refers to “twin 'arginine translocation pathway”
  • Twin-arginine-translocation- pathway a mechanism that recognizes arginine-arginine conserved regions conserved in signal peptides and secretes proteins through membrane proteins containing TatA, B, C, and E. Or means a route.
  • Tat-based secretory apparatus refers to membrane proteins containing TatA, B, C, and E. These TatA, B, C, and E are transmembrane proteins existing in the cell membrane, and it is thought that they form a complex and form pores for protein permeation on the cell membrane. The detailed structure and function of TatA, B, C, and E during protein permeation are still under study. The gene encoding TatA and the gene encoding TatC in C.
  • glutamicumATCC13869 are located very close to each other.
  • the gene sequence encoding TatA and the 5 'upstream region thereof, and the gene sequence encoding TatC are described in SEQ ID NO: 38.
  • the amino acid sequence of TatA is shown in SEQ ID NO: 46
  • the amino acid sequence of TatC is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the gene sequence encoding TatB and its 5 ′ upstream region are shown in SEQ ID NO: 41
  • the amino acid sequence of TatB is shown in SEQ ID NO: 47
  • the gene sequence encoding TatE is shown in SEQ ID NO: 48
  • the amino acid sequence of TatE is shown in 49.
  • TatA and TatE have very high homology, and it is known that TatA and TatE can complement their functions in E. coli [EMBO J. 1; 17 (13): 3640-50 (1998).] .
  • the Tat-based secretory apparatus may be partially or partially deficient in the amino acid sequence, or may be a Tat-derived bacterium derived from C. glutamicum. Not only the secretory apparatus but also any Tat-based secretory apparatus that can function in coryneform bacteria No.
  • the secretion signal of this system has a "Tat system-dependent signal peptide” (also called “Twin-arginine signal peptide”).
  • the “Tat system-dependent signal peptide” is a signal peptide recognized by the Tat system and has an arginine-arginine conserved region.
  • the “Tat-dependent signal peptide” includes trimethylamine N-oxide reductase (TorA) from Escherichia coli,
  • Sufl suppressor of ftsl; ftsl suppressor
  • PhoD phosphodiesterase of Bacillus subtilis (Bacillus subtilis)
  • LipA Arsulopacta ⁇ ⁇ ⁇ Globiformis
  • a signal peptide such as isomaltodextranase (IMD) derived from Arthrobacter globiformis).
  • IMD isomaltodextranase
  • the amino acid sequences of these signal peptides are as follows: TorA signal peptide: MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 8)
  • Sufl signal peptide MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA (SEQ ID NO: 28) PhoD signal peptide
  • LipA signal peptide MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH (SEQ ID NO: 30)
  • IMD signal peptide MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA (SEQ ID NO: 6)
  • TorA signal peptide Sufl signal peptide, PhoD signal peptide, LipA signal peptide, and IMD signal peptide refer to SEQ ID NOs: 8, 28, 29, respectively.
  • a peptide having substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids in each sequence is also included.
  • severeal refers to a force that varies depending on the position and type of amino acid residues in these Tat-dependent signal peptides, usually 1 to 7, preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 2. It is about.
  • the homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 28, 29, 30 or SEQ ID NO: 6 is usually 85% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. It may be a signal peptide having the above amino acid sequence.
  • Nucleic acid sequences encoding signal peptides having such substitutions, deletions, insertions or additions may be other than Escherichia coli, Bacillus' subtilis, a variant of A. globiformis, a spontaneous or artificial mutant, or an A. globiformis. It can be obtained from Bacillus microorganisms other than Bacillus subtilis or Bacillus subtilis.
  • a nucleic acid sequence encoding a Tat-dependent signal peptide having a substitution, deletion, addition or insertion may be a Tat-dependent signal peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 28, 29, 30 or SEQ ID NO: 6. It can also be obtained by in vitro mutagenesis or site-specific mutagenesis of the nucleic acid encoding the signal peptide. These mutation treatments can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • substitution, deletion, insertion or addition is a conservative mutation that retains a consensus motif described below.
  • Conservative mutations are typically conservative substitutions.
  • Amino acids that substitute the original amino acids of these signal peptides and are considered conservative substitutions include Ala for Ser or Thr, Arg for Gln, His or Lys, and Asn force Glu.
  • hydrophobic regions of S / TRRXFLK (SEQ ID NO: 31) and RRX-#-#-(#: hydrophobic residue) (SEQ ID NO: 32) are conserved. However, even if these consensus motifs are conserved, they are also affected by secreted proteins.
  • the signal peptide of Bacillus subtilis WprA and WapA has a twin-arginine motif, which is not a Tat system but depends on the SRP / Sec system. It has been shown to be secreted (Biochem Biophys Res Commun. 2003 Apr 25; 304 (1): 48-54).
  • proteins that can be secreted by the Tat system include, but are not limited to, TorA and Sufl from E.
  • proteins that can be secreted using the Tat system in coryneform bacteria include various enzymes such as isomaltodextranase, plotting glutaminase, and transdaltaminase. Specifically, isomaltodextranase derived from Arthrobacter P.
  • globif ormis T6 (NRRL B-4425, IMA12103), preferably isomatodextranase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, talisebatatellidium 'proteoliticum ( Chryseobacterium proteolyticum) derived protease, preferably, a protease having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, GFP (green fluorescent protein), and Streptomyces' mobalense (WO 02/81694). Streptoverticillium mobaraense) -derived transglutaminase and the like are not limited to these.
  • Arthrobacter globiformis strain T6 is registered with the Northern Utilization Research and Development Division under accession number NRRL B-4425.
  • Chryseobacterium roteollyticum was designated as FERM BP-3523 on November 8, 2000 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Tsukuba, Ibaraki, Japan). ⁇ East 1-1-1 Central No. 6, postcode
  • Isomaltodextranase is an enzyme that efficiently produces isomaltose from dextran and the like. Isomaltose obtained by allowing this enzyme to act on dextran or the like has an anti-cariogenic effect (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-76063) and a growth effect of bifidobacteria, a useful human intestinal bacterium. It has an effect (see JP-A-61-22777) and is an industrially useful enzyme. Protein daltaminase is an enzyme that functions as daltaminase, does not degrade proteins, acts directly on glutamine residues present in proteins, does not break peptide bonds and does not crosslink proteins, and has a deamidation effect.
  • the coryneform bacterium referred to in the present invention is an aerobic gram-positive bacillus, and includes a bacterium which was conventionally classified into the genus Brevipacterium, but is now integrated into the genus Corynepacterium (Int. Syst. BacterioL, 41, 255 (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevibataterium which are closely related to the genus Corynebacterium.
  • the advantage of using coryneform bacteria is that there are very few proteins that are naturally secreted extracellularly compared to molds, yeasts and bacteria of the genus Bacillus, which have so far been suitable for secreting heterologous proteins.
  • the purification process can be simplified or omitted.
  • they can easily grow in simple media containing sugar, ammonia, inorganic salts, etc. Includes superiority in terms of sex. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • Corynebacterium dartamicum AJ12036 (FERM BP-734) (FERM BP-734) isolated as a streptomycin (Sm) -resistant mutant strain from the wild-type strain Corynebacterium 'C. glutamicum ATCC13869 (March 26, 1984) Nihara Depositary) (now the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Patent Organism Depositary, Tsukuba East Higashi 1 1 1 Chuo No. 6, Zip Code 305-8566) has a higher protein content than its parent strain (wild strain). Mutations in functional genes involved in secretion are predicted, and the ability to produce and secrete heterologous proteins is extremely high, about 2-3 times as much as the amount accumulated under optimal culture conditions. WO 02/081694).
  • a strain modified so as not to produce such a cell surface protein makes it easier to purify the heterologous protein secreted into the medium, which is particularly preferable.
  • Such modification can be performed by introducing a mutation into a cell surface protein on a chromosome or its expression regulatory region by mutation or gene recombination.
  • Examples of the coryneform bacterium modified so as not to produce a cell surface protein include C. glutamicum YDK010 strain, which is a cell surface protein (PS2) disruption strain of AJ12036 (WO 01/23591).
  • the gene construct used in the present invention generally comprises a promoter, a sequence encoding an appropriate signal peptide and a nucleic acid fragment encoding a target protein, and control elements necessary for expressing the target protein gene in coryneform bacteria. Sequences (operators, terminators, etc.) are in place where they can function.
  • the target protein may have a pro-structure at the N-terminus.
  • Vectors that can be used for this construct are not particularly limited, and those that can autonomously propagate outside the chromosome, such as plasmids, that can function in a coryneform bacterium, are integrated into the bacterial chromosome. It may be.
  • Such examples include PAM330 (JP-A-58-067699), pHM1519 (JP-A-58-77895), and pSFK6 (JP-A-2000-262288).
  • these vectors are capable of autonomously replicating plasmids in coryneform bacteria.
  • a DNA fragment having the above is taken out and inserted into the vector for Escherichia coli, it can be used as a so-called shuttle vector that can be replicated in both Escherichia coli and coryneform bacteria.
  • artificial transposons and the like can also be used. When a transposon is used, the target gene is introduced into the chromosome by homologous recombination or its own transposition ability.
  • the promoter that can be used in the present invention is not particularly limited, and any promoter that can function in the coryneform bacterium can be used in general. Furthermore, Escherichia coli (E. coli-derived promoter. Among them, a strong promoter such as a tac promoter is more preferable. Examples of promoters derived from coryneform bacteria include promoters for genes of cell surface proteins PS1, PS2 and SlpA, various amino acid biosynthesis systems such as glutamate dehydrogenase genes of glutamic acid biosynthesis system, and glutamine synthesis system of glutamine synthesis system.
  • Enzyme gene aspartoxykinase gene of lysine biosynthesis system, homoserine dehydrogenase gene of threonine biosynthesis system, acetohydroxyacid synthase gene of isoleucine and norin biosynthesis systems, and 2-isopropylyl apple of leucine biosynthesis system Acid synthase gene, glutamic acid kinase gene of proline and arginine biosynthesis, phosphoribosyl-ATP pyrophosphorylase gene of histidine biosynthesis, and deoxyarabinohe Pulphonate phosphate (DAHP) synthase gene, phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) amide transferase gene, inosinate dehydrogenase gene, and guanylate synthase gene in nucleic acid biosynthesis systems such as inosinic acid and guar-acid Each promoter.
  • DAHP deoxyarabinohe Pulphonate phosphate
  • PRPP phosphoribo
  • the signal peptide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a Tat-dependent signal peptide that can function in the coryneform bacterium, and any Tat system that can function in the coryneform bacterium.
  • Dependent signal peptides can also be used. Therefore, a Tat-dependent signal peptide derived from a different species, for example, Escherichia coli or Bacillus' subtilis, can also be used in the present invention as long as it can function in the cells of a coryneform bacterium.
  • a portion of the N-terminal amino acid sequence of the secretory protein from which the signal peptide is derived may be added. The signal sequence is used when the translation product is secreted extracellularly.
  • the gene encoding the signal peptide can be used as is, but may be modified to have an optimal codon according to the codon usage of the host used.
  • the gene encoding the target protein is connected to the 3'-end of the gene encoding the signal peptide, and is arranged so that expression is controlled by the above promoter. .
  • a useful protein that can be produced and secreted by the present invention is essentially a protein encoded by a nucleic acid that can be contained in the same gene construct as the nucleic acid sequence encoding the Tat-dependent signal peptide described above. All proteins including intracellular proteins derived from animals, plants and microorganisms, regardless of whether they are secreted by the force Sec system, which is a protein secreted by the Tat system. Examples of proteins that can be secreted and produced according to the present invention include proteases, aminopeptidases, carboxypeptidases, collagenases and chitinases. In particular, proteins that could not be secreted by the conventional SEC system are suitable for production and secretion according to the present invention.
  • genes encoding these proteins can be modified depending on the host used and to achieve Z or the desired activity, including the addition, deletion, and substitution of one or more amino acids. Is included. If necessary, it may be converted to an optimal codon depending on the codon usage of the host.
  • Such general molecular biology techniques are well known to those of skill in the art, including modification techniques, gene clowning techniques, and produced protein detection techniques, and are described, for example, in Sambrook et al., 1989. , Molecular loning: A Laooratory Manual, Second Edition (1989) and old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (DN Glover ed. 1985), FM Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press and the like.
  • the method for introducing the gene construct into the coryneform bacterium that can be used in the present invention is not particularly limited, and a commonly used method such as the protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), The mouth-portion method (Bio / Technology, 7, 1067-1070) (1989) can be used.
  • the coryneform bacterium is a strain in which the tat secretory apparatus is amplified, ie, a strain in which the membrane protein containing TatA, B, C, and E constituting the tat secretory apparatus is amplified. May be.
  • Such a coryneform bacterium is required to enhance the expression level of one or more of a group of genes including tatA, tatB, tatC, and tatE, which are genes encoding the tat secretory apparatus of the parent strain. can get.
  • Enhancement of the expression level of genes containing tatA, tatB, tatC, and tatE which are genes encoding these tat secretion apparatus (hereinafter, may be referred to as any of the "tat genes"). Is achieved by increasing the copy number of any one or more of the tat genes.
  • a fragment encoding a gene containing tatA or a fragment encoding a gene linking tatA and tatB is ligated to a vector that functions in coryneform bacterium, preferably a multicopy type vector to ligate recombinant DNA. It may be prepared and introduced into a coryneform bacterium as described above for transformation.
  • the vector used at this time is the same as the vector that can be used for the aforementioned gene construct.
  • the copy number can also be increased by transferring one or more copies of the gene encoding the Tat secretory apparatus onto the chromosome.
  • homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target.
  • sequences present in multiple copies on chromosomal DNA repetitive DNA and inverted 'repeats present at the ends of transposable elements can be used.
  • the expression control sequence such as the promoter of the tat gene on chromosomal DNA or a plasmid may be replaced with a strong one. It can also be achieved by modifying a factor involved in the regulation of gene expression, for example, an operator repressor.
  • an operator repressor for example, lac promoter, trp promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters. Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al.
  • the obtained gene-introduced transformant can be cultured according to commonly used methods and conditions.
  • the transformant can be cultured in a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions.
  • Organic micronutrients such as vitamins and amino acids can be added as needed to obtain higher growth.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols, and the like can be used.
  • the nitrogen source ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, and others can be used.
  • a calcium ion, a magnesium ion, a phosphate ion, a potassium ion, an iron ion and the like can be appropriately used as needed.
  • Culture can be carried out under aerobic conditions at an appropriate range of pH 5.0 to 8.5 and 15 ° C to 37 ° C, and the culture period can be about 1 to 7 days. By culturing the transformant under such conditions, the target protein is produced in large amounts in the cells and secreted efficiently out of the cells.
  • the protein secreted into the medium according to the present invention can be separated and purified also from the medium after culturing according to methods well known to those skilled in the art. For example, after removing cells by centrifugation, salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion-exchange column chromatography, affinity chromatography, medium-high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography Known suitable methods, such as chromatography, hydrophobic chromatography, Alternatively, they can be separated and purified by combining them.
  • the protein secreted into the cell surface according to the present invention is also soluble in a method well known to those skilled in the art, for example, by increasing the salt concentration, using a surfactant, etc., and then secreted into the medium. It can be separated and purified.
  • the protein secreted to the cell surface may be used as, for example, an immobilized enzyme without being soluble.
  • Example 1 Secretion expression of isomaltodextranase using the signal sequence of isomaltdextranase from Arthrobacter globiformis (A. globiformis)
  • T6 isomaltodextranase (EC.3.2.1.94; 1,6-a-D-glucan isomanoletotrantranase; 1,6-a-D-glucan isomalto-dextranase) gene Her identity has already been determined [Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)].
  • primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 11 (5'-ATGATGAACCTGTCCCGCCGCG-3 ') and SEQ ID NO: 12 (5, -CGCGGATCCCTGAGGGCGGGAAC-3') were synthesized, and were synthesized according to a conventional method (Saito, Miura [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)] Using the prepared chromosomal DNA of A. globiformis as type I, the region encoding isomaltdextranase was amplified by PCR.
  • SEQ ID NO: 16 encodes the N-terminal side of the signal sequence of isomaltodextranase Contains an array that [0033]
  • the PCR product amplified with the primers of the sequences shown in SEQ ID NOS: 11 and 12 and the PCR product amplified by the primers of the sequences shown in SEQ ID NOS: 14 and 16 are mixed to form type III.
  • Crossover PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14.
  • the constructed plasmid pPKI-IMD was used to transform a C. glutamicum ATDK13869 streptomycin (Sm) resistant strain AJ12036 cell surface protein (PS2) disrupted strain, C. glutamicum YDK010 strain (described in Patent WO 01/23591). Strains grown on a CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin were selected. The selected strain was cultured in MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours. After completion of the culture, 10 ⁇ l of the culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE.
  • the N-terminal amino acid sequence of secreted isomaltdextranase was analyzed using a protein sensor. As a result, the 31st amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It was confirmed that isomaltodextranase starting from Ala was secreted. Therefore, it was confirmed that the signal sequence region had the sequence shown in SEQ ID NOS: 5 (nucleotide sequence) and 6 (amino acid sequence).
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were synthesized and prepared according to a conventional method (Saito, Miura [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]).
  • the region encoding isomaltodextranase was amplified from the chromosomal DNA of globiformis by PCR using Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) and the reaction conditions were in accordance with the protocol recommended by the manufacturer.
  • the sequence of SEQ ID NO: 12 includes a recognition sequence for the restriction enzyme BamHI!
  • PCR was performed using 5′-GTCCCCGTCACGGCCGCGCC-3) and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 12, and the signal sequence was removed to amplify the region encoding mature isomaltodextranase.
  • Plasmid pPKSPTGl a type II plasmid, is a promoter of PS2, a cell surface protein derived from C. glutamicum, a region encoding a signal sequence derived from cell surface protein SlpA of C. ammoniagenes, and a region encoding S. mobaraense. It contains a region encoding protransglutaminase derived from E. coli. A fragment containing the region encoding the SlpA signal sequence is amplified.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 15 contains a sequence coding for the N-terminal amino acid region of mature isomaltdextranase.
  • (A-1) a PCR product amplified using the primers having the sequences shown in SEQ ID NOS: 13 and 12 and a PCR product amplified using the primers having the sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15
  • the product was mixed with the product, and these were used as the ⁇ -form.
  • Cross-over PCR was performed using primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 12, and the signal peptide sequence of PS2 promoter and SlpA and the mature isoform
  • the fusion gene with maltodextranase was amplified.
  • the constructed plasmid pPKSIMD was used to transform a C. glutamicum ATDK13869 streptomycin (Sm) resistant strain AJ12036 cell surface protein (PS2) disrupted strain, C. glutamicum YDK010 strain (described in WO 01/23591).
  • Strains grown on a CM2G agar medium containing 1 kanamycin (10 g yeast extratato, 10 g tryptone, 5 g glucose, 5 g NaCl, 15 g agar, 1 U rub with water) were selected.
  • the selected strain was cultured in MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours.
  • Example 2 Secretion expression of pro-structured plotting glutaminase using IMD signal sequence derived from Arthrobacter globiformis
  • the sequence of the plotting rutaminase (EC.3.5.1) gene from the Chryseobacterium proteolyticum strain has already been determined [Eur. J. Biochem. 268. 1410-1421 (2001)]. With reference to this sequence, conversion to frequently used codons in Corynebacterium glutamicum was performed, and the gene sequence shown in SEQ ID NO: 3 was constructed. This sequence includes the signal sequence (pre-part) of the pro- ducing rutaminase and the pro-part and the region encoding the mature form of the pro- ducing rutaminase. The entire gene sequence was prepared by synthesis.
  • SEQ ID NO: 17 (5 ′
  • the primer shown in SEQ ID NO: 17 contains the N-terminal sequence of the signal sequence of the protein rutaminase
  • the primer shown in SEQ ID NO: 18 contains the C-terminal of the mature protein daltaminase and a recognition sequence for BamHI.
  • PCR was carried out using the DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 as the type I primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, and the pro-part of the plotting rutaminase and the mature plotting lutaminase was amplified.
  • This PCR fragment was inserted into the Smal site of pVC7 described in JP-A-9-070291, and then introduced into a competent cell of E. coli JM109 (Takara Shuzo). A strain containing the plasmid cloned with the protein glutaminase gene was obtained, and the plasmid was recovered. The nucleotide sequence of the fragment cloned into this plasmid was determined, and it was confirmed that the nucleotide sequence was identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 3. (2-2) Construction of Plasmid Expressing Protolutaminase with Prostructure Using IMD Signal Sequence
  • the region encoding the promoter and the signal peptide was added to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 21 (5'-CCTGGTTGCCGTTGGAATCGGCCTGGGCGGAGCCTGCC-3,). Amplification was performed by performing PCR using primers having the indicated sequences. The amplified region contains the region encoding the PS2 promoter and the IMD signal peptide. The sequence shown in SEQ ID NO: 21 contains the sequence at the 5 'end of the region encoding the protein daltaminase gene with a pro structure.
  • PCR was performed using a primer having the sequence of SEQ ID NO: 20 (5, -GATTCCAACGGCAACCAGGA-3,) and SEQ ID NO: 18, to obtain a protein with a pro-structure.
  • SEQ ID NO: 20 5, -GATTCCAACGGCAACCAGGA-3,
  • SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18
  • the PCR product obtained using the primers having the sequences of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 21 and the PCR product obtained using the primers having the sequences of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 18 were: These were mixed with each other to obtain a type II, and by performing crossover PCR using primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 18, the PS2 promoter region and the IMD signal sequence, A fusion gene with a gene encoding a structured plotting rutaminase was amplified. After digesting this crossover PCR product with restriction enzymes Seal and BamHI, a DNA fragment of about 1.6 kbp was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment was excised from agarose gel, recovered using EasyTrap Ver.2 (Takara Shuzo), inserted into the Seal-BamHI site of plasmid pPK4 described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-322774, and inserted into a plasmid with a pro-structured protein daltaminase expression plasmid.
  • pPKI-PPG was constructed. As a result of determining the nucleotide sequence of the gene sequence to be inserted into the constructed plasmid, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • the constructed plasmid pPKI-PPG was used to transform a YDK010 strain (described in International Publication Pamphlet WO01 / 23591) obtained from a mutant strain YSr derived from C. glutamicum, and Example 1 (1 A strain grown on a CM2G agar medium (containing 25 mg / l kanamycin) was selected in the same manner as in 3). The selected strain was cultured in a MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours.
  • the culture supernatant is subjected to desalting and concentration treatment by ultra-free (manufactured by Millipore), followed by enzymatic digestion with the actinomycete-derived protease SAM-P45 (described in International Publication Pamphlet WO 01/23591) to produce the proto-glutaminase protein.
  • the structure was cut and matured.
  • the activity of the matured protein was measured by the method described in JP-A-2000-50887, and it was confirmed that the secreted protein actually had protein daltaminase activity.
  • Chryseobacterium proteolyticum strain-derived plotting rutaminase (EC.3.5.1) gene sequence [Eur. J. Biochem. 268. 1410-1421 (2001)] with reference to Corynebacterium glutamicum! Conversion to codons led to the sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • This sequence includes the signal sequence region (pre-part), the pro-region and the region encoding the mature form of the plotting glutaminase.
  • a nucleic acid molecule containing the entire gene sequence was prepared by synthesis.
  • primers having the sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were synthesized.
  • the primer having the sequence of SEQ ID NO: 17 The primer contains the N-terminal sequence of the signal sequence of glutaminase, and the primer having the sequence of SEQ ID NO: 18 contains the C-terminus of the mature plotting glutaminase and the recognition sequence of BamHI.
  • PCR was performed using the DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 as the ⁇ type and primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 to amplify the pro-protolutaminase pro-region and the region encoding the mature proto-lutaminase.
  • This PCR fragment was inserted into the Smal site of pVC7 described in JP-A-9-070291, and then introduced into a combi tent cell of E. coli JM109 (Takara Shuzo). A strain containing the plasmid in which the protein daltaminase gene was cloned was obtained, and the plasmid was recovered from the strain. Plasmid ⁇ The nucleotide sequence of the cloned fragment was determined and confirmed to be consistent with the sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amplified region contains the PS2 promoter and the region encoding the SlpA signal peptide.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 19 contains the sequence at the 5 'end of the region encoding the protein daltaminase gene with a pro structure.
  • a PCR product obtained using the primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 19 and a PCR product obtained using the primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 18 Mixed with each other to obtain a type II, and by performing a crossover PCR using a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 18, the sequence containing the PS2 promoter region and the SlpA signal sequence And a fusion gene with a gene encoding a pro-structured plotting rutaminase was amplified.
  • This crossover PCR product is After digestion with BamHI, an approximately 1.6 kbp DNA fragment was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment was excised from the agarose gel, recovered using EasyTrapVer.2 (Takara Shuzo), inserted into the Scal-BamHI site of plasmid pPK4 described in JP-A-9-322774, and inserted into a plasmid pPKS with a pro-structured protein daltaminase. -Build PPG.
  • the nucleotide sequence of the gene sequence inserted into the constructed plasmid was determined. As a result, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • a YDK010 strain (described in Patent WO01 / 23591) obtained from a mutant strain derived from C. glutamicum was transformed, and kanamycin at 25 mg / l was obtained in the same manner as in Example 1 (1-3).
  • the strains grown on the containing CM2G agar medium were selected.
  • the selected strain was cultured in MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours. After completion of the culture, 10 ⁇ l of the culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE.
  • Example 3 Secretion and expression of a protein glutaminase using a TorA (trimethylamine N-oxidoreductase) signal sequence derived from E. coli
  • TorA trimethylamine N-oxidoreductase
  • a region encoding a promoter and a signal peptide was amplified by performing PCR using a primer having a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24 (5 ′ sequence) using the plasmid pPKSPTGl described in International Publication Pamphlet WO01 / 23591 as type ⁇ .
  • the sequence of SEQ ID NO: 24 contains the sequence at the 5 'end of the gene encoding the TorA signal peptide.
  • this PCR product and SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: obtained in Example 3-1
  • the gene sequence encoding TorA amplified by the primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 23 and the PCR product containing the region containing the signal sequence upstream thereof were mixed in a ratio of 1: 1.
  • Crossover PCR was performed with a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • a sequence containing the PS2 promoter region, a TorA signal sequence, and a Tor The fusion gene containing the sequence encoding A was amplified.
  • This crossover PCR product was digested with the restriction enzymes Seal and BamHI, and a DNA fragment of about 3.1 kbp was detected by agarose gel electrophoresis. Agarose gel was excised, recovered using EasyTrapVer.2 (manufactured by Takara Shuzo), inserted into the Seal-BamHI site of plasmid pPK4 described in JP-A-9-322774 to obtain plasmid pPKT-TorA.
  • the nucleotide sequence of the gene sequence was determined, and it was confirmed that the expected fusion gene had been constructed.
  • This plasmid was designated as type I and had the SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 25 (5, Using the primers, the portion containing the PS2 promoter region and the region encoding the TorA signal peptide was amplified by PCR, and the PCR product and the sequence of SEQ ID NO: 20 were used in the same manner as in Example 2 (2-2). And the region encoding the prostructured plotting rutaminase was amplified by PCR using primers having the sequence shown in SEQ ID NO: 18. These PCR products were mixed in a 1: 1 ratio to form type II, and Crossover PCR was performed using primers having the sequences shown in 14 and SEQ ID NO: 18.
  • agarose gel A DNA fragment of about 3.1 kbp was detected. This DNA fragment was cut out from the agarose gel, recovered using EasyTrap Ver.2 (manufactured by Takara Shuzo), and inserted into the Seal-BamHI site of the plasmid pPK4 described in JP-A-9-322774 to obtain a plasmid pPKT-PPG. . The nucleotide sequence of the inserted sequence in the plasmid was determined, and it was confirmed that the expected fusion gene was formed.
  • the constructed plasmid pPKT-PPG was used to transform a C. glutamicum-derived mutant strain C. glutamicum ATCC13869 streptomycin (Sm) strain YDK010 strain (obtained from patent WO 01/23591) obtained from the AJ12036 strain, and 25 mg / Strains grown on CM2G agar containing 1 kanamycin were selected.
  • the selected strain was cultured at 30 ° C. for 48 hours in an MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin. After completion of the culture, 10 ⁇ l of the culture supernatant was analyzed by SDS-PAGE.
  • Example 2 the culture supernatant was treated with Ultrafree (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 2 (2-2), followed by enzymatic digestion with the actinomycete-derived protease SAM-P45 to remove the pro-structure of plotting glutaminase. Cleavage and maturation were performed. The activity of the matured protein was measured using the method described in Patent Publication 2000-50887, and it was confirmed that the secreted protein actually had a pro-tindal taminase activity.
  • amino acid sequence of the protorutaminase with a pro structure is shown in SEQ ID NO: 4.
  • CAF18991.1 has been shown to exist, but these functions have not been clarified.
  • TatC-deficient strain of YDK010 strain was obtained as follows.
  • This fragment was digested with Kpnl and Xbal, and inserted into the Kpnl-Xbal site of pHS4 (US Pat. No. 5,616,480), a temperature-sensitive plasmid vector derived from plasmid pHM1519, to construct pHStatC.
  • Escherichia coli AJ12570 transformed with plasmid pHS4 was designated as FERM BP-3523 on October 11, 1990 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (now the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology It has been deposited in Tsukuba East, Ibaraki, Japan 1 1 1 Chuo No. 6, postcode 305-8566).
  • pHStatC was digested with Ndel and Seal, a DNA fragment of about 70 bp was removed, the internal region of the tatC gene was deleted, and recirculation was performed to construct plasmid pHS AtatC.
  • This plasmid was introduced into YDK010 strain by electoporation, and a tatC gene-deficient strain, YDK011 strain, was obtained by the homologous recombination method described in Japanese Patent No. 2763054.
  • the protein was subjected to SDS-PAGE and stained with protein in SYPRO Orange. as a result,
  • the rabbits were immunized with plotting glutaminase to prepare an anti-protein daltaminase polyclonal antibody.
  • an anti-protein daltaminase polyclonal antibody As a result of Western blotting using this polyclonal antibody, the YDK010 / ⁇ -PPG strains prepared in Examples 2 and 3 and
  • Example 3 Using the plasmid pPKT-PPG constructed in Example 3 (3-2), the YDK010 strain obtained from C. glutamicum ATCC13869 and a streptomycin (Sm) metamorphic mutant strain of A.12036 of C. glutamicum ATCC13869 (described in WO 01-23591) ), And a strain grown on a CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin as in Example 1 (1-3) was selected. Both selected strains were cultured in MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours. After completion of the culture, the culture supernatant at 10 / z1 was analyzed by SDS-PAGE.
  • Sm streptomycin
  • glutamicum ATCC 13869 strain carrying PPG was about 70 mg / l. Furthermore, the culture supernatant was treated with Ultrafree (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 2 (2-2), followed by enzymatic digestion with the actinomycete-derived protease SAM-P45 to remove the pro-structure of plotting glutaminase. Cleavage and maturation were performed. The activity of this matured protein daltaminase was measured by the method described in Patent Publication 2000-50887, and it was confirmed that the secreted protein actually had protein daltaminase activity.
  • TatA there is a gene encoding TatA in the 5 'upstream region of the gene sequence encoding TatC of C. glutamicum.
  • the gene sequence containing the promoter region upstream of the tatA gene was amplified by PCR. Adjusted by the method of Saito, Miura et al.
  • the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13869 was designated as type III, and SEQ ID NO: 33 (5,
  • SEQ ID NO: 34 contains the sequence at the 5' end of tatC.
  • tatC in C.glutamicumATCC13032
  • the primer SEQ ID No. 36 (5 ′
  • -CTAGAGCACGTCACCGAAGT-3 was prepared and amplified by PCR. Furthermore, the PCR product amplified by using SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 and the PCR product amplified by using SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 are mixed in a ratio of 1: 1 to form a type II, and the PCR product is cloned using SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 37. A fusion gene of the tatA promoter region and the gene encoding TatC was amplified by performing the over PCR.
  • a TatC expression plasmid pVtatC was constructed by agarose gel electrophoresis of this PCR product, recovering a DNA fragment of about 1.8 kb, and inserting the recovered DNA fragment into the Smal site of plasmid pVC7 described in JP-A-9-070291. .
  • the nucleotide sequence of the inserted portion of the constructed plasmid was confirmed in the same manner as in Example 1.
  • the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13869 was designated as type III and shown in SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 37.
  • the gene sequence encoding TatA and its 5 ′ upstream region, and further, the region containing the gene sequence encoding TatC were amplified by PCR.
  • the resulting PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 2.4 kb.
  • a TatA and TatC expression plasmid pVtatAC was constructed by inserting the recovered DNA fragment into the Smal site of plasmid pVC7 described in JP-A-9-070291.
  • the nucleotide sequence of the inserted gene was confirmed in the same manner as in Example 1. As a result, it was revealed that the base sequence of tatA was slightly different from the predicted sequence of tatA in C. glutamicum ATCC13032.
  • the gene sequence encoding TatA and the 5 'upstream region thereof, and the gene sequence encoding TatC are described in SEQ ID NO: 38.
  • a DNA fragment of about 1.7 kb was recovered from the amplified PCR product by agarose gel electrophoresis.
  • the TatB expression plasmid pVtatB was constructed by inserting the recovered DNA fragment into the Smal site of plasmid pVC7 described in JP-A-9-070291.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the constructed plasmid was confirmed in the same manner as in Example 1.
  • the gene sequence encoding TatB and the gene sequence in the 5 'upstream region thereof are described in SEQ ID NO: 41.
  • This TatB expression plasmid pVtatB was digested with the restriction enzyme Kpnl, and a DNA fragment of about 1.5 kb was recovered by agarose gel electrophoresis. This DNA fragment contains the tatB promoter region and the gene sequence encoding TatB. This fragment was inserted into the Kpnl site of the plasmid pVtatAC prepared in Example 6 (2) to construct a plasmid pVtatABC expressing TatA, TatB and TatC.
  • a strain 13869 / pPKT-PPG was prepared by transforming C. glutamicum ATCC13869 with the pro-structured production rutaminase expression plasmid pPKT-PPG prepared in Example 3 (3-2). Further transformed with each of the above plasmids pVtatC, pVtatAC, pVtatABC And selected strains that grow on CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin and 5 mg / l chloramphenecol, 13869 / pPKT-PPG / pVtatC, 13869 / pPKT-PPG / pVtatAC, 13869 / pPKT-PPG / pVtatABC was obtained.
  • 13869 / pPKT-PPG / pVtatAC showed about 3-fold increase in secretion
  • 13869 / pPKT-PPG / pVtatABC showed about 10-fold increase in secretion.
  • Example 7 Effect of transataminases on the secretion of transdaltaminase using an IMD signal derived from Arthrobactor globiformis by amplification of a Tat-based secretory apparatus
  • Isomaltodextranase secretion expression plasmid pPKI-IMD using the IMD signal prepared in Example 1 was designated as type ⁇ , and SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 42 (the IMD signal sequence and its 5 ′ A region containing the CspB promoter in the basin was amplified, SEQ ID NO: 42 contains the gene sequence coding for the C-terminal side of the IMD signal sequence and the sequence coding for the N-terminal side of the trans sequence of the prodal sequence of transdaltaminase. Further, pPKSPTGl (described in WO-01 / 233591) was designated as type II and SEQ ID NO: 43 (
  • PCR was performed using primers having the sequence shown in 5′-GACAATGGCGCGGGGGAAG-3 ′) to amplify the gene sequence encoding transdaltaminase with a pro-structure.
  • cross-over PCR was performed using primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 44 to fuse the CspB promoter, the IMD signal and the gene encoding transglutaminase with a pro-structure.
  • the gene was amplified.
  • This PCR product was cut with restriction enzymes Seal and Eco065I, and a gene fragment of about 700 bp was recovered by agarose gel electrophoresis. This recovered DNA fragment is called pPKSPTGl (
  • a transdaltaminase expression plasmid with a pro-structure pPK to PTG1 was prepared.
  • the nucleotide sequence of the prepared plasmid was determined by the method described in Example 1, and it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • a strain 13869 / pPKIPTGl in which C. glutamicum ATCC 13869 was transformed with the plasmid pPK to PTG1 prepared in (1) was prepared.
  • This strain is further transformed with a Tat secretion apparatus TatA, TatB and TatC expression plasmid pVtatABC prepared in Example 6 (3), and then grown on a CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin and 5 mg / l chloramphen-col.
  • CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin and 5 mg / l chloramphen-col.
  • 13869 / pPKI-PTG1 and 13869 / pPKI-PTG1 / pVtat ABC were cultured in a MM medium containing 25 mg / l of kanamycin and 5 mg / l of kappa ramfechol at 30 ° C. for 48 hours.
  • the culture supernatant was subjected to SDS-PAGE according to the method described in Example 2 (2-3) .As a result, compared with 2256 / pPKI-PTG1, 2256 / pPKI-PTGl / pVtatABC An increase in the amount of glutaminase secreted was confirmed.
  • the culture supernatant was quantified by reverse-phase HPLC under the conditions described in Reference Example A-3. As a result, the secretion amount was about 7-fold in the Tat-type secretory apparatus-amplified strain.
  • Example 8 Effect of Transglutaminase on Secretion of Transglutaminase Using TorA Signal Derived from E. coli by Amplification of Tat System Secretion Apparatus
  • Example 3 A plotting glutaminase component using the TorA signal prepared in (3-2)
  • the lactation expression plasmid pPKT-PPG was used as type I, and the region containing the TorA signal sequence and the CspB promoter in the 5 'upstream region thereof was amplified using the primers of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 45 (SEQ ID NO: 45).
  • the sequence described in (1) contains a gene sequence coding for the C-terminal side of the TorA signal sequence and a sequence coding for the N-terminal side of the pro-sequence of transdaltaminase, and pPKSPTGl (described in WO-O1 / 23591).
  • PCR was performed using primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 to amplify the gene sequence encoding transdaltaminase with a pro-structure, as shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 45.
  • the PCR product amplified with the primers of the sequence shown above and the PCR product amplified with the primers of the sequence shown in SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 were mixed 1: 1 to form a ⁇ , and SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: Of the sequence shown in 44
  • the primers were used to perform crossover PCR to amplify the fusion gene of the CspB promoter, the TorA signal, and the gene encoding transglutaminase with a pro-structure.
  • the PCR product was cut with Seal and Eco065I and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • a gene fragment of about 700 bp was recovered and inserted into the Seal-Eco065I region of pPKSPTGl (described in WO-O1 / 23591) to obtain a trans-Daltaminase expression plasmid with a pro-structure pPKT-PTGl.
  • the nucleotide sequence of the prepared plasmid was determined by the method described above, and it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • a strain 13869 / pPKTPTGl in which C. glutamicum ATCC13869 was transformed with the plasmid pPKT-PTG1 prepared in Example 8 (1) was prepared. After transforming this strain with the TatA, TatB and TatC expression plasmids pVtatABC produced in Example 8, strains that grow on a CM2G agar medium containing 25 mg / l kinamicin and 5 mg / l chloramphene-col were selected. The Tat secretory apparatus amplified strain 13869 / pPKTPTGl / pVtatABC was obtained.
  • 13869 / pPKT-PTG1 and 13869 / pPKT-PTGl / pVtatABC were cultured in a MM medium containing 25 mg / l of kanamycin and 5 mg / l of chloramphenol at 30 ° C for 48 hours. End of culture After completion, the culture supernatant 10 1 was subjected to SDS-PAGE according to the method described in Example 2 (2-3) .As a result, 13869 / pPKT-PTGl / pVtatABC had a pro-structure compared to 13869 / pPKT-PTG1. An increase in transdartaminase was confirmed. The culture supernatant was quantified by reversed-phase HPLC under the same conditions as described in Reference Example A-3. As a result, the secretion amount was about 40 times that of the Tat-type secretory apparatus amplified strain.
  • the N-terminal amino acid sequence of the plotting rutaminase whose activity was confirmed in Examples 3 and 5 was analyzed, it was a sequence (NKLASV) having two amino acids added compared to the native plotting rutaminase. Therefore, the C-terminal sequence of the pro-sequence was changed so that the pro-sequence was cleaved to have the same sequence as the N-terminal sequence of the native-type printing rutaminase.
  • the C-terminus of the pro-sequence of native-producing glutaminase is "QTNK", it is expected to be easily cleaved by SAM-P45, "FGPK", or by subtilisin-based alcalase (Novozymes).
  • FGPF "FGPF”, “FAPF”, “FAPY”, “AHAY”, “AHAJI,” “AAPF”, “AAPY”, “AAPM”
  • CCTT A primer having the sequence shown in GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG
  • SEQ ID NO: 51 TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT was used.
  • the primer of SEQ ID NO: 51 is a primer for amplifying the mature part.
  • the plasmid pPKT-PPG constructed in Example 3 (3-2) Using a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 50, the prosequence portion of The mature portions of the plotting glutaminase were amplified using primers having the sequences shown in SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 18.
  • This crossover PCR product was cloned into the Smal site of pUC18. (pUCPPG (FGPK)), the nucleotide sequence was confirmed, and the pro sequence was changed. Next, the Aatll-BstPI fragment of pPKT-PPG (large) and the Aatll-BstPI fragment of pUCPPG (FGPK) (small) were ligated to construct pPKT-PPG (FGPK).
  • sequences of SEQ ID Nos. 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 and 66 are the primers for amplifying the prosequence, and the sequences of SEQ ID Nos. 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 and 67. Is a primer for amplifying the mature part.
  • the prosequence portion of the plotting rutaminase was sequenced using a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 52.
  • pPKT-PPG (FAPF), pPKT-PPG (FAPY), pPKT-PPG (AHAY), pPKT-PPG (AHAL), pPKT-PPG (AAPF), pPKT-PPG (AAPY), pPKT-PPG (AAPM) was constructed.
  • C. glutamicum ATCC13869 was transformed, and strains grown on a CM2G agar medium containing 25 mg / l kanamycin were selected.
  • the selected strain was cultured in MM liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C for 48 hours.
  • 101 culture supernatants were analyzed by SDS-PAGE.
  • SDS-PAGE was performed using a 4-20% gradient gel (manufactured by Dai-ichi Kayaku), and protein staining was performed with Coomassie brilliant blue staining. As a result, a band was detected near the expected molecular weight, around 35 kDa.
  • Analysis of the culture supernatant 1001 by reverse phase HPLC revealed that the protein concentration was about 20 mg / l.
  • Example 2 the culture supernatant was treated with Ultrafree (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 2 (2-2), followed by enzymatic digestion with the actinomycete-derived protease SAM-P45 to remove the pro-structure of plotting glutaminase. Cleavage and maturation were performed.
  • the activity of the matured protein was measured using the method described in Patent Publication 2000-50887, and it was confirmed that the secreted protein actually had protein glutaminase activity.
  • the protein had the same LASV as the native form.
  • trypsin or protease M (Amano Enzym) was used as an enzyme for maturation, the same N-terminus as the natural type was generated.
  • the culture supernatant was treated with Ultrafree (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 2 (2-2), and then digested with subtilisin (Sigma) or alcalase (Novozymes). Was cut and matured.
  • the activity of the matured protein was measured using the method described in Patent Publication 2000-50887, and it was confirmed that the secreted protein actually had protein daltaminase activity. Analysis of the N-terminal amino acid sequence of the matured protein confirmed that it had the same LASV as the native form.
  • the present invention it is possible to efficiently produce and produce industrially useful heterologous proteins, for example, isomaltextranase and plotting rutaminase, which were difficult to secrete in the Sec system, which is a protein secretion pathway in coryneform bacteria. It can be secreted (secretory production) outside the cells.
  • the present invention provides a method for efficiently producing a heterologous protein that has been difficult to secrete and produce depending on the Sec secretory pathway.

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Abstract

　本発明は、コリネ型細菌に産業上有用なタンパク質、特に従来のタンパク質分泌経路では分泌させることが困難であったタンパク質を効率的に製造する方法を提供する。特に本発明は、5’から3’方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、Tat系依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前記コリネ型細菌に産生および分泌させることによる、タンパク質を効率的に製造する方法を提供する。

Description

明 細 書
タンパク質の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、異種タンパク質を、コリネ型細菌で分泌生産させる方法に関する。特に
、本発明は、産業上有用な酵素や生理活性タンパク質を含む異種タンパク質をコリ ネ型細菌で分泌生産させる方法に関する。
[0002] (背景技術）
コリネ型細菌は、 L グルタミン酸、 L リジンを始めとする L アミノ酸、核酸生産 菌として発酵工業上、非常に有用な細菌である。また、コリネ型細菌は、異種タンパク 質の分泌に好適とされるカビ、酵母や Bacillus属細菌と比べ、もともと菌体外に分泌さ れるタンパク質が極めて少なぐ異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が 簡略化、省略ィ匕できることであり、また糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地 で早く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れており、異種タンパク生産に おいても非常に有用な細菌であると考えられている。
[0003] コリネ型細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産する方法として、コリネ ノ クテリゥム.グノレタミカム (Corynebacterium glutamicum) (以後、 C. glutamicumと略 すことがある）によるヌクレアーゼゃリパーゼの分泌 [米国特許第 4965197号，
J.BacterioL, 174, 1854-1861(1992)]及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌 [Appl.Environ.MicrobioL, 61, 1610-1613(1995)]、コリネ型細菌の細胞表層タンパク 質の分泌 [特表平 6-502548]、コリネ型細菌を利用したフイブロネクチン結合タンパク 質の分泌 [Appl. Environ. Microbiol, 63, 4392-4400(1997)]、変異型分泌装置を利用 したタンパク質の分泌方法 [特開平 11-169182]、トランスダルタミナーゼの分泌生産 法 [Appl. Environ. Microbiol, 69, 358-366(2003)]、変異株を利用したトランスグルタミ ナーゼの分泌生産法 [WO02/81694]等がある。タンパク質の蓄積量でみると、バチル ス'ズブチリス由来のサチライシン遺伝子 (aprE)のプロモーター、リボソーム結合部位 及びシグナルペプチドの配列を利用してディケロバクタ一'ノドサス（Dichelobacter nodosus)由来のアルカリ性プロテアーゼの遺伝子を C. glutamicumにおいて発現さ せ、約 2.5mg/mlの蓄積を認めた例 [Appl. Environ. Microbiol, 61, 1610-1613 (1995) ]、また、トランスダルタミナーゼの分泌については、最大 930mg/Lという分泌蓄積が 確認されている [WO 02/81694]。
[0004] これまでに知られているコリネ型細菌のタンパク質分泌経路は、 Sec系といわれる経 路である。 Sec系は、細胞膜上に存在し、タンパク質分泌のチャンネルとして働く SecY [特開平 6-169780]、 SecE [特開平 6-277073]、 SecG [特開平 11-169182]及び、タ ンパク質透過のための駆動力供給として機能する SecA [特開平 7-107981]を主成分と するコンポーネントより構成されて!、る。この系はェシエリヒア 'コリやバチルス'ズブチ リス等の原核生物から、酵母、カビ、そしてヒト等の真核生物に至るまで幅広く存在し
、最も主要で且つ一般的なタンパク質分泌経路である。
し力しながら、コリネ型細菌に於いて Sec系による分泌生産が困難なタンパク質も存 在することが知られている。そのような例には、イソマルトデキストラナーゼゃプロティ ントランスダルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質が含まれる。
[0005] 近年になって、 Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチ ラコイド膜において見出された [EMBO J., 14, 2715-2722 (1995) ]0この経路を通して 分泌されるタンパク質のシグナル配列にはアルギニン アルギニンの配列が共通し て存在しており [EMBO J., 14, 2715-2722 (1995) ],そのことより Tat系 [Twin- Arginine Translocation system]と呼ばれる様になった。その後、この Tat系が大腸菌レダクトォ キシダーゼ、硝酸還元酵素 (nitrate reductase)やバチルス'ズブチルスのリポ酸合成 酵素（Lipoic acid synthetase)や、ホスホシエステラーセ (phosphodiesteraseリのよつな アルギニン-アルギニンの共通配列のシグナル配列を持つタンパク質の分泌に特異 的に関与していることが明らかになった [Science, 278, 1467-1470 (1997)，米国特許 第 6022952号,米国特許第 6335178号] [J. Biol. Chem., 275, 41350-41357,国際公開 パンフレット WO 02/22667]。
また、 Sec系ではタンパク質が高次構造形成する前の状態で分泌されるのに対し、 Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌さ れることが特徴的である [J Biol Chem25;273(52):34868-74(1998)]0
[0006] コリネ型細菌でも Tat系コンポーネントをコードする遺伝子と相同性の高い遺伝とし て、 tatA(GENEBANK cgl03060 1571065- 1571382),tatB(GENEBANK cgl03060 1167110-1167580),tatC (GENEBANK cgl03060 1569929-1570873) tatE(gi|41223046|emb|CAF18991.l| )が存在することが明らかになっているが、これら の機能は知られておらず、コリネ型細菌において Tat系 経路によってタンパク質分 泌が行われているかどうか明らかでなかった。
また、ェシエリヒア'コリにおいては Tat系分泌装置をコードする遺伝子 tatA、 tatB、 tatCを発現するプラスミドを導入することにより、 Tat経路におけるペリブラズムへの分 泌量の向上が認められた例があるが、その蓄積量は 5— 10mg/Lであり、産業上実用 的なレベルには達していない。 [Biochem. Biophys. Res. Commun.
304:279-284.(2003) ]
[0007] (発明の開示）
本発明は、コリネ型細菌において、タンパク質分泌経路の一つである Sec系を利用 したのでは分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質を効率的に 菌体外に分泌 (分泌生産)させる方法を提供することを目的とする。
より具体的には、本発明は、タンパク質分泌経路の一つである Sec系を利用したの では分泌させることが困難であった産業上有用な異種タンパク質をコリネ型細菌にお いて産生させ、かつ、効率的に菌体外に分泌 (分泌生産）させることによって、異種タ ンパク質を効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
[0008] 本発明者らはコリネ型細菌におけるタンパク質分泌経路の仕組みについて着目し、 これまでに知られていた Sec系とは異なるタンパク質分泌経路である Tat系がコリネ型 細菌で機能することを見いだした。より具体的には、本発明者らは、コリネ型細菌のタ ンパク質分泌経路である Tat系を構成すると考えられるタンパク質をコードする遺伝子 を欠損させることにより、これまで分泌されていたタンパク質が分泌されなくなる現象 を見いだし、 Tat系がコリネ型細菌に於いても機能していることを確認した。さらに本 発明者らは、 Tat系依存的なシグナル配列を見いだし、これをコードする配列の下流 に、これまでのタンパク質分泌経路である Sec系では分泌させることが困難であった目 的タンパク質遺伝子配列を結合した発現構築物をコリネ型細菌に導入し、得られた 形質転換コリネ型細菌を培養することにより、目的タンパク質を効率よく分泌させるこ とが可能であることを見出した。本発明者らは、コリネ型細菌において新規に見出さ れたタンパク質分泌経路である Tat系を利用することにより、従来のタンパク質分泌経 路である Sec系分泌経路によっては分泌させることが困難であった異種タンパク質、 例えばイソマルトテキストラナーゼゃプロティングルタミナーゼを効率よく分泌させ得 ることを見出し、本発明を完成させた。また、さらにコリネ型細菌において、 Tat系分泌 装置をコードする遺伝子を増幅することにより Tat系を利用して分泌可能なタンパク質 の分泌量を向上させ得ることを見出した。
[0009] 本発明は、 5'から 3 '方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、 Tat系 依存シグナルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードす る核酸配列を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タン ノ ク質を前記コリネ型細菌に産生および分泌させることを特徴とする、異種タンパク 質の製造方法である。
より具体的には、本発明は、上記方法において、 Tat系依存シグナルペプチドが配 列番号 31または 32記載の配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。
更に具体的には、本発明は、上記方法において、 Tat系依存シグナルペプチドが 配列番号 28〜30の 、ずれかの配列を含む、異種タンパク質の製造方法である。 特に、本発明は、上記方法において、 Tat系依存シグナルペプチド力イソマルトデ キストラナーゼのシグナルペプチドまたはトリメチルァミン N—ォキシドレダクターゼの シグナルペプチドである、異種タンパク質の製造方法である。
さらに具体的には、本発明は、上記方法において、上記イソマルトデキストラナーゼ の Tat系依存シグナルペプチドが配列番号 6記載のアミノ酸配列を有する、または、ト リメチルァミン N—ォキシドレダクターゼのシグナルペプチドが配列番号 8記載のアミ ノ酸配列を有することを特徴とする、異種タンパク質の製造方法である。
[0010] (発明を実施するための最良の形態）
本発明の方法においては、コリネ型細菌が宿主ベクター系として用いられ、コリネ型 細菌の Tat系依存シグナルペプチドの下流に分泌させる目的タンパク質の遺伝子を 結合した発現構築物が作製され、これがコリネ型細菌内に導入され、発現され、 目的 タンパク質が菌体外に分泌される。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク 質またはペプチドの分子が細菌菌体外 (細胞外）に移送されることをいい、最終的に そのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はも ちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含 む。
[0011] 分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレブ口ペプチドとして翻訳され、 その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレぺプチ ドまたはプレブ口ペプチドとして翻訳された後、シグナルペプチド（「プレ部分」）が切 断されて成熟ペプチドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼ によってさらにプロ部分が切断されて成熟ペプチドになることが知られている。また、 本明細書において、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体の N末端に存在 し、かつ天然の成熟タンパク質には存在しない配列をいい、「シグナルペプチド」とは そのようなタンパク質前駆体力 切り取られるペプチドを 、う。一般にはシグナル配列 は菌体外への分泌に伴ってプロテアーゼ（一般にシグナルぺプチダーゼと呼ばれる )によって切断される。このようなシグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した 配列上の特徴を有する力 ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生 物種にぉ 、ても必ずしも分泌機能を発揮すると!/ヽうことではな!/、。
[0012] 本明細書において、シグナルペプチドおよびプロ部分の両方を有するタンパク質、 すなわち、一次翻訳産物を「プレブ口タンパク質」と称することがあり、また、シグナル ペプチドを有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することが ある。プロタンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することも あり、本明細書においてタンパク質の「プロ構造部 Zプロ構造」とタンパク質の「プロ 部分」とは互換的に使用される。プレブ口タンパク質またはプレタンパク質において、 そのシグナルペプチドは異なるタンパク質に由来する場合であっても、 目的タンパク 質に天然に存在するシグナルペプチドであってもよ 、が、使用する宿主の分泌型タ ンパク質に由来することが好ましい。あるいは、使用する宿主のコドン使用頻度に応 じて最適なコドンを有するように改変してもよい。さらに本発明の目的に使用し得るシ グナルペプチドは、それが由来する天然の成熟タンパク質の N末端アミノ酸配列を一 部含んでいてもよい。シグナルペプチドが異なるタンパク質に由来する場合はプレブ 口タンパク質を特に「異種融合プレブ口タンパク質」と称することもある。
例えば、タンパク質がプロティングルタミナーゼの場合は、それぞれ「プレブ口プロ ティングルタミナーゼ」、「プロプロティングルタミナーゼ」および「異種融合プレブロブ 口ティングルタミナーゼ」と称される。また、「プロ部分を切断した」タンパク質とは、ぺ プチド結合を切断することによってプロ部分を構成する少なくとも 1以上のアミノ酸を 除去したタンパク質を 、 、、その N末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全 に一致するタンパク質、および、そのタンパク質の活性を有する限り、天然のタンパク 質に比較して N末端にプロ部分に由来する 1以上の余分のアミノ酸を有するものおよ び天然の成熟型タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。
本発明において、「Tat系」とは、「ツイン'アルギニン移行経路」（
Twin- arginine- translocation- pathway)とも呼ばれる経路であり、シグナルペプチド中 に保存されたアルギニン-アルギニンの保存領域を認識して、 TatA、 B、 C、 Eを含む 膜タンパクにより、タンパク質を分泌する機構または経路を意味する。また、「Tat系分 泌装置」とは TatA、 B、 C、 Eを含む膜タンパクを指す。これらの TatA、 B、 C、 Eは細胞 膜に存在する膜貫通型タンパク質であり、これらが複合体となり細胞膜上にタンパク 質が透過するためのポアを形成していると考えられている。また、タンパク質が透過 する際の TatA、 B、 C、 E詳細な高次構造および機能については研究途上である。 C.glutamicumATCC13869における TatAをコードする遺伝子と TatCをコードする遺伝 子は非常に近傍に位置している。 TatAをコードする遺伝子配列とその 5'上流域、さら に TatCをコードする遺伝子配列を配列番号 38に記載した。また、 TatAのアミノ酸配 列を配列番号 46に、 TatCのアミノ酸配列を配列番号 10に示す。 TatBをコードする遺 伝子配列とその 5'上流域を配列番号 41、 TatBのアミノ酸配列を配列番号 47に、 TatEをコードする遺伝子配列を配列番号 48、 TatEのアミノ酸配列 49に示した。 TatAと TatEは非常に相同性が高く E.coliにおいては TatAと TatEはその機能を相補で きることが知られている [EMBO J. 1;17(13):3640- 50(1998).]。
本発明で用いるコリネ型細菌にぉ 、て、増幅されて 、ても良 、Tat系分泌装置は、 アミノ酸配列の一部欠損または一部付カ卩した場合、また、 C.glutamicum由来の Tat系 分泌装置に限らずコリネ型細菌において機能し得るいずれの Tat系分泌装置をも含 む。
[0014] この系による分泌シグナルは「Tat系依存シグナルペプチド」 (「ツイン ·アルギニン · シグナルペプチド」 (Twin-arginine signal peptide)とも呼ばれる）を有している。「Tat 系依存シグナルペプチド」とは、 Tat系によって認識されるシグナルペプチドで、アル ギニン-アルギニンの保存領域が存在している。「Tat系依存シグナルペプチド」として は、大腸菌のトリメチルァミン N-ォキシドレダクターゼ (TorA)、大腸菌の
Sufl(suppressor of ftsl ;ftslサプレッサー)、バチノレス'ズブチリス（Bacillus subtilis)の PhoD (ホスホジエステラーゼ)、 LipA、ァルスロパクタ^ ~ ·グロビフオルミス（
Arthrobacter globiformis)由来のイソマルトデキストラナーゼ (IMD)等のシグナルぺプ チドが挙げられる。これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである： TorAシグナルペプチド: MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (配列番号 8)
Suflシグナルペプチド: MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA (配列番号 28) PhoDシグナルペプチド
： MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS (配列番 号 29)
LipAシグナルペプチド: MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH (配列 番号 30)
IMDシグナルペプチド： MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA (配列番号 6 )
[0015] なお、本明細書にぉ 、て、 TorAシグナルペプチド、 Suflシグナルペプチド、 PhoDシ グナルペプチド、 LipAシグナルペプチド又は IMDシグナルペプチドという場合は、そ れぞれ、前記配列番号 8、 28、 29、 30又は 6を有するペプチドのほか、各配列におい て、 1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するペプチドも含まれる。 ここで、「数個」とは、これらの Tat系依存シグナルペプチドにおけるアミノ酸残基の位 置や種類によっても異なる力 通常 1〜7個、好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜 2個程度である。また、配列番号 8、 28、 29、 30又は配列番号 6に示されるアミノ酸配 列に対する相同性力 通常 85%以上、好ましくは 90%以上、更に好ましくは 95%以 上のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであってもよい。
このような置換、欠失、挿入又は付加を有するシグナルペプチドをコードする核酸 配列は、大腸菌、バチルス'ズブチリス、ァルスロバクタ一'グロビフオルミスの変種、 自然突然変異株又は人為突然変異株、ァルスロパクター ·グロビフオルミス以外のァ ルスロパクター属微生物やバチルス'ズブチリス以外のバチルス属微生物から取得さ れ得る。また、置換、欠失、付加又は挿入を有する Tat系依存シグナルペプチドをコ ードする核酸配列は、配列番号 8、 28、 29、 30又は配列番号 6に示されるアミノ酸配 列を有する Tat系依存シグナルペプチドをコードする核酸をインビトロ変異処理、ある いは部位特異的変異処理することによつても取得され得る。これらの突然変異処理 は、当業者に周知の方法によって行うことができる。
上記のような置換、欠失、挿入又は付カ卩は、後述するコンセンサスモチーフが保持 されるような保存的変異である。保存的変異は、代表的には保存的置換である。これ らのシグナルペプチドの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミ ノ酸としては、 Alaから Ser又は Thrへの置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置換、 Asn 力 Glu、 Gln、 Lys, His又は Aspへの置換、 Aspから Asn、 Glu又は Ginへの置換、 Cys 力ら Ser又は Alaへの置換、 Ginから Asn、 Glu、 Lys, His, Asp又は Argへの置換、 Gluか ら Asn、 Gln、 Lys又は Aspへの置換、 Glyから Proへの置換、 Hisから Asn、 Lys, Gln、 Arg又は Tyrへの置換、 lieから Leu、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから Ile、 Met, Val 又は Pheへの置換、 Lysから Asn、 Glu、 Gln、 His又は Argへの置換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Pheから Trp、 Tyr, Met, lie又は Leuへの置換、 Serから Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は Alaへの置換、 Trpから Phe又は Tyrへの置換、 Tyrから His, Phe又は Trpへの置換、及び、 Valから Met、 lie又は Leuへの置換が挙げられる。 「Tat系依存シグナルペプチド」にお!/、ては、コンセンサスモチーフとして
S/T-R-R-X-F-L-K (配列番号 31)や R-R-X- #-#-(#:疎水性残基)（配列番号 32)の 疎水性領域が保存されている。但し、これらのコンセンサスモチーフが保存されてい る場合であっても、さらに分泌されるタンパク質によっても影響を受ける。例えば、 Bacillus subtilisの WprA, WapAのシグナルペプチドはツイン ·アルギ-ンモチーフ（ Twin-arginine motif)を持っているがそれらは Tat系ではなぐ SRP/Sec系に依存して 分泌されることが明らかにされている（Biochem Biophys Res Commun. 2003 Apr 25; 304(1): 48-54)。 Tat系で分泌可能なタンパク質の例には、大腸菌由来の TorAおよび Sufl、バチルス'ズブチリス由来の PhoD、バチルス'ズブチリス由来の LipAが含まれる が、これらに限定されない。特に、コリネ型細菌において Tat系を利用して分泌可能な タンパク質の例には、イソマルトデキストラナーゼ、プロティングルタミナーゼ、トランス ダルタミナーゼ等の各種酵素が挙げられる。具体的には、ァルスロパクター ·グロビフ オルミス T6(NRRL B- 4425,IMA12103)由来イソマルトデキストラナーゼ、好ましくは配 列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するイソマルトデキストラナーゼ、タリセォバタテリ ゥム 'プロテオリチカム (Chryseobacterium proteolyticum)由来プロティングノレタミナ ーゼ、好ましくは、配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するプロティングルタミナ一 ゼ、 GFP (緑色蛍光タンパク質）、 WO 02/81694記載のストレプトマイセス 'モバラェン ス（Streptoverticillium mobaraense)由来トランスグルタミナーゼ等が挙げられる力 こ れらに限定されない。 Arthrobacter globiformis T6株は、 Northern Utilization Research and Development Divisionに登録番号 NRRL B- 4425として登録されている 。 Chryseobacterium roteollyticumは、 FERM BP- 3523として、平成 12年 11月 8日にェ 業技術院生命工学工業技術研究所 (現、独立行政法人 産業技術総合研究所 特 許生物寄託センター、 日本国茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6、郵便番号
305-8566)に寄託されている。
イソマルトデキストラナーゼは、デキストラン等からイソマルトースを効率よく生産する 酵素である。本酵素をデキストラン等に作用させて得られるイソマルトースは、抗ぅ蝕 性を有する効果 (特開昭 58-76063号参照）、及びヒトの腸内有用細菌であるビフィズ ス菌の増殖効果を有する効果 (特開昭 61-22777号参照)があり、産業上有用な酵素 である。プロテインダルタミナーゼは、ダルタミナーゼとして機能する酵素で、タンパク 質を低分子化せず、タンパク質中に存在するグルタミン残基に直接作用し、ペプチド 結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わず、脱アミド作用を有する面で非常に有用 である（特開 2001-218590)。 GFPは、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質 (Green Fluorescent Protein; GFP)で他のタンパク質に融合させて細胞に導入すると細胞内 の任意の場所に蛍光を作りだすことが出来るため、 in vivoで特定の構造体を蛍光ラ ベルするのに威力を発揮し、多く研究に用いられている。これらの酵素は、従来の Sec系では分泌されず、 Tat系を利用することによって初めて分泌可能となる。但し本 発明によって効率よく製造されるタンパク質はこれらの酵素に限られずコリネ型細菌 にお!/、て Tat系を利用して分泌されるタンパク質であれば!/、ずれでもよ!/、。
[0018] 本発明に言うコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビパクテリ ゥム属に分類されていたが現在コリネパクテリゥム属に統合された細菌を含み (Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255(1981))、またコリネバタテリゥム属と非常に近縁なブレビバタ テリゥム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでに異種タン パク質の分泌に好適とされるカビ、酵母や Bacillus属細菌と比べて本来的に菌体外に 分泌されるタンパク質が極めて少なぐ異種タンパク質を分泌生産した場合にその精 製過程が簡略化、省略化できること、また糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培 地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが 含まれる。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
[0019] コリネバタテリゥム.ァセトァシドフィラム、
コリネバタテリゥム ·ァセトグノレタミカム、
コリネバタテリゥム ·ァノレ力ノリティカム、
コリネバタテリゥム ·カルナェ、
コリネバタテリゥム ·グノレタミカム、
コリネバタテリゥム 'リリウム、
コリネバタテリゥム 'メラセコーラ、
コリネバタテリゥム ·サーモアミノゲネス、
コリネバタテリゥム 'ノヽーキユリス、
ブレビバタテリゥム ·ディバリカタム、
ブレビバタテリゥム ·フラバム、
ブレビバタテリゥム 'インマリオフィラム、
ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム、
ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム、
ブレビバタテリゥム.サッカロリティカム、 ブレビバタテリゥム ·チォゲ二タリス、
コリネパクテリゥム.アンモニアゲネス、
ブレビバタテリゥム ·アルバム、
ブレビバタテリゥム ·セリヌム、
ミクロノくクテリウム -アンモニアフィラム。
[0020] 具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバタテリゥム.ァセトァシドフィラム ATCC13870、
コリネバタテリゥム 'ァセトグルタミカム ATCC15806、
コリネパクテリゥム.ァルカノリティカム ATCC21511、
コリネバタテリゥム'カルナェ ATCC15991、
コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060、 コリネバタテリゥム 'リリウム ATCC15990、
コリネバタテリゥム'メラセコーラ ATCC17965、
コリネバタテリゥム 'エツフイシエンス AJ12340(FERM BP- 1539)、
コリネバタテリゥム'ハーキユリス ATCC13868、
ブレビパクテリゥム 'ディパリ力タム ATCC14020、
ブレビバタテリゥム 'フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP- 2205) ブレビバタテリゥム 'インマリオフィラム ATCC14068、
ブレビパクテリゥム 'ラタトフアーメンタム ATCC13869、
ブレビバタテリゥム'ロゼゥム ATCC13825、
ブレビバタテリゥム 'サッカロリティカム ATCC14066、
ブレビバタテリゥム ·チォゲ-タリス ATCC 19240、
コリネバタテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC6871、 ATCC6872,
ブレビバタテリゥム 'アルバム ATCC15111、
ブレビバタテリゥム 'セリヌム ATCC15112、
ミクロパクテリゥム.アンモニアフィラス ATCC15354。
[0021] これらを入手するには、例えばアメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクションより分譲を 受けることができる。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この 登録番号はアメリカン'タイプ ·カルチヤ一'コレクションのカタログに記載され、この番 号を参照して各菌株の分譲を受けることができる。
とりわけ、野生株コリネバタテリゥム 'グルタミカム（C. glutamicum)ATCC13869よりス トレプトマイシン (Sm)耐性変異株として分離したコリネバタテリゥム ·ダルタミカム AJ12036(FERM BP-734) (昭和 59年 3月 26日原寄託）（現、独立行政法人 産業技術 総合研究所 特許生物寄託センター、日本国つくば巿東 1 1 1 中央第 6、郵便 番号 305-8566)はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝 子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件 下での蓄積量としておよそ 2〜3倍と極めて高いため、宿主菌として好適である (WO 02/081694参照)。
さらに、このような菌株力 細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を 宿主として使用すれば、培地中に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特 に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細 胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことがで きる。細胞表層タンパク質を生産しな 、ように改変されたコリネ型細菌としては、 AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2)破壊株である C. glutamicum YDK010株が挙げ られる（国際公開パンフレット WO 01/23591)。
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルぺプ チドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、およびコリネ型細 菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列 (オペレーターや ターミネータ一等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。目 的タンパク質は、 N末端にプロ構造部を有していてもよい。この構築物のために使用 できるベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るものであればよぐプ ラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれる ものであってよい。そのような例には、 PAM330(特開昭 58-067699号公報)、 pHM1519(特開昭 58-77895号公報)、 pSFK6 (特開 2000-262288号公報）が含まれる 。また、これらのベクター力 コリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力 を持つ DNA断片を取り出し、前記大腸菌用ベクターに挿入すると、大腸菌及びコリネ 型細菌の両方で複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することが出来る。 また、人工トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合 は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入され る。
[0023] 本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機 能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えば tacプロモ 一ター等の大腸菌（E.coli)由来のプロモーターであってもよい。その中で、 tacプロモ 一ター等の強力なプロモーターがより好ましい。コリネ型細菌由来のプロモーターとし ては、例えば、細胞表層タンパク質の PS1、 PS2、 SlpAの遺伝子のプロモーター、各種 アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、 グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のァスバルトキナー ゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよび ノ リン生合成系のァセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の 2-イソプロ ピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キ ナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル -ATPピロホスホリラーゼ遺伝子 、トリプトファン、チロシンおよびフエ-ルァラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデォ キシァラビノヘプッロン酸リン酸 (DAHP)合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグァ -ル 酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート (PRPP)アミドトランス フェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグァニル酸合成酵素遺伝子 の各プロモーターが挙げられる。
[0024] 本発明で使用するシグナルペプチドはコリネ型細菌の菌体内で機能し得る Tat系依 存シグナルペプチドであれば特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得る どのような Tat系依存シグナルペプチドも使用することができる。したがって、異種由 来の、例えば大腸菌やバチルス'ズブチリス由来の Tat系依存シグナルペプチドも、コ リネ型細菌の菌体内で機能し得る限り、本発明に使用することができる。シグナルべ プチドには、それが由来する分泌性タンパク質の N末端アミノ酸配列の一部が付加さ れていてもよい。シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルぺ プチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天 然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドン を有するように改変してもよい。これらのシグナルペプチドを使用する場合、 目的とす るタンパク質をコードする遺伝子は、シグナルペプチドをコードする遺伝子の 3'-末端 側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置する。
[0025] 本発明によって生産および分泌し得る有用タンパク質は、前述した Tat系依存シグ ナルペプチドをコードする核酸配列と同一の遺伝子構築物中に含まれうる核酸により コードされるタンパク質であれば、元来 Tat系で分泌されるタンパク質である力 Sec系 で分泌されるタンパク質であるかを問わず、動植物や微生物由来の菌体内タンパク 質を含むタンパク質全般が含まれる。本発明によって分泌生産できるタンパク質の例 には、プロテアーゼ、アミノぺプチダーゼ、カルボキシぺプチダーゼ、コラゲナーゼお よびキチナーゼが含まれる。特に、従来の SEC系で分泌不可能であったタンパク質 は、本発明によって生産および分泌させるために適している。これらのタンパク質をコ ードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および Zまたは、望みの活性を得るため に改変することができ、それらには 1以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれ る。必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。改変技 術、遺伝子のクローユング技術、生産されたタンパク質の検出技術を含む、このような 一般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、 Sambrook et al., 1989, Molecularし loning: A Laooratory Manual, Second Edition (1989) し old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、 DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)、 F.M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)、 PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press等を参照することができる。
[0026] 本発明に使用し得る遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定され ず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法 (Gene, 39, 281-286(1985))、ェ レクト口ポレーシヨン法 (Bio/Technology, 7, 1067- 1070)(1989》等を使用することがで きる。 [0027] また、本発明においては、コリネ型細菌は、 tat系分泌装置が増幅された株、即ち、 tat系分泌装置を構成する TatA、 B、 C、 Eを含む膜タンパクが増幅された株であっても 良い。このようなコリネ型細菌は、親株の tat系分泌装置をコードする遺伝子である、 tatA、 tatB、 tatC、 tatEを含む遺伝子群のいずれ力 1種又は 2種以上の発現量を増強 すること〖こより得られる。
[0028] これらの tat系分泌装置をコードする遺伝子である、 tatA、 tatB、 tatC、 tatEを含む遺 伝子（以下いずれかを指して「tat遺伝子」ということもある。）の発現量の増強は、 tat 遺伝子群のいずれか 1種又は 2種以上のコピー数を高めることによって達成される。 例えば、 tatAを含む遺伝子をコードする断片や、 tatAと tatBを連結した遺伝子をコー ドする断片を、コリネ型細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクタ 一と連結して組換え DNAを作製し、これを上述のようなコリネ型細菌に導入して形質 転換すればよい。この際用いられるベクターは、前述の遺伝子構築物のために使用 できるベクターと同様である。また、コピー数の上昇は、 Tat系分泌装置をコードする 遺伝子を染色体上に 1コピーあるいは複数コピー転移させることによつても達成され る。コリネ型細菌の染色体 DNA上に tat遺伝子を複数コピー導入するには、染色体 DNA上に複数コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体 DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブ DNA、転移因子の端部に存 在するインバーテッド'リピートが利用できる。あるいは、特開平 2-109985号公報に開 示されて!/ヽるように、 tat遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体 DNA上に多コピー導入することも可能である。（特開平 2-109985号、特開平 7— 107 976号、 Vertes'A.A., Asai'Y., Inui.M., Kobayashi.M., Kurusu.Y. and Yukawa, H. ： Mol.Gen.Genet.,245, 397-405 (1994))。染色体上に tat遺伝子が転移したことの確 認は、 tat遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダィゼーシヨンを行うことに よって確認出来る。
[0029] また、 tat系分泌装置の発現を上昇させる手段として上記の遺伝子増幅による以外 に、染色体 DNA上またはプラスミド上の tat遺伝子のプロモーター等の発現調節配列 を強力なものに置換すること、 tat遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばォペレ 一ターゃリプレッサーを改変することによつても達成される。（Hamilton et al，； Journal of Bacterology 171 : 4617-4622)例えば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモ 一ター等が強力なプロモーターとして知られて 、る。プロモーターの強度の評価法お よび強力なプロモーターの例は、 Goldsteinらの餘文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105- 128)等に記載されている。ま た、国際公開 WO00/18935に開示されているように、 目的遺伝子のプロモーター 領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さ らに、リボソーム結合部位 (RBS)と開始コドンとの間のスぺーサ、特に開始コドンの すぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換が mRNAの翻訳効率に非常に 影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。 tat遺伝子のプ 口モーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターや GENETYX等の遺伝 子解析ソフトを用いて決定することも出来る。発現調節配列の置換は、例えば、上述 の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
[0030] 得られた遺伝子導入形質転換体は通常用いられる方法および条件に従って培養 することができる。例えば、形質転換体は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通 常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るため、ビタミン、アミノ酸等の 有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。炭素源としてはグルコースお よびシユークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を 使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ-ゥム 塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン 、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用することができる 。培養は pH5.0〜8.5、 15°C〜37°Cの適切な範囲にて好気的条件下で行えばよぐ培 養期間は 1〜7日間程度でよい。このような条件下で形質転換体を培養することによ り、 目的タンパク質は菌体内で多量に生産され、効率よく菌体外に分泌される。
[0031] 本発明によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従 つて培養後の培地力も分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により 除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン 交換カラムクロマトグラフィー、ァフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマ トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、 またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。本発明によって菌 体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、 界面活性剤の使用等によって可溶ィ匕した後に、培地中に分泌された場合と同様にし て分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質 を可溶ィ匕せずに、例えば固定ィ匕酵素として使用しても良い。
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意 味でも本発明を限定するものと解してはならない。
(実施例）
実施例 1. Arthrobacter globiformis (A. globiformis)由来のイソマルトデキストラナ一 ゼのシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
(1 - 1) C.glutamicumによるイソマルトデキストラナーゼのシグナル配列を用いたィ ソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミドの構築
A. globiformis T6株由来イソマルトデキストラナーゼ (EC.3.2.1.94; 1,6- a - D-グル カンイソマノレトテキストラナーゼ； 1,6— a -D-glucan isomalto— dextranase)遺伝子の酉己 列は既に決定されている [Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)]。この配列 を参考にして、配列番号 11 (5 ' -ATGATGAACCTGTCCCGCCG-3')と配列番号 12 (5， -CGCGGATCCCTGAGGGCGGGAAC-3')に示した配列を有するプライマーを 合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)] 調製した A. globiformisの染色体 DNAを铸型としてイソマルトデキストラナーゼをコード する領域を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造 社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号 12の 配列は制限酵素 BamHIの認識配列を含んで 、る。
また、上述の pPKSPTGl (WO 01/23591記載）を铸型として、プロモーターおよびシ グナル配列をコードする領域を、配列番号 14 (5 '
-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3')、配列番号 16 (5，- イマ一を用いて PCRを行うことにより増幅した。配列番号 16に示した配列は、イソマル トデキストラナーゼのシグナル配列の N末端側をコードする配列を含んでいる。 [0033] 配列番号 11及び 12に示した配列のプライマーで増幅された PCR産物と、配列番号 14と 16に示した配列のプライマーで増幅された PCR産物とを混合し、これらを铸型と して配列番号 12と配列番号 14に示したプライマーを用いてクロスオーバー PCRを実 施した。この PCR産物を制限酵素 Sealと BamHIにより消化した後、ァガロースゲル電 気泳動により約 2.5kbの DNA断片を回収し、この断片を pPKSPTGl (WO 01/23591記 載）の Scal-BamHI領域に挿入して、イソマルトデキストラナーゼ発現プラスミド pPKI-IMDを構築した。構築したプラスミドに挿入された遺伝子の配列は、ダイターミ ネーターサイクルシークェンシングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNA シークェンサ一 377A(PEアプライドバイォシステムズ社製)を用いて決定した。塩基配 列決定の結果、得られたイソマルトデキストラナーゼ遺伝子配列は報告されて!ヽる配 列と一部異なって 、ることが判明した。新たに決定されたイソマルトデキストラナーゼ 遺伝子の配列を配列番号 1に、アミノ酸配列を配列番号 2に示した。
[0034] (1 - 2) Corynebacterium glutamicum (C.glutamicum)による IMDシグナル配列を用い た IMDの分泌
構築したプラスミド pPKI-IMDを用いて C.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシ ン (Sm)耐性株 AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2)破壊株である C.glutamicum YDK010株（特許 WO 01/23591記載）に形質転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を 25mg/lのカナマイシン を含む MM液体培地で 30°Cにて 48時間培養した。培養終了後 10 μ 1の培養上清を SDS- PAGEにより分析した。 SDS- PAGEは 12.5%のゲル（第一化薬製）を用い、クマシ 一ブリリアントブルー染色によりタンパク質のバンドを検出した。その結果、予想される 分子量である約 65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタ ンパク質の定量を行った結果、タンパク質濃度は約 120mg/lであることが示された。ま た、 Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマルト デキストラナーゼの酵素活性を測定し、得られたタンパク質が実際にイソマルトデキス トラナーゼの酵素活性を有して ヽることを確認した。
また、分泌されたイソマルトデキストラナーゼの N末端アミノ酸配列をプロティンシー タエンサ一で解析を行った。その結果、配列番号 2に示したアミノ酸配列の 31番目の Alaから始まるイソマルトデキストラナーゼが分泌されて 、ることが確認できた。従って シグナル配列領域は、配列番号 5 (ヌクレオチド配列)及び 6 (アミノ酸配列）に示した 配列であることが確認された。
[0035] (参考例 A)
Corynebacterium ammoniagenesの細胞表層タンパク質 SlpAに由来するシグナル配列 を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
(A- l)A. globiformis T6(NRRL B-4425,IMA12103)由来イソマルトデキストラナーゼ 遺伝子の取得
配列番号 11と配列番号 12に示した配列を有するプライマーを合成し、常法に従つ て（斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619. (1963)]に従って調製した A. globiformisの染色体 DNAからイソマルトデキストラナーゼをコードする領域を PCR法に て増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造社製)を用い、反応条 件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号 12の配列は制限酵素 BamHIの認識配列を含んで!/、る。
次に PCR法にて増幅した DNA断片を铸型として、配列番号 13 (
5'- GTCCCCGTCACGGCCGCGCC- 3，）と配列番号 12に示した配列のプライマーを 用いて PCRを行 、、シグナル配列を除 、た成熟型イソマルトデキストラナ一ゼをコ一 ドする領域を増幅した。
[0036] (A- 2) C.glutamicumによる SlpAシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分 泌発現プラスミドの構築
WO 01/23591記載のプラスミド pPKSPTGlを铸型とし、プロモーターおよびシグナ ル配列をコードする領域を、配列番号 14、配列番号 15 (5' - に示した配列を有するプライマーを用いて PCRを行うことにより増幅した。铸型とした プラスミド pPKSPTGlは C. glutamicum由来の細胞表層タンパク質である PS2のプロモ 一ター、 C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質 SlpAに由来するシグナル配列をコ ードする領域、および S. mobaraenseに由来するプロトランスグルタミナーゼをコードす る領域を含んでいる。前述の PCRにより、このプラスミド中の PS2プロモーター及び SlpAシグナル配列をコードする領域を含む断片が増幅される。なお、配列番号 15に 示したプライマーは、成熟型イソマルトデキストラナーゼの N末端側アミノ酸領域をコ ードする配列を含んでいる。
次に (A-1)において配列番号 13と配列番号 12に示した配列を有するプライマーを 用いて増幅した PCR産物と、配列番号 14と配列番号 15に示した配列を有するプライ マーにより増幅した PCR産物とを混合し、これらを铸型として配列番号 14と配列番号 12に示した配列を有するプライマーを用 、てクロスオーバー PCRを行 、、 PS2プロモ 一ターおよび SlpAのシグナルペプチド配列と成熟型イソマルトデキストラナーゼとの 融合遺伝子を増幅した。この PCR産物を制限酵素 Sealと BamHIにより消化した後、ァ ガロースゲル電気泳動により約 2.5kbの DNA断片を回収し、特開平 9 322774記載 のプラスミド pPK4の Scal-BamHI部位に挿入して成熟型イソマルトデキストラナーゼの 発現プラスミド pPKSIMDを構築した。
(A- 3) C. ammoniagenesの細胞表層タンパク質 SlpAに由来するシグナル配列を用 いての IMDの分泌
構築したプラスミド pPKSIMDを用いて C.glutamicum ATCC13869のストレプトマイシ ン (Sm)耐性株 AJ12036の細胞表層タンパク質（PS2)破壊株である C.glutamicum YDK010株（WO 01/23591記載）を形質転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G 寒天培地（酵母エキストラタト 10g、トリプトン 10g、グルコース 5g、 NaCl 5g、寒天 15g、 水で 1Uこする）で生育した菌株を選択した。選択した菌株を 25mg/lのカナマイシンを 含む MM液体培地で 30°Cにて 48時間培養した。培養終了後 10 μ 1の培養上清を SDS-PAGEにより分析した。 SDS-PAGEを 12.5%のゲル（第一化薬製）を用いて行い 、ゲルをクマシ一ブリリアントブルー染色してタンパク質を検出した。その結果、非常 に微量の約 65kDaのバンドを検出した。さらに逆相クロマトグラフィー分析によりタンパ ク質の定量を行った結果、濃度は約 10mg/lであることが示された。これは、
Arthrobacter globiformis由来の IMDのシグナル配列を用いた場合と比べ、タンパク分 泌量が低下していたことを示す。逆相クロマトグラフィーの条件は、以下に記載したと おりである。
カラム： protein C4 214TP5410 (Vydac社製）、 溶出条件： 24-80%ァセトニトリル リニアグラジェント /0.1%Tトリフルォロ酢酸、 流速： l.Oml/min
また、 Journal of Bacteriology, 176, 7730-7734 (1994)に記載の方法に従いイソマル トデキストラナーゼの酵素活性を測定し、分泌されたタンパク質が実際にイソマルトデ キス卜ラナ一ゼ活'性を有して ヽることを確認した。
実施例 2. Arthrobacter globiformisに由来する IMDシグナル配列を用いたプロ構造 付きプロティングルタミナーゼの分泌発現
(2— 1) Chryseobacterium proteolyticum由来プロティングノレタミナーゼ遺伝子の取 得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロティングルタミナーゼ (EC.3.5.1)遺伝子 の配列はすでに決定されている [Eur.J.Biochem. 268. 1410-1421(2001)]。この配列を 参考にして、 Corynebacterium glutamicumにおいて使用頻度の高いコドンへの変換 を行 ヽ配列番号 3に示した遺伝子配列を構築した。この配列はプロティングルタミナ ーゼのシグナル配列（プレ部分）とプロ部分および成熟型プロティングルタミナーゼを コードする領域を含んで ヽる。この全遺伝子配列を合成により作製した。
構築した配列番号 3の遺伝子配列情報に基づいて、配列番号 17 (5'
- CATGAAGAACCTTTTCCTGTC- 3 ' )と配列番号 18 (5 '
-GTAAAAGGATCCATTAATTAAAATCC-3 ' )に示した配列のプライマーを合成し た。配列番号 17に示したプライマーはプロティングルタミナーゼのシグナル配列の N 末端配列を含んでおり、配列番号 18に示したプライマーは成熟型プロテインダルタミ ナーゼの C末端と BamHIの認識配列を含んで 、る。配列番号 3に示した配列を有す る DNAを铸型として配列番号 17と配列番号 18に示した配列のプライマーを用いて PCRを行 、、プロティングルタミナーゼのプロ部分および成熟型プロティングルタミナ ーゼをコードする領域を増幅した。この PCR断片を特開平 9-070291記載の pVC7の Smal部位に挿入した後 E.coli JM109のコンビテントセル (宝酒造社製）に導入した。プ ロテイングルタミナーゼ遺伝子がクローンィ匕されたプラスミドを保持する菌株を取得し 、プラスミドを回収した。このプラスミドにクローン化された断片の塩基配列を決定し、 配列番号 3に示した配列と一致することを確認した。 [0039] (2- 2) IMDシグナル配列を用いたプロ構造付きプロティングルタミナーゼの分泌発 現プラスミドの構築
実施例 1 (1— 1)に記載した IMD発現プラスミド pPKI- IMDを铸型として、プロモータ 一およびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号 14、配列番号 21 (5' -CCTGGTTGCCGTTGGAATCGGCCTGGGCGGAGCCTGCC- 3，）に示した配列 を有するプライマーを用いて PCRを行うことにより増幅した。増幅した領域は PS2プロ モーターおよび IMDシグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番 号 21に示した配列は、プロ構造付きプロテインダルタミナーゼ遺伝子をコードする領 域の 5'末端の配列を含んでいる。次にプロティングルタミナーゼがクローン化されて Vヽるプラスミドを铸型として、配列番号 20 (5， -GATTCCAACGGCAACCAGGA-3， ) と配列番号 18の配列を有するプライマーを用いた PCRにより、プロ構造付きプロティ ングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域を増幅した。さらに、配列番号 14、配列番 号 21の配列を有するプライマーを用いて得られた PCR産物と、配列番号 20および配 列番号 18の配列を有するプライマーを用いて得られた PCR産物とを 1： 1で混合し、こ れらを铸型とし、配列番号 14と配列番号 18に示した配列を有するプライマーを用い てクロスオーバー PCRを実施することにより、 PS2プロモーター領域および IMDシグナ ル配列と、プロ構造付きプロティングルタミナーゼをコードする遺伝子との融合遺伝 子を増幅した。このクロスオーバー PCR産物を制限酵素 Sealおよび BamHIにて消化し た後、ァガロースゲル電気泳動により約 1.6kbpの DNA断片を検出した。この DNA断 片をァガロースゲルより切り出し、 EasyTrapVer.2 (宝酒造社製)を用いて回収し、特 開平 9— 322774記載のプラスミド pPK4の Seal- BamHI部位に挿入してプロ構造付き プロテインダルタミナーゼ発現プラスミド pPKI-PPGを構築した。構築したプラスミドに 挿入されて!ヽる遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が 構築されて ヽることを確認した。
[0040] (2- 3) C.glutamicumによる IMDシグナル配列を用いたプロ構造付きプロティングル タミナーゼの分泌
構築したプラスミド pPKI-PPGを用いて C.glutamicum由来の変異株 YSr株より取得し た YDK010株（国際公開パンフレット WO01/23591記載）に形質転換し、実施例 1 (1 - 3)と同様に 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地 (で生育した菌株を選択 した。選択した菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培地で 30°Cにて 48時間 培養した。培養終了後 10 1の培養上清を SDS- PAGEにより分析した。 SDS- PAGEを 4-20%のグラジェントゲル (第一化薬製)を用いて行 、、クマシ一ブリリアントブルー 染色によりタンパク質染色を実施した。その結果、予想される分子量である約 35kDa 付近にバンドを検出した。培養上清 100 1を逆相 HPLCにより分析した結果、タンパク 質の濃度は約 20mg/lであった。逆相 HPLCの条件は、以下に記載したとおりである。 カラム CAPCELL PAK C18 SG300 4.6xl50mm(SISEIDO製）
溶出条件： 32- 48%ァセトニトリル リニアグラジェント /0.1%Tトリフルォロ酢酸 (15min) 、流速： l.Oml/min
さらに、培養上清をウルトラフリー (ミリポア製）により脱塩濃縮処理を行った後、放線 菌由来プロテアーゼ SAM- P45(国際公開パンフレット WO 01/23591に記載)により酵 素消化してプロティングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この 成熟化したタンパク質の活性を特開 2000-50887記載の方法により測定し、分泌され たタンパク質が実際にプロテインダルタミナーゼ活性を有していることを確認した。 (参考例 B)
C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質 SlpAに由来するシグナル配列を用いた
Chryseobacterium proteolyticum由来プロティングノレタミナーゼの分泌、発現
(B— 1) Chryseobacterium proteolyticum由来プロティングノレタミナーゼ遺伝子の取 得
Chryseobacterium proteolyticum株由来プロティングルタミナーゼ (EC.3.5.1)遺伝子 の配列 [Eur.J.Biochem. 268. 1410- 1421(2001)]を参考にして、 Corynebacterium glutamicumにお!/、て使用頻度の高 、コドンへの変換を行 、、配列番号 3に示した配 列を導いた。この配列はプロティングルタミナーゼのシグナル配列領域 (プレ部分）、 プロ領域および成熟型プロティングルタミナーゼをコードする領域を含んで 、る。こ の全遺伝子配列を含む核酸分子を合成により作製した。
作製した配列番号 3の遺伝子配列の情報をもとに配列番号 17と配列番号 18の配 列を有するプライマーを合成した。配列番号 17の配列を有するプライマーはプロティ ングルタミナーゼのシグナル配列の N末端配列を含んでおり、配列番号 18の配列を 有するプライマーは成熟型プロティングルタミナーゼの C末端と BamHIの認識配列を 含んで ヽる。配列番号 3に示した配列を有する DNAを铸型として配列番号 17と配列 番号 18に示した配列のプライマーを用いて PCRを行い、プロティングルタミナーゼの プロ部分と成熟型プロティングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。この PCR断 片を特開平 9-070291記載の pVC7の Smal部位に挿入した後、 E.coli JM109のコンビ テントセル (宝酒造社製）に導入した。プロテインダルタミナーゼ遺伝子がクローンィ匕 されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収した。プラスミド〖こ クローン化されている断片の塩基配列を決定し、配列番号 3に示した配列と一致する ことを確認した。
[0042] (B- 2) C.glutamicumによる SlpAシグナル配列を用いたプロティングルタミナーゼの 分泌発現プラスミドの構築
特許 WO01— 23591記載のプラスミド pPKSPTGlを铸型として、プロモーターおよび シグナルペプチドをコードする領域を、配列番号 14、配列番号 19 (5'
PCRを行うことにより増幅した。増幅した領域は PS2プロモーターおよび SlpAシグナル ペプチドをコードする領域を含んでいる。なお、配列番号 19に示した配列は、プロ構 造付きプロテインダルタミナーゼ遺伝子をコードする領域の 5'末端の配列を含んでい る。
[0043] 次に参考例 B— 1で得たプロティングルタミナーゼがクローンィ匕されて 、るプラスミド を铸型として、配列番号 20と配列番号 18を用いて PCRを行い、プロ構造付きプロテ イングルタミナーゼ遺伝子をコードする領域を増幅した。さらに、配列番号 14、配列 番号 19に示した配列を有するプライマーを用いて得られた PCR産物と、配列番号 20 と配列番号 18に示した配列を有するプライマーを用いて得られた PCR産物を 1： 1で 混合し、これらを铸型とし、配列番号 14と配列番号 18に示した配列を有するプライマ 一を用いてクロスオーバー PCRを実施することにより、 PS2プロモーター領域を含む配 列および SlpAシグナル配列と、プロ構造付きプロティングルタミナーゼをコードする遺 伝子との融合遺伝子を増幅した。このクロスオーバー PCR産物を制限酵素 Sealおよ び BamHIにて消化した後、ァガロースゲル電気泳動により約 1.6kbpの DNA断片を検 出した。この DNA断片をァガロースゲルより切り出し、 EasyTrapVer.2 (宝酒造社製）を 用いて回収し、特開平 9-322774記載のプラスミド pPK4の Scal-BamHI部位に挿入して プロ構造付きプロテインダルタミナーゼ発現プラスミド pPKS-PPGを構築した。構築し たプラスミドに挿入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合 遺伝子が構築されて ヽることが確認された。
[0044] (B- 3) C.glutamicumによる SlpAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロティングル タミナーゼの分泌
構築したプラスミド pPKS-PPGを用いて C.glutamicum由来の変異株より取得した YDK010株 (特許 WO01/23591記載)を形質転換し、実施例 1 (1-3)と同様に 25mg/l のカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培地で 30°Cにて 48時間培養した。培養終了後 10 μ 1の培養上清を SDS- PAGEにより分析した。 SDS- PAGEを 12.5%のゲル（第一化 薬製)を用いて行 、、クマシ一ブリリアントブルー染色および蛍光色素 SYPRO Orange (Molecular Probes社）によりタンパク染色を実施した。その結果、いずれの染 色方法においても、予想される分子量付近にバンドを検出することはできな力つた。
[0045] 実施例 3.大腸菌（E.coli)に由来する TorA (トリメチルァミン N-ォキシドレダクターゼ） シグナル配列を用 、たプロティングルタミナーゼの分泌発現
(3- 1)大腸菌に由来する TorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の取得 大腸菌に由来する TorAシグナルペプチドを含む TorA遺伝子の配列は既に決定さ れている (Mol. Microbiol. 11:1169-1179 (1994))。この配列を参考にして、配列番号 2 2 (5 ' -ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGG-3 ' )と配列番号 23 (5 '
- CCGGATCCTGGTCATGATTTCACCTG- 3，）に示したプライマーを合成し、常法 に従って（斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製した大腸 菌 W3110株の染色体 DNAを铸型として、 TorAをコードする領域およびその上流にあ るシグナル配列を含む領域を PCR法にて増幅した。 PCR反応は Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従って行 つた。なお、配列番号 23の配列は制限酵素 BamHIの認識配列を含んでいる。 TorA のシグナル配列をコードする DNA配列を配列番号 7に示す。
(3— 2) TorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロティングルタミナーゼ (PPG)の 分泌発現プラスミドの構築
国際公開パンフレット WO01/23591記載のプラスミド pPKSPTGlを铸型としてプロモ 一ターおよびシグナルペプチドをコードする領域を、配列番号 14、配列番号 24 (5' 配列を有するプライマーを用いて PCRを行うことにより増幅した。配列番号 24の配列 は、 TorAシグナルペプチドをコードする遺伝子の 5'末端の配列を含んでいる。次にこ の PCR産物、並びに、実施例 3-1で得た、配列番号 22と配列番号 23に示す配列を 有するプライマーにより増幅された TorAをコードする遺伝子配列およびその上流に あるシグナル配列を含む領域を含む PCR産物とを 1： 1で混合し、これらを铸型とし、 配列番号 14と配列番号 23に示した配列を有するプライマーによりクロスオーバー PCRを実施した。これにより PS2プロモーター領域を含む配列、 TorAシグナル配列、 および TorAをコードする配列を含む融合遺伝子が増幅された。このクロスオーバー PCR産物を制限酵素 Sealおよび BamHIにて消化した後、ァガロースゲル電気泳動に より約 3.1kbpの DNA断片を検出した。この DNA断片をァガロースゲルより切り出し、 EasyTrapVer.2 (宝酒造社製）を用いて回収し、特開平 9-322774記載のプラスミド pPK4の Seal- BamHI部位に挿入してプラスミド pPKT- TorAを得た。このプラスミドに揷 入された遺伝子配列の塩基配列を決定した結果、予想される融合遺伝子が構築さ れていることが確認された。このプラスミドを铸型とし、配列番号 14と配列番号 25 (5， す配列を有すプライマーを用いて、 PS2のプロモーター領域および TorAシグナルぺ プチドをコードする領域を含む部分を PCRにより増幅した。この PCR産物と実施例 2 ( 2-2)と同様に、配列番号 20と配列番号 18に示す配列を有するプライマーを用いた PCRにより、プロ構造付きプロティングルタミナーゼをコードする領域を増幅した。これ らの PCR産物を 1： 1で混合し、それらを铸型とし、配列番号 14と配列番号 18に示す 配列を有するプライマーを用いてクロスオーバー PCRを実施した。
この PCR産物を制限酵素 Sealおよび BamHIにて消化した後、ァガロースゲル電気泳 動を実施し、約 3.1kbpの DNA断片を検出した。この DNA断片をァガロースゲルより切 り出し、 EasyTrapVer.2 (宝酒造社製）を用いて回収し、特開平 9— 322774記載のプ ラスミド pPK4の Seal- BamHI部位に挿入してプラスミド pPKT- PPGを得た。プラスミド中 の挿入配列の塩基配列を決定し、予想される融合遺伝子ができて ヽることが確認さ れた。
[0047] (3— 3) C.glutamicumによる TorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロティングル タミナーゼの分泌
構築したプラスミド pPKT-PPGを用いて C.glutamicum由来の変異株 C. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン (Sm)而性株 AJ12036株より取得した YDK010株（特許 WO 01/23591記載）を形質転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で 生育した菌株を選択した。選択した菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培 地において 30°C、 48時間培養した。培養終了後 10 μ 1の培養上清を SDS-PAGEによ り分析した。 SDS-PAGEを 4-20%のグラジェントゲル (第一化薬製)を用いて行い、ク マシーブリリアントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される 分子量付近、約 35kDa付近にバンドを検出した。培養上清 100 /z lを逆相 HPLCにより 分析した結果、タンパク質の濃度は約 20mg/lであった。
さらに、同様に実施例 2 (2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー (ミリポア製）により 処理した後、放線菌由来プロテアーゼ SAM- P45により酵素消化してプロティングルタ ミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性 を特許開 2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプ 口ティンダルタミナーゼ活性を有していることが確認された。
なお、プロ構造付きのプロティングルタミナーゼのアミノ酸配列を配列番号 4に示す
[0048] 実施例 4. TatC欠損株の作製
(4— 1)コリネバタテリゥム 'ダルタミカム AJ12036由来 tatC遺伝子破壊株の作製 上述の IMDのシグナル配列を連結したイソマルトデキストラナーゼ、および、 TorAの シグナル配列を連結したプロティングルタミナーゼがそれぞれ Tat系によって分泌さ れて 、るかどうかを検討した。 これまでにコリネ型細菌の tat系遺伝子ホモログとして、 tatA(GENEBANK cgl03060 1571065-1571382)、 tatB(GENEBANK cgl03060 1167110-1167580)、
tatC(GENEBANK cgl03060 1569929-1570873)、 tatE(gi 41223046 emb
CAF18991.1)が存在することが明らかになっているがこれらの機能は明らかになって いない。
従って tat遺伝子を破壊することによって、上述の実施例で分泌を確認した酵素が tat系で分泌されているかどうかを確認することとした。
[0049] 以下の様に相同性組換え法を利用して YDK010株の TatC欠損株を取得した。
斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta., 72, 619(1963)]に従って調製した Corynebacterium glutamicum ATCC13869の染色体 DNAを铸型として、配列番号 26 (5 — ggcggtaccgttaagcgccctcggcgagttatct— 3 )と目 C歹 号 27 (5
— gcctctagactagagcacgtcaccgaagtcggcg— 3 に示す目 il歹 U ¾するフフィマーの糸且み合 わせを用いて PCRを行なった。
この断片を Kpnlと Xbalで消化し、プラスミド pHM1519由来の温度感受性プラスミドべ クタ一である pHS4 (米国特許第 5,616,480号）の Kpnl- Xbal部位に挿入し、 pHStatCを 構築した。プラスミド pHS4で形質転換された大腸菌 AJ12570は FERM BP-3523として 、平成 2年 10月 11日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所 (現、独立行政法 人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば巿東 1 1 1中央第 6、郵便番号 305-8566)に寄託されている。
次に pHStatCを Ndelと Sealで消化し、約 70bpの DNA断片を除去して tatC遺伝子内 部領域を欠損させ、再環状ィ匕させプラスミド pHS AtatCを構築した。このプラスミドを YDK010株にエレクト口ポレーシヨンにより導入し、 日本国特許第 2763054号に記載し た相同組換え法により tatC遺伝子欠損株、 YDK011株を取得した。
[0050] (4- 2) TatC欠損株における分泌発現
(4- 2- 1) SlpAに由来するシグナル配列を用 、たイソマルトデキストラナーゼ (IMD) 分泌発現プラスミド pPKS-IMDおよび、 IMDシグナル配列を用いた IMD分泌発現プラ スミド pPKト IMDによる形質転^ ¾における IMD分泌の比較
参考例 Aにお!/、て作製 C.ammoniagenesの細胞表層タンパク質 SlpAに由来するシグ ナル配列を有するイソマルトデキストラナーゼ分泌発現プラスミド pPKS-IMDで上述の TatC欠損株を転換形質し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した 菌株を選択することにより YDKOll/pPKS-IMD株を取得した。また、同様にして、実施 例 1で作製した IMDシグナル配列を有する IMD分泌発現プラスミド pPKI-IMDを用い て、 TatC欠損株 YDK011株を形質転換し、 YDKOll/pPKI-IMD株を取得した。取得し た両株を各々 MM培地中、 30°Cにて 48時間培養し、培養上清中の IMD分泌量の比 較を行った。両株の各々の培養上清 10 /z lを SDS-PAGEにかけて分析し、 SYPRO Orange (Molecular Probes社）を用いてタンパク染色した。その結果、
YDKOll/pPKS-IMD株の培養上清については IMDの分子量付近に非常に弱いバン ドが検出されたが、 YDKOll/pPKI-IMD株の培養上清については、 IMDの分子量付 近にバンドが検出されな力つた。
[0051] (4- 2- 2) IMDシグナル配列を用いたプロテインダルタミナーゼ分泌発現プラスミド pPKI-PPGおよび TorAシグナル配列を用 、たプロティングルタミナーゼ分泌発現プラ スミド pPKT-PPGによる形質転換株におけるプロテインダルタミナーゼ分泌の比較 実施例 2で作製した IMDシグナル配列を含む IMD分泌発現プラスミド pPKト PPGで TatC欠損株 YDK011株を形質転換し、 YDKOll/pPKI- PPG株を取得した。さらに、大 腸菌由来 Tat系シグナルである TorAシグナルを含むプロティングルタミナーゼ (PPG) 発現プラスミド pPKT-PPG (実施例 3)で TatC欠損株である YDK011株を形質転換して YDKOll/pPKT-PPG株を取得した。取得した形質転換株を最少液体培地中、 30°C にて 48時間培養し、培養上清中の PPG分泌量を分析した。
[0052] YDK011/pPKI- PPG株および YDK011/pPKT- PPG株の培養上清各 10 μ 1を
SDS-PAGEにかけ、 SYPRO Orangeにおいてタンパク染色した。その結果、
YDK011/pPKI- PPG株および YDK011/pPKT- PPG株の!/、ずれの培養上清中にも、 分子量 35kDa付近に PPGのバンドを検出できなかった。
次に、プロティングルタミナ一ゼをゥサギに免疫して抗プロテインダルタミナーゼポリ クローナル抗体を作製した。このポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロッテイン グを行つた結果、実施例 2及び 3で作製した YDK010/ρΡΚΙ-PPG株および
YDK010/pPKT- PPG株のどちらの培養上清中にもバンドが検出された力 一方、 YDKOll/pPKI- PPG株、および YDKOll/pPKT- PPG株のどちらの培養上清中にも PPGのバンドは検出されなカゝつた。さらに培養後のそれぞれの菌体を超音波で破砕 し、菌体内のタンパクについて SDS-PAGE分析を実施した。培養上清について行つ たように、各形質転換菌株の菌体内のタンパクについてもウェスタンブロッテイングを 実施した結果、 YDK011/pPKI- PPG株および YDK011/pPKT- PPG株由来の菌体破 砕物に関して、いずれも分子量 35kDa付近に PPGのバンドが検出された。
[0053] IMDシグナルおよび TorAシグナルを用いた場合には、正常 TatCを有する各形質転 の培養上清中には PPGまたは IMDタンパク質が分泌される力 各形質転換 TatC 欠損株の培養上清中には PPGタンパク質または IMDタンパク質が分泌されな力つたと V、う上述の結果は、 IMDシグナルおよび TorAシグナル力Tat経路による IMDまたは PPGの分泌に関与することを示して 、る。
[0054] 実施例 5. Corynebacterium glutamicum ATCC13869におけるプロティングルタミナ一 ゼの分泌発現
(5— 1) TorAシグナル配列を用いた、プロ構造付きプロティングルタミナーゼの C. glutamicumからの分泌、
実施例 3 (3- 2)で構築したプラスミド pPKT-PPGを用いて C. glutamicum ATCC13869、および C. glutamicum ATCC13869のストレプトマイシン (Sm)而性変異 株 AJ12036株より取得した YDK010株 (WO 01— 23591記載)を形質転換し、実施例 1 (1— 3)と同様に 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した菌株を選 択した。選択した両菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培地にお!、て 30°C にて 48時間培養した。培養終了後 10 /z 1の培養上清を SDS-PAGEにより分析した。 SDS-PAGEを 4-20%のグラジェントゲル（第一化薬製）を用いて行 、、クマシーブリリア ントブルー染色によりタンパク染色を実施した。その結果、どちらの菌株の培養上清 中にも、予想される分子量約 35kDaの位置にバンドが検出された。それぞれの培養 上清 100 1を逆相 HPLCによりタンパク質濃度を分析した結果、 pPKT-PPGを保持す る C. glutamicum YDK010株の培養上清中のタンパク質濃度は約 20mg/lであり、同じ pPKT-PPGを保持する C. glutamicum ATCC 13869株の培養上清中のタンパク質濃 度は約 70mg/lであった。 さらに、同様に実施例 2 (2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー (ミリポア製）により 処理した後、放線菌由来プロテアーゼ SAM- P45により酵素消化してプロティングルタ ミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したプロテインダルタミ ナーゼの活性を特許開 2000-50887記載の方法によって測定し、分泌されたタンパク 質が実際にプロテインダルタミナーゼ活性を有していることを確認した。
[0055] 実施例 6. Tat系分泌装置の増幅による E.coliに由来する TorAシグナル配列を用いた プロテインダルタミナーゼ分泌量に及ぼす効果
(1) TatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumの TatCをコードする遺伝子配列の 5'上流域に TatAをコードする遺伝 子が存在する。その tatA遺伝子の上流のプロモーター領域を含む遺伝子配列を PCR法において増幅した。斎藤、三浦らの方法により調整した
C.glutamicumATCC13869の染色体 DNAを铸型とし、配列番号 33 (5，
-GCTTGATCATTCCTTTAAGG- 3)と配列番号 34 (5' 列のプライマーを用いた。配列番号 34は tatCの 5'末端の配列を含んでいる。また TatCをコードする遺伝子を増幅するため C.glutamicumATCC13032における tatCの 遺伝子配列 (配列番号 35)を参考に、プライマー配列番号 36 (5'
-ATGTCCATTGTTGAGCACATC- 3 ' )と配列番号 37 (5 '
-CTAGAGCACGTCACCGAAGT- 3，）を作成し PCR法にて増幅した。さらに、配列 番号 33と配列番号 34により増幅した PCR産物と、配列番号 36と配列番号 37を用い て増幅した PCR産物を 1： 1で混合して铸型とし配列番号 33と配列番号 37によりクロ スオーバー PCRを行なって tatAのプロモーター領域と TatCをコードする遺伝子の融 合遺伝子を増幅させた。この PCR産物をァガロースゲル電気泳動により、約 1. 8kb の DNA断片を回収した、回収した DNA断片を特開平 9— 070291記載のプラスミド pVC7の Smal部位に挿入することによって、 TatC発現プラスミド pVtatCを構築した。構 築したプラスミドは実施例 1と同様の方法で挿入部分の塩基配列を確認した。
[0056] (2) TatAおよび TatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumATCC13869の染色体 DNAを铸型とし、配列番号 33と配列番号 37に示 した配列のプライマーを用いて TatAをコードする遺伝子配列とその 5 '上流域、さらに TatCをコードする遺伝子配列を含んだ領域を PCR法により増幅した。この PCR産物を ァガロースゲル電気泳動により、約 2. 4kbの DNA断片を回収した。回収した DNA断 片を特開平 9-070291記載のプラスミド pVC7の Smal部位に挿入することによって、 TatAおよび TatC発現プラスミド pVtatACを構築した。構築したプラスミドは実施例 1と 同様の方法で挿入した遺伝子の塩基配列を確認した。その結果、 tatAの塩基配列 は C.glutamicumATCC13032における tatAの予測配列と若干異なっていることが判明 した。この TatAをコードする遺伝子配列とその 5 '上流域、さらに TatCをコードする遺 伝子配列を配列番号 38に記載した。
[0057] (3) TatA, TatBおよび TatC発現プラスミドの構築
C.glutamicumATCC13032で予想されている TatBをコードする遺伝子配列を含む領 域とさらにその 5'上流域を、下記の配列番号 39 (5'
-GAGGCGCTGCCTGAAGATTA- 3， )と配列番号 40 (5，
-GACAGGTGAAGAGGTCAAGG- 3' )に示した配列のプライマーを用いた PCR法 により増幅した。増幅した PCR産物をァガロースゲル電気泳動により、約 1. 7kbの DNA断片を回収した。回収した DNA断片を特開平 9— 070291記載のプラスミド pVC7の Smal部位に挿入することによって、 TatB発現プラスミド pVtatBを構築した。構 築したプラスミドは実施例 1と同様の方法で挿入した DNA断片の塩基配列を確認した 。 TatBをコードする遺伝子配列とさらにその 5'上流域の遺伝子配列を配列番号 41に 記載した。この TatB発現プラスミド pVtatBを制限酵素 Kpnlで消化し、ァガロースゲル 電気泳動により約 1. 5kbの DNA断片を回収した。この DNA断片は tatBのプロモータ 一領域と TatBをコードする遺伝子配列を含んで 、る。この断片を実施例 6(2)で作製 したプラスミド pVtatACの Kpnl部位に挿入することにより TatA、 TatBおよび TatCを発 現するプラスミド pVtatABCを構築した。
[0058] (4) Tat系分泌装置増幅株によるプロテインダルタミナーゼ分泌発現
C.glutamicumATCC13869に実施例 3 (3— 2)で作製したプロ構造付きプロティング ルタミナーゼ発現プラスミド pPKT-PPGにより形質転換した菌株 13869/pPKT-PPGを 作製した。さらに上記のプラスミド pVtatC、 pVtatAC、 pVtatABC各々により形質転換 し、カナマイシン 25mg/lおよびクロラムフエ-コール 5mg/lを含む CM2G寒天培地にお いて生育する菌株を選択し、 13869/pPKT-PPG/pVtatC , 13869/pPKT-PPG /pVtatAC、 13869/pPKT-PPG /pVtatABCを得た。これらの株をカナマイシン 25mg/l およびクロラムフエ-コール 5mg/lを含む MM培地にお!、て 30°C48時間培養した。培 養終了後の培養上清 10 1を実施例 2 (2— 3)に記載した方法で SDS-PAGEによる分 析を実施した結果、 Tat系分泌装置を増幅した 13869/pPKT-PPG/pVtatC、
13869/pPKT- PPG/pVtatAC、 13869/pPKT- PPG/pVtatABCは、 Tat系分泌装置増 幅前の菌株 13869/pPKT-PPGに比較し著し!/、分泌量の増加を認めた。それぞれの 上清を逆相 HPLCにおいて実施例 2に記載した条件により分析した結果、
13869/pPKT- PPGに対し 13869/pPKT- PPG/pVtatCゝおよび
13869/pPKT- PPG/pVtatACで約 3倍、 13869/pPKT- PPG/pVtatABCで約 10倍の分 泌量向上が認められた。
実施例 7. Tat系分泌装置増幅による Arthrobactor globiformisに由来する IMDシグ ナルを用いたトランスダルタミナーゼの分泌量に及ぼす効果
(1) Arthrobactor globiformisに由来する IMDシグナルを用 、たトランスグルタミナ一 ゼの分泌発現プラスミドの作製
実施例 1により作製した IMDシグナルを用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌発現 プラスミド pPKI-IMDを铸型とし、配列番号 14と配列番号 42 (5' 配列のプライマーにより、 IMDシグナル配列とその 5'上流域の CspBプロモーターを含 んだ領域を増幅した。配列番号 42は IMDシグナル配列の C末端側をコードする遺伝 子配列とトランスダルタミナーゼのプロ配列の N末端側をコードする配列を含んでいる 。また pPKSPTGl (WO- 01/23591記載）を铸型とし配列番号 43 (
5し GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3'；)と配列番号 44 (
5'- GACAATGGCGCGGGGGAAG- 3' )に示した配列のプライマーを用いて PCRを 行ない、プロ構造付きトランスダルタミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配 列番号 14と配列番号 42に示した配列のプライマーにより増幅された PCR産物と、配 列番号 43と配列番号 44に示した配列のプライマーにより増幅された PCR産物を 1： 1 で混合して铸型とし、配列番号 14と配列番号 44に示した配列のプライマーを用いた クロスオーバー PCRを行な 、、 CspBプロモーターと IMDシグナルとプロ構造付きトラン スグルタミナーゼをコードする遺伝子の融合遺伝子を増幅した。この PCR産物を制限 酵素 Sealおよび Eco065Iにおいて切断し、ァガロースゲル電気泳動において約 700bpの遺伝子断片を回収した。この回収した DNA断片を pPKSPTGl (
WO- 01/23591記載）の ScaI-Eco065I領域に挿入することによりプロ構造付きトランス ダルタミナーゼ発現プラスミド pPKト PTG1を作製した。作製したプラスミドの塩基配列 は実施例 1に記載の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されていること を確認した。
[0060] (2) Tat系分泌装置増幅株による IMDシグナルを用いたトランスダルタミナーゼの分 泌発現
(1)で作製したプラスミド pPKト PTG1により C.glutamicumATCC 13869を形質転換した 菌株 13869/pPKIPTGlを作製した。この菌株をさらに実施例 6 (3)で作製した Tat分泌 装置 TatA、 TatBおよび TatC発現プラスミ pVtatABCにより形質転換後、カナマイシン 25mg/lおよびクロラムフエ-コール 5mg/lを含む CM2G寒天培地において生育する菌 株を選択し、 Tat系分泌装置増幅株 13869/pPKI-PTGl/pVtatABCを得た。
13869/pPKI- PTG 1と 13869/pPKI- PTG 1 /pVtat ABCをカナマイシン 25mg/lおよびク 口ラムフエ-コール 5mg/lを含む MM培地にお!、て 30°Cにて 48時間培養した。培養終 了後、培養上清を実施例 2(2— 3)に記載した方法で SDS-PAGEを実施した結果、 2256/pPKI- PTG1に比較し 2256/pPKI- PTGl/pVtatABCでプロ構造付きトランスグル タミナーゼの分泌量の増加が確認された。さらに培養上清を参考例 A-3に記載した 条件にお 1ヽて逆相 HPLCで定量した結果、 Tat系分泌装置増幅株にお ヽて分泌量は 約 7倍であった。
[0061] 実施例 8. Tat系分泌装置増幅による E.coliに由来する TorAシグナルを用いたトラン スグルタミナーゼの分泌量に及ぼす効果
( 1 ) E. coliに由来する Tor Aシグナルを用いたトランスダルタミナーゼの分泌発現プラ スミドの構築
実施例 3 (3— 2)により作製した TorAシグナルを用いたプロティングルタミナーゼ分 泌発現プラスミド pPKT- PPGを铸型とし、配列番号 14と配列番号 45 (5' 列のプライマーにより、 TorAシグナル配列とその 5'上流域の CspBプロモーターを含 んだ領域を増幅した。配列番号 45に記載の配列は TorAシグナル配列の C末端側を コードする遺伝子配列とトランスダルタミナーゼのプロ配列の N末端側をコードする配 列を含んでいる。また pPKSPTGl (WO- 01/23591記載）を铸型とし、配列番号 43と配 列番号 44に示した配列のプライマーを用いて PCRを行 、、プロ構造付きトランスダル タミナーゼをコードする遺伝子配列を増幅した。配列番号 14と配列番号 45に示した 配列のプライマーで増幅された PCR産物と、配列番号 43と配列番号 44に示した配 列のプライマーで増幅された PCR産物を 1:1で混合して铸型とし、配列番号 14と配列 番号 44に示した配列のプライマーによりクロスオーバー PCRを行ない、 CspBプロモ 一ターと TorAシグナルとプロ構造付きトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の融 合遺伝子を増幅した。この PCR産物を Sealおよび Eco065Iにおいて切断し、ァガロー スゲル電気泳動にぉ 、て約 700bpの遺伝子断片を回収した。この回収した DNA断片 を pPKSPTGl (WO- 01/23591記載）の Seal- Eco065I領域に挿入することによりプロ構 造付きトランスダルタミナーゼ発現プラスミド pPKT-PTGlを作製した。作製したプラス ミドの塩基配列は前述の方法により決定し、予想通りの融合遺伝子が構築されている ことを確認した。
(2) Tat系分泌装置増幅株による TorAシグナルを用いたトランスダルタミナーゼの分 泌発現
実施例 8(1)で作製したプラスミド pPKT- PTG1により C.glutamicumATCC13869を形 質転換した菌株 13869/pPKTPTGlを作製した。この菌株をさらに実施例 8で作製した Tat分泌装置 TatA、 TatBおよび TatC発現プラスミド pVtatABCにより形質転換後、力 ナマイシン 25mg/lおよびクロラムフエ-コール 5mg/lを含む CM2G寒天培地において 生育する菌株を選択し、 Tat系分泌装置増幅株 13869/pPKTPTGl/pVtatABCを得た
13869/pPKT- PTG1と 13869/pPKT- PTGl/pVtatABCをカナマイシン 25mg/lおよび クロラムフエ-コール 5mg/lを含む MM培地にお!、て 30°Cで 48時間培養した。培養終 了後、培養上清 10 1を実施例 2(2— 3)に記載した方法で SDS-PAGEを実施した結 果、 13869/pPKT- PTG1に比較し 13869/pPKT- PTGl/pVtatABCでプロ構造付きトラ ンスダルタミナーゼの増加が確認された。また、培養上清を参考例 A-3に記載したの と同条件の逆相 HPLCで定量した結果、 Tat系分泌装置増幅株にぉ 、て分泌量は約 40倍であった。
[0063] 実施例 9. TorAシグナル配列を用いたプロティングルタミナーゼの分泌におけるプロ 配列 C末端の変更
(1)プロティングルタミナーゼのプロ配列 C末端の変更
実施例 3及び 5において活性が確認されたプロティングルタミナーゼの N末端アミノ 酸配列を解析したところ、天然型プロティングルタミナーゼと比較して 2アミノ酸が付 カロした配列 (NKLASV)であった。そこで、天然型プロティングルタミナーゼの N末端 配列と同じ配列にもつようにプロ配列の切断が行われるよう、プロ配列の C末端配列 の変更を行った。天然型プロティングルタミナーゼのプロ配列の C末端は" QTNK"で あるが、 SAM- P45で切断されやすいと予想される" FGPK"、 subtilisinを主成分とする アルカラーゼ (Novozymes)で切断されやすいと予想される" FGPF"、 "FAPF"、 "FAPY "、 "AHAY"、 "AHAじ，、 "AAPF"、 "AAPY"、 "AAPM"に変更した。 "FGPK"への変更 は、配列番号 50 (CTT GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配 列番号 51 (TTC GGC CCC AAG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)に示す配 列を有するプライマーを用いた。配列番号 50の配列は、プロ配列部分を増幅するた めのプライマー、配列番号 51の配列は、成熟体部分を増幅するためのプライマーで ある。実施例 3 (3— 2)にて構築したプラスミド pPKT- PPGを铸型として、配列番号 20 と配列番号 50に示す配列を有するプライマーを用いてプロティングルタミナーゼの プロ配列部分を、配列番号 51と配列番号 18に示す配列を有するプライマーを用い てプロティングルタミナーゼの成熟体部分をそれぞれ増幅した。さら〖こ、これらの PCR 産物を 1： 1で混合し、これらを铸型として配列番号 20と配列番号 18に示す配列を有 するプライマーを用いてクロスオーバー PCRを実施することにより、プロ配列 C末端が FGPKに変更されたプロ構造付きプロテインダルタミナーゼ遺伝子を増幅した。
[0064] このクロスオーバー PCR産物を pUC18の Smalサイトにクローユングし (pUCPPG(FGPK))、塩基配列の確認を行ったところ、 pro配列が変更されていた。次 に、 pPKT- PPGの Aatll- BstPI断片 (大)と pUCPPG(FGPK)の Aatll- BstPI断片 (小)を連 結して、 pPKT-PPG(FGPK)を構築した。同様に、 "FGPF"への変更は配列番号 52 ( GAA GGG GCC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 53 ( TTC GGC CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 "FAPF"への変更は配列 番号 54 (GAA GGG CGC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 55 (TTC GCG CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 "FAPY，，への変 更は酉己歹 U番号 56 (GTA GGG CGC GAA GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と 配列番号 57 (TTC GCG CCC TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 " AHAY"への変更は配列番号 58 (GTA CGC GTG CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 59 (GCG CAC GCG TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT) , "AHAじ，への変更は配列番号 60 ( CAA CGC GTG CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 61 (GCG CAC GCG TTG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 "AAPF"への変更は配列番号 62 (GAA GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 63 (GCG GCG CCC TTC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 "AAPY"への変更は配列番号 64 (GTA GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 65 (GCG GCG CCC TAC TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)、 "AAPM"への変更は配列番号 66 (CAT GGG CGC CGC GCC CTT GAC TTC TTT GGT CAG)と配列番号 67 (GCG GCG CCC ATG TTG GCG TCC GTC ATT CCA GAT)に示す配列を有するプライマー を用いた。配列番号 52、 54、 56、 58、 60、 62、 64、 66の配列は、プロ配列部分を 増幅するためのプライマー、配列番号 53、 55、 57、 59、 61、 63、 65、 67の配列は、 成熟体部分を増幅するためのプライマーである。実施例 3 (3— 2)にて構築したブラ スミド pPKT-PPGを铸型として、配列番号 20と配列番号 52に示す配列を有するプラ イマ一を用いてプロティングルタミナーゼのプロ配列部分を、配列番号 53と配列番 号 18に示す配列を有するプライマーを用いてプロティングルタミナーゼの成熟体部 分をそれぞれ増幅した。さら〖こ、これらの PCR産物を 1 : 1で混合し、これらを铸型とし て配列番号 20と配列番号 18に示す配列を有するプライマーを用いてクロスオーバ 一 PCRを実施することにより、プロ配列 C末端が FGPFに変更されたプロ構造付きプロ ティングルタミナーゼ遺伝子を増幅した。このクロスオーバー PCR産物を pUC18の Smalサイトにクローユングし (pUCPPG(FGPF))、塩基配列の確認を行ったところ、 pro 配列が変更されていた。次に、 pPKT- PPGの Aatll- BstPI断片 (大)と pUCPPG(FGPF) の Aatll- BstPI断片 (小)を連結して、 pPKT- PPG(FGPF)を構築した。同様の手順で、 pPKT- PPG(FAPF)、 pPKT- PPG(FAPY)、 pPKT- PPG(AHAY)、 pPKT- PPG(AHAL)、 pPKT- PPG(AAPF)、 pPKT- PPG(AAPY)、 pPKT- PPG(AAPM)を構築した。
[0065] (2)プロ配列 C末端を" FGPK"に変更したプロティングルタミナーゼの分泌発現
構築したプラスミド pPKT-PPG(FGPK)を用いて、 C. glutamicum ATCC13869を形質 転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。 選択した菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培地にお!、て 30°C、 48時間培 養した。培養終了後 10 1の培養上清を SDS- PAGEにより分析した。 SDS- PAGEを 4-20%のグラジェントゲル (第一化薬製)を用いて行 、、クマシ一ブリリアントブルー 染色によりタンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約 35kDa付 近にバンドを検出した。培養上清 100 1を逆相 HPLCにより分析した結果、タンパク質 の濃度は約 20mg/lであった。
さらに、同様に実施例 2 (2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー (ミリポア製）により 処理した後、放線菌由来プロテアーゼ SAM- P45により酵素消化してプロティングルタ ミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタンパク質の活性 を特許開 2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパク質が実際にプ ロテイングルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成熟化したタンパク 質の N末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じ LASVであることが確認された 。更に、成熟化を行う際の酵素として、 trypsinやプロテアーゼ M (天野ェンザィム）を 用いた場合にも、天然型と同じ N末端を生じることが確認された。
[0066] (3)プロ配列 C末端を変更したプロティングルタミナーゼの分泌発現とアルカラーゼ による成熟化
構築したプラスミド pPKT-PPG(FGPF)、 pPKT- PPG(FAPF)、 pPKT- PPG(FAPY)、 pPKT- PPG(AHAY)、 pPKT- PPG(AHAL)、 pPKT- PPG(AAPF)、 pPKT- PPG(AAPY)、 pPKT-PPG(AAPM)を用いて、それぞれ C. glutamicum ATCC13869を形質転換し、 25mg/lのカナマイシンを含む CM2G寒天培地で生育した菌株を選択した。選択した 各菌株を 25mg/lのカナマイシンを含む MM液体培地にお!、て 30°C、 48時間培養した 。培養終了後 10 1の培養上清を SDS- PAGEにより分析した。 SDS- PAGEを 4- 20%の グラジェントゲル (第一化薬製)を用いて行い、クマシ一ブリリアントブルー染色により タンパク染色を実施した。その結果、予想される分子量付近、約 35kDa付近にバンド を検出した。培養上清 100 1を逆相 HPLCにより分析した結果、タンパク質の濃度は 約 20mg/lであった。
さらに、同様に実施例 2 (2-2)と同様に培養上清をウルトラフリー (ミリポア製）により 処理した後、 subtilisin (Sigma)またはアルカラーゼ（Novozymes)により酵素消化して プロティングルタミナーゼのプロ構造部を切断し、成熟化を行った。この成熟化したタ ンパク質の活性を特許開 2000-50887記載の方法を用いて測定し、分泌されたタンパ ク質が実際にプロテインダルタミナーゼ活性を有していることが確認された。また、成 熟化したタンパク質の N末端アミノ酸配列を解析した結果、天然型と同じ LASVである ことが確認された。
本発明により、コリネ型細菌においてタンパク質分泌経路である Sec系では分泌させ ることが困難であった産業上有用な異種タンパク質、例えば、イソマルトテキストラナ ーゼ、プロティングルタミナーゼ、を効率的に生産および菌体外に分泌 (分泌生産） させることができる。すわなち、本発明によって、 Sec系分泌経路によっては、分泌生 産が困難であった異種タンパク質を効率的に製造する方法が提供される。
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配列番号 11〜27、 33、 34, 36, 37、 39, 40、 42〜45、 50〜67：合成オリゴヌク レオチド

Claims

請求の範囲
[I] 5'から 3 '方向に、コリネ型細菌中で機能するプロモーター配列、 Tat系依存シグナ ルペプチド領域をコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列 を含む発現遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、前記異種タンパク質を前 記コリネ型細菌に産生および分泌させることを特徴とする、異種タンパク質の製造方 法。
[2] シグナルペプチドが配列番号 31または 32記載の配列を含む、請求項 1記載の方法
[3] シグナルペプチドが配列番号 28〜30記載のいずれかの配列を含む、請求項 1記載 の方法。
[4] シグナルペプチドがイソマルトデキストラナーゼのシグナルペプチドである請求項 1 記載の方法。
[5] イソマルトデキストラナーゼのシグナルペプチドが配列番号 6記載のアミノ酸配列を 含むペプチドである請求項 4記載の方法。
[6] シグナルペプチドがトリメチルァミン N-ォキシドレダクターゼのシグナルペプチドで ある請求項 1記載の方法。
[7] トリメチルァミン N—ォキシドレダクターゼのシグナルペプチドが配列番号 8記載の アミノ酸配列を含むペプチドである請求項 6記載の方法。
[8] 異種タンパク質がプロテインダルタミナーゼである請求項 1〜7の 、ずれか 1項記載 の方法。
[9] 異種タンパク質力イソマルトデキストラナーゼである請求項 1〜7のいずれか 1項記 載の方法。
[10] コリネ型細菌が、 tat系分泌装置をコードする 1以上の遺伝子が増幅された株である 請求項 1〜9のいずれか 1項記載の方法。
[II] tat系分泌装置をコードする遺伝子力 tatA、 tatB、 tatC及び tatEからなる群より選ば れる、請求項 10記載の方法。
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