WO2010070746A1 - イヌアンジオスタチン様ポリペプチド - Google Patents
イヌアンジオスタチン様ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- WO2010070746A1 WO2010070746A1 PCT/JP2008/072974 JP2008072974W WO2010070746A1 WO 2010070746 A1 WO2010070746 A1 WO 2010070746A1 JP 2008072974 W JP2008072974 W JP 2008072974W WO 2010070746 A1 WO2010070746 A1 WO 2010070746A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- angiostatin
- polypeptide
- plasminogen
- canine
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 23
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 21
- 102000012936 Angiostatins Human genes 0.000 description 21
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 21
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 21
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 21
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 3
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000605399 Canis lupus familiaris Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000037602 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000235 effect on cancer Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M sodium;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- the present invention relates to a method for producing an angiostatin-like polypeptide from canine plasminogen having a natural sugar chain, and a canine angiostatin-like polypeptide obtained by this method.
- Angiogenesis is a process in which new blood vessels are formed from existing blood vessels, and is regulated by various inhibitors such as growth factors released from platelets and vascular endothelial cells. Angiogenesis in tumors is essential for tumor growth, and therefore substances that inhibit angiogenesis may be useful as anti-tumor agents based on their ability to suppress cancer growth, invasion and metastasis. is there.
- Angiostatin is known as an example of such a substance.
- Angiostatin is a polypeptide containing kringle region 1 to 4 of plasminogen obtained by degrading plasminogen, which is a fibrinolytic factor, and reported to have an effect on cancer in animal experiments. (Non-Patent Document 1).
- angiostatin As a method for producing angiostatin, methods for producing recombinant proteins derived from humans (Non-patent Documents 2 to 3), dogs (Patent Documents 1 and 2), etc. have been reported. Angiostatin produced by these methods does not have a natural sugar chain structure. If it does not have a natural sugar chain structure, it may be antigenic in the administered subject, and if the sugar chain affects the activity, the activity may be lost. Therefore, angiostatin as described above may not exhibit sufficient activity as an anticancer agent.
- Non-patent Document 4 a method of hydrolyzing plasminogen with elastase is known (Non-patent Document 4).
- This method makes it difficult to selectively produce angiostatin from plasminogen because many byproducts are generated due to the low substrate specificity of elastase. This method therefore has the disadvantage that the activity of the resulting angiostatin is low.
- elastase preparations can be used to produce active angiostatin, and it has been suggested that cleavage or subsequent treatment may modify angiostatin (Non-Patent Documents). 4).
- angiostatin-like fragment (main product) was obtained by specifically cleaving human plasminogen using “Bacillolysin MA” which is a protease produced by Bacillus megaterium strain A9542.
- Bacillus megaterium strain A9542 was found to be a fragment having the amino acid sequence of Glu 1 to Ser 441 (hereinafter referred to as “human BL angiostatin” or “hBLAS”) (Patent Document 3).
- the above amino acid numbers are based on the amino acid sequence of a mature polypeptide (ie, Glu 1 -Asn 791 ) excluding the signal peptide from the amino acid sequence of human plasminogen (SWISSPROT accession number P00747).
- human BL angiostatin has an extremely excellent anticancer effect and has high solubility in water, and therefore exhibits an exceptional anticancer effect even by intravenous administration ( Patent Document 4).
- an angiostatin-like fragment human BL angiostatin obtained by allowing bacilolysin MA to act on human plasminogen has been demonstrated.
- angiostatin-like fragments as described above are expected to have similar effects.
- the fragment may be recognized as heterologous by the immune system of the administered animal, so that the effect may not be exhibited. Therefore, for application to non-human animals, it is necessary to obtain angiostatin-like fragments using plasminogen from the animal to be administered as a starting material.
- basilolysin MA is an enzyme obtained based on the action on human plasminogen, basilolysin MA was allowed to act on plasminogen derived from a non-human animal having an amino acid sequence different from that of human plasminogen. In some cases it was unclear whether fragments with angiostatin-like activity could be obtained. Therefore, a method for obtaining an angiostatin-like fragment having a natural sugar chain suitable for administration to mammals other than humans has been desired.
- JP 2002-355056 A Japanese translation of PCT publication No. 2002-523036 JP 2002-272453 A International Publication No.
- An object of the present invention is to provide a method for producing an angiostatin-like polypeptide from canine plasminogen having a natural sugar chain, and a canine angiostatin-like polypeptide obtained by this method.
- the present invention [1] A method for producing an angiostatin-like polypeptide, comprising digesting canine plasminogen with basilolysin MA; [2] Angiostatin-like polypeptide obtained by digesting canine plasminogen with basilolysin MA; [3] The N-terminal amino acid is arginine at position 78 or leucine at position 81 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the molecular weight determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions is 35 to 38 kDa Angiostatin-like polypeptide of [2]; [4] Angiostatin-like polypeptide of [2] or [3] comprising kringle regions 1 to 3 and not including NTP and kringle regions 4 to 5; [5] The angiostatin-like polypeptide according to any one of [2] to [4], wherein canine plasminogen has a natural sugar chain; [6] An an
- VEGF represents a group to which 10 ng / mL vascular endothelial growth factor (VEGF) was added, the horizontal axis represents the concentration of canine angiostatin (cBLAS), and the vertical axis was stained with anti-CD31 antibody for the entire visual field. The ratio (%) of the remaining area.
- dog plasminogen refers to dog-derived plasminogen.
- Plasminogen is a precursor of plasmin, present in animal plasma, which is cleaved by plasminogen activator and converted to active plasmin. Plasmin consists of an H chain containing five kringle regions (K1 to K5) and an L chain containing a serine protease active center.
- plasminogen having a natural sugar chain is preferably used. “Having a natural sugar chain” means having a sugar chain having substantially the same structure as a sugar chain bound to natural plasminogen at the same site.
- Canine plasminogen having a natural sugar chain can be obtained, for example, by purification from canine plasma.
- plasminogen produced using recombinant DNA technology or the like based on the amino acid sequence of known canine plasminogen is used as long as it has a natural sugar chain. can do.
- NTP N-terminal peptide
- the kringle region is defined as a region sandwiched between the most N-terminal and C-terminal cysteine (Cys) residues of each region
- the kringle regions 1 to 5 are positions 84 to 162 of SEQ ID NO: 1, respectively. This corresponds to the regions of the 166th to 243rd, 256th to 333th, 360th to 437th, and 464th to 543th positions.
- Bacillolysin MA refers to a protease produced by Bacillus megaterium strain A9542. Basilolysin MA specifically cleaves human plasminogen to produce an angiostatin-like fragment (the main product is a fragment having the amino acid sequence of Glu 1 to Ser 441 ; the amino acid number is the amino acid sequence of human plasminogen (SWISSPROT The activity to generate a mature polypeptide (ie, based on the amino acid sequence of Glu 1 -Asn 791 ) excluding the signal peptide from session number P00747). Bacillus megaterium A9542 strain was established in Tsukuba Center, Central 1-1-1 Tsukuba Center, Ibaraki 305-8586, Japan, under the patent number FERM P-18268 in 2001. Deposited on March 21.
- angiostatin refers to a polypeptide that is derived from plasminogen and exhibits angiogenesis inhibitory activity, including plasminogen kringle regions 1 to 4.
- Angiostatin-like polypeptide refers to a plasminogen-derived polypeptide that exhibits angiogenesis inhibitory activity similar to Angiostatin. According to the present invention, an angiostatin-like polypeptide is obtained by digesting canine plasminogen with basilolysin MA.
- the angiostatin-like polypeptide of the present invention is not necessarily composed of a single molecular species, and may be a mixture of a plurality of molecular species having different N-terminal amino acids or sugar chain structures.
- an angiostatin-like polypeptide obtained by digesting canine plasminogen with basilolysin MA is also referred to as “cBLAS”.
- the polypeptide portion other than the sugar chain is an amino acid sequence derived from canine plasminogen.
- the angiostatin-like polypeptide of the present invention has a natural sugar chain.
- the angiostatin-like polypeptide may be further purified by subjecting this digest to affinity chromatography (eg, Lys-Sepharose).
- Angiogenesis inhibitory activity can be measured in vitro, for example, by observing the effect of a test substance on angiogenesis by endothelial cells using a commercially available kit or the like.
- angiogenesis inhibitory activity can be measured in vivo by observing the effect of a test substance on the growth of Lewis lung cancer transplanted subcutaneously into mice, for example as described in US Pat.
- the angiostatin-like polypeptide of the present invention is, for example, 34-40 kDa, preferably 35-38 kDa, more preferably 36-36 by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions.
- the molecular weight is 37 kDa.
- the N-terminal amino acid of the angiostatin-like polypeptide of the present invention is arginine at position 78 (Arg 78 ) or leucine at position 81 (Leu 81 ) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- the C-terminal amino acid of the angiostatin-like polypeptide of the invention is tyrosine (Tyr 342 ) at position 342 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- the angiostatin-like polypeptide of the present invention has an amino acid sequence of Arg 78 or Leu 81 to Tyr 342 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 except that the polypeptide portion (polypeptide backbone) other than its sugar chain Consists of.
- the amino acid sequences of Arg 78 -Tyr 342 and Leu 81 -Tyr 342 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are shown in SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively.
- This region includes the kringle regions 1 to 3, but does not include the NTP and the kringle regions 4 to 5.
- the main product of angiostatin-like fragment obtained by digesting human plasminogen with basilolysin MA has the amino acid sequence of human plasminogen Glu 1 to Ser 441 . This sequence includes NTP and kringle regions 1-4.
- the angiostatin-like polypeptide derived from canine plasminogen of the present invention has a structure very different from the angiostatin-like fragment derived from human.
- the recombinant canine angiostatins described in Patent Documents 1 and 2 each contain kringle regions 1 to 4 of canine plasminogen and have a structure different from that of the angiostatin-like polypeptide of the present invention. ing.
- the conditions for digestion of plasminogen with basilolysin MA are appropriately selected so as to obtain a polypeptide exhibiting angiogenesis inhibitory activity. Since basilolysin MA requires Ca 2+ for its enzymatic reaction, digestion is performed in the presence of Ca 2+ .
- the reaction temperature is selected in consideration of the optimum temperature of basilolysin MA (about 50 to 60 ° C.), the stability of the substrate (plasminogen), etc., for example, 0 to 60 ° C., preferably 20 to 50 ° C., more preferably Is 30 to 40 ° C., more preferably 37 ° C.
- Other conditions such as reaction time, enzyme and substrate concentration in the reaction solution are also appropriately determined by those skilled in the art.
- the reaction time is, for example, 0.5 to 2.5 hours, preferably 1 to 2 hours.
- concentration of enzyme (basilolysin MA) (concentration calculated based on a molecular weight of 34 kDa) is, for example, 50 to 500 nM, preferably 100 to 300 nM, more preferably 150 nM.
- concentration of the substrate (dog plasminogen) is, for example, 0.1 to 2 mg / mL, preferably 0.2 to 1.0 mg / mL, more preferably 0.5 mg / mL.
- the angiostatin-like polypeptide obtained by the production method of the present invention exhibits angiogenesis inhibitory activity. Since basilolysin MA is an enzyme obtained based on the action on human plasminogen, basilolysin MA is added to plasminogen derived from dogs, which are non-human animals having an amino acid sequence different from the amino acid sequence of human plasminogen. It was unclear whether a fragment having angiostatin-like angiogenesis inhibitory activity would be obtained when allowed to act. For example, the cleavage site of human plasminogen by basilolysin MA is between serine (Ser) at position 441 and valine (Val) at position 442.
- the amino acids of canine plasminogen corresponding to these amino acids are serine (Ser) at position 443 and Ala at position 444 of SEQ ID NO: 1.
- the cleavage site of basilolysin MA cannot be predicted from the primary amino acid sequence alone, so that the structure of a polypeptide obtained by reacting basilolysin MA with canine plasminogen could not be predicted. Therefore, the above findings were unexpected.
- the angiostatin-like polypeptide obtained by the production method of the present invention has a natural sugar chain because it can be obtained using plasminogen having a natural sugar chain as a starting material. Therefore, the present invention is advantageous in that it is not necessary to consider problems such as antigenicity and deactivation that may occur when a natural sugar chain is not present.
- the present invention provides a composition comprising the above-mentioned angiostatin-like polypeptide.
- This composition can be used to inhibit angiogenesis.
- a disease in which inhibition of angiogenesis is desired can be treated.
- a cancer is illustrated as a disease.
- the subject to be administered can be any mammal in need of treatment, but is preferably a dog.
- the composition can further include optional ingredients such as other angiogenesis inhibitors, pharmaceutically acceptable excipients, and the like.
- the form and route of administration of the preparation can be arbitrarily selected from known ones. For example, an injectable formulation can be administered to a subject by intravenous injection.
- Example 1 Purification of basilolysin MA (BL-MA) Glucose 1%, corn starch 3%, soybean meal 1%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, CaCO 3 0.2%, CB442 0.01 In a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of a liquid medium (pH 7.0) containing 1%, Bacillus megaterium A9542 strain (1-1-1 Higashi Tsukuba City, Ibaraki 305-8856 Tsukuba Center Chuo No. 6, Industrial Technology (Deposited on March 21, 2001) under the accession number FERM P-18268 at the Research Center for Patent Biological Deposits) and cultured with shaking at 28 ° C. for 6 days.
- BL-MA basilolysin MA
- BL-MA concentration of BL-MA is displayed in units such as “nM” and “ ⁇ M” calculated based on the molecular weight (34 kDa).
- Example 2 Purification of canine plasminogen (cPlg) Purification of cPlg was performed according to the procedure described in 1) to 8) below. The chromatographic flow rate was 8 mL / min unless otherwise specified.
- Protein was quantified by the Lowry method.
- 20 ⁇ L of cPlg obtained in 8) after dialysis was diluted with 40 ⁇ L of 0.1 M sodium hydroxide.
- 300 ⁇ L of a solution in which 2% (w / v) Na 2 CO 3 /0.1 M sodium hydroxide and 0.5% CuSO 4 .5H 2 O / 1% sodium citrate were mixed at a ratio of 50: 1 was first added. Were mixed well and allowed to react for 15 minutes at room temperature. After the reaction, 30 ⁇ L of a phenol reagent was added, mixed well, and further reacted at room temperature for 30 minutes.
- CPlg was purified 11 times in total. From the protein quantification results after dialysis, it was found that 448 mg of cPlg was obtained. In addition, when 1 ⁇ L of the eluate was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE, 10%, reducing conditions), no band other than cPlg was observed, so the purity was estimated to be 95% or more. . Since the total amount of canine plasma used was 4030 mL, the yield was 111 mg / L plasma.
- Example 4 Examination of cPlg cleavage conditions TBS / T / Ca (50 mM Tris-HCl (pH 7.4 (25 ° C.)) / 100 mM NaCl / 0.01% Tween 80/1 mM CaCl 2 ) 46.4 ⁇ L in 1.5 mL plastic
- 25.6 ⁇ L of 1.6 mg / mL cPlg prepared by diluting the stock solution with TBS / T / Ca
- 8 ⁇ L of 1.5 ⁇ M BL-MA (prepared by diluting the stock solution with TBS / T / Ca) was added to this tube and mixed uniformly.
- reaction temperature 37 ° C. was used.
- the optimal temperature for BL-MA is a higher temperature (50-60 ° C.), but this temperature was chosen to avoid denaturation of the substrate protein (cPlg).
- Example 5 Preparation of canine BL angiostatin (cBLAS) 0.5 mg / mL cPlg and 150 nM BL-MA were incubated in TBS / T / Ca for 2 hours at 37 ° C. Thereafter, EDTA-2Na was added to a final concentration of 10 mM to stop the reaction. The obtained reaction solution was immediately subjected to purification using Lys-Sepharose.
- cBLAS canine BL angiostatin
- the fraction in which cBLAS band was confirmed by SDS-PAGE was dialyzed against ultrapure water in the same manner as in Example 2 except that ultrapure water was used, freeze-dried, and dissolved in physiological saline. The solution was sterilized by filtration using a 0.2 ⁇ m disk filter. A part of the sample was subjected to protein quantification (by the Lowry method described in Example 2) and purity assay by SDS-PAGE.
- cBLAS was obtained from 448 mg of cPlg (about 3 mL of 35.7 mg / mL cBRAS solution). Further, when 1 ⁇ L of the eluate was subjected to SDS-PAGE (10%, reducing conditions), no band other than cBRAS was observed, so the purity was estimated to be 95% or more.
- the cBRAS solution was stored at ⁇ 80 ° C. Based on the molecular weights of cPlg and cBRAS on SDS-PAGE (about 100 kDa and about 37 kDa, respectively), the recovery was calculated to be about 84% (140 / (448 ⁇ 37/100)).
- Example 6 Determination of partial amino acid sequence
- the cBRAS obtained in Example 1 was subjected to SDS-PAGE. A 36-37 kDa band corresponding to two cBRAS was confirmed (FIG. 1, left lane).
- the protein in the gel was transferred to a PVDF membrane (Fluorotrans (registered trademark), Nippon Genetics)
- the target band was cut out and the N-terminal amino acid sequence was analyzed using 476A Protein Sequencer (Applied Biosystems).
- c-Plg BL-MA digest unpurified
- was subjected to SDS-PAGE several more bands were seen (FIG. 1, right lane). The most dominant band of about 53 kDa was similarly subjected to sequence analysis.
- N-terminal sequences determined for the upper and lower bands of cBRAS were Arg-Ile-Tyr-Leu and Leu-Ser-Glu-XXX-Lys, respectively. This sequence matched the sequence starting from ArP 78 and Leu 81 of cPlg, respectively.
- the N-terminal sequence of the approximately 53 kDa band dominant in the BL-MA digest of cPlg was Leu-Asp-Ala-Pro-Ala. This sequence matched the sequence starting from Leu 343 of cPlg.
- the N-terminal of the polypeptide corresponding to the band of about 50 kDa found in Example 4 was determined to be Val 356 , and the polypeptide corresponding to the band of about 53 kDa was further decomposed. It was suggested that it occurred.
- Example 7 Evaluation of cBRAS activity Regarding the effect of canine BL angiostatin (cBRAS) on angiogenesis of human endothelial cells induced by vascular endothelial growth factor (VEGF), angiogenesis kit (Kurashiki Spinning Co., Ltd.) It was examined using.
- VEGF vascular endothelial growth factor
- a “saline group” sodium chloride 85 mg in 10 mL water
- a “VEGF group” VEGF 10 ng / mL
- a “cBRAS group” VEGF 10 ng / mL + cBRAS 1, 10, 100 ⁇ g / mL, hereinafter “Experiments were performed using a total of 5 groups, “cBLAS 1 ⁇ g / mL group”, “cBRAS 10 ⁇ g / mL group”, and “cBRAS 100 ⁇ g / mL group”.
- the medium On the day of arrival of the angiogenesis kit (day 1), the medium is replaced with a medium in which the test sample (cBLAS at a predetermined concentration) is added to the medium (VEGF ( ⁇ ) medium) that does not contain VEGF for the cBLAS group.
- the physiological saline group and the VEGF group were replaced with VEGF ( ⁇ ) medium supplemented with the same amount of physiological saline as the test sample.
- the medium is changed to a medium in which the test sample (cBLAS at a predetermined concentration) is added to the medium (VEGF (+) medium) attached to the kit containing VEGF for the cBLAS group,
- the physiological saline group was replaced with a VEGF ( ⁇ ) medium
- the VEGF group was replaced with a medium in which the same amount of physiological saline as the test sample was added to the VEGF (+) medium.
- staining with an anti-CD31 (PECAM-1) antibody was performed according to the instructions of the angiogenesis staining kit.
- the staining area measured for the physiological saline group was 2.79 ⁇ 0.13% (mean value ⁇ standard deviation).
- the stained areas measured for the VEGF group, cBRAS 1 ⁇ g / mL group, cBRAS 10 ⁇ g / mL group, and cBRAS 100 ⁇ g / mL group are 3.06 ⁇ 0.11%, 3.00 ⁇ 0.11%, and 2.08, respectively. They were ⁇ 0.19% and 1.25 ⁇ 0.11% (FIG. 2).
- endothelial cell proliferation was significantly inhibited in the cBRAS 10 ⁇ g / mL group and the cBRAS 100 ⁇ g / mL group (P ⁇ 0.01).
- the present invention provides a method for producing an angiostatin-like polypeptide from canine plasminogen having a natural sugar chain, and a canine angiostatin-like polypeptide obtained by this method.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
天然型糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンからアンジオスタチン様ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られたイヌアンジオスタチン様ポリペプチドを提供する。
Description
本発明は、天然型糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンからアンジオスタチン様ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られたイヌアンジオスタチン様ポリペプチドに関する。
血管新生は、既存の血管から新しい血管が形成される過程であり、血小板や血管内皮細胞から放出される成長因子等と種々の阻害因子によって調節されている。腫瘍における血管新生は腫瘍の増殖に必須であり、それゆえ、血管新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤および転移を抑制するその能力に基づいて、抗腫瘍剤として有用である可能性がある。
このような物質の一例としてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる、プラスミノーゲンのクリングル領域１～４を含むポリペプチドであり、そして動物実験において癌に対する効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。
アンジオスタチンの製造方法としては、ヒト（非特許文献２～３）、イヌ（特許文献１～２）など由来の組換えタンパク質の製造方法が報告されている。これらの方法によって製造されたアンジオスタチンは、天然型の糖鎖構造を有していない。天然型の糖鎖構造を有していなければ投与された対象内で抗原性を示す可能性があり、また糖鎖が活性に影響していれば、活性が失われる可能性もある。そのため、上記のようなアンジオスタチンは抗癌剤としての活性を十分に示さない可能性がある。
天然型糖鎖を有するアンジオスタチンの生産は、天然型のプラスミノーゲンを精製し、適当な酵素で処理することによって達成され得る。このような方法としては、例えば、プラスミノーゲンをエラスターゼで加水分解する方法が知られている（非特許文献４）。この方法では、エラスターゼの基質特異性の低さのために多くの副生成物が生じるので、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難である。従って、この方法には、得られるアンジオスタチンの活性が低いという欠点がある。また、すべての市販エラスターゼ標品を使用して活性のあるアンジオスタチンを生産することができるわけではなく、切断またはその後の処理によってアンジオスタチンが変性される可能性も示唆されている（非特許文献４）。
本発明者らは、プラスミノーゲンから選択的にアンジオスタチンを生成するために適切な基質特異性を有し、かつ副生成物を生じさせない新たな酵素を探索した。その結果、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼである「バシロライシンＭＡ」（Bacillolysin MA）を用いて、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断することによってアンジオスタチン様フラグメント（主生成物はＧｌｕ１からＳｅｒ４４１のアミノ酸配列を有するフラグメントである、以下、「ヒトＢＬアンジオスタチン」または「ｈＢＬＡＳ」と記載する）が得られることを見出した（特許文献３）。なお、上記のアミノ酸番号は、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ００７４７）からシグナルペプチドを除外した成熟ポリペプチド（すなわち、Ｇｌｕ１－Ａｓｎ７９１）のアミノ酸配列に基づく。
さらに、本発明者らは、ヒトＢＬアンジオスタチンが極めて優れた制癌効果を有すること、および水に対する溶解性が高いことから、静脈内投与によっても格別の制癌効果を奏することを見出した（特許文献４）。このように、ヒトプラスミノーゲンにバシロライシンＭＡを作用させることによって得られるアンジオスタチン様フラグメント（ヒトＢＬアンジオスタチン）の有効性は実証されている。
癌のような血管新生の阻害が有効な疾患はヒト以外の哺乳動物にも存在する。このような疾患には上記のようなアンジオスタチン様フラグメントが同様の効果を有することが期待される。しかし、例えば、ヒト由来のプラスミノーゲンフラグメントを他の動物に投与すれば、このフラグメントは投与された動物の免疫系によって異種として認識されるので、その効果が発揮されない可能性がある。従って、ヒト以外の動物へ適用のためには、投与しようとする動物由来のプラスミノーゲンを出発材料として使用してアンジオスタチン様フラグメントを得る必要がある。バシロライシンＭＡはヒトプラスミノーゲンに対する作用に基づいて得られた酵素であるので、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するヒト以外の動物由来のプラスミノーゲンにバシロライシンＭＡを作用させた場合に、アンジオスタチン様活性を有するフラグメントが得られるかどうかは不明であった。それゆえ、ヒト以外の哺乳動物への投与に適切な天然型糖鎖を有するアンジオスタチン様フラグメントを得るための方法が望まれていた。
特開２００２－３５５０５６号公報
特表２００２－５２３０３６号公報
特開２００２－２７２４５３号公報
国際公開第２００５／０７９８３５号パンフレット
M.S. O'Reilly et al., Cell, 79:315-328 (1994)
Shepard, S.R. et al., Protein Expr. Purif., 20:216-227 (2000)
Lin, J. et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 24:31-35 (2000)
M.S. O'Reilly et al., Nature Medicine, 2:689-692 (1996)
本発明の目的は、天然型糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンからアンジオスタチン様ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られたイヌアンジオスタチン様ポリペプチドを提供することである。
本発明は、
［１］イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することを含む、アンジオスタチン様ポリペプチドの製造方法；
［２］イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することによって得られる、アンジオスタチン様ポリペプチド；
［３］Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸配列の７８位のアルギニンまたは８１位のロイシンであり、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される分子量が３５～３８ｋＤａである、［２］のアンジオスタチン様ポリペプチド；
［４］クリングル領域１～３を含み、ＮＴＰおよびクリングル領域４～５を含まない、［２］または［３］のアンジオスタチン様ポリペプチド；
［５］イヌプラスミノーゲンが天然型の糖鎖を有する、［２］～［４］のいずれかのアンジオスタチン様ポリペプチド；
［６］［２］～［５］のいずれかのアンジオスタチン様ポリペプチドを含む、血管新生阻害用組成物
に関する。
［１］イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することを含む、アンジオスタチン様ポリペプチドの製造方法；
［２］イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することによって得られる、アンジオスタチン様ポリペプチド；
［３］Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸配列の７８位のアルギニンまたは８１位のロイシンであり、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される分子量が３５～３８ｋＤａである、［２］のアンジオスタチン様ポリペプチド；
［４］クリングル領域１～３を含み、ＮＴＰおよびクリングル領域４～５を含まない、［２］または［３］のアンジオスタチン様ポリペプチド；
［５］イヌプラスミノーゲンが天然型の糖鎖を有する、［２］～［４］のいずれかのアンジオスタチン様ポリペプチド；
［６］［２］～［５］のいずれかのアンジオスタチン様ポリペプチドを含む、血管新生阻害用組成物
に関する。
本明細書において使用する「イヌプラスミノーゲン」（「ｃＰｌｇ」ともいう）なる用語は、イヌ由来のプラスミノーゲンを指す。プラスミノーゲンは、動物の血漿中に存在する、プラスミンの前駆体であり、プラスミノーゲンアクチベータによって切断されて活性なプラスミンに変換される。プラスミンは５個のクリングル領域（Ｋ１～Ｋ５）を含むＨ鎖と、セリンプロテアーゼ活性中心を含むＬ鎖とからなる。本発明の目的のためには天然型の糖鎖を有するプラスミノーゲンが好適に使用される。「天然型の糖鎖を有する」とは、天然のプラスミノーゲンに結合した糖鎖と実質的に同一の構造を有する糖鎖を同一の部位に有することを意味する。イヌプラスミンのＨ鎖にはＮ結合型糖鎖が結合する可能性があるコンセンサス配列（Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が２箇所存在する（配列番号１の１１７～１１９位および２８９～２９１位）。このうち後者はヒトプラスミンのＮ結合型糖鎖結合部位に相当し、イヌプラスミンにおいても実際に糖鎖が結合していると考えられる。天然型糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンは、例えば、イヌ血漿から精製して得ることができる。あるいは、公知のイヌプラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、組換えＤＮＡ技術などを使用して産生されたプラスミノーゲンであっても、天然型糖鎖を有するのであれば使用することができる。配列番号１のアミノ酸配列において、プラスミノーゲンアクチベータによる切断部位は５６３位と５６４位との間に存在し、７８から５６３位がＨ鎖に、５６４～７９３位がＬ鎖に相当し、１～７７位の領域はＮ末端ペプチド（N-terminal peptide；ＮＴＰ）と称する。クリングル領域をそれぞれの領域の最もＮ末端側および最もＣ末端側のシステイン（Ｃｙｓ）残基にはさまれた領域と定義すれば、クリングル領域１～５はそれぞれ配列番号１の８４～１６２位、１６６位～２４３位、２５６～３３３位、３６０～４３７位、４６４～５４３位の領域に相当する。
本明細書において使用する「バシロライシンＭＡ」（「ＢＬ－ＭＡ」ともいう）なる用語は、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）Ａ９５４２株が産生するプロテアーゼを指す。バシロライシンＭＡは、ヒトプラスミノーゲンを特異的に切断して、アンジオスタチン様フラグメント（主生成物はＧｌｕ１からＳｅｒ４４１のアミノ酸配列を有するフラグメント；アミノ酸番号はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ００７４７）からシグナルペプチドを除外した成熟ポリペプチド（すなわち、Ｇｌｕ１－Ａｓｎ７９１）のアミノ酸配列に基づく）を生成する活性を示す。バチルス・メガテリウム Ａ９５４２株は、〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－１８２６８の下、２００１年３月２１日に寄託されている。
本明細書において使用する「アンジオスタチン」なる用語は、プラスミノーゲンに由来し、プラスミノーゲンのクリングル領域１～４を含む、血管新生阻害活性を示すポリペプチドを指す。本明細書において使用する「アンジオスタチン様ポリペプチド」なる用語は、アンジオスタチンと同様の血管新生阻害活性を示すプラスミノーゲン由来のポリペプチドを指す。本発明によれば、アンジオスタチン様ポリペプチドは、イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することによって得られる。なお、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドは必ずしも単一の分子種からなるものではなく、Ｎ末端アミノ酸や糖鎖構造の異なる複数の分子種の混合物であってもよい。本明細書において、イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化して得られるアンジオスタチン様ポリペプチドを「ｃＢＬＡＳ」ともいう。本発明によれば天然型の糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンが出発材料として使用されるので、その糖鎖以外のポリペプチド部分（「ポリペプチド骨格」という）はイヌプラスミノーゲン由来のアミノ酸配列からなり、そして本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドは天然型糖鎖を有する。この消化物をアフィニティクロマトグラフィー（例えば、Ｌｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に供することによってアンジオスタチン様ポリペプチドをさらに精製してもよい。血管新生阻害活性は、例えば、市販のキットなどを使用して、内皮細胞による血管新生に対する試験物質の効果を観察することによってインビトロで測定することができる。あるいは、血管新生阻害活性は、例えば特許文献４に記載されるように、マウスに皮下移植したルイス肺癌の成長に対する試験物質の効果を観察することによってインビボで測定することができる。
１つの実施態様において、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドは、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で例えば３４～４０ｋＤａ、好ましくは３５～３８ｋＤａ、より好ましくは３６～３７ｋＤａの分子量を示す。１つの実施態様において、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列の７８位のアルギニン（Ａｒｇ７８）または８１位のロイシン（Ｌｅｕ８１）である。１つの実施態様において、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドのＣ末端アミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列の３４２位のチロシン（Ｔｙｒ３４２）である。１つの実施態様において、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドは、その糖鎖以外のポリペプチド部分（ポリペプチド骨格）が、配列番号１のアミノ酸配列のＡｒｇ７８またはＬｅｕ８１からＴｙｒ３４２までのアミノ酸配列からなる。配列番号１のアミノ酸配列のＡｒｇ７８－Ｔｙｒ３４２およびＬｅｕ８１－Ｔｙｒ３４２のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および３に示す。この領域にはクリングル領域１～３は含まれるが、ＮＴＰおよびクリングル領域４～５は含まれない。上記のヒトプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化して得られるアンジオスタチン様フラグメントの主生成物はヒトプラスミノーゲンのＧｌｕ１からＳｅｒ４４１のアミノ酸配列を有する。この配列にはＮＴＰおよびクリングル領域１～４が含まれる。このように、本発明のイヌプラスミノーゲン由来のアンジオスタチン様ポリペプチドは、ヒト由来のアンジオスタチン様フラグメントと非常に異なった構造を有している。また、特許文献１および２に記載される組換えイヌアンジオスタチンはいずれもイヌプラスミノーゲンのクリングル領域１～４を含むものであり、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドとは異なる構造を有している。
プラスミノーゲンのバシロライシンＭＡでの消化の条件は、血管新生阻害活性を示すポリペプチドが得られるように適宜選択される。バシロライシンＭＡはその酵素反応にＣａ２＋を必要とするので、消化はＣａ２＋の存在下行われる。反応温度は、バシロライシンＭＡの至適温度（約５０～６０℃）、基質（プラスミノーゲン）の安定性などを考慮して選択され、例えば０～６０℃、好ましくは２０～５０℃、より好ましくは３０～４０℃、さらに好ましくは３７℃である。反応時間、酵素および基質の反応液中の濃度などの他の条件も当業者によって適宜決定される。反応時間は、例えば０．５～２．５時間、好ましくは１～２時間である。酵素（バシロライシンＭＡ）の濃度（分子量３４ｋＤａに基づいて算出される濃度）は例えば５０～５００ｎＭ、好ましくは１００～３００ｎＭ、より好ましくは１５０ｎＭである。基質（イヌプラスミノーゲン）の濃度は例えば０．１～２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２～１．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬである。
本発明の製造方法によって得られるアンジオスタチン様ポリペプチドは、血管新生阻害活性を示す。バシロライシンＭＡはヒトプラスミノーゲンに対する作用に基づいて得られた酵素であるので、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するヒト以外の動物であるイヌ由来のプラスミノーゲンにバシロライシンＭＡを作用させた場合に、アンジオスタチン様の血管新生阻害活性を有するフラグメントが得られるかどうかは不明であった。例えば、バシロライシンＭＡによるヒトプラスミノーゲンの切断部位は４４１位のセリン（Ｓｅｒ）と４４２位のバリン（Ｖａｌ）との間である。一方、これらのアミノ酸に相当するイヌプラスミノーゲンのアミノ酸は配列番号１の４４３位のセリン（Ｓｅｒ）および４４４位のＡｌａである。このような基質のアミノ酸配列の相違に加えて、バシロライシンＭＡの切断部位を一次アミノ酸配列のみから予測することはできないという理由から、イヌプラスミノーゲンにバシロライシンＭＡを作用させて得られるポリペプチドの構造を予測することはできなかった。従って、上記の知見は予想外であった。また、本発明の製造方法によって得られるアンジオスタチン様ポリペプチドは、天然型糖鎖を有するプラスミノーゲンを出発材料として得られるので、天然型糖鎖を有する。従って、天然型糖鎖を有していない場合に生じる可能性のある抗原性や失活などの問題を考慮する必要がないという点で本発明は有利である。
本発明により、上記のアンジオスタチン様ポリペプチドを含む組成物が提供される。この組成物は、血管新生を阻害するために使用することができる。例えば、本発明のアンジオスタチン様ポリペプチドを含有する組成物を対象に投与することによって、血管新生の阻害が所望される疾患を処置することができる。疾患としては癌が例示される。投与対象は処置を必要とする任意の哺乳動物であり得るが、好ましくはイヌである。組成物には、他の血管新生阻害剤、薬学的に許容される賦形剤など、任意の成分をさらに含めることができる。製剤の形態および投与経路は、公知のものから任意に選択することができる。例えば、注射用製剤を静脈注射によって対象に投与することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：バシロライシンＭＡ（ＢＬ－ＭＡ）の精製
グルコース１％、コーンスターチ ３％、大豆ミール１％、ペプトン ０．５％、イーストエキス０．５％、ＣａＣＯ3 ０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコ中で、バチルス・メガテリウム Ａ９５４２株（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－１８２６８の下、２００１年３月２１日に寄託）を２８℃、６日間振とう培養した。培養後、培養液３Ｌをセライト（Celite（登録商標））を通してろ過し、そのろ液１ＬをＨ2Ｏで希釈して５Ｌにし、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。この混合物を、２０ｍＭ ＭＥＳ（２‐［Ｎ‐モルホリノ］エタンスルホン酸）－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化したカルボキシルメチルセルロース（生化学工業株式会社）カラム（４００ｍＬのゲル）に流速１５ｍＬ／分でアプライした。同じ緩衝液６００ｍＬで洗浄した後、２０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍＬずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、精製品９０ｍｇを得た。なお、以下では、ＢＬ－ＭＡの濃度を、その分子量（３４ｋＤａ）に基づいて算出される「ｎＭ」、「μＭ」などの単位で表示する。
グルコース１％、コーンスターチ ３％、大豆ミール１％、ペプトン ０．５％、イーストエキス０．５％、ＣａＣＯ3 ０．２％、ＣＢ４４２ ０．０１％を含む液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコ中で、バチルス・メガテリウム Ａ９５４２株（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－１８２６８の下、２００１年３月２１日に寄託）を２８℃、６日間振とう培養した。培養後、培養液３Ｌをセライト（Celite（登録商標））を通してろ過し、そのろ液１ＬをＨ2Ｏで希釈して５Ｌにし、イソプロピルアルコールを最終濃度５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。この混合物を、２０ｍＭ ＭＥＳ（２‐［Ｎ‐モルホリノ］エタンスルホン酸）－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコールで平衡化したカルボキシルメチルセルロース（生化学工業株式会社）カラム（４００ｍＬのゲル）に流速１５ｍＬ／分でアプライした。同じ緩衝液６００ｍＬで洗浄した後、２０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）／５％イソプロピルアルコール／０．２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。その溶出画分を６０ｍＬずつ分画し、活性の認められた画分を集めた。その純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、精製品９０ｍｇを得た。なお、以下では、ＢＬ－ＭＡの濃度を、その分子量（３４ｋＤａ）に基づいて算出される「ｎＭ」、「μＭ」などの単位で表示する。
実施例２：イヌプラスミノーゲン（ｃＰｌｇ）の精製
ｃＰｌｇの精製を以下の１）～８）に記載する手順に従って行った。クロマトグラフィーの流速は特に指定がない限り、８ｍＬ／分であった。
ｃＰｌｇの精製を以下の１）～８）に記載する手順に従って行った。クロマトグラフィーの流速は特に指定がない限り、８ｍＬ／分であった。
１）４５ｍＬのＬｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GE healthcare、17-0960-01）を、平衡化緩衝液（０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ ８．３））を用いてＸＫ２６／２０カラム（GE healthcare、18-1000-72）に充填した（φ２．６×１１ｃｍ）。
２）カラムを２２５ｍＬの平衡化緩衝液で平衡化した。
３）３８０μＬの１０５ ＫＩＵ／ｍＬのアプロチニン（和光純薬、016-11826）を、３８０ｍＬのイヌ血漿（オリエンタル酵母）に添加した（血漿は、低温で、泡立たせないように取り扱った）。
４）この血漿を上記Ｌｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにアプライし、その後、１３５０ ｍＬの洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）／０．５Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄した（流速１５ｍＬ／分）。
５）カラムの３倍容量の溶出緩衝液（０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）／０．２Ｍ ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ））を用いて溶出した。２８０ｎｍの吸光を観察し、検出されるピークに相当する画分の溶出液を回収した。
６）溶出液の一部をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、ｃＰｌｇの純度、収量を確認した。残りの溶出液は以下のように硫安沈殿により濃縮した。溶出液１００ｍＬに対して、乳鉢で十分に細かくした硫酸アンモニウムを、氷上で溶出液を攪拌しながら、１０ｇを５分程度の添加速度で３９ｇ添加した（６０％飽和度）。全ての硫安を添加後、さらに１５分間攪拌し、１６，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を別のチューブにデカンテーションにより移し、沈殿のあるチューブを再度１６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を、ピペットを用いて先程のチューブに移した。得られた沈殿と上清はそれぞれ、－３０℃、４℃で保存した。
７）凍結（－３０℃）したｃＰｌｇに、数ｍＬのＴＢＳ／Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．４（２５℃））／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０）を添加して沈殿を溶解し、この溶液を他の凍結ｃＰｌｇを含むチューブに順次移し、同様の操作を繰り返し、高濃度のｃＰｌｇ溶液を調製した。
８）上述で調製したｃＰｌｇ溶液を透析膜セルロースチューブ２０／３２（三光純薬）に移し、２０倍量のＴＢＳ／Ｔに対して透析を行った。２時間ごとにＴＢＳ／Ｔを５回交換し、ｃＰｌｇの精製物とした。
Ｌｏｗｒｙ法によりタンパク質を定量した。１．５ｍＬのチューブ中で、８）で得られた透析後ｃＰｌｇ ２０μＬを４０μＬの０．１ Ｍの水酸化ナトリウムで希釈した。更に、２％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＣＯ３／０．１Ｍ水酸化ナトリウムと０．５％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ／１％クエン酸ナトリウムを５０：１の割合で混合した溶液３００μＬを先のチューブに添加し、十分混和し、１５分間室温で反応させた。反応後、３０μＬのフェノール試薬を添加し、十分混和し、さらに３０分間室温で反応させた。この反応液の２００μＬを９６ウェルプレートに移し、７５０ｎｍの吸光度を測定した。２０～１００μｇ／ｍＬのＢＳＡを用いて同様の操作を行って吸光度を測定することによって検量線を作成した。この検量線に基づいて試料のタンパク濃度を算出した。
ｃＰｌｇの精製は計１１回行った。透析後のタンパク定量結果から、４４８ｍｇのｃＰｌｇが得られたことが分かった。また、溶出液１μＬをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、１０％、還元条件）に供した際に、ｃＰｌｇ以外のバンドが観察されなかったため、純度は９５％以上であると推定した。使用したイヌ血漿の総量は４０３０ｍＬであるため、収率は１１１ｍｇ／Ｌ血漿であった。
実施例４：ｃＰｌｇ開裂条件の検討
ＴＢＳ／Ｔ／Ｃａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４（２５℃））／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／１ｍＭ ＣａＣｌ２）４６．４μＬを１．５ｍＬプラスチックチューブにとり、このチューブに１．６ｍｇ／ｍＬ ｃＰｌｇ ２５．６μＬ（原液をＴＢＳ／Ｔ／Ｃａで希釈して調製）を添加し、均一に混和した。このチューブに１．５μＭ ＢＬ－ＭＡ ８μＬ（原液をＴＢＳ／Ｔ／Ｃａで希釈して調製）を添加し、均一に混和した。このチューブを３７℃のウォーターバスで加温し、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５時間目にチューブから１０μＬの反応液を取り、別の１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。このチューブを直ぐに氷上に移し，６０ｍＭ ＥＤＴＡ ２μＬを添加して酵素反応を停止させた。続いてこのチューブにＥｚＡｐｐｌｙ（AE-1430、ATTO）１２μＬを添加し、全量（２４μＬ）を電気泳動で分画した。
ＴＢＳ／Ｔ／Ｃａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４（２５℃））／１００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０／１ｍＭ ＣａＣｌ２）４６．４μＬを１．５ｍＬプラスチックチューブにとり、このチューブに１．６ｍｇ／ｍＬ ｃＰｌｇ ２５．６μＬ（原液をＴＢＳ／Ｔ／Ｃａで希釈して調製）を添加し、均一に混和した。このチューブに１．５μＭ ＢＬ－ＭＡ ８μＬ（原液をＴＢＳ／Ｔ／Ｃａで希釈して調製）を添加し、均一に混和した。このチューブを３７℃のウォーターバスで加温し、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５時間目にチューブから１０μＬの反応液を取り、別の１．５ｍＬプラスチックチューブに移した。このチューブを直ぐに氷上に移し，６０ｍＭ ＥＤＴＡ ２μＬを添加して酵素反応を停止させた。続いてこのチューブにＥｚＡｐｐｌｙ（AE-1430、ATTO）１２μＬを添加し、全量（２４μＬ）を電気泳動で分画した。
その結果、１．０～２．０時間の試料について、ｃＢＬＡＳへの変換を示す２本のバンドが観察された。さらに加温すると、上記２本のバンドのうち、下のバンドの強度がさらに増加し、ｃＰｌｇ由来のｃＢＬＡＳ以外の部分に相当する約５０ｋＤａおよび約５３ｋＤａのバンドが時間経過とともに減少した。ｃＢＬＡＳの下のバンドの強度の増強がこれらの分解物に起因する可能性も考えられた。そこで、ｃＰｌｇの開裂に最適な反応時間は１～２時間とした。
３７℃の反応温度を使用した。ＢＬ－ＭＡの至適温度はより高い温度（５０～６０℃）であるが、基質タンパク質（ｃＰｌｇ）の変性を回避するためにこの温度を選択した。
実施例５：イヌＢＬアンジオスタチン（ｃＢＬＡＳ）の調製
０．５ｍｇ／ｍＬのｃＰｌｇと１５０ｎＭのＢＬ－ＭＡをＴＢＳ／Ｔ／Ｃａ中、３７℃で２時間インキュベートした。その後、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡ－２Ｎａを添加し、反応を停止した。得られた反応液は直ちにＬｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた精製に供した。
０．５ｍｇ／ｍＬのｃＰｌｇと１５０ｎＭのＢＬ－ＭＡをＴＢＳ／Ｔ／Ｃａ中、３７℃で２時間インキュベートした。その後、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡ－２Ｎａを添加し、反応を停止した。得られた反応液は直ちにＬｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた精製に供した。
ｃＢＬＡＳを精製するためのクロマトグラフィーは１ｍＬ／分で実施した。ｃＰｌｇ量２２４ｍｇに相当する上述の反応液を６０ｍＬのＬｙｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（カラムの５倍量の平衡化緩衝液で平衡しておいた）へアプライした。その後、カラムの１０倍量の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、グラジエント溶出（カラムの５倍量；平衡化緩衝液中のＥＡＣＡ濃度を０ｍＭから８ｍＭへ増加させた）、８ｍＭ ＥＡＣＡを含む平衡化緩衝液での溶出（カラムの３倍量）によって行った。溶出画分は１０ｍＬずつ分取した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいてｃＢＬＡＳのバンドが確認された画分を、超純水に対して、超純水を用いた以外は実施例２と同様にして透析し、凍結乾燥し、生理食塩水に溶解後、０．２μｍのディスクフィルターを用いてろ過滅菌した。試料の一部を、タンパク定量（実施例２に記載のＬｏｗｒｙ法による）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度検定に供した。
４４８ｍｇのｃＰｌｇから約１４０ｍｇのｃＢＬＡＳが得られた（３５．７ ｍｇ／ｍＬのｃＢＬＡＳ溶液約４ｍＬ）。また、溶出液１μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％、還元条件）に供した際に、ｃＢＬＡＳ以外のバンドが観察されなかったため、純度は９５％以上であると推定した。ｃＢＬＡＳ溶液は、－８０℃で保存した。ｃＰｌｇおよびｃＢＬＡＳのＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量（それぞれ約１００ｋＤａおよび約３７ｋＤａ）に基づいて、回収率は約８４％と算出された（１４０／（４４８×３７／１００））。
実施例６：部分アミノ酸配列の決定
実施例１で得られたｃＢＬＡＳをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。２本のｃＢＬＡＳに相当する３６～３７ｋＤａのバンドが確認された（図１、左レーン）。ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（フルオロトランス（登録商標）、日本ジェネティクス株式会社）に転写した後、目的のバンドを切り出し、４７６Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems）を使用してＮ末端アミノ酸配列を解析した。ｃＰｌｇのＢＬ－ＭＡ消化物（未精製）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供すると、さらにいくつかのバンドが見られた（図１、右レーン）。この中で最も優勢な約５３ｋＤａのバンドも同様に配列解析に供した。
実施例１で得られたｃＢＬＡＳをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。２本のｃＢＬＡＳに相当する３６～３７ｋＤａのバンドが確認された（図１、左レーン）。ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（フルオロトランス（登録商標）、日本ジェネティクス株式会社）に転写した後、目的のバンドを切り出し、４７６Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems）を使用してＮ末端アミノ酸配列を解析した。ｃＰｌｇのＢＬ－ＭＡ消化物（未精製）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供すると、さらにいくつかのバンドが見られた（図１、右レーン）。この中で最も優勢な約５３ｋＤａのバンドも同様に配列解析に供した。
ｃＢＬＡＳの上下のバンドについて決定されたＮ末端配列はそれぞれＡｒｇ－Ｉｌｅ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ、およびＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－ＸＸＸ－Ｌｙｓであった。この配列はそれぞれｃＰｌｇのＡｒｇ７８、Ｌｅｕ８１から開始する配列に一致した。またｃＰｌｇのＢＬ－ＭＡ消化物において優勢な約５３ｋＤａのバンドのＮ末端配列はＬｅｕ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｌａであった。この配列はｃＰｌｇのＬｅｕ３４３から開始する配列に一致した。以上の結果から、ｃＢＬＡＳのＣ末端アミノ酸配列はＴｙｒ３４２であると推測した。なお、実施例４において見られた約５０ｋＤａのバンドに対応するポリペプチドのＮ末端はＶａｌ３５６であると決定され、このポリペプチドは上記の約５３ｋＤａのバンドに対応するポリペプチドがさらに分解されて生じたことが示唆された。
実施例７：ｃＢＬＡＳの活性の評価
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導されるヒト内皮細胞の血管新生に対するイヌＢＬアンジオスタチン（ｃＢＬＡＳ）の作用について、血管新生キット（Angiogenesis kit；倉敷紡績株式会社）を用いて検討した。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導されるヒト内皮細胞の血管新生に対するイヌＢＬアンジオスタチン（ｃＢＬＡＳ）の作用について、血管新生キット（Angiogenesis kit；倉敷紡績株式会社）を用いて検討した。
試験群として「生理食塩水群」（水１０ｍＬ中塩化ナトリウム８５ｍｇ）、「ＶＥＧＦ群」（ＶＥＧＦ １０ｎｇ／ｍＬ）、ならびに「ｃＢＬＡＳ群」（ＶＥＧＦ １０ｎｇ／ｍＬ＋ｃＢＬＡＳ １、１０、１００μｇ／ｍＬ、以降、「ｃＢＬＡＳ １μｇ／ｍＬ群」、「ｃＢＬＡＳ １０μｇ／ｍＬ群」、「ｃＢＬＡＳ １００μｇ／ｍＬ群」と称する）の計５群を使用して実験を行った。血管新生キット到着日（１日目）に、培地を、ｃＢＬＡＳ群についてはＶＥＧＦを含まないキット添付の培地（ＶＥＧＦ（－）培地）に試験サンプル（所定の濃度のｃＢＬＡＳ）を添加した培地に交換し、生理食塩水群およびＶＥＧＦ群については試験サンプルと同量の生理食塩水を添加したＶＥＧＦ（－）培地に交換した。２、４、７、９日目に、培地を、ｃＢＬＡＳ群についてはＶＥＧＦを含むキット添付の培地（ＶＥＧＦ（＋）培地）に試験サンプル（所定の濃度のｃＢＬＡＳ）を添加した培地に交換し、生理食塩水群についてはＶＥＧＦ（－）培地に交換し、ＶＥＧＦ群についてはＶＥＧＦ（＋）培地に試験サンプルと同量の生理食塩水を添加した培地に交換した。１１日目に血管新生染色キットの説明書に従って抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）抗体での染色を行った。画像解析システムＷｉｎＲＯＯＦ（Visual System）を使用して染色領域（染色された領域の全視野に対する割合）を測定し、得られた数値の統計学的解析をエクセル統計２００６（Ｖｅｒ．１．４１）（社会情報サービス（SSRI））を使用してＤｕｎｎｅｔｔの多重比較により行った。
生理食塩水群について測定された染色領域は２．７９±０．１３％（平均値±標準偏差）であった。ＶＥＧＦ群、ｃＢＬＡＳ １μｇ／ｍＬ群、ｃＢＬＡＳ １０μｇ／ｍＬ群、ｃＢＬＡＳ １００μｇ／ｍＬ群について測定された染色領域はそれぞれ、３．０６±０．１１％、３．００±０．１１％、２．０８±０．１９％、１．２５±０．１１％であった（図２）。ＶＥＧＦ群と比較して、ｃＢＬＡＳ １０μｇ／ｍＬ群、ｃＢＬＡＳ １００μｇ／ｍＬ群では，内皮細胞の増殖が有意に阻害された（Ｐ＜０．０１）。なお、ＶＥＧＦ群では生理食塩水群と比較して有意な血管新生が観察されなかった。生理食塩水のみでは血管新生は起こらないと考えられるので、この結果は、上記条件ではＶＥＧＦによる血管新生効果が観察されなかったことを示す。従って、上記結果は、ｃＢＬＡＳが既存の内皮細胞の生存を阻害している可能性を示唆する。以上のように、本試験条件下においてｃＢＬＡＳはヒト内皮細胞の増殖を有意に阻害することが確認された。
本発明により、天然型糖鎖を有するイヌプラスミノーゲンからアンジオスタチン様ポリペプチドを製造するための方法、およびこの方法によって得られたイヌアンジオスタチン様ポリペプチドが提供される。
Claims (6)
- イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することを含む、アンジオスタチン様ポリペプチドの製造方法。
- イヌプラスミノーゲンをバシロライシンＭＡで消化することによって得られる、アンジオスタチン様ポリペプチド。
- Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸配列の７８位のアルギニンまたは８１位のロイシンであり、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される分子量が３５～３８ｋＤａである、請求項２記載のアンジオスタチン様ポリペプチド。
- クリングル領域１～３を含み、ＮＴＰおよびクリングル領域４～５を含まない、請求項２または３記載のアンジオスタチン様ポリペプチド。
- イヌプラスミノーゲンが天然型の糖鎖を有する、請求項２～４のいずれか１項記載のアンジオスタチン様ポリペプチド。
- 請求項２～５のいずれか１項記載のアンジオスタチン様ポリペプチドを含む、血管新生阻害用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2008/072974 WO2010070746A1 (ja) | 2008-12-17 | 2008-12-17 | イヌアンジオスタチン様ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2008/072974 WO2010070746A1 (ja) | 2008-12-17 | 2008-12-17 | イヌアンジオスタチン様ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2010070746A1 true WO2010070746A1 (ja) | 2010-06-24 |
Family
ID=42268437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2008/072974 WO2010070746A1 (ja) | 2008-12-17 | 2008-12-17 | イヌアンジオスタチン様ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2010070746A1 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001151691A (ja) * | 1995-04-26 | 2001-06-05 | Childrens Medical Center Corp | アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン凝集体および使用方法 |
| JP2002355056A (ja) * | 2000-08-25 | 2002-12-10 | Pfizer Prod Inc | 脈管形成を伴う障害の診断及び治療のための組成物及び方法 |
| WO2004065595A1 (ja) * | 2003-01-17 | 2004-08-05 | Ttc Co., Ltd. | アフィニティートラップリアクター、及びそれを用いたアンジオスタチン様断片のヒト血漿からの一段階精製プロセス |
| WO2005079835A1 (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Ttc Co., Ltd. | Ｂｌアンジオスタチンを含む制がん剤 |
-
2008
- 2008-12-17 WO PCT/JP2008/072974 patent/WO2010070746A1/ja active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001151691A (ja) * | 1995-04-26 | 2001-06-05 | Childrens Medical Center Corp | アンジオスタチンフラグメント、アンジオスタチン凝集体および使用方法 |
| JP2002355056A (ja) * | 2000-08-25 | 2002-12-10 | Pfizer Prod Inc | 脈管形成を伴う障害の診断及び治療のための組成物及び方法 |
| WO2004065595A1 (ja) * | 2003-01-17 | 2004-08-05 | Ttc Co., Ltd. | アフィニティートラップリアクター、及びそれを用いたアンジオスタチン様断片のヒト血漿からの一段階精製プロセス |
| WO2005079835A1 (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Ttc Co., Ltd. | Ｂｌアンジオスタチンを含む制がん剤 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LUCAS, R. ET AL.: "Multiple forms of angiostatin induce apoptosis in endothelial cells", BLOOD, vol. 92, no. 12, 1998, pages 4730 - 4741 * |
| NARASAKI, R. ET AL.: "Bacillolysin MA, a novel bacterial metalloproteinase that produces angiostatin-like fragments from plasminogen and activates protease zymogens in the coagulation and fibrinolysis systems", J. BIOL. CHEM., vol. 280, no. 14, 2005, pages 14278 - 14287 * |
| PIRIE-SHEPHERD, S.R. ET AL.: "The role of angiostatin in the spontaneous bone and prostate cancers of pet dogs", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 292, no. 4, 2002, pages 886 - 891 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10925926B2 (en) | GLA domains as therapeutic agents | |
| DE3885419T2 (de) | Für die direkte Expression von aktiviertem menschlichen Protein-C verwendbare Vektoren und Zusammensetzungen. | |
| Dubey et al. | Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources | |
| CN102121023B (zh) | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 | |
| Hwang et al. | Purification and characterization of a new fibrinolytic enzyme of Bacillus licheniformis KJ-31, isolated from Korean traditional Jeot-gal | |
| EA028228B1 (ru) | Гидролизующая глютеновые олигопептиды эндопептидазная композиция, способ ее получения и применение | |
| CN104560924B (zh) | 一种鼠妇纤溶酶及其应用 | |
| JPH022376A (ja) | 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| WO2010070746A1 (ja) | イヌアンジオスタチン様ポリペプチド | |
| US8017750B2 (en) | Haemocoagulase | |
| CN101627052A (zh) | 激活酚氧化酶原系统的蛋白及其编码基因 | |
| KR20150004009A (ko) | 만가닥버섯으로부터 유래된 피브린분해 알파 키포트립신계 세린 메타로프로테아제 및 그 정제방법 | |
| RU2236460C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
| EP1111054B1 (en) | A new gene of human lysoenzyme, the encoding polypeptide and methods for preparing them | |
| CN102258483B (zh) | 一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂 | |
| KR101263670B1 (ko) | 스트렙토마이세스속 균주로 부터 혈전용해 효소의 제조 방법 | |
| US20110200541A1 (en) | Recombinant preparation of bromelain inhibitors and bromelain inhibitor precursor | |
| US20110092442A1 (en) | Anticancer agent containing bl-angiostatin | |
| KR100453574B1 (ko) | 곤충 유래의 혈전용해성 세린프로테아제와 그 추출방법 및이를 이용한 식·의약조성물 | |
| JP4190753B2 (ja) | 血管新生阻害活性をもつプラスミノゲン断片およびその生成を導く化合物の探索方法 | |
| JPH05504679A (ja) | ラクトペルオキシダーゼの組み換え体の生産 | |
| JP2008106064A (ja) | ｔ−ＰＡ亢進物質及びその製造方法 | |
| KR101884394B1 (ko) | 비브리오 프루니씨 유래 재조합 혈전분해 효소 및 이의 용도 | |
| JP3680131B2 (ja) | 耐病性誘導活性を有するタンパク質 | |
| JP2002272453A (ja) | 新規なアンジオスタチン変換酵素、該酵素の生産菌、該酵素の製造方法、該酵素の利用によるアンジオスタチンおよび活性型セリンプロテアーゼの製造 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08878914 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 08878914 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: JP |