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CN112724259A - 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途 - Google Patents

人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途 Download PDF

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CN112724259A CN202011280409.5A CN202011280409A CN112724259A CN 112724259 A CN112724259 A CN 112724259A CN 202011280409 A CN202011280409 A CN 202011280409A CN 112724259 A CN112724259 A CN 112724259A
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Abstract

本发明涉及人血清白蛋白(特别是野生型人血清白蛋白)与人白介素‑2(特别是突变型人白介素‑2)的融合蛋白。所述融合蛋白具有相对于重组白介素‑2显著延长的体内半衰期，从而能够单独用于治疗肿瘤。而且，所述融合蛋白能够显著提高抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体的抗肿瘤功效。

Description

人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及人血清白蛋白(特别是野生型人血清白蛋白)与人白介素-2(特别是突变型人白介素-2)的融合蛋白。所述融合蛋白具有相对于重组白介素-2显著延长的体内半衰期，从而能够单独用于治疗肿瘤。而且，所述融合蛋白能够显著提高抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗肿瘤功效。
背景技术
(一)人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR,“Albumin structure,Function,and Uses”Pergamon,N.Y.，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物，特别是毕赤酵母工程菌生产重组表达白蛋白(rHSA)已在于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。
白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为20天。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率,在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果(于在林、富岩，更优生物创新药-重组人血清白蛋白融合蛋白，中国医药生物技术，2017,12(3):248-264)。
(二)人白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)是一种天然的细胞因子，1976年由Doris A.Morgan等人首次发现。由活化的T淋巴细胞(辅助型T细胞)在抗原或有丝分裂刺激下产生，IL-2具有免疫调节活性，对机体免疫系统有直接增强上调作用功能，也对抗体依赖性的免疫调节或体液(细胞)免疫反应均具有上调增强机制，IL-2是人体至关重要的细胞因子之一。IL-2具有4个反平行的、两亲性α螺旋，此4个α螺旋形成其功能必不可少的四级结构。IL-2通过三种不同受体起作用：IL-2受体α(IL-2Rα；CD25)具显著刺激和增强细胞因子产生和快速释放的体内作用功能，也是过量增强时导致细胞因子风暴，免疫过激反应的关键细胞因子。IL-2受体β(IL-2Rβ；CD122)和白介素-2受体γ(IL-2Rγ；CD132)，则对于IL-2的信号传导，特别是抑制肿瘤细胞生长起着至关重要的作用。IL-2在人血清白蛋白的不同端直接融合，以及IL-2经氨基酸替换(变异)后，并与白蛋白形成一种融合蛋白，就可产生意想不到的长效性，避免产生细胞因子风暴的形成、增强或不降低其与IL-2Rβ/γ的结合能力，产生抑制肿瘤细胞生长等新的生物学功能，这可在临床肿瘤治疗中发生显著新临床应用功能(疗效)。
重组人白细胞介素-2，又称Aldesleukin(Proleukin)，是一种有效的抗癌药物。其血液半衰期仅3.5h左右，临床血液频繁给药，不利于患者的依从性和临床疗效。重组白介素-2的上市药品与表达于免疫细胞表面的高亲和性IL-2受体相互作用，刺激细胞因子大量释放，包括各种干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factors，TNF)和其它细胞因子，诱导多种细胞增殖和分化，包括B和T细胞,单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)和淋巴因子激活杀伤细胞(lymphokine activated killer，LAK)。IL-2抗肿瘤活性被认为是细胞毒性淋巴细胞激活的结果。IL-2药物提高白介素-1、肿瘤坏死因子α/β、γ干扰素和白介素-6的水平。IL-2通过与细胞表面受体结合作用于免疫细胞，IL-2与受体相互作用的数量和性质决定了对细胞影响的大小。天然的IL-2能激活β和γ受体细胞发挥抗肿瘤活性,但是天然IL-2会优先结合免疫细胞上的α受体(CD25)，这些免疫细胞就会引起很大的副作用,如严重毒性和免疫抑制，形成细胞因子风暴。rIL-2有很大毒副作用，包括危及生命的、有时是致命的血管泄漏综合征(vascular leak syndrome，VLS)，以及它的半衰期短，需要每天给药3次，疗程超过8天，限制了它的临床用途。临床上患者有对具药物长效化的显著临床需求。
到目前为止，所有批准的IL-2疗法，包括aldesleukin,CAR-T都会有优先激活非靶细胞的特征，这也是其在临床应用上受到巨大限制的缘故。
IL-2免疫治疗已在各种临床试验中得到证实，IL-2单独或与LAK联合使用，可抑制不同免疫原性和非免疫原性小鼠癌症的肺和肝转移的发展。对晚期癌症患者的早期研究显示，单独或联合LAK的高剂量IL-2治疗可介导癌症的完全或部分消退。
为改善IL-2与IL-2的α受体相结合产生的严重细胞因子风暴，形成严重的毒副反应和免疫激荡，科学家开展了各种各样的创新性研发，例如类IL-2样的药物NKTR-214、ALKS4230、THOR-707等，其研发过程都可谓一波三折，并不稳定。
1.Nektar公司研发的新药NKTR-214，是一种CD122偏向性细胞因子激动剂，与聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)结合，旨在通过异二聚体IL-2受体途径(IL-2R)提供持续信号，由调节型T细胞(regulatory T cells，Treg)优先激活和扩大CD8+T和NK效应细胞。NKTR-214单独用药试验失败。Plainview报告表明，NKTR-214单药疗法在EXCEL试验与以前的IL-2单药疗法总有效率(Overall Response Rate，ORR)为15-29％相比，显示出0％的ORR(0/28)。淋巴细胞需要增加200-300％时才能达到临床疗效，但NKTR-214只能提高33-50％的淋巴细胞，其治疗效果太弱。
2.ALKS4230是Alkermes公司研发的另一种白细胞介素-2样药物，一种由循环排列的IL-2和IL-2受体(IL-2R)组成的工程融合蛋白，用于选择性激活具有中度亲性的IL-2R。ALKS 4230的选择性旨在克服其局限性的同时，充分利用IL-2疗法的抗肿瘤作用。第一阶段研究的初始数据显示出ALKS 4230的独特机制，对循环自然杀伤细胞和CD8+T细胞具有剂量依赖性药效效应，对免疫抑制调节性T细胞具有最小和非剂量依赖性效应。
根据最初单药剂量递增队列的数据，2018年9月展开了ALKS 4230在给药量为3μg/kg/day条件下的研究。Alkermes在ALKS 4230单独给药疗法中，也将继续加大剂量展开研究。目前，ALKS4230的药物应用尚未成功。
3.Synthorx公司正在开发THOR-707，也是一种IL-2的“非α”Synthorin,用于治疗实体瘤。分析在同源小鼠肿瘤模型中THOR-707的作用表明，单独和联合使用PD-1抑制剂，THOR-707诱导CD8+T效应细胞向肿瘤浸润，可产生抗肿瘤作用。在临床前研究中，THOR-707在体内诱导T细胞活化和外周NK和CD8+效应T细胞增殖的分子标记物。Synthorx预计将于2019年与THOR-707开始一期临床试验。
4.Proleukin公司的Aldesleukin(rhIL-2)，用于治疗成人转移性肾细胞癌和成人转移性黑色素瘤，已被用作癌症患者无其他治疗选择时的最后治疗药物。
5.IL-2氨基酸位点突变，Oliver AST等(US2018/0142037)提出在IL-2的氨基酸残基位置42,45和72上引入三重突变F42A/Y45A/L72G来降低对IL-2Rα受体的亲合力。AronM.Levin等(Nature,Vol 484，p529-533,DOI:10.1038/nature10975)提出一种称作“superkine”的IL-2突变体IL-2H9，该突变体包含五重突变L80F/R81D/L85V/I86V/I92F，具有增强的IL-2Rβ结合，由此提高了对CD25-细胞的刺激作用。Rodrigo Vazquez-Lombardi等人(Nature Communications,8:15373,DOI:10.1038/ncomms15373)提出一种三重突变人IL-2突变蛋白IL-2 3X，该蛋白在氨基酸残基位置38,43和61分别具有残基突变R38D/K43E/E61R，导致该突变蛋白对IL-2Rα不结合，以达到消除IL-2对CD25+细胞的激活偏向性。但是，IL-2 3X对CD25+细胞的激活偏向性依然存在，且该突变蛋白半衰期极短，临床难于考察到成药性，表达量水平低，也不利于后续作为药物大规模生产。
但是上述PEG修饰或是少量IL-2氨基酸序列的替换、突变，均未能很好地在改善IL-2的细胞因子毒性，或是解决产生制造的稳定性问题、特别是都在生产成本上均具各种各样的问题。例如2019年NKRT-214，一种由6条PEG修饰的IL-2产品，就产生严重的产品批次生产的不可重复的制造稳定性问题。消息爆出导致Narkert Thereaputic公司的股价暴跌40％以上，展示出药物生产制造过程(CMC)也是保证药物质量稳定性的最关键性因素。
(三)PD-1/L1抗体药物
蛋白质PD-1全称是程序性死亡受体1，英文名字为programmed cell death-1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，其位于T细胞表面。蛋白质PD-L1全称是程序性死亡受体-配体1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，其位于肿瘤细胞的表面。当T-细胞与肿瘤细胞相遇，PD-1可与PD-L1相结合，阻止T细胞识别肿瘤细胞，并导致T细胞的死亡(凋零，programma deathy)。使用PD-1抑制剂(例如，抗PD-1蛋白的特异性抗体)可阻断PD-L1蛋白与PD-1受体的结合，使T细胞正常发挥杀死肿瘤功效。使用PD-L1抑制剂(例如，对PD-L1蛋白特异性的抗体)可阻断肿瘤细胞上的PD-L1蛋白与T细胞上的PD-1受体结合，也可使T细胞正常发挥杀死肿瘤功效。
PD-L1/PD-1抗体属于免疫检查点阻断药物，帮助T细胞揭开肿瘤细胞伪善的面纱，恢复其对肿瘤细胞识别和杀伤。目前获批的PD-1/PD-L1药物主要有5种(PD-1药物：Keytruda和Opdivo，PD-L1药物：Tecentriq，Imfinzi和Bavencio)。国产PD-1/L1抗体则主要有：特瑞普利单抗、信迪利单抗和卡瑞利珠单抗等。PD-1/L1单抗真正的临床疗效也仅仅是15-30％而已，还有显著的副反应。有特别急需提高临床疗效的实际需求。
本发明以现有的IL-2在临床上遇到的影响临床疗效和白介素-2类似物，变异体氨基酸替换等现有研发中的产品遇到的问题、以及PD-1/L1抗体药物在临床上疗效不佳的不足点作为技术创新，药物分子结构创新，希望获得肿瘤患者可以至少可每两周给药一次，患者依从度可大大提高，生产制备费用仅为Netkar的PEG-化白介素-2的1/300的产品，同时还解决野生型人白介素-2的不足，所发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的药物分子结构上，决定其不与IL-2的α受体(CD25)相结合，可显著减少产生细胞因子风暴类的免疫过激毒副反应，患者的治疗费用更会大大降低的创新药物结构；本发明的类似物融合蛋白也与白介素-2β、γ受体结合力因氨基酸替换有目的地人为设计和变异，而提高抑制肿瘤生长的能力。特别是当与PD-1/L1抗体药物联用是，又可提高PD-1/L1抗体的肿瘤抑制功能，提高临床疗效、抑制肿瘤瘤体的增生。本发明将有利于更多急需要治疗，而在依从度和治疗费用受到限制用药的人群接受必须的治疗，为此获得意想不到的技术优势和创造性。
发明概述
本发明涉及人血清白蛋白和人白介素-2的融合蛋白。
在一个方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白成熟肽和人白介素-2成熟肽。在一个实施方案中，所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽直接连接。在一个实施方案中，所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽经由肽接头间接连接。在一个实施方案中，所述人白介素-2成熟肽以其C端与所述人血清白蛋白成熟肽的N端融合。在一个实施方案中，所述人白介素-2成熟肽以其N端与所述人血清白蛋白成熟肽的C端融合。在一个实施方案中，所述人血清白蛋白成熟肽具有野生型人血清白蛋白成熟肽序列，例如如SEQ ID NO.9所示。在一个实施方案中，所述人血清白蛋白成熟肽具有突变型人血清白蛋白成熟肽序列。在一个实施方案中，所述人白介素-2成熟肽具有野生型人白介素-2成熟肽序列，例如如SEQ ID NO.10所示。在一个实施方案中，所述人白介素-2成熟肽具有突变型人白介素-2成熟肽序列，例如相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含下述替代中的一项或多项：T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A。在一个实施方案中，所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于如SEQ ID NO.10所示野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代。在一个实施方案中，所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于如SEQ ID NO.10所示野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代。在一个实施方案中，相对于野生型人白介素-2成熟肽包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代的突变型人白介素-2成熟肽以其C端与人血清白蛋白成熟肽的N端直接连接。在一个实施方案中，相对于野生型人白介素-2成熟肽包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代的突变型人白介素-2成熟肽以其N端与人血清白蛋白成熟肽的C端直接连接。在一个实施方案中，所述融合蛋白具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
在一个实施方案中，所述融合蛋白具有下述一项或多项特性：
(a)具有与野生型人白介素-2相比减弱的人IL-2α受体(CD25)结合；
(b)不结合人IL-2α受体(CD25)；
(c)具有与野生型人白介素-2相比增强的IL-2β受体(CD122)和IL-2γ受体(CD132)结合；
(d)具有与野生型人白介素-2或其氨基酸序列变体相比延长至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多的体内半衰期；
(e)具有与野生型人白介素-2相比降低的细胞毒性；
(f)具有与野生型人白介素-2相比升高的抑制肿瘤生长的活性；和/或
(g)将抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体抑制肿瘤生长的活性提高至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多。
在一个实施方案中，所述融合蛋白用作药物。在一个实施方案中，所述融合蛋白用于治疗肿瘤。在一个实施方案中，所述融合蛋白用于治疗癌症。在一个实施方案中，所述融合蛋白用于治疗癌性腹水。在一个实施方案中，所述融合蛋白单独使用。在一个实施方案中，所述融合蛋白与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合使用。
在一个方面，本发明提供一种核酸，其编码本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，所述核酸具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQID NO.8。
在一个方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸。在一个实施方案中，所述载体是克隆载体或表达载体。在一个实施方案中，所述载体是质粒载体或病毒载体。
在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的核酸，或者包含本发明的载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞、巴斯德毕赤酵母细胞或CHO细胞。
在一个方面，本发明提供一种生成本发明的融合蛋白的方法，其包括培养本发明的宿主细胞，使得所述融合蛋白生成。在一个实施方案中，所述方法还包括分离和/或纯化所述融合蛋白。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白。
在一个方面，本发明提供本发明的融合蛋白制备用于治疗肿瘤的药物的用途。在一个方面，本发明提供本发明的融合蛋白制备用于治疗癌症的药物的用途。在一个方面，本发明提供本发明的融合蛋白制备用于治疗癌性腹水的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物单独使用。在一个实施方案中，所述药物与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合使用。
在一个方面，本发明提供一种治疗肿瘤的方法，其包括对具有肿瘤的受试者施用本发明的融合蛋白。在一个方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括对具有癌症的受试者施用本发明的融合蛋白。在一个方面，本发明提供一种治疗癌性腹水的方法，其包括对具有癌性腹水的受试者施用本发明的融合蛋白。在一个实施方案中，所述方法还包括对所述受试者施用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
附图说明
图1.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白毕赤酵母工程菌在500L发酵罐发酵，在不同时间的上清液中目的蛋白表达结果。
图2.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白Capto-MMC柱层析纯化结果。
图3.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白精纯原液的还原(Reducing)和非还原(Non-Reducing)的SDS-PAGE蛋白电泳图。
图4.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白原液的凝胶高效液相色谱(SEC-HPLC)测量纯度图。
图5.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白SDS-PAGE胶图(A)及Western-blot(B)显示出融合蛋白与人白介素-2特异抗体具显著免疫反应。
图6.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白皮下给药后在大鼠中的血药浓度测定及半衰期测定图。
图7.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白中的9555(融合蛋白分子结构为：rIL-2v5/SA)在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的相对肿瘤体积变化。
图8.以重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白类似物9555单用或与PD-1抗体Keytruda联用，在第2天、第5天和第7天小鼠实体肿瘤抑制增生的疗效结果图。
图9.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白中的9777(融合蛋白分子结构为：rHSA/IL-2v7)在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的相对肿瘤体积变化。
图10.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的肿瘤生长抑制作用，特别是在停药后肿瘤增生的变化情况。左图是给药5天时肿瘤生长状况(肿瘤生长获得严重抑制)；右图则是停药3天后的第5-8天期间，小鼠体内肿瘤在没有药物抑制的情况下，显示肿瘤又快速增长发育。所有受药组小鼠的肿瘤药物抑制或停药后的表现均一致。
图11.显示本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白具有明显的定向激活分化CD8+细胞、抑制Treg细胞的结果，与NKTR-214的结果(2019ASCO)极为相似。图11中虚线圆圈标示的G2组(重组人白介素-2v5/血清白蛋白融合蛋白，rhIL-2v5/SA，代码：9555，G2代表给药剂量为2mg剂量组)，在CD8+细胞具显著的增生提升作用；在Treg细胞具显著抑制增生和下降的趋势。
发明详述
本发明是为了解决野生型IL-2的短效、野生型IL-2与CD25(IL-2的α受体)结合，所导致的临床上患者发生严重“细胞因子风暴”毒副反应、在抑制肿瘤瘤体生长作用上不显著等上述技术问题，所提出的一种全新重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白分子结构、作为药物在临床上的用途和药物制备生产方法。
本发明涉及生物技术领域，具体地是在抗肿瘤上具有显著优于人白介素-2的长效抗肿瘤功效，特别是成人转移性肾细胞癌(RCC)及黑色素瘤等恶性肿瘤，也适用于癌性胸腹水控制药物的用途重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白；更特别地是，该重组融合蛋白及其类似物在与PD-1/L1单克隆抗体药物联用时，可提高PD-1/L1抗体药物的抗肿瘤功效至少1倍以上。本发明还公开了重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的制备生产方法和其在临床上作为生物创新药中的用途。
通过本发明制备的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，可作为用于肿瘤治疗的创新分子结构，达到具两周或更长间隔给药一次，具显著优于已上市的重组白介素-2的长效性。该重组融合蛋白及其类似物融合蛋白在与PD-1/L1单克隆抗体药物组合联用时，具显著降低与IL-2Rα受体结合能力，在抑制肿瘤生长上又可显著提高PD-1/L1抗体药物的抗肿瘤功效至少1倍以上，显著降低细胞因子风暴的发生，具更少给药频次、更优临床疗效、更低的生产成本。
本发明是按照以下技术方案实现的。
用于治疗肿瘤的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.2。
用于治疗肿瘤的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.3。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.4。
用于治疗肿瘤的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.5。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.6。
用于治疗肿瘤的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.7。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.8。
所述的用于肿瘤治疗的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，其特征在于：SEQ ID No.5的氨基酸序列相对于野生型人白介素-2融合蛋白SEQ IDNo.3，其中有5个氨基酸被特异定点替换，分别是T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A。
所述的用于肿瘤治疗的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，其特征在于：SEQ ID No.7的氨基酸序列相对于野生型人白介素-2融合蛋白SEQ IDNo.1，其中有7个氨基酸被特异定点替换，分别是T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A。
所述的用于肿瘤治疗的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的白介素-2成熟肽蛋白质氨基酸序列，与人白蛋白直接融合蛋白，白介素-2置于白蛋白成熟肽的不同端，以及融合蛋白中的白介素-2基因经特异的氨基酸替换、经不同氨基酸替换，可达到降低与CD25受体(白介素-2Rα)结合的能力；可提高类似物融合蛋白与白介素-2Rβ、Rγ(CD132/CD122)结合的能力，结果可大大提高抑制肿瘤生长的能力。白介素-2类似物融合蛋白基因中的C125A的氨基酸替换，则可减少白介素-2融合蛋白在生产制备中的形成二聚体的机率。所有重组蛋白质制备中，二聚体的形成均是与临床上免疫原性(毒副反应发生)的发生有着直接的相关性。
进一步的，所述的用于肿瘤治疗的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，其特征在于：人白介素-2或变异体类似物成熟肽的C端与人血清白蛋白的N端直接连接(SEQ ID No.3或如SEQ ID No.5)；人白介素-2或变异体类似物成熟肽的N端与人血清白蛋白的C端直接连接(SEQ ID No.1或如SEQ ID No.7)。人血清白蛋白氨基酸序列可为天然或变异的或是人白蛋白的片段。
进一步的，所述用于肿瘤治疗的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，其特征在于：人白介素-2类似物融合蛋白不与CD25(又称人白介素-2alpha受体)结合或是弱结合，可显著降低野生型人白介素-2细胞毒性和可提高疗效。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因通过重组工程宿主细胞表达；所述重组工程宿主细胞为酵母菌、植物、细菌或者动物细胞(例如昆虫细胞，例如CHO细胞)；重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因通过质粒DNA载体表达、病毒载体表达、或转基因技术转移到植物和动物体内表达。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因选用基因工程技术构建来表达；获得融合蛋白的方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达重组融合蛋白。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因选用酵母表达载体来转化毕赤酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。
进一步的，所述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因表达的酵母属宿主为毕赤酵母属巴斯德菌种。
上述用于治疗肿瘤适应症的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的高密度表达、生产制备的方法，包括以下步骤：
a.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白载体质粒的构建及表达
以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反应来合成、扩增HSA基因；经电泳分离纯化HSA DNA片断，将其克隆至酵母表达载体，获得pYZ-HSA重组质粒；采用DNA全序列合成法来人工合成人白介素-2或其类似物核苷酸序列；用酶切合成的目的基因人白介素-2突变类似物基因和pYZ-HSA重组质粒，并将二者进行连接，获得pYZ-HSA/IL-2不同的融合蛋白基因或其类似物融合蛋白表达重组质粒；
b.毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将pYZ-HSA/IL-2不同基因融合或其类似物融合蛋白基因重组质粒经Pme I限制性内切酶处理后点转入毕赤酵母X33感受态细胞，转化后的酵母菌接种于含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上进行培养；
c.重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5％甲醇；每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；
d.大规模高密度表达生产重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白
使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加；产量不低于3克/L发酵上清液。
上述用于治疗肿瘤适应症的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的纯化方法，将酵母工程菌高密度发酵，直接分泌到发酵上清液中的可溶性、具完整分子结构的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，通过如下3步富集、纯化生产工艺，可获得的纯度不低于95％，符合药用级别的原料药(原液)。洗脱中的目的蛋白纯度高，并且回收率可观。该精纯方法依融合蛋白的分子结构(氨基酸序列的不同)而不同，但简单易行。
a.亲和层析柱：重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白酵母工程菌发酵上清液(代码为不同白介素-2融合蛋白分子结构)均直接采用美国GE公司的Capto-MMC填料介质启动第一级分离纯化、富集目的蛋白(见实施例)。
b.疏水介质层析柱：不同重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白需采用不同的介质，用于第二步的分离纯化、富集的目的。例如：辛基、丁基、苯基介质填料(Outyl SepharoseTM High Performance，Butyl SepharoseTM High Performance或Phnyl High Performance，PFP)(见实施例)。
c.第3步纯化分离层析柱：按不同的融合蛋白需采用相同或不同的Q FF或Capto-DEAE填料进一步精纯，获得重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白符合临床注射给药的原液(原料药)纯度要求(见实施例)。
必要时，融合蛋白可按常规方法，层析法(Sephacryl S-200HR)或膜透析法浓缩，获得高浓度原液，用于符合临床用药制剂成品的生产。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白可制备成冻干粉针剂剂型，优选地是水针剂剂型，进一步更优选地是预充式注射器给药剂型。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白其在动物和人体中的药物代谢半衰期比上市成品重组人白介素-2，具4-10倍的半衰期，具长效性。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在制备治疗肿瘤适应症药物中的用途，其可达到每2周给药一次或是更少的给药频次。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在癌性腹水的临床治疗用药物制备上的用途。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在与PD-1抗体组合联用，可显著增强PD-1抗体的抗肿瘤功效至少1倍、2倍、5倍、10倍或以上。
上述重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在与PD-L1抗体组合联用，可显著增强PD-L1抗体的抗肿瘤功效。
本发明获得了如下有益效果。
本发明将人白介素-2及其类似物变异体成熟肽基因的C-端与人的血清白蛋白基因的N-端直接进行分子融合，之间不设有联接肽。本发明将人白介素-2及其类似物变异体成熟肽基因的N-端与人的血清白蛋白基因的C-端直接进行分子融合，之间不设有联接肽。通过研究和多次反复试验，构建了长效化重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白表达毕赤酵母工程菌。建立了新的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白特异分离纯化的技术和方法。酵母菌表达的融合蛋白是完整分子结构、直接分泌可溶型的，其可与特异识别人血清白蛋白的抗体相结合，也可与特异识别人白介素-2的抗体相结合。
本发明中的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白核苷酸可利用重组基因克隆技术引入宿主细胞，以使融合蛋白得以表达。工程宿主细胞可以在含常规营养物的培养基中培养，并经过适当修改以利于启动子高效工作。以适当的操作方式控制选择转化子或扩增编码重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的核苷酸链的培养条件，如温度，pH和选择高表达细胞工程株。
本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白基因(核苷酸序列)表达需要通过重组工程宿主细胞表达。重组工程宿主细胞可以是酵母菌、植物细胞、细菌或者动物细胞(例如昆虫细胞，例如CHO细胞)，可以直接通过质粒DNA载体表达、可以通过病毒载体表达、也可以通过转基因技术转移到植物和动物体内表达。
在本发明中提到的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，优选使用基因工程技术构建来表达。获得融合蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达融合蛋白。特别优选的是利用可转化的酵母表达载体，来转化毕赤酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。优选的用于表达重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的酵母属宿主可为毕赤酵母属巴斯德菌种。利用酵母菌表达重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的优势在于，酵母菌体系可以产生高质量成熟的融合蛋白，并可以分泌到培养液中而便于纯化。
酵母菌遗传工程的进展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量、蛋白质为可溶性的、蛋白质结构具正确的折迭和易于大规模生产和纯化。
本发明提供了利用酵母菌来更有效地及节省费用地生产制造重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白。本发明也以实施例的方式提供和公开了表达这种高产无热源重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的毕赤酵母工程菌的吨级规模化发酵工艺和融合蛋白分离纯化的方法，该蛋白在毕赤酵母菌在1000L发酵罐中的表达量不低于1g/L，纯化后的纯度可达99％，并且内毒素含量≤0.5EU/mg。
本发明设计了复合式新型弱阳离子交换层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析顺序组合来去除杂蛋白、糖类、脂类、宿主蛋白等杂质，最终得到高纯度蛋白。
本发明使用毕赤酵母菌表达系统制备重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，经由这一系统制备的重组蛋白药物完全适合于临床应用，本发明研发的创新药原液中的宿主蛋白残留量也符合2015版中国药典三部的要求。
本发明也完成高剂量蛋白质药物水针剂的25℃快速试验确保新剂型的稳定性不存在问题(25℃长期稳定性考察6个月相当于，该制剂可在规定2-8℃保藏条件下可稳定保藏3年)。
本发明使得在规模化后生产的长效重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白注射液或冻干粉针剂(规格：5mg/ml)，其生产成本将在5元-10元之间。现在市场销售中已经有重组人白介素-2产品，生产成本高而销售价格在竞争中日益下滑。可达到2周给药1次的本发明长效重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白则是新一代人白介素-2药物的升级换代产品，其生产成本低，产能大，注射次数少，完全可以逐步取代现有短效和长效PEG化的人白介素-2及其类似物、变异体等产品。本发明的技术在市场竞争中具有极大的和明显的优势。
本发明特别构建的不同分子结构的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在动物实验中展示不同的生物学功能，特别是在与PD-1或PD-L1抗体药物联用时。这些意想不到的新生物学功能，确定是可能带来临床巨大潜在用途。动物实验确认了不同的白蛋白与白介素-2融合蛋白分子结构、白介素-2氨基酸序列上发生不同的氨基酸替换，在单独用于抑制肿瘤生长或与PD-1抗体药物联用时，抑制肿瘤效果具显著不同。可显著增强PD-1抗体的抗肿瘤功效至少1倍、2倍、5倍、10倍或以上。
在附图和具体实施方案中是为了进一步说明本发明。然而，这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围。
实施例
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：人血清白蛋白(HSA)基因表达及载体质粒的构建
以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反应来合成、扩增HSA基因。5微克总RNA在反转录酶(购自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相对应的DNA链。反应条件为45℃，20分钟，而后升温至55℃，继续保温40分钟。
所使用的寡聚核苷酸引物DNA序列为：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
两个EcoRⅠ识别位点分别加在HSA基因的两端克隆入一表达载体。PCR反应条件为94℃，4分钟，编码HSA的DNA进一步扩增35个循环反应：94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，2分30秒。循环反应结束时，再给予72℃，10分钟的延长反应。凝胶电泳显示PCR扩增产物长约1850碱基对。PCR产物利用TA克隆的方法插入PCRII载体(Invitrogen公司)。所得质粒命名为PCR-HSA。DNA测序结果表明其翻译的HSA氨基酸序列与GenBank公开的人血清白蛋白氨基酸序列相同(GenBank，Access#V00494)。用EcoRⅠ限制性酶消化PCR产物，经电泳分离纯化HSADNA片断，将其克隆至酵母表达载体(pYZ载体，购自天津溥瀛生物技术有限公司)。经转化DH5a感受态细胞，在含有抗生素Zeocin的低盐LB-琼脂平板上筛选阳性单克隆，其经检定对HSA基因插入的质粒命名为pYZ-HSA(见图1，pYZ-HSA重组质粒EcoRⅠ&XhoⅠ酶切鉴定，目的条带大小约1850bp，与预期目的条带大小一致。测序确认正反向)。
克隆所获得的人血清白蛋白(HSA)成熟肽氨基酸序列为SEQ ID No.9序列，由发明人YU.Z/FU Y注册保存在GeneBank，ACCESS#：AY728024。
实施例2：重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白表达及载体质粒的构建
根据GeneBank注册号：NM_000586，NP_000577.2获得人白介素-2(野生型)成熟肽的氨基酸序列SEQ ID No.10，发明人设计重组人血清白蛋白融合蛋白的分子结构，将白介素-2成熟肽以“无缝连接”方式，之间不设连接肽分别置于人血清白蛋白成熟肽的C末端，SEQ ID No.1，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.2，或将白介素-2成熟肽以“无缝连接”方式，之间不设连接肽分别置于人血清白蛋白成熟肽的N端，SEQ ID No.3，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
根据已知计算机分析和文献，以及IL-2与细胞表面3个受体结合的分子模型，经发明人多次试验选择IL-2不同的点突变、共突变，并开展突变体的细胞水平生物活性测定、动物肿瘤模型测定分析，发明人设计重组人血清白蛋白融合蛋白的分子结构，将白介素-2成熟肽突变体类似物，氨基酸替换后，以“无缝连接”方式，之间不设连接肽分别置于人血清白蛋白成熟肽的N端，SEQ ID No.5，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.6。SEQ ID No.5的氨基酸替换与野生型IL-2(对应SEQ ID No.10)相比，共有5个氨基酸发生替换，分别是T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A。
发明人也将白介素-2成熟肽以“无缝连接”方式，之间不设连接肽分别置于人血清白蛋白成熟肽的C末端，SEQ ID No.7，对应的核苷酸序列为SEQ ID No.8。SEQ ID No.7中的氨基酸替换与野生型IL-2(对应SEQ ID No.10)相比，共有7个氨基酸发生替换，分别是T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A。
为此，按rhIL-2v5/SA成熟肽氨基酸序列，也可采用DNA全序列合成法来人工合成IL-2突变体成熟肽的核苷酸序列。人工合成时可分别在其N端加上XhoⅠ酶切位点，在其C端加上人血清白蛋白成熟肽序列至Ale I酶切位点。可用这两个酶分别酶切合成的目的基因IL-2v5和pYZ-HSA中的HSA基因序列形成重组质粒。分泌肽则可使用酵母菌的α-因子分泌目的基因IL-2v5与HSA基因连接的重组序列。具体步骤：将酶切后的目的基因IL-2v5与HSA重组DNA质粒按一定比例混合，并加入连接缓冲液和连接酶，22℃连接1小时；连接产物转化DH5α感受态细胞，具体步骤：将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入培养基置于摇床中，150rpm，45分钟，12000rpm离心1分钟，涂板。测序验证，具体步骤：挑取单克隆，扩大培养，小量提取质粒，酶切鉴定，挑选出酶切得到与目的片段大小一致的质粒，并进行测序确认，测序引物为正向SEQ ID No.13(P1)和反向SEQ IDNo.14(P9)。将最终全测序确认的质粒命名为pYZ-rhIL-2v5/SA。
实施例3：毕赤酵母Pichia pastoris表达工程菌的转化和制备
将毕赤酵母菌菌株X33菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml离心管中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M山梨醇溶液洗涤一次。
以实施例2中构建的pYZ-rhIL-2v5/SA质粒DNA为例，该质粒DNA经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5μg线性化后质粒DNA与80μl处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于电转仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。
实施例4：重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600＝2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，细胞密度达到OD600＝1.0，继续培养。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的表达，筛选表达目的特异蛋白质的重组酵母工程菌株。
实施例5:大规模高密度表达重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白
本发明使用500L和1000L(吨级)生物发酵罐系统分别开展了重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的吨级规模化生产和发酵工艺以及公斤级重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的制备工艺和技术建立。重组酵母工程菌按研发的工艺程序制备工程菌种子库。取一支工程菌工作种子库种子管接种到三角瓶中，从小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐(1吨体积)。经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加。待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。可在不同培养时间点取样测试重组蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果显示发酵液中的rhIL-2/SA蛋白的表达水平在3-10g/L左右。图1.重组重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白赤酵母工程菌在500L发酵罐发酵，在不同时间的上清液中目的蛋白表达结果。其中从左至右泳道1：自制MK(分子量由上至下：83KD，66KD)；泳道2：诱导表达52小时的还原rhIL-2/SA，分子量～81.6kD；泳道3：诱导表达72小时的还原rhIL-2/SA，分子量～81.6kD；泳道4：诱导表达52小时的非还原rhIL-2/SA，分子量～81.6kD；泳道5：诱导表达72小时的非还原rhIL-2/SA，分子量～88.6kD；泳道6：蛋白质标准分子量(由上至下：97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD，14.4kD)。SDS-PAGE分为非还原SDS-PAGE和还原SDS-PAGE，均是变性条件下的电泳。还原和非还原SDS-PAGE的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如DTT或2-巯基乙醇等)。
实施例6：分泌的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的纯化与特性
重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白经酵母工程菌发酵培养直接分泌到上清液。经连续流离心将含有分泌出的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白上清液与菌体分离后，柱层析纯化首先采用美国GE公司的复合式新型弱阳离子交换层析Capto-MMC层析，因为表达的上清成分复杂，且有一定浓度的盐的存在，Capto-MMC层析可以承受较高的流速，高结合载量，并对发酵上清液中的盐浓度要求不高，非常适合发酵液的第一步柱层析收集。
Capto-MMC层析可选用10～100mM NaAc-HAC缓冲液，pH的范围4.5～6.5，洗脱缓冲液可以使用10～100mM的磷酸缓冲液，含有0.1-0.5M的NH4Cl或其他高盐溶液，pH的范围4.5～8.5，也可以使用各种浓度的有机溶剂。也可在缓冲液中加入一定量的氨基酸，例如甘氨酸或半胱氨酸来保持融合蛋白的稳定性。
经过大量的筛选和探索性实验，具体试验流程可以如下：
Figure BDA0002780584990000131
Figure BDA0002780584990000141
经由Capto-MMC初纯的含有目的蛋白峰组分，为了生产工艺的便捷和有效力，特别探索了可直接进入疏水介质填料分离纯化的工艺的第二个步骤。为此继续在丁基(butyl-)，苯基(phenyl-)或辛基(octyl-)基团的疏水填料比较和筛选，并分别选用20～100mM的Tris-HCl或磷酸缓冲液，pH范围在5.0～9.0，加入1～2M的NH4Cl或1～2M的(NH4)2SO4的缓冲液为平衡缓冲液，以不含NH4Cl或(NH4)2SO4的缓冲液为洗脱缓冲液，也可在缓冲液中加入一定量的甘氨酸或半胱氨酸保持蛋白质的稳定性。过程包括将Capto-MMC层析柱的洗脱峰用pH5.0～9.0，含有1～2M的NH4Cl或1～2M的(NH4)2SO4的20～100mM的Tris-HCl或磷酸缓冲液稀释数倍，或在Capto-MMC层析柱的洗脱峰中直接加入高浓度的NH4Cl或(NH4)2SO4溶液至浓度为1～2M的NH4Cl或1～2M的(NH4)2SO4，上样于疏水柱，然后以平衡缓冲液冲洗柱子，再以洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。通过疏水柱可进一步去除可能存在的多聚体、糖类、脂类、降解蛋白、色素等杂质，进一步提高目的蛋白的纯度。图2.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白Capto-MMC柱层析纯化结果。为发酵上清液直接上Capto-MMC层析柱后的各组分峰样品的SDS-PAGE电泳图谱。图中的从左到右各条带分别是泳道1.M分子量从上到下分别为85kD、66kD；泳道2.发酵上清液组分；泳道3.上清液流穿液组分；泳道4.洗脱缓冲液洗脱组分的非还原电泳；泳道5.洗杂缓冲液洗脱组分；泳道6.泳道4洗脱组分的还原电泳；泳道7.标准分子量(从上到下：97kD、66kD、45kD、35kD、24kD、14kD)。
经过大量的筛选和探索性实验，进一步的疏水介质纯化工艺第二步流程如下：
Figure BDA0002780584990000142
Figure BDA0002780584990000151
经疏水层析纯化后的样品，也从生产工艺考量，从Q或DEAE等阴离子交换柱进入第三步的再纯化。通过与疏水层析不同的分离机制，离子交换层析可使目标蛋白得到进一步的纯化。可以选用pH范围在6.0～9.0之间的20～100mM的Tris-HCl或磷酸缓冲液做为平衡缓冲液，也可在缓冲液中加入一定量的甘氨酸或半胱氨酸保持蛋白质的稳定性。可以在平衡缓冲液中加入浓度为200～1000mM NaCl或NH4Cl做为洗脱缓冲液。经过阴离子交换层析的样品通常可以达到95％以上的纯度。
经过大量的筛选实验，第三步纯化工艺的试验流程如下：
Figure BDA0002780584990000152
Figure BDA0002780584990000161
经离子交换层析后收集的洗脱峰，可直接上样于Sephacryl、Superdex或Sephadex等凝胶层析柱，进行脱盐换液。凝胶层析用5～50mM的磷酸缓冲液(PB)为平衡缓冲液，也可在缓冲液中加入一定量的甘氨酸或半胱氨酸保持蛋白质的稳定性。可将阴离子交换层析条件下得到的目的蛋白rhIL-2/SA的缓冲液体系改为5～10mM的磷酸缓冲液可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析或超滤等其他手段，减少处理步骤中可能的污染、蛋白的变性、降解及聚集等损失。
经过大量的筛选实验，浓缩工艺流程如下：
层析柱：Sephacryl S-200HR
平衡缓冲液：20mM PB，5％甘氨酸，pH7.2
整个纯化过程顺序合理，操作简便，易于工业放大生产，最终的产品单一组分可达99％(≥95％以上)。目的蛋白的聚合体、二聚体、目的蛋白的相关蛋白计算为目的蛋白则宿主蛋白残留量则小于0.05％。本发明形成的可大规模化用于生产制备重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白分离纯化生产工艺，最终纯度达到99％以上的高度纯化效果。
实施例7：高效液相色谱法测定重组人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的纯度测定
使用岛津LC-10Avp Plus高效液相色谱仪，色谱柱：TOSOH公司TSK-GEL G2000SWXL7.8×300mm柱。以50mM PB-0.1M NaCl缓冲液，pH7.0为流动相，流速：0.8ml/min，检测波长：280nm。经上述程序建立的优化分离纯化工艺，获得了重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白纯度为99.62％(SDS-PAGE)图3.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白精纯原液的还原(R,Reducing)和非还原(N,Non-Reducing)的SDS-PAGE蛋白电泳图。图4.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白原液的凝胶高效液相色谱(SEC-HPLC)测量纯度图。目的蛋白相关蛋白含量(聚合体和目的蛋白降解物)则低于1％。
实施例8：重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白酵母菌宿主蛋白残留量检测
采用发明人在中国发明专利(CN 109851674 A)中公开的检定方法，使用检测试剂盒Immunoenzymetric Assay Kit for the Measurement of Pichia pastoris Host CellProteins(美国Cygnus公司)，货号：Cat#F140，检测波长为450/650nm；标准品溶液制备：使用试剂盒内提供的标准品溶液。设置回收率测定孔(复孔)。测定方法则以试剂盒制造商提供的操作说明书为准。结果表明：重组融合蛋白原液中的宿主蛋白残留量应不高于总蛋白的0.01％。经本发明生产制备工艺生产的高纯度可注射用重组融合蛋白产品，经检测结果表明宿主蛋白残留量已经在0.01％以下。即目的蛋白的纯度已经达到99.99％。酵母菌的宿主蛋白是酵母菌附件过程中产生的酵母分泌的蛋白、酶和降解的酵母菌生产的宿主蛋白。宿主蛋白残留物可以在药物使用皮下注射给药后进入血液，刺激机体产生免疫反应，或者表现为高热、寒战等表征，宿主蛋白残留量越小越好。经本发明生产制备工艺生产的高纯度可注射用重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白产品，经检测结果表明宿主蛋白残留量已经在0.01％以下。即目的蛋白的纯度已经达到99.99％。
实施例9：免疫印记分析重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白
精纯得到的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，经电泳仪将蛋白质转移到醋酸纤维素膜上，再以特异抗体(第一抗体)识别相对应的蛋白质。然后带有辣根过氧化物酶的第二抗体，识别并结合于第一抗体，经过DAB显色后在醋酸纤维素膜上上留下印记。
对经酵母菌表达分泌的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白以抗人HSA鼠单克隆抗体(Sigma Cat#：A6684)进行检测，确认含有人血清白蛋白蛋白质序列。同理，以相同的样品电泳胶转印后，以美国Abcam公司抗人IL-2的兔单克隆抗体(cat#:ab92381)所做的蛋白质免疫印迹实验表明，融合蛋白含有与人IL-2相同的抗原性。为此确认表达的rhIL-2/SA融合蛋白既有人血清白蛋白的抗原性也有人白介素-2变异体的抗原性。图5.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白SDS-PAGE胶图(A)及Western-blot(B)显示出融合蛋白与人白介素-2特异抗体具显著免疫反应。SDS-PAGE使用的蛋白质标准分子量从上到下分别是97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20.1kD和14.4kD；Western-blot使用的蛋白质标准分子量从上到下分别是250kD、150kD、100kD、75kD、50kD、37kD、25kD20kD、15kD和10kD(Bio-RAD)。结果显示出融合蛋白及其类似物融合蛋白均与人白介素-2特异抗体具显著免疫反应。
实施例10:重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白生物学活性测定
采用中国药典2015版三部通则3524，重组人白介素-2生物活性CTLL-2细胞/MTT比色法开展。依据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同，以此检测IL-2的生物学活性。
标准品溶液的制备：取重组人白介素-2生物学活性测定用国家标准品，按使用说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml约含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法：CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每1ml含6.0×105个细胞的细胞悬液，于37℃、5％二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时；然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5％二氧化碳条件下保温18～24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
供试品生物学活性(IU/ml)＝PrX(DsXEs)/(DrXEr)
式中：Pr为标准品生物学活性，IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效量的稀释倍数。注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。
由江苏金丝丽生物药业股份有限公司对重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白【rHSA/IL-2(9222)及rhIL-2/SA(9333)】开展的成品检测结果表明，重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白(生产批号：9222/1807A)其生物比活性为：2.46X106IU/mg。重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白(生产批号：9333/1809A)，其生物比活性为：2.39X106 IU/mg。结果显示野生型人白介素-2不不管是位于人血清白蛋白成熟肽的C末端或是N端，其白介素-2的生物活性未受影响。即白介素-2与细胞表面受体相结合的位点没有疏导人血清白蛋白的干扰。重组人血清白蛋白/白介素-2类似物融合蛋白原液批次为：9555Y20190306，当使用中国药典方法，在细胞水平上，测定其生物比活性约为：1.49X106IU/mg。这个结果显示经氨基酸替换后的变异体融合蛋白，或类似物融合蛋白，其细胞水平的生物比活性是有显著下降。鉴于重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的分子量为：81.6kD。人IL-2变异体的分子量为：15.1kD。由此，IL-2变异体分子量应占整个融合蛋白的18.5％。中国药典中重组人白介素-2(单体)的细胞生物比活性值规定为：1X107 IU/mg。按理论分子摩尔计，融合蛋白的理论生物比活性应该是0.15X107 IU/mg。实际测定结果正好是0.149X107 IU/mg，可能由此计算，不同检测条件下，检测结果是否略有偏差，也是可能的。总之可以初步确定融合蛋白中的IL-2生物活性不因与白蛋白融合而发生显著生物活性降低。表格-重组人白介素-2(rhIL-2)商品与4个重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白的生物活性检测结果。
Figure BDA0002780584990000181
实施例11：重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白大鼠体内半衰期测定
使用Sprague-Dawley大鼠(SD，SPF级，雌雄各半)。大鼠给药前一天(D-1)对大鼠体重进行了测量，其中雄鼠体重范围约为276-372g，雌鼠体重范围约为221-280g。阳性对照药为重组人白介素-2(rhIL-2)原液(来自山东金泰生物制药有限公司)。供试药为本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白注射液，规格均是：2.5mg/0.5ml/支(蛋白质浓度为5mg/ml)。大鼠给药时，每组动物3只，按融合蛋白中每mg蛋白质中仅有1/4的rhIL-2含量计算，给药剂量均为200μg/kg。每个给药体积为300μl。给药前1h，药后的2min、0.5h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、168h取血。采用异氟烷吸入麻醉后，眼眶静脉丛以毛细管取血，每只每次采血量约0.02-0.05mL。血样采集后转移入含EDTA的EP管中，充分摇匀，置于碎冰中(碎冰中保存不超过2h)，之后在4000rpm低温(约4℃)条件下离心10min，分离血浆，-20℃以下保存待分析。
采用美国R&D Systems公司生产的Human IL-2Quantikine ELISA Kit(Cat#2050)。使用ELISA试剂盒开展血样的检测。IL-2的血样稀释度，要较融合蛋白血样的稀释度高约100-300倍。总之要使得血样测试在OD450下的吸收值坐落在0-4之间。图6.为重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白皮下给药后在大鼠中的血药浓度测定及半衰期测定图。结果显示三只动物的IL-2血液半衰期测定最低值和最高值分别为2.5h和4.5h。而本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白(9222,rHSA/IL-2)、重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白(9333，rhIL-2/SA)和重组人白介素-2v5/血清白蛋白融合蛋白(9555,rhIL-2v5/SA)分别在三只动物中血液半衰期测定值的最低值和最高值分别为68h和96h(图6)。以融合蛋白血液半衰期的最低值68h为例计算，以白介素-2单体半衰期是4.5h计，约是15.1倍，以单体IL-2半衰期是2.5h计，则约是27,2倍的长效性。正是因为重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白都在动物体内经由显著和意想不到的长代谢周期，即长血液半衰期，使得在融合蛋白上的白介素-2及其白介素-2变异体得到缓慢释放。融合蛋白具长效性在与单克隆抗体药物联用时就会有更好的应用前景和带来意想不到的临床治疗的优效。
实施例12：免疫检测点人源化小鼠BALB/c-hPD1皮下接种CT26.WT结肠癌肿瘤模型中的药效学研究(由江苏集萃药康生物科技有限公司完成测试)
江苏集萃药康生物科技有限公司自主研发的PD1人源化小鼠模型，是采用程序性细胞死亡受体PD1人源化小鼠BALB/c-hPD1模型。创建方法是将BALB/c小鼠的PD1细胞外部分替换为相应的人源片段，从而完整保留了小鼠PD1的细胞内部分而获得转基因PD-1人源化小鼠。继而再通过皮下接种小鼠结肠癌细胞系CT26.WT建立移植瘤小鼠模型。该小鼠模型已用于评价了多种药物与人PD-1抗体药物联合使用的抗肿瘤效果。
由发明人提供的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白(rIL-2v5/SA，产品代码：9555；rHSA/IL-2v7，产品代码：9777)作为测试药，与由集萃药康提供的购自MSD的PD-1抗体Keytruda，分组设置给药。动物分组为空白制剂(Vehicle)对照鼠(G1组)；rhIL-2v5/SA单药低剂量组(2mpk，G2组)和高剂量组(10mpk，G3组)；rHSA/IL-2v7单药低剂量组(2mpk，G4组)和高剂量组(10mpk。G5组)；Keytruda单药(10mpk，G6组)；及rIL-2v5/SA低剂量(2mpk)+Keytruda(10mpk)组(G7组)和高剂量(10mpk)+Keytruda(10mpk)(G8组)；rHSA/IL-2v7低剂量(2mpk)+Keytruda(10mpk)组(G9组)和高剂量(10mpk)+Keytruda(10mpk)(G10组)，考察单独或联合使用(联用)抗肿瘤的效果。
以试验第5天的肿瘤生长抑制作用的结果就已经非常显著，图7.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白中的9555(融合蛋白分子结构为：rIL-2v5/SA)在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的相对肿瘤体积变化。这表明：G3组即9555高剂量组(10mpk)、G7组即9555低剂量(2mpk)与Keytruda(10mpk)联合用药组、G8组即9555高剂量(10mpk)与Keytruda(10mpk)联合用药组肿瘤抑制率变化均优于G6组单用Keytruda(10mpk)。G3组即9555高剂量组(10mpk)肿瘤抑制率变化43.80％，与对照组相比出现显著性差异，P值＝0.035；G8组即9555高剂量(10mpk)与Keytruda(10mpk)联合用药组肿瘤体积变化(图7)肿瘤生长抑制率变化40.92％，与对照组相比出现显著性差异，P值＝0.008(图8)。从图中的本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，9555低剂量组单用、PD-1单克隆抗体药物Keytrude单用，与Keytrude+9555(2mg剂量组)，在第5天时各自的肿瘤抑制率分别为7.26％、9.36％和19.33％。这个结果表明keytrude+rhIL-2v5/SA组合联用，可提高抗体药物Keytrude至少1倍以上的肿瘤抑制能力，已具显效。图8.以重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白类似物9555单用或与PD-1抗体Keytruda联用，在第2天(D2)、第5天(D5)和第7天(D7)小鼠实体肿瘤抑制增生的疗效结果图。
当发明人提供的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，rHSA/IL-2v7，产品代码：9777作为测试药，与由集萃药康提供的购自MSD的PD-1抗体Keytruda，给药分组设置。获得5天内与9555不同的肿瘤抑制结果，见图9.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白中的9777(融合蛋白分子结构为：rHSA/IL-2v7)在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的相对肿瘤体积变化。但是在协同增效上也表现出9777与Keytruda联用是可增加抑制肿瘤瘤体增生的疗效，尽管效果不如9555分子结构的类似物融合蛋白更显著。但长时间给药后是否有更佳的疗效，需要开展进一步的研究来确认。
通过短时间给药后，单用重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白就可表现出具有抑制实体肿瘤增生的显著疗效。当与PD-1抗体联用时，更是可显著提高抑制实体肿瘤瘤体增生的效果。
为此发明人停止给药rhIL-2v5/SA(9555)，但继续给予与单药剂量相同的Keytrude。结果表明停药后的3天，即总试验的第8天时，Keytrude 10mg+9555 2mg联用组的肿瘤生长抑制率提高到23.72％，而同时继续给药的9555的2mg组为8.36％，Keytrude 10mg单用则为19.71％，还是显示出联用的增效作用。高剂量组联用时，即使停止rhIL-2/SA给药，联用仍然达到33.71％，提高至少1倍的疗效。在临床上，如果能够达到肿瘤的抑制率为30％这个评价点是，即为临床显著疗效。动物药效学研究已显示出本发明的融合蛋白可具显著临床优势。
当在重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白10mg+Keytrude(10mg)的G8组，在第5天取得40.92％的肿瘤生长抑制效果时，而单独使用rhIL-2v5/SA的10mg高剂量组在第5天也已取得惊人的43.8％的肿瘤生长抑制率。结果显示本发明的融合蛋白高剂量已有显著疗效，当与抗体组合联用，并没有产生更高的肿瘤生长抑制率。当发明人停止给药rhIL-2v5/SA，继续给药Keytrude时，该组所有小鼠的肿瘤均立即开始显著继续生长，见图10.重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在人源化PD-1转基因小鼠肿瘤模型中的各给药组与对照组间的肿瘤生长抑制作用，特别是在停药后肿瘤增生的变化情况。图10中左图是给药5天时肿瘤生长状况(肿瘤生长获得严重抑制)；图10中右图则是停药3天后的第5-8天期间，小鼠体内肿瘤在没有药物抑制的情况下，显示肿瘤又快速增长发育。所有受药组小鼠的肿瘤药物抑制或停药后的表现均一致。这个试验给出本发明的重组融合蛋白在抑制肿瘤生长具有特别意想不到的显著作用和强肿瘤生长抑制功能。本发明公开的长效重组白介素-2变异体融合蛋白单用或与PD-1抗体Keytrude联用均具强力抑制小鼠体内肿瘤生长的作用，以及对PD-1抗体具显著的协同增效作用，同时，试验中观察到细胞因子风暴现象非常显著地减少。
实施例13:在人源化PD-1转基因小鼠结肠癌CT26皮下移植模型中的药效学评价肿瘤TILs流式仪检测
为测试本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白单用或和Keytrude，PD-1抗体，组合联用，在免疫检测点人源化小鼠BALB/c-hPD1皮下接种CT26.WT结肠癌肿瘤模型，皮下荷瘤药效评价中，考察流式检测肿瘤组织中TIL细胞，观察药物对免疫系统的影响。样品：肿瘤。检测指标：CD45、CD3、CD8、CD4、CD49b、CD25、FOXP3。使用仪器主要有Thermo AttuneNxT流式细胞仪，Eppendorf 5804R冷冻离心机，组织处理器(GentleMACS)等。使用40％+70％非连续密度梯度Percoll，离心富集免疫细胞。根据FVS780使用说明，标记死细胞。缓冲液洗2次后，细胞进行胞外染色。配置抗体混合液，每管样品添加50uL抗体混合液，4℃避光孵育40-60min。根据固定破膜试剂(Ebioscience，00-5523)使用说明操作，固定破膜后孵育FOXP3抗体，4℃避光孵育30min，洗2次，流式上机检测。使用的抗体主要有：
标志物 染料 供应商 产品目录号
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mCD25 BV421 BD 564370
mFOXP3 PE ebioscience 12-5773-82
Live/dead FVS780 BD 565388
图11.显示本发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白具有明显的定向激活分化CD8+细胞、抑制Treg细胞的结果，与NKTR-214的结果(2019ASCO)极为相似。图11中虚线圆圈标示的G2组(重组人白介素-2v5/血清白蛋白融合蛋白，rhIL-2v5/SA，代码：9555，G2代表给药剂量为2mg剂量组)，在CD8+细胞具显著的增生提升作用和在Treg细胞具显著抑制增生和下降的趋势。Treg细胞升高是导致细胞因子风暴发生的关键因素。在试验中观察到小鼠的细胞因子风暴发生现象确已显著减少。研究显示重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白在治疗肿瘤药物中与PD-1/L1抗体组合联用，可显著提高抗体疗效，比抗体单用，可提高抗体疗效5倍以上。也体现出了至少1倍、2倍、5倍、10倍协同增效作用的可能，也具制备肿瘤治疗用药物的用途。
图11中的G1、G2、G4、G6、G7、G8、G9组别各代表供试样品名称和给药剂量说明详见实施例12。
本发明显示了所发明的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，具意想不到的优于现有市售白介素-2产品或国内外在研中的PEG-白介素-2、Fc-白介素-2药物的长效化药物优势。这个结果也完全支持本发明生产工艺制备的重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白及其类似物融合蛋白，作为药物可以期待其能在单独使用或和PD-1/L-1抗体联用时，能够达到给药频次为每2周，或每3周，甚至每4周给药一次的临床治疗的特别需求，还能给予PD-1抗体药物以显著的协同增效临床疗效。
本发明涉及下述实施方案。
1.一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白成熟肽和人白介素-2成熟肽。
2.实施方案1的融合蛋白，其中所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽直接连接。
3.实施方案1的融合蛋白，其中所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽经由肽接头间接连接。
4.实施方案1-3任一项的融合蛋白，其中所述人白介素-2成熟肽以其C端与所述人血清白蛋白成熟肽的N端融合。
5.实施方案1-3任一项的融合蛋白，其中所述人白介素-2成熟肽以其N端与所述人血清白蛋白成熟肽的C端融合。
6.实施方案1-5任一项的融合蛋白，其中所述人血清白蛋白成熟肽具有野生型人血清白蛋白成熟肽序列。
7.实施方案6的融合蛋白，其中所述野生型人血清白蛋白成熟肽序列如SEQ IDNO.9所示。
8.实施方案1-5任一项的融合蛋白，其中所述人血清白蛋白成熟肽具有突变型人血清白蛋白成熟肽序列。
9.实施方案1-8任一项的融合蛋白，其中所述人白介素-2成熟肽具有野生型人白介素-2成熟肽序列。
10.实施方案9的融合蛋白，其中所述野生型人白介素-2成熟肽序列如SEQ IDNO.10所示。
11.实施方案1-8任一项的融合蛋白，其中所述人白介素-2成熟肽具有突变型人白介素-2成熟肽序列。
12.实施方案11的融合蛋白，其中所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含下述替代中的一项或多项：T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A。
13.实施方案12的融合蛋白，其中所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于如SEQID NO.10所示野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代。
14.实施方案12的融合蛋白，其中所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于如SEQID NO.10所示野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代。
15.实施方案1的融合蛋白，其中相对于野生型人白介素-2成熟肽包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代的突变型人白介素-2成熟肽以其C端与人血清白蛋白成熟肽的N端直接连接。
16.实施方案1的融合蛋白，其中相对于野生型人白介素-2成熟肽包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代的突变型人白介素-2成熟肽以其N端与人血清白蛋白成熟肽的C端直接连接。
17.实施方案1的融合蛋白，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
18.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其具有与野生型人白介素-2相比减弱的人IL-2α受体(CD25)结合。
19.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其不结合人IL-2α受体(CD25)。
20.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其具有与野生型人白介素-2相比增强的IL-2β受体(CD122)和IL-2γ受体(CD132)结合。
21.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其具有与野生型人白介素-2或其氨基酸序列变体相比延长至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多的体内半衰期。
22.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其具有与野生型人白介素-2相比降低的细胞毒性。
23.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其具有与野生型人白介素-2相比升高的抑制肿瘤生长的活性。
24.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其将抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体抑制肿瘤生长的活性提高至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或更多。
25.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其用作药物。
26.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其用于治疗肿瘤。
27.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其用于治疗癌症。
28.实施方案1-17任一项的融合蛋白，其用于治疗癌性腹水。
29.一种核酸，其编码实施方案1-17任一项的融合蛋白。
30.实施方案29的核酸，其具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8。
31.一种载体，其包含实施方案29或30的核酸。
32.实施方案31的载体，其为克隆载体或表达载体。
33.实施方案31或32的载体，其为质粒载体或病毒载体。
34.一种宿主细胞，其包含实施方案29或30的核酸，或者包含实施方案31-33任一项的载体。
35.实施方案34的宿主细胞，其为细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。
36.实施方案34的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞、巴斯德毕赤酵母细胞或CHO细胞。
37.一种生成实施方案1-17任一项的融合蛋白的方法，其包括培养实施方案34-36任一项的宿主细胞，使得所述融合蛋白生成。
38.一种药物组合物，其包含实施方案1-17任一项的融合蛋白。
39.实施方案1-17任一项的融合蛋白制备用于治疗肿瘤的药物的用途。
40.实施方案1-17任一项的融合蛋白制备用于治疗癌症的药物的用途。
41.实施方案1-17任一项的融合蛋白制备用于治疗癌性腹水的药物的用途。
42.一种治疗肿瘤的方法，其包括对具有肿瘤的受试者施用实施方案1-17任一项的融合蛋白。
43.一种治疗癌症的方法，其包括对具有癌症的受试者施用实施方案1-17任一项的融合蛋白。
44.一种治疗癌性腹水的方法，其包括对具有癌性腹水的受试者施用实施方案1-17任一项的融合蛋白。
45.实施方案42-44任一项的方法，其还包括对所述受试者施用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
46.实施方案42-45任一项的方法，其中融合蛋白给药至多每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次。
序列表
<110> 天津林达生物科技有限公司
中美福源生物技术（北京）股份有限公司
北京美福源生物医药科技有限公司
天津溥瀛生物技术有限公司
<120> 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
<130> C20P0176
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 718
<212> PRT
<213> rHSA/IL-2 fusion, 9222
<400> 1
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1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
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Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
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Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
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Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
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Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
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Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
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Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
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Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
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Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
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Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
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Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
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Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
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Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
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<211> 2232
<212> DNA
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<400> 2
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ctgacttgat aa 2232
<210> 3
<211> 718
<212> PRT
<213> rhIL-2/SA fusion, 9333
<400> 3
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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210 215 220
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Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp
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Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met
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<213> Human Serum Albumin mature protein
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85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> Human Interleukin-2 mature protein, wild-type
<400> 10
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Human Serum Albumin PCR primer-1
<400> 11
gaattcatga agtgggtaac ctttatttcc 30
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Human Serum Albumin PCR primer-2
<400> 12
gaattcttat aagcctaagg cagcttgact tgc 33
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> albumin-IL-2 fusion protein sequence primer-P1
<400> 13
ctggttccaa ttgacaagc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> albumin-IL-2 fusion protein sequence primer-P9
<400> 14
gactcatcag caacacatg 19

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白成熟肽和人白介素-2成熟肽，其中所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽直接连接或经由肽接头间接连接，
其中所述人白介素-2成熟肽以其C端与所述人血清白蛋白成熟肽的N端融合或所述人白介素-2成熟肽以其N端与所述人血清白蛋白成熟肽的C端融合，
其中所述人白介素-2成熟肽具有野生型人白介素-2成熟肽序列或相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含下述替代中的一项或多项的突变型人白介素-2成熟肽序列：T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A，其中所述野生型人白介素-2成熟肽序列任选如SEQID NO.10所示，
其中所述人血清白蛋白成熟肽具有野生型人血清白蛋白成熟肽序列，任选如SEQ IDNO.9所示，或所述人血清白蛋白成熟肽具有突变型人血清白蛋白成熟肽序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其中
(a)所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代并以其C端与人血清白蛋白成熟肽的N端直接连接；或
(b)所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代并以其N端与人血清白蛋白成熟肽的C端直接连接。
3.权利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的融合蛋白，其具有下述一项或多项特性：
(a)具有与野生型人白介素-2相比减弱的人IL-2α受体(CD25)结合；
(b)不结合人IL-2α受体(CD25)；
(c)具有与野生型人白介素-2相比增强的IL-2β受体(CD122)和IL-2γ受体(CD132)结合；
(d)具有与野生型人白介素-2或其氨基酸序列变体相比延长至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多的体内半衰期；
(e)具有与野生型人白介素-2相比降低的细胞毒性；
(f)具有与野生型人白介素-2相比升高的抑制肿瘤生长的活性；和/或
(g)将抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体抑制肿瘤生长的活性提高至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或更多。
5.一种核酸，其编码权利要求1-4任一项的融合蛋白，任选具有SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5的核酸，任选为细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，进一步任选为巴斯德毕赤酵母细胞或CHO细胞。
7.一种生成权利要求1-4任一项的融合蛋白的方法，其包括培养权利要求6的宿主细胞，使得所述融合蛋白生成。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1-4任一项的融合蛋白。
9.权利要求1-4任一项的融合蛋白制备用于治疗肿瘤、癌症或癌性腹水的药物的用途。
10.一种治疗肿瘤、癌症或癌性腹水的方法，其包括对具有肿瘤、癌症或癌性腹水的受试者施用权利要求1-4任一项的融合蛋白，任选还包括对所述受试者施用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113880908A (zh) * 2021-08-25 2022-01-04 北京伟德杰生物科技有限公司 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法
CN114149508A (zh) * 2021-11-25 2022-03-08 苏州普乐康医药科技有限公司 一种结合cd40l的融合蛋白及其应用
WO2022100741A1 (zh) * 2020-11-16 2022-05-19 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
WO2023024758A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 北京伟德杰生物科技有限公司 白细胞介素2的融合蛋白及其在ibd中的应用
WO2023030118A1 (zh) 2021-09-01 2023-03-09 浙江新码生物医药有限公司 人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其应用
WO2023217288A1 (zh) * 2022-05-13 2023-11-16 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 新融合蛋白及其用途
WO2024104444A1 (zh) * 2022-11-17 2024-05-23 南通壹宸生物医药科技有限公司 Il-2突变体及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118542931B (zh) * 2024-07-30 2024-11-15 上海桀蒙生物技术有限公司 生物制品及其使用方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050186664A1 (en) * 2001-12-21 2005-08-25 Rosen Craig A. Albumin fusion proteins
CN103492411A (zh) * 2011-02-10 2014-01-01 罗切格利卡特公司 突变体白介素-2多肽
CN104231068A (zh) * 2014-01-27 2014-12-24 苏州发士达生物科技有限公司 人白细胞介素ii突变体及其应用
CN104507504A (zh) * 2012-08-10 2015-04-08 罗切格利卡特公司 白介素-2融合蛋白及其用途
CN105980410A (zh) * 2014-02-06 2016-09-28 豪夫迈·罗氏有限公司 白介素-2融合蛋白和其用途
CN109952311A (zh) * 2016-11-15 2019-06-28 分子免疫中心 用于增加白介素-2及其衍生蛋白质的分泌水平的方法
WO2020057646A1 (zh) * 2018-09-21 2020-03-26 信达生物制药(苏州)有限公司 新型白介素2及其用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2513213C (en) * 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN100379762C (zh) * 2003-12-08 2008-04-09 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 人血清白蛋白与白细胞介素2的融合蛋白及其编码基因
CN102816241B (zh) * 2004-02-09 2015-07-22 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
CN1884520A (zh) * 2006-07-10 2006-12-27 江南大学 人白介素－2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品
CN101280018A (zh) * 2008-05-23 2008-10-08 江南大学 突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备
CN109851674B (zh) 2018-10-26 2022-02-15 天津林达生物科技有限公司 一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050186664A1 (en) * 2001-12-21 2005-08-25 Rosen Craig A. Albumin fusion proteins
CN103492411A (zh) * 2011-02-10 2014-01-01 罗切格利卡特公司 突变体白介素-2多肽
CN104507504A (zh) * 2012-08-10 2015-04-08 罗切格利卡特公司 白介素-2融合蛋白及其用途
CN104231068A (zh) * 2014-01-27 2014-12-24 苏州发士达生物科技有限公司 人白细胞介素ii突变体及其应用
CN105980410A (zh) * 2014-02-06 2016-09-28 豪夫迈·罗氏有限公司 白介素-2融合蛋白和其用途
CN109952311A (zh) * 2016-11-15 2019-06-28 分子免疫中心 用于增加白介素-2及其衍生蛋白质的分泌水平的方法
WO2020057646A1 (zh) * 2018-09-21 2020-03-26 信达生物制药(苏州)有限公司 新型白介素2及其用途

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4245776A4 (en) * 2020-11-16 2025-01-01 Huatong Forturn China Co Ltd FUSION PROTEIN OF HUMAN SERUM ALBUMIN AND HUMAN INTERLEUKIN-2, AND ITS USE
WO2022100741A1 (zh) * 2020-11-16 2022-05-19 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
CN113880908B (zh) * 2021-08-25 2024-05-14 北京伟德杰生物科技有限公司 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法
WO2023024758A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 北京伟德杰生物科技有限公司 白细胞介素2的融合蛋白及其在ibd中的应用
WO2023024759A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 北京伟德杰生物科技有限公司 白细胞介素2的融合蛋白及其在als中的应用
WO2023024215A1 (zh) * 2021-08-25 2023-03-02 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
CN113880908A (zh) * 2021-08-25 2022-01-04 北京伟德杰生物科技有限公司 纯化重组人血清白蛋白的融合蛋白的方法
CN116179596A (zh) * 2021-08-25 2023-05-30 北京伟德杰生物科技有限公司 长效化重组人白细胞介素2融合蛋白及其制备方法和应用
WO2023030118A1 (zh) 2021-09-01 2023-03-09 浙江新码生物医药有限公司 人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其应用
CN114149508A (zh) * 2021-11-25 2022-03-08 苏州普乐康医药科技有限公司 一种结合cd40l的融合蛋白及其应用
CN117881704A (zh) * 2022-05-13 2024-04-12 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 新融合蛋白及其用途
WO2023217288A1 (zh) * 2022-05-13 2023-11-16 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 新融合蛋白及其用途
CN117881704B (zh) * 2022-05-13 2025-02-18 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 新融合蛋白及其用途
WO2024104444A1 (zh) * 2022-11-17 2024-05-23 南通壹宸生物医药科技有限公司 Il-2突变体及其应用

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