WO2005079835A1

WO2005079835A1 - Ｂｌアンジオスタチンを含む制がん剤

Info

Publication number: WO2005079835A1
Application number: PCT/JP2004/002124
Authority: WO
Inventors: Keiji Hasumi; Kosuke Shimizu; Tetsuro Yamamoto
Original assignee: Ttc Co., Ltd.
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2005-09-01
Also published as: AU2004316095A1; CA2557154A1; JPWO2005079835A1; US20110092442A1

Abstract

　本発明は、ＢＬアンジオスタチンを有効成分として含む制がん剤及びその製造方法を提供する。

Description

明細書

B Lアンジォスタチンを含む制がん剤技術分野

本発明は B Lアンジォスタチンを含む制がん剤及びその製造方法に関する。背景技術

血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジォスタチンが知られている。アンジォスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約 4 0, 000のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（M.S. O'Reilly et al.， Cell, 79, 315-328(1994))。

アンジォスタチンには、（1 ) プラスミノーゲンをエラスターゼで加水分解したもの（M.S. O'Reilly et al. , ature Medicine, 2, 689-692 (1996) ) 及び (2) 遺伝子組換え技術を用いて酵母に直接生産させたもの（B.K. Sim et al. , Cancer Research 57, 1329-1334 (1997)) の 2種類が知られていた。

しかし、（1 ) では、エラスターゼの基質特異性の低さのため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジォスタチンを選択的に生成させることが困難であることから、アンジォスタチンの活性が低いという欠点があった。また、

(2) では、アンジォスタチンの精製が困難であり、高コストであり、また、水に対する溶解性が低いという問題があつた。

最近、 Bacillus megaterium A9542株が産生するプロテアーゼであるバシロライシン MAを用いて、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断したアンジォスタチン様断片（主に G 1 u¹— S e r⁴⁴¹、以降、「B Lアンジォスタチン」と記載する。）が開発された。（特開 2 0 0 2— 2 7 24 5 3号公報）。ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は公知であり、 S W I 3 3 ? 1 〇丁に受入番号？ 00 74 7として登録されている。なお、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列は、シグナルペプチド（Me t ¹— G l y ¹⁹) を含むものであるため、本出願では、シグナルペプチドを除外した成熟ポリペプチド、すなわち、 G l u¹— A s n ⁷⁹¹のアミノ酸配列に基づくアミノ酸番号でアミノ酸位置を示した。

また、組換えアンジォスタチンは、天然型に比べて物理的性質と活性にばらつきがあり、これは異種生物での発現の過程でのタンパク質フォールディングの差に基づく立体構造の変化、糖鎖修飾の差などが原因と考えられる（Cao, Y.， Int

J Biochem Cell Biol 33, 357-69 (2001)、 Dell' Eva, R.， et al. , Endothelium

9, 3-10 (2002))。また、同様の原因により、組換えタンパク質の溶解性が低いことも指摘されている。これらの点で、組換え体と比較して、酵素法により生産される天然型が有利である。

しカゝし、タンパク質解酵素の基質認識が特異性であることから、プラスミノーゲンから選択的にアンジォスタチンを生成することは、極めて困難であり、多くの副産物を生成するという欠点があった。

また、すべての巿販ェラスタ一ゼ標品が活性のあるアンジォスタチンを生産することができるわけではなく、切断、その後の処理によってアンジォスタチンを変性させる可能性も示唆されている（O'Reilly et al. , Nat Med 2, 689-92

(1996))。

バシロライシン MAは、プラスミノーゲンを極めて選択的に切断し、 BLアンジォスタチン（主生成物として G 1 u ¹から S e r ⁴⁴¹のアミノ酸配列を有するフラグメント、微量生成物として、 P h e ⁷⁵から S e r ⁴⁴¹、 G l u ¹から V a 1⁴⁴9、および P h e ⁷⁵から V a 1⁴⁴⁹のアミノ酸からなるフラグメント）を生じせしめる（特開 2002— 272453号公報）。

更に発明者らは、バシロライシン MA固定化リアクター（ァフイエティートラップリアクター）を開発し、ヒト血漿から 1段階のステップで G 1 u ¹から S e r ⁴⁴¹のアミノ酸配列を有するフラグメントを主成分とするプラスミノーゲンフラグメントの製造技術を開発し（？〇丁】？ 03 003 38)、製造時間の短縮とコスト削減を達成した。

組換えアンジォスタチンは L e u⁷⁴から L e u ⁴⁵¹のアミノ酸からなるプラスミノーゲンの内部フラグメントである（Sim, B. K. et al. Cancer Res 57, 1329-34 (1997)) のに対し、 BLアンジォスタチンは、上述のようにアンジォスタチンとは異なる構造を有するが、アンジォスタチンと同様の抗血管内皮細胞作用をもつ。

特に、主生成物である G 1 u ¹から S e r ^{4 4 1}のァミノ酸配列を有するフラグメント、更に G 1 u ¹から V a 1 ^{4 4 9}のァミノ酸配列を有するフラグメントは、プラスミノ一ゲンの N末端側を含むものである。

プラスミノーゲンの N末端ペプチド（G 1 u ¹から G 1 u ^{8 3} ) は親水性アミノ酸に富み、 N末端べプチドの有無の差は B Lアンジォスタチンとアンジォスタチンとの間に、溶解性などの物理的特性だけではなく、生体内での活性、動態などにも差異をもたらすと考えられる。

しかし、 B Lアンジォスタチンが、実際に、インビボでの制がん効果を有するとの報告はまだなされておらず、安価で、水に対する溶解性が高く、かつ、優れた制がん性を有する制がん剤及びその製造方法の開発が待たれている。

本発明者は、上記の B Lアンジォスタチンのがんに対する効果について鋭意研究を行なった結果、驚くべきことに、 B Lアンジォスタチンが極めて優れた制がん効果を有し、かつ、水に対する溶解性が高いことから、静脈内投与によっても格別の制がん効果を奏することを発見して、本発明を完成するに至った。

また、本発明者は、 B Lアンジォスタチンの製造の際に、バシロマイシン MA による自己消化の阻害剤であるイソプロピルアルコールを用いないでも、効率よく B Lアンジォスタチンを得ることができることを発見して、本発明を完成するに至った。発明の開示

本発明は、 B Lアンジォスタチンを有効成分として含む制がん剤及びその製造方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、ァフイエティートラップリアクターにより精製した B Lアンジォスタチンを示す。レーン 1は、得られた B Lアンジォスタチンである。レーン 2は、バシロライシン MA ( 5 nM)、プラスミノーゲン（3 M) を 1 0 0 mMN a C l、 0. 0 1 %Tw e e n 8 0、 1 mM C a C 1 ₂を含む 5 0 mM トリス塩酸（pH 7. 4) 1 0 1 中で37 、 60分間インキュベートした後、 Ι Ο μΙ のサンプル緩衝液（4%SDS、 1 0% 2—メルカプトエタノール、 20%スクロース、 0. 004 %ブロモフエノールブルーを含む 1 2 5mM トリス塩酸緩衝液、 pH 6. 8) を加えレーン 1と同様に分析した。

図 2は、皮下移植ルイス肺がんの増殖に対する B Lアンジォスタチンの効果 (腫瘍体積の推移）を表す。 X軸はルイス肺がんを移植してからの日数（日）であり、 Y軸は腫瘍体積（讓 ³) である。 ·は、対照群を、 ▲、騸、 X及び♦は、それぞれ、 BLアンジォスタチン 0. 3、 1、 3及び 1 Omg/kg/day 処理群を表し、それぞれの値は、各群 8例の平均値土標準偏差を表す。 D u n n e t tの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は *印を付してある。 * (P < 0. 05)、 * * (p < 0. 01)

図 3は、皮下移植ルイス肺がんの増殖に対する B Lアンジォスタチンの効果 (腫瘍湿重量）を表す。 X軸は B Lアンジォスタチンの用量（mg/kg/day) であり、 Y軸は腫瘍湿重量（mg) である。それぞれの値は、各群 8例の平均値土標準誤差を表す。 Du n n e t tの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は *印を付してある。 * (p < 0. 05)、 * * (p < 0. 01)

図 4は、ルイス肺がん皮下移植動物の体重に対する B Lアンジォスタチンの影響を表す。 X軸はルイス肺がんを移植してからの日数（日）であり、 Y軸は体重 (g) である。參は対照（生理食塩水）処理群であり、 ▲は、アンジォスタチン

0. 3 mg/kg/day 処理群であり、醒は、アンジォスタチン 1 mg/kg/day 処理群であり、 Xは、アンジォスタチン 3 mg/kg/day 処理群であり、 ♦は、アンジォスタチン 1 Omg/kg/day 処理群である。それぞれの値は、各群 8例の平均値土標準誤差を表す。 Du n n e t tの多重比較検定で、対照群と比較して統計的に有意な差は *印を付してある。 * (pく 0. 05)、 * * (p < 0. 01)

図 5は、腫瘍の病理組織像及び V o n W i 1 1 e b r a n d因子免疫染色像を表す。対照群（腫瘍長径 8. 2mm、短径 7. 8 mm) (A、 B、 C、 D) 、 3mg/kg 投与群（腫瘍長径 7. 0隨、短径 5. 6讓）（E、 F、 G、 H) および 10 mgZk g投与群（腫瘍長径 4. 4 mm、短径 2. 8 mm) ( 1、 J、：、 L) の代表例を示す。 D、 Hおよび Lは V o n Wi l l e b r a n d因子免疫染色、それ以外はへマトキシリン 'ェォシン染色。倍率は、 5倍（A、 E、 1 )、 25倍（B、 F、 J)、 1 00倍（C、 G、 K)、および 50倍（D、 H、 L)₀ 発明を実施するための最良の形態

本発明の B Lアンジォスタチン

本発明の B Lアンジォスタチンは、プロテアーゼ、特に、バチラスメガテリゥム（Bacillus megaterium) A 9542が産生する酵素であるバシロライシン MA (BLMA) を用いてプラスミノーゲンを処理することによって得ることができる。バチラスメガテリゥム（Bacillus megaterium) A 9542は、産業技術総合研究所生命工学研究所の特許生物寄託センターに平成 1 3年 3月 2 1 日に受託番号 FERM P— 1 8268として寄託されている。 B LMAのアミノ酸配列は、特開 2002— 272453に開示されている。

BLMAは、ヒトプラスミノーゲンの S e r ⁴⁴¹— V a 1⁴⁴²、 L e u⁷⁴— P h e ⁷⁵及び V a 1⁴⁴⁹ -L e u ⁴⁵⁰の間を切断し、 G l i^— S e r ⁴⁴¹ G 1 u ¹— Va l ⁴⁴⁹、 P h e ⁷⁵— S e r ⁴⁴¹、 P h e ⁷⁵— V a 1⁴⁴⁹の 4種類のァンジォスタチン様活性を有する断片を生成することが知られている。

本発明の制がん剤としては、上記の 4つのアンジォスタチン様断片の 1種類以上を単独でか又は組み合わせて用いることができるが、特に、 G l u¹— S e r

⁴⁴¹が好ましく用いられる。

プラスミノーゲンは、哺乳動物、特にヒトゃゥシにおいて、そのアミノ酸配列が高度に保存されていることが知られている。したがって、本発明の BLアンジォスタチンの製造のための原料としてのプラスミノーゲンは、哺乳動物に由来するものであればあらゆるものを用いることができ、特に、ヒトゃゥシ由来のプラスミノーゲンが好ましい。

また、本発明の B Lアンジォスタチンは、化学合成又は遺伝子組み換え技術によっても製造することができる。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、遺伝子組み換え技術による製造が好ましい。本発明の BLアンジォスタチンを製造するには、該タンパク質をコードする塩基配列を有する DNAを作製し、これを好適な発現系に導入することにより目的タンパク質を製造することができる。

本発明の B Lアンジォスタチンの塩基配列を有する DNAは、ヒト由来（例えば、 He pG 2細胞由来など）の c DNAライブラリ一を、 BLアンジォスタチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマー又はプローブを用いてスクリーユングすることにより入手できる。スクリーニングはプラークハイブリダィゼーシヨン等で行うことができる。あるいは、ヒト由来（例えば、 He p G2細胞由来など）の c DNAライブラリーを铸型として使用し、上記塩基配列の情報に基づいて設計した好適なプライマーを用いて P

CRを行うことにより、目的遺伝子を直接クローニングすることもできる。組み換えタンパク質を発現させるための発現系（遺伝子を含む発現べクタ一とその宿主）は当業者に公知である。 DN Aを宿主細胞中で発現させるためには、まず、該 DNAを発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入し、次いでこの組み換え発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。細菌用の発現ベクターとしては、 p GEMEX_ l (Promega) , p QE— 9 (QIAGEN)、 p Q E - 30 (QIAGEN) , p R S ET (Invitrogen) , p LEX (Invitrogen) などが挙げられ、動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、 p c DNA I、 p c DM8 (フナコシ）、 p c DNA I /AmP (Invitrogen), p REP 4 (Invitrogen) や、組換えウィルス作成用発現ベクター、例えば、 pM

FG (Takara) が挙げられる。

細菌用の発現べクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、 t r pプロモーター、 T 7プロモーター、 1 a cプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等を挙げることができる。酵母用の発現べクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、 PH05プロモーター、 GAPプロモーターを挙げることができる。動物細胞用の発現ベクターに用いることができるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィルス（ヒト CMV)の I E (immediate early)遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、アデノウイノレスのプロモーター、メタロチォネインプロモーター、ヒートショックプロモーターを挙げることができる。

宿主細胞としては、目的タンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。

組換えベクターの宿主への導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーシヨン法、スフエロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフエクション法などが挙げられ、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。

形質転換体の培養物から、目的の組み換えタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。例えば、組み換えタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、ァフィ二ティーク口マトダラフィ一法を単独でか又は組み合わせて用い、精製することができる。

また、本発明は、下記工程：

ァガロースゲル上にバシロライシン MA及びリシンを固定したァフィ二ティトラップリアクターを緩衝液で平衡化する工程、

クェン酸処理した血清を添加する工程、

塩化ナトリゥムを含む緩衝液で洗浄する工程、及び

6—ァミノへキサン酸で溶出する工程からなる、 B Lアンジォスタチンの製造方法であって、上記緩衝液が、イソプロピルアルコールを含まないことを特徴とする、製造方法にも関する。好ましくは、全ての操作を 4 °Cで行う。これによつて、 B Lアンジォスタチンを高収率で得ることができる。

本発明の制がん剤は、一般的には、有効成分としての B Lアンジォスタチンと担体、賦形剤などの製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供される。

本発明の制がん剤は、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。本発明の薬剤の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。

B Lアンジォスタチンは、先行技術のアンジォスタチンとは異なり、水に対する溶解度が高い（20mg/ml 以上）ことから、本発明の制がん剤は、静脈内投与によって投与することができるという特徴を有する。

本発明の制がん剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択することができる。

本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、 0. lmg/kg 体重/ 日〜 1 0 Om_g/kg 体重/日、好ましくは 1 mg/kg 体重/日〜 1 Omg/kg 体重/日である。

本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、臈がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、等の治療に用いることができる。実施例

以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。

例 1. バシロライシン MAの生産及び精製

バシロライシン MAは、 Bacillus megaterium A9542 株（寄託番号 F ERM P- 1 8268で経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている）から、以下の方法により分離精製した。

グルコース 1 0/₀、コーンスターチ ₃o/₀、大豆ミール 1%、ペプトン 0. 5⁰/₀、イースト抽出物 0. 5%、 C a CO₃0. 2%、 CB 442 0. 0 1 %の成分を含む液体培地（pH7. 0) 1 00ml を含む 5 00ml 容三角フラスコで、 Bacillus megaterium A9542株を 28 °Cで 6日間振とう培養後、培養液 3リットルをセライトを用いてろ過し、そのろ液 1 リットルを H₂〇で 5リットルに希釈し、イソプロピルアルコールを最終濃度 5% (v/v) となるように添加した。その後、 2 OraM ME S (2— 〔N—モルホリノ〕エタンスルホン酸）一 Na〇H 緩衝液（ p H 6. 5 ) 5 %イソプロピルアルコールで平衡化した 400 ml のカルボキシメチルセルロース（生化学工業株式会社）カラムに流速 1 5 ml/分で注入した。同じ緩衝液 60 Oml で洗浄した後、 20mM ME S/N a OH (p H 6. 5) /5%イソプロピルアルコール/ 0. 2M Na C lで溶出した。その溶出画分を 60ml ずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度を S D S-P AGEで確認し、精製物 90 mgを得た。

例 2. バシロライシン MA及びリシンを固定した本発明のァフィ二ティートラップリアクターの作成（リアクター 10mlを作成）

臭化シアンであらかじめ活性化しておいたァガロースゲル（セファロース 4 B、フアルマシア社） 2. 8 6 gを 1 mMH C 1溶液 1 0 0ml に懸濁し、室温で 1 5分間撹拌した。これをカラムに移し、吸引して HC 1溶液を除去し、 ImMH C 1溶液 1 00ml で 3回、次に 0. 5M Na C l、 5%イソプロピルアルコールを含む緩衝液 A (0. 1M 炭酸水素ナトリウム、 pH8. 3) 75ml で 1回ゲルを洗浄した。 2. 84mg/ml のバシロライシン MA溶液を同じ緩衝液 Aで作成し、その 1 7. 6 mlをカラムに添加し、室温で 2時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、吸引により溶液を除去し、 0. 2M L- リシン塩酸塩を含む 5%イソプロピルアルコール水溶液（pH8. 0) 20 ml を加えて、室温で 2時間撹拌することによりリシンの固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を吸引により除去し、 5%イソプロピルアルコールを含む、緩衝液 B ( 2 OraM ME S (2— 〔モルホリノ〕エタンスルホン酸）一 N a OH) 500ml でゲルを洗浄し、最後に 0. 02%アジ化ナトリウムを含む、上記組成の緩衝液 B中、 4 °Cで保存した。

例 3. バシロライシン MA リシンリアクタ一を用いた、ヒト血漿からの B Lァンジォスタチンの一段階精製プロセス

クェン酸処理したヒト血漿 95ml にイソプロピルアルコール 5ml を氷上で添加し、 30分間放置した後、遠心分離（22, 000 x g、 4°C、 1時間）により上清を得、ろ過した。以降の操作はすべて 4 °Cで行なった。例 2で作成した本発明のバシロライシン MA/リシンリアクター 1 0ml を、 5%イソプロピルァルコールを含む緩衝液 C (25mM リン酸ナトリウム、 pH7. 4) で平衡化した。平衡化したリアクターに、上記の上清を流速 1. 5 ml/分で添加した。その後、 0. 5M N a C 1を含む上記組成の緩衝液 C 20 Oml でリアクターを洗浄した（3ml/分）。生成した B Lアンジォスタチンの溶出は、 200mM の 6—ァミノへキサン酸を含む 5 %イソプロピルアルコール溶液 5 Oml で行なった。その結果、ほとんどの B Lアンジォスタチンは、 1 0〜 3 Oml の溶出液で溶出された。 B Lアンジォスタチンの収量は、 4. 2mg であり、純度は 95%であつた。

なお、使用後のリアクターは、 1Mの Na C l と 200mMの 6—アミノへキサン酸を含む上記組成の緩衝液 C 5 Oml を用いて 4 °Cで洗浄した。その後、 0. 02 %アジ化ナトリウムを含む緩衝液 C中、 4 °Cで保存した。この状態で洗浄、保存したリアクターは、 2ヶ月以上繰り返して使用可能であった。

例 4. バシロライシン MA/リシンリアクターを用いた、ヒト血漿からの BLァンジォスタチンの一段階精製プロセス（イソプロピルアルコールを用いない方法）

クェン酸処理したヒト血漿を 1 5， 000 r pm、 20分間遠心して、上清を得た。以下の操作は、すべて 4°Cで行った。例 2で作製した本発明のバシロライシン MA リシンリアクター 0. 5ml を、緩衝液 Cで平衡化した。これに、上記の上淸 2. 5 ml を流速 0. 1ml/分で添加した。その後、 1 5 ml の 0. 5M 塩化ナトリウムを含む緩衝液 Cで洗浄（0. 1 5ml/分）後、 2. 5 ml の 20 OmM 6—ァミノへキサン酸で溶出した。大部分の B Lアンジォスタチンは、 0から 1. 5ml の溶出液で溶出された。 B Lアンジォスタチンの収量は 63 μ g で純度は 94%であった（図 1)。

なお、使用後のリアクターは、 1Mの Na C l と 200mMの 6—ァミノへキサ酸を含む緩衝液 C 2. 5ml を用いて洗浄した。その後、 0. 02%アジ化ナトリウムを含む緩衝液 C中、 4°Cで保存した。この状態で、保存したリアクターは 2ヶ月以上繰り返して使用可能であった。

得られた B Lアンジォスタチンのうち 4 gを精製水に溶解して 1 Ο _μ1とし、これに Ι Ο μΙ のサンプル緩衝液（4%SDS、 1 0% 2—メルカプトエタノール、 20%スクロース、 0. 004 %のブロモフエノールブルーを含む 1 25mM トリス塩酸緩衝液、 pH 6. 8) を加え、そのうち 1 0 μ 1 を、 7. 5%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分画した後、クーマシーブリリアントブルー R 250で染色した（図 1)。

例 5. B Lアンジォスタチンのルイス肺がんに対する効果

•がん種及びがんの移植方法、試験動物

ルイス肺がん細胞を C 5 7 B LZ 6マウスに皮下移植して継代維持した。

10— 14日目の腫瘍を摘出し、リン酸緩衝生理食塩水にがん細胞を懸濁した。 5週齢で購入し、その後 1週間 S P F環境下で予備飼育した B D F iマウスの腹側部皮下に、 1匹当たり 1 X 1 0⁵個の細胞を含む 0. 05 ml の細胞懸濁液を移植した。以後の実験もすベて S P F環境で行った。

·薬剤調製方法、投与方法、投与条件

例 3の方法で調製した B Lアンジォスタチンを凍結乾燥し、これを精製水に対して、 2時間、 3回透析した。得られた溶液を凍結乾燥して、 20mg/ml となるように生理食塩水に溶解した。この溶液を孔径 0. 22 / m のフィルターを用いてろ過滅菌した。この溶液をさらに滅菌生理食塩水で希釈して、 0. 06mg/ml、 0. 2mg/ml、 0. 6 mg/ml及び 2 mg/mlの溶液を作製した。ルイス肺がん細胞の移植の翌日から、上記の B Lアンジォスタチン溶液を、 5 ml/kg の割合で毎日 1回 14日間静脈内投与した。これにより、それぞれの投与量は、 0. 3、 1、 3、および 1 0mg/kg となった。対照群には、生理食塩水を同容量静脈内投与した。各群の動物数は 10匹とした。

·観察項目

投与期間中は、腫瘍の大きさ（短径及び長径から腫瘍体積を以下のように算出：短径の 2乗 X長径 X 0. 52) 及び体重を毎日測定した。投与終了翌日、エーテル麻酔下にマウスを致死させ、腫瘍を摘出してその湿重量を測定した。各群の最大及び最小値を除外して、計 8匹の動物のデータを統計処理した。有意差の検定には Du n n e t tの多重比較検定を用い、危険率 0. 05%以下を有意差とした。更に、対照群、 3mg/kg 投与群および 1 Omg/kg 投与群の代表例各 3個体から得られた腫瘍について、長径および短径の測定、細胞増殖、出血、壊死、分裂細胞の組織学的観察、および抗 V o n W i 1 1 e b r a n d因子抗体を用いた血管内皮細胞の免疫染色を行った。

，観察結果、考察

対照群と比較して、ルイス肺がん移植後 1 0日目移行、 3及び 10mg/kgBL アンジォスタチン投与群において、腫瘍体積が有意に低下した（図 2)。 1 Omg/kg 投与群においてはすべての観察期間で、腫瘍体積は対照群の 1 2以下であった。 0. 3及び lmg/kg 投与群においても腫瘍成長の抑制が観察されたが統計的に有意な差となったのは、 0. 3mg/kg 投与群で 1 4及び 1 5 日目、 lmg/kg 投与群で 14日目であった（図 2)。また、移植後 1 5日目に腫瘍を摘出して、その湿重量を測定したが、 B Lアンジォスタチン投与群では対照群と比較して、 50— 70%の値となった（図 3)。 0. 3、 3及ぴ 1 Omg/kg 投与群における差は統計的に有意な差であった。一方、飼育期間を通して各群の体重に有意な差は見られなかった（図 4)。また、動物の一般状態も、試験群間の差は見られなかった。

摘出した腫瘍の病理組織学的検査の結果を表 1にまとめた。対照群では、細胞増殖が高度に（図 5A)、出血が軽度に（図 5 B)、壊死が軽微に（図 5 B)、分裂細胞が中等度に（図 5 C) 認められた。また、抗 v o n W i l l e b r a n d因子抗体による血管内皮細胞の免疫染色では、陽性細胞の割合が軽度から中等度に認められた（図 5D)。 B Lアンジォスタチン 3mg/kg 投与群では、細胞増殖が中等度に（図 5 E)、出血が軽度に（図 5 F)、壊死が軽度に（図 5 F)、分裂細胞が中等度に（図 5G)、 v o n W i l l e b r a n d因子陽性細胞の割合が軽微から中等度に（図 5 H) 認められた。更に、 B Lアンジォスタチン

1 Omg/kg 投与群では、細胞増殖が軽微から中等度に（図 5 1 )、出血が軽微から中等度に（図 5 J)、壊死が軽度から高度に（図 5 J)、分裂細胞が軽微から軽度に（図 5K)、 v o n W i 1 l e b r a n d因子陽性細胞の割合が軽微から軽度に（図 5 L) 認められた。表 1. 腫瘍の病理組織学的検査および von Wi llebrand因子免疫染色検査の結果用量 ng/kg) 0 3 10 腫瘍の病理組織学的

所見（へマトキシリ

ン ·ェォシン染色）

長径 10. 6 7. 6 8. 2 7. 4 7. 0 7. 1 5. 5 6. 7 4. 4 短径 5. 0 7. 5 7. 8 5. 6 5. 6 4. 2 2. 8 6. 2 2. 8 細胞增殖 +++ +++ +++ ++ ++ ++ 土 ++ + 出血 + + + + + + ++ 土 + 壊死土 - 土 + + + +++ + ++ 分裂細胞 ++ ++ ++ ++ ++ ++ 土 + 士月重の von

Wi llebrand 因子免疫

+ ++ ++ + ++ 土土 + 土染色所見（陽性血管

の割合）

以上のことから、 1 日当たり 0 . 3 mg/kg〜 1 O mg/kg の B Lアンジォスタチンの静脈内投与は、皮下移植ルイス肺がんの成長の抑制に有効であることが示された。また、腫瘍の病理組織学的検査の結果から、 B Lアンジォスタチンの投与により、腫瘍細胞の分裂増殖の低下、壊死の増加がおこることが示された。さらに、抗 v o n W i 1 1 e b r a n d因子抗体による血管内皮細胞の免疫染色により、 B Lアンジォスタチンが、がんの新生血管を抑えていることが確認され、この血管新生阻害作用が、上述の腫瘍細胞の分裂増殖の低下、壊死の増加をもたらすものと考えられる。また、試験動物の体重や一般状態に影響しないことから、 B Lアンジォスタチンは重篤な副作用を持たないものと推測される。臨床予測性に優れたルイス肺がんの成長を抑制したことから、他の多くのがん（乳がん、肺がん、咽頭がん、膝がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん等）に対して、抑制効果を示すと考えられる。産業上の利用可能性

本発明の制がん剤は、乳がん、肺がん、咽頭がん、胃がん、膝がん、肝がん、結腸がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん等の治療に用いることができる。

Claims

求の

2. BLアンジォスタチンが、哺乳動物に由来する、請求の範囲第 1項に記載の制がん剤。

3. B Lアンジォスタチンが、ヒトプラスミノーゲンの G 1 u i— S e r ⁴⁴¹、 G l u ¹— V a l ⁴⁴⁹、 P h e ⁷⁵- S e r ⁴⁴¹及ぴ 1 e ⁷⁵-V a 1⁴⁴⁹断片からなる群より選択される、請求の範囲第 1又は 2項に記載の制がん剤。

4. 下記工程：

ァガロースゲル上にバシロライシン M A及びリシンを固定したァフィ二ティトラップリアクターを緩衝液で平衡化する工程、

クェン酸処理した血清を添加する工程、

塩化ナトリゥムを含む緩衝液で洗浄する工程、及び

6—ァミノへキサン酸で溶出する工程からなる、請求の範囲第 1項に記載の B L アンジォスタチンの製造方法であって、上記緩衝液が、イソプロピルアルコールを含まないことを特徴とする、製造方法。