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WO2005014774A1 - 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法 - Google Patents

動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法 Download PDF

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Publication number
WO2005014774A1
WO2005014774A1 PCT/JP2004/011656 JP2004011656W WO2005014774A1 WO 2005014774 A1 WO2005014774 A1 WO 2005014774A1 JP 2004011656 W JP2004011656 W JP 2004011656W WO 2005014774 A1 WO2005014774 A1 WO 2005014774A1
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WO
WIPO (PCT)
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thin film
cell culture
carrier
hydrogel
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/011656
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiaki Takezawa
Aya Nitani
Original Assignee
National Institute Of Agrobiological Sciences
Asahi Technoglass Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute Of Agrobiological Sciences, Asahi Technoglass Corporation filed Critical National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority to JP2005513025A priority Critical patent/JPWO2005014774A1/ja
Publication of WO2005014774A1 publication Critical patent/WO2005014774A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for culturing animal cells, and a method for culturing and transplanting animal cells using the carrier for culturing.
  • the present invention relates to a cell culture carrier comprising a hydrogel thin film produced by applying a vitrification technique by drying. More specifically, in a culture system, a culture carrier having strength and shape maintaining power, a culture method for realizing a functional assay for analyzing cell characteristics by culturing various cells on the carrier, an epithelial mesenchyme, Weaving and other fields
  • the present invention relates to a method for culturing animal cells for reconstructing a model of a tissue or an organ, and a method for transplanting cells cultured on a culture carrier.
  • Carrier materials can be classified into natural material-derived materials, artificial materials, and hybrids of natural material-derived materials and artificial materials, and their shapes are adsorbents to the support, coatings of the support, films, and films. , Plates, petri dishes, flasks, hollow yarns, yarns and / or woven fabrics thereof, gels, beads and the like.
  • Examples of the natural material-derived materials include collagen, fibronectin, laminin, glycosaminodalican, proteodalican, and matrigenole (a basement membrane extracted and reconstituted from an EHS tumor; Kleinman, HK, et al. Basement membrane 25, 312, 1986.), cell-free dermal matrix prepared from animal tissue (Livesey, SA, et al. Transplanted acellular allograft dermal matrix. Transplant, 60, 1, 1995.), mussel-derived adhesive protein, silk, cotton, and the like have been developed as culture carriers.
  • non-bioabsorbable synthetic polymers such as nylon, bioabsorbable synthetic polymers such as polyglycolic acid, and ceramics have been developed as culture carriers.
  • animal cells are cultured in two-dimensional culture using a plastic petri dish as a culture carrier.However, especially in primary cultured cells, repeated passage and maintenance may not maintain the original functional expression of the cells. is there. On the other hand, it has been known that when cells are cultured three-dimensionally using culture carriers of various materials and shapes as described above, the tissue-specific functions of the cells can be improved and maintained. I have.
  • Methods for performing such three-dimensional culture include a method of culturing on a gel or a gel of an extracellular matrix component, and a method of culturing cells in a multilayered manner using hollow fibers (Knazek, RA, et al. ⁇ . Cell culture on artificial capillaries: An approach to tissue growth in vitro.Science. 178, 65, 1972.), a method of culturing Itoda cells around a large number of bead carriers (van Wezel, AL Growth of cell-strains and Primary cells on micro-carriers in homogeneous cyiture. Nature.
  • a method of coagulating and culturing cells in the porous medium of a sponge carrier such as PUF (Matsushita. T., et al. High albumin production by multicellular speroids of adult rat hepatocytes formed in the pores of polyurethan foam.Appl Microbiol Biotecnol. 36, 324, 1991. spheroid composed of fibroblasts and hepatocy tes. J Cell Sci. 101, 495, 1992.) and multicellular spheroids (spheroid) cultivation method using functional culture carriers, liquid-permeable culture carriers such as gauze (Takezawa, T., et. al.
  • the three-dimensional culture method as described above is not as simple as the two-dimensional culture method, and its implementation requires skill, and although it has been used by basic researchers in specialized fields, It has not yet become widespread in the fields of chemical development, such as pharmaceuticals, which require speed and cost (drug discovery research, drug efficacy testing, toxicology / safety testing). In other words, it has not yet become widespread in the industrial field due to the difficulty in realizing it.
  • the three-dimensional culturing method as described above has a disadvantage that it is difficult or impossible to observe individual cells with a microscope as compared to two-dimensional culturing cells.
  • Riki et al. Had a concept of reconstructing an organ-like structure (organoid) consisting of two or more types of cells, but the concept of culturing cells on both sides of a hide-mouth gel thin film was used as a method. It has never been before.
  • a culture method using an extracellular matrix component such as collagen or Matrigel not only excels in inducing cell differentiation, but also provides an epithelial mesenchyme Living tissue formed m vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211, 1052, 1981.)
  • Ability to construct an angiogenesis model using cells ⁇ Black, AF, et al. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. FASEB J. 12, 1331, 1998.) and the ability to construct a cancer invasion model by cancer cells Albini, A., et al., A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of Tumor cells. Cancer Res. 47, 3239, 1987 .; has demonstrated its usefulness.
  • Japanese Patent No. 308111 Japanese Patent No. 308111
  • this patented technology is intended to increase the strength of the hydrogel kfc fermentation carrier, including the extracellular matrix component, in order to solve the problems of softness and difficulty in handling, etc.
  • the handling is simplified by attaching a support.
  • An object of the present invention is to provide a three-dimensional culture carrier comprising a hydrogel such as collagen or matrigel without the need for preparation for use, and to overcome the difficulty of seeding animal cells associated with three-dimensional culture.
  • a culture carrier that can achieve three-dimensional culture by the same means as seeding two-dimensional cells.
  • it is a gel carrier that does not cause extreme shrinkage of the gel at the mouth of the cell, and the culture medium can be easily exchanged.
  • An object of the present invention is to provide a culture carrier comprising a hydrogel.
  • the other objectives of this effort are: functional assays for analyzing cell characteristics on the culture support, reconstruction of models of tissues and organs including epithelial mesenchyme, and culture on the culture support. To provide a method for transplanting cells.
  • Another object of the present invention is to establish a process for producing a hydrogel thin film such as an extracellular matrix component serving as a culture carrier for animal cells with stable and reproducible physical properties.
  • a hydrogel thin film such as an extracellular matrix component serving as a culture carrier for animal cells with stable and reproducible physical properties.
  • the present invention relates to a cell culture carrier comprising a hydrogel thin film prepared by sufficiently drying a hydrogel, vitrifying and rehydrating the hydrogel, wherein the strength of the hydrogel thin film is twice the strength of the hydrogel.
  • the drying time should be set so that the absorbance at 400 nm of the hydrogel thin film decreases to 70% to 10% of the hydrogel so that it increases by up to 20 times.
  • it is a gel carrier that does not cause extreme shrinkage of the hydrogel by cells, and facilitates exchange of culture media
  • a culture carrier comprising a hydrogel can be provided.
  • Fig. 1 is a plan view showing the configuration of a donut-shaped support
  • Fig. 2 is a phase contrast micrograph of a collagen hide gel immediately after gelation
  • Fig. 3 is a collagen hide gel after drying 72 S.
  • Fig. 4 is a phase contrast micrograph of the gel thin film
  • Fig. 4 is a graph showing the results of the strength measurement test
  • Fig. 5 is a graph showing the results of the transparency test
  • Fig. 6 is a diagram showing the results of double-sided culture.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph when double-sided culture was performed
  • FIG. 8 is a photograph showing the Matrigel hydrogel thin film of Example 6
  • FIG. FIG. 9 is a schematic diagram showing a state in which a thin section has been transferred to a collagen gel thin film on a slide glass of Example 8.
  • the present inventors have paid special attention to the vitrification process in producing a hydrogel thin film, and have earnestly studied the effects of the difference in drying time in the vitrification process on the compressive fracture strength, transparency, and the like of the gel film at the mouth. As a result of repeated studies, the present invention has been completed.
  • “Hide mouth gel” refers to a substance in which a polymer has a network-like structure due to a chemical bond and a large amount of water is retained in the network, and more specifically, It refers to a culture carrier such as a natural product-derived material or an artificial material that has been gelled in an incubator.
  • the “dried hydrogel” refers to a product obtained by drying the above “hydrogel” by various methods described below, and the “hydrogel thin film” refers to the “dried hide gel” described above. It shall mean the rehydrated one.
  • vitrification refers to a glass that turns a protein (white body) of a hen's egg into a hard, transparent substance by air-drying.
  • Talshi E. Edible eyeballs from fish. Nature 345, 298, 1990.
  • Drying time The time to dry Hyde mouth gel sufficiently differs for each substance, and even if the same collagen is used, the required drying time due to the difference in the water content is the same.
  • drying methods such as air drying, drying in a closed container (circulating the air in the container, and always supplying dry air), and drying in an environment with silica gel.
  • Examples of the air drying method include drying in an incubator kept sterile at 10 ° C and 40% humidity for 2 days, or drying all day and night in a sterile clean bench at room temperature. is there. After air drying, keep aseptically at room temperature or at 4 ° C. As described later, in the present invention, it was confirmed that the strength and transparency significantly increased when the storage time was longer than one month. Success,
  • Examples of the natural product-derived polymer used in the production of the hydrogel in the present invention include an extracellular matrix component, a basement membrane component (trade name: Matrigenole) reconstituted from mouse EHS tumor extract, gelatin, agar, agarose, and the like. No. Furthermore, examples of the extracellular matrix include collagen, laminin, chondronectin, glycosaminodalican, hyaluronic acid, and proteoglycin, and a salt component, concentration, pH, etc., which are optimal for each gelling are selected. It is possible to produce hydrogels. ⁇ '
  • the solvent that gives the optimal salt concentration is PBS (Phosphate Buffered Saline), HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), a basic culture solution, and a serum-free culture solution.
  • a serum-containing culture solution or the like may be used.
  • the collagen content per unit area of the collagen hydrated mouth gel thin film is preferably 100 ⁇ g / cm 2 to: Lmg / cm 2 , and the optimal concentration is 250 ⁇ g / cm 2 . If the collagen content is less than 100 ⁇ g / cm 2 , the collagen concentration is too low and the gelation is weak, making it impossible to produce a collagen gel thin film of sufficient strength.
  • the pH of the solution at the time of collagen gelation is preferably 6 to 10. Outside this range, it becomes difficult to cause collagen gelling.
  • Synthetic polymers used for the preparation of hide mouth gels include polyacrylamide, polybutyl alcohol, methylcellulose, polyethylene oxide, o 1 y (, 2—hydro xy et hylme thacrylate) / po 1 ycapro 1 actone and the like. It is also possible to prepare a hydrogel using two or more of these polymers.
  • Hydrate gel thin films contain physiologically active substances in addition to the gel component polymer. You may have. Examples of the physiologically active substance include cell growth factors, differentiation inducing factors, cell adhesion factors, antibodies, enzymes, cytokines, hormones, lectins, and fibronectin, vitronectin, entactin, osteopoetin, etc. as extracellular matrix components that do not gel. Can be It is also possible to include a plurality of these.
  • a hydrogel thin film containing a physiologically active substance as described above is prepared by first mixing a physiologically active substance to be contained in a gel-constituting polymer solution before gelation, and then hydrolyzing the gel to form a gel. It can be manufactured through a gel thin film manufacturing process. In this way, factors necessary for cell growth, cell division, adhesion and the like can be supplied from the hydrogel thin film side, so that a better culture environment can be realized. It is also very useful for conducting tests to examine the effects of contained physiologically active substances on cells.
  • the above-mentioned polymers are adjusted to an optimum salt concentration and pH unique to each polymer, and gelled at each optimum temperature.
  • the conditions of the gelling are different depending on the polymer to be used, but it is obvious for those skilled in the art.
  • the gel body is dried by air drying or the like to form a glass.
  • transparency and strength can be stably increased by drying for a sufficient time.
  • the hide-mouthed gel thin film in the thickness range of 1 ⁇ to 1 mm. If the thickness of the gel at the mouth opening is less than 1 ⁇ , the required strength cannot be obtained. On the other hand, by increasing the amount of gel before drying, it is possible to produce a hydrated gel thin film with a thickness of 1 mm or more.However, in the case of collagen, the solubilization concentration is limited to 0.5%. Therefore, a large amount of 0.5% collagen aqueous solution must be used, and it takes a long time to dry.
  • the hide-mouthed gel thin film produced by the method of the present invention is capable of transmitting a bioactive substance having a large molecular weight, whereby each of the two different surfaces of the hydrogel thin film sowed is seeded. Testing of interaction between cells through bioactive substances ⁇ It is thought to contribute greatly to research.
  • the hydrogel thin film prepared by the method as described above can be used as a cell culture carrier for culturing animal cells by introducing it into a culture vessel.
  • Animal cells to be cultured include primary culture cells, cell lines, fertilized eggs, and cells in which a foreign gene has been introduced into these cells. Further, those cells may be undifferentiated stem cells, cells undergoing differentiation, cells undergoing terminal differentiation, and cells undergoing dedifferentiation.
  • Means for initiating the culturing of those cells include seeding a cell suspension, minced tissue sections, fertilized eggs, or three-dimensionally reconstructed multicellular aggregates. In other words, adherent cells that can be cultured by the existing method can be cultured on the hydrogel thin film.
  • the reconstructed substance having epithelial-mesenchymal interaction cultured using the culture carrier according to the present invention can be applied to an alternative model of animal experiments, development of a cultured organ, and transplantation of the cultured organ.
  • Japanese Patent No. 3,081,130 it is possible to apply the gel culture carrier for hide mouth alone to prevent adhesion to organs.
  • a circular support with an outer diameter of 33 mm and an inner diameter of 24 mm as shown in Fig. 1 was prepared by cutting out a nylon membrane (Amersham # RPN 1782 B). After sterilization, a culture dish made of hydrophobic polystyrene ( ⁇ 35 mm: I WAK 1 # 3000— 03 5 X). Place 2.5 ml of cell culture medium (10% non-incubated fetal serum, 20 mmol / l HEPES (GI BCO #) in a 50 ml 1 volume sterile conical tube (IWAKI # 2342—050) cooled on ice.
  • cell culture medium (10% non-incubated fetal serum, 20 mmol / l HEPES (GI BCO #) in a 50 ml 1 volume sterile conical tube (IWAKI # 2342—050) cooled on ice.
  • the 0.25% collagen gel at a final concentration of 0.25% was vitrified by completely aseptically drying it for 2 days with the lid removed in a clean bench at 10 ° C and 40% humidity.
  • the glass-collagen dried collagen hydrogel was rehydrated.
  • 3 m 1 P Rinse with BS was added to the collagen thin film.
  • the collagen thin film was aseptically dried completely for 2 days with the lid removed in a clean bench under the conditions of 10 ° C. and 40% humidity. Thereafter, the cells were stored aseptically at room temperature.
  • FIG. 2 is a phase contrast micrograph of the collagen hydrogel immediately after gelation
  • FIG. 3 is a phase contrast micrograph of the collagen hydrogel thin film 72 days after drying.
  • a thick fiber structure was observed in the collagen hydrate mouth gel immediately after gelation, but it was not observed in the collagen hydrogel thin film after drying 72 days.
  • a granular structure was observed. This result suggested that some structural change occurred in the drying process.
  • the hide-mouthed gel thin film (hereinafter referred to as “thin film A”) prepared by the method shown in the above (Example 1) was stored at room temperature under aseptic conditions at various times ranging from 8 days to 133 days.
  • a strength measurement test was performed as follows. Strength measurement test, the ® present Nidec Industry Co., Ltd .: the intensity measuring device (digital force gauge), the contact area 1. Attach the first 3 cm 2 circular adapter, press the thin film at a rate of 9 mm / min, The maximum load when the thin film was broken was measured.
  • Figure 4 shows the results of the strength measurement test. That is, the strength of the thin film B that has not been sufficiently dried ( ⁇ in the figure) is about 109.3 g, while the strength of the sufficiently dried thin film A ( ⁇ in the figure) is In proportion to the drying time, it rose from 10.9 to 81.3 g. In other words, comparing the two, it was found that the strength of the thin film A was 1 to 8 times that of the thin film B. In particular, it was found that the strength increased remarkably when the drying time was 40 days or more.
  • the strength of the non-vitrified Hyde-mouth gel (Hata in the figure) is about 41.4 g.
  • the vitrified hide-mouth gel thin film had twice to 20 times the strength of non-vitrified hide-mouth gel.
  • the drying time was short, so that the strength varied, but as apparent from FIG.
  • the strength could be stably increased by drying for a sufficient time.
  • the reason that the strength of the hydrogel thin film is improved by sufficiently drying the hydrogel is considered to be related to the removal of the water contained in the hydrogel. Also, the reason why the strength is further improved after the drying time exceeds 40 days is considered that the bound water may have escaped.
  • a hydrogel thin film can be similarly prepared using extracellular matrix components other than collagen. In that case, it is not necessary to say that the required drying time differs for each substance.
  • a basement membrane component extracted from an EHS tumor in the example of the present specification, MATR IGEL (registered trademark: manufactured by Becton 'Dickinson' and 'Company') was used, the following:
  • MATR I GEL is diluted with a culture solution (DMEM) to prepare a 1 Omg / m 1 MATR I GEL solution.
  • an agarose hydrogel thin film can be prepared as follows. That is, 0.1 g of powdered agarose is added to 1 Om 1 of PBS, and the mixture is dissolved in an autoclave to prepare 1% agarose. After adding 2 ml of this solution to a 35 mm culture dish, keep at room temperature for 30 minutes to allow gelation. After that, it was dried all day and night on a clean bench, and then rehydrated. Can produce thin film hydrogel
  • a transparency test was performed on each of the thin film A (A1 to A9) and the thin film B prepared in the same manner as in the above (Example 2) as follows.
  • the absorbance at 400 nm of each hydrogel thin film and the non-vitrified hydrogel with the support was measured with a spectrophotometer (manufactured by JASCO Corporation).
  • Figure 5 shows the results of the transparency test. That is, the absorbance at 400 nm is 0.115 to 0.208 for the sufficiently dried thin film A ( ⁇ in the figure), and the absorbance of hydrogenated non-vitrified hydrogen () in the figure (0. 342) decreased from 33% to 60%.
  • the reason for improving the transparency of the hide-mouth gel by sufficiently drying the hide-mouth gel is that the moisture contained in the hide-mouth gel is removed. Is considered to be related. The reason that the transparency is further improved after the drying time exceeds 40 days is considered to be due to the possibility that the bound water is leaking.
  • the permeability of serum proteins in the gel membrane at the mouth opening was examined using a palm cell (manufactured by Beadrex), which is a glass device that can set the drug addition tank and the drug permeation tank through a membrane. Put 30% FBS / PBS in the drug addition tank, The solution was collected at 100 ⁇ l / time and sampled for 7 days. The collected sample was electrophoresed and the protein was stained by silver staining. As a result, it was confirmed that more than 110,000 daltons permeated the hydrogel thin film.
  • Example 5 Cell culture using a collagen hydrogel thin film culture carrier
  • 2 ml of CACO-2 cell suspension stained with # 26 was applied.
  • the inner wall of the petri dish was traced with tweezers to peel off the hydrated gel thin film on which CACO-2 was cultured on one side and collected.
  • the recovered hydrogel thin film was placed on an in vitro fertilization Petri dish (falcon # 3653) containing 3 ml of culture solution at the center with the cell culture surface facing down, and the upper surface was stained with PKH2.
  • Human dermis-derived fibroblasts (4 ⁇ 10 5 cells sZ350Ai I) were seeded and cultured in a 37 ° C. humidified incubator in the presence of 5% C 2 Z 95% air for 2 hours. Thereafter, the hydrogel thin film in which cells were seeded on both sides was transferred to a Petri dish to which a surface treatment for cell culture to which 2 ml of a culture solution had been added was added, and cultured for 3 days in the same manner as described above.
  • a circular support with an outer diameter of 33 mm and an inner diameter of 24 mm was prepared by cutting out a nylon membrane (Amersham # RPN 1782 B), aseptically treating, and a culture dish made of hydrophobic polystyrene ( ⁇ i). 35mm: IWAKI # 3000-0 35 X). 19. 2 mg / m 1 matrigel solution (BD B iosciences # 354234) was placed in a 2m l ahead of the support a hydrophobic polystyrene culture Yoyo petri dish was placed, 5% C0 2 95% 37 ° of the air presence The gel was maintained in the moisturizing incubator C for 1 hour.
  • each molecular weight protein of the hide-opening gel thin film was examined using a palm cell (manufactured by Beadrex), which is a glass device capable of setting the drug addition tank and the drug permeation tank through a membrane.
  • a solution in which each molecular weight protein was dissolved in 10% FBSZD MEM was added to the drug addition tank, and 10% FBS / DMEM was added to the drug permeation tank, and 200 ⁇ l was collected at a time and sampled for 7 days.
  • Glucose (Molecular weight; 180) Interleukin 8 (Molecular weight 9,000) Interleukin 6 (Molecular weight 23,200)
  • 10 mg / m1, 500 pg / m1, 250 pg / m 1 was added to the drug addition tank.
  • the glucose, interleukin 8, and interleukin 6 contained in the collected samples were quantified and found to have permeated at average rates of 22.4 mg / h, 30.41 g / h, and 16.54 pg / h, respectively.
  • the protein permeation rate changes depending on the molecular weight of the protein.
  • Example 8 Collagen Gel Thin Film Containing Tissue Section Derived from Mammalia
  • a collagen gel thin film was prepared using a circular nylon membrane having an outer diameter of 24 mm and an inner diameter of 16 mm as a support. After rehydration, it was dried on a slide glass.
  • an unfixed frozen tissue section embedded with OCTcompound (Sakura Seiki, Code # 4583) is attached to a cryostat (LEICA, Code # CM3050S) sample holder and sectioned with a microtome.
  • Tissue thin sections were obtained. Normally, the obtained thin section is attached to a slide glass, but in this example, as shown in FIG. 9, the thin section is transferred to a collagen gel thin film on the slide glass obtained as described above. Was completed.
  • the collagen gel thin film containing the tissue section was stored in 70% ethanol, but the tissue section was not removed.
  • the present invention facilitates functional assays for analyzing cell characteristics on the culture carrier according to the present invention, reconstruction of models of tissues and organs including epithelial mesenchyme, and transplantation of cells cultured on the culture carrier. It can greatly contribute to the production of organ-like structures by three-dimensional culture, development of cultured organs, or testing and research in the field of transplantation of cultured organs.

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Abstract

ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、ハイドロゲル薄膜の強度がハイドロゲルの強度より２倍～２０倍に増加するように、または、ハイドロゲル薄膜の４００ｎｍにおける吸光度が、ハイドロゲルの７０％～１０％に減少するように、その乾燥時間を設定して作製する。

Description

動物細胞の培養担体と、 該培養担体を用 ヽた動物細胞の培養方法およぴ移植方法 技術分野
本発明は、 乾燥によるガラス化技術を適用して作製されるハイドロゲル薄膜か ら成る細胞培養担体に関するもの ある。 さらに詳しくは、 培養系において、 強 度と形状維持力を有した培養担体と明、 当該担体上で様々な細胞を培養することで 細胞特性を解析する機能ァッセィを実現する培養方法、 上皮間充織をはじめとす 田
る組織や器官のモデルを再構築する動物細胞の培養方法、 およびその培養担体上 で培養した細胞の移植方法に関するものである。 背景技術
培養下における動物細胞は、 その培養環境を工夫することで、 医薬品等の生理 活性物質の開発研究やその製造手段、 あるいは培養 βの作製やその移植へと活 用領域が拡大している。 このような状況下、 従来より、 動物由来の機能細胞に目 的とする能力を発揮させるために、 動物細胞用の様々な培養担体が開発されてい る。 このように、 培養担体の素材と形状を創意工夫することで、 細胞の接着、 伸 展、 移動、 浸潤、 増殖、 分化、極性、 自己組織化、器官様構造体 （オルガノィド） 形成等の細胞挙動、 さらには細胞と培養液の相互作用機構を制御することができ る ( Takezawa T. A strategy for the development of tissue engineering scaffolds that regulate cell behavior. Biomaterials. 24, 2267, 2003. ) 0 これまでの培養担体の素材は、 天然物由来素材、 人工素材、 および天然物由来 素材と人工素材のハイブリッドに分類することができ、 それらの形状は、 支持体 への吸着体、 支持体の被膜、 フィルム、 膜、 プレート、 シャーレ、 フラスコ、 中 空糸、 糸およぴ /またはその織成体、 ゲル、 ビーズ等さまざまである。
上記天然物由来素材としては、 コラーゲン、 ファイブロネクチン、 ラミニン、 グリコサミノダリカン、 プロテオダリカン、 あるいはマトリゲノレ ( E H S腫瘍か ら抽出して再構成された基底膜； Kleinman, H. K. , et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochem. 25, 312， 1986. ) 等の動物糸且織か ら抽出した細胞外マトリックス構成成分、 動物組織から調製した無細胞真皮マト リ ックス (Livesey, S. A. , et al. Transplanted acellular allograft dermal matrix. Transplant, 60, 1, 1995. )、ィガイ由来の接着蛋白質、 絹、 あるいは綿等 が培養担体として開発されている。 また、 人工素材としては、 ナイロン等の生体 非吸収性の合成高分子、 ポリグリコール酸等の生体吸収性の合成高分子、 あるい はセラミックス等が培養担体として開発されている。
一般に、 動物細胞の培養は、 培養担体としてプラスチックシャーレを用いて 2 次元培養を行うが、 特に初代培養細胞では、 継代維持を繰り返すことにより、 元 来の細胞の機能発現を維持できなくなることがある。 これに対して、 上述の様な 種々の素材と形状の培養担体を用いて細胞を 3次元的に培養すると、 その細胞が 有している組織特異的機能を向上させ、 維持できることが知られている。
このような 3次元培養を行う手段としては、 細胞外マトリックス構成成分のゲ ル上ないしはゲル内で培養する方法、 中空糸を利用して細胞を多層化培養する方 法 ( Knazek, R. A. , et a丄. Cell culture on artificial capillaries : An approach to tissue growth in vitro. Science. 178， 65, 1972. )、 多数のビーズ担体の周囲 に糸田胞を培養する方法 ( van Wezel, A. L. Growth of cell-strains and primary cells on micro-carriers in homogeneous cyiture. Nature. 216， 64, 1967. )、 P U Fをはじめとするスポンジ担体の多孔質内で細胞を凝集培養する方法 ( Matsushita. T.， et al. High albumin production by multicellular speroids of adult rat hepatocytes formed in the pores of polyurethan foam. Appl Microbiol Biotecnol. 36, 324, 1991. )、温度感受性培養担体（ Takezawa, T. , et al. Morphological and iramuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101， 495, 1992. ) 等の機 能性培養担体を利用した多細胞性球状凝集塊 （スフヱロイド） 培養法、 ガーゼ等 の通液性培 担体 ( Takezawa, T. , et al. Mass transport via naturally branched scaffolds maintains viability of a reconstituted model of connective tissue. Tissue Eng. 3， 329， 1997. )を用いた多細胞性再構築体の培養法、生体内臓器の細胞 の足場である細胞外マトリックスを、 連続的 3段階灌流法により培養担体に改変 して、 臓器をまるごと培養する器官工学の技術を利用した培養法
( Takezawa, Γ. , et a丄. Concept for organ engineering: A reconstruction method of rat liver for in vitro culture. Tissue Eng. 6, 641, 2000. )、 および生体の 組織を複雑な構造とその構成成分を保持している動物組織の切片から成る培養担 体上で細胞を培養する方法 ( Takezawa, T. , et al. Cell culture on thin tissue sections commonly prepared for histopathology FASEB J. lb, 1847, 2002. ) 等 が知られている。 これらの 3次元培養法は、 上述の様な細胞挙動の誘導に活用さ れ、 ライフサイエンスのみならずバイオメディカルの分野の基礎研究に大きく寄 与してきた。 .
[発明が解決しようとする課題]
しかしながら、 上述したような 3次元培養の手法は、 2次元培養の手法の様に 単純ではなく、 その実現には熟練を要することから、 専門分野の基礎研究者たち には利用されてきたものの、 スピード、 コストを要求される医薬品をはじめとす る化学品開発の分野 （医薬品探索研究、 薬効試験、 毒性 ·安全性試験） に普及す るには至っていない。 つまり、 産業分野にはその実現の困難さから未だ普及して いない。
さらに、 上述したような 3次元培養法では、 2次元培養細胞に比べて個々の細 胞の顕微鏡観察が困難、 もしくは不可能であるという欠点があった。 また、 従来 力 ら、 2種以上の細胞からなる器官様構造体 （オルガノイド） を再構築するとい う概念はあったが、 その方法として、 ハイド口ゲル薄膜の両面に細胞を培養する という概念はこれまでにはないものである。
すなわち、 上述したような種々の 3次元培養法の中でも、 特にコラーゲンやマ トリゲル等の細胞外マトリックス構成成分を用いた培養方法は、 細胞の分化誘導 に優れているのみならず、 上皮間充織細胞からなる皮膚等のオルガノイド ( Bell, β.， et a丄. Living tissue formed m vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211, 1052, 1981. ) を再構 築できること、 血管内皮細胞による血管新生モデルを構築できること ^ Black, A. F. , et al. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. FASEB J. 12, 1331， 1998. )、 ガン細胞によるガン浸潤モデルを構築できること（ Albini, A. , et al.， A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239, 1987.；)から、 その有用性が実証されてきた。
しかしながら、これらのコラーゲンゲルやマトリゲルなどの様なハイドロゲノレ から成る 3次元培養担体は、 その調製作業の操作も煩雑であり、 それを用いた 3 次元培養、 さらに培養細胞の観察も困難であるという欠点があった。 すなわち、 コラーゲンゲルやマトリゲルは、 その調製時に、 塩濃度、 p Hおよび温度の管理 が必須であるが、 特に温度は、 ピペッティング操作などの際に低温を維持するこ とが難しく、 操作中にピペット内でゲル化が始まるなどの困難さがあった。
また、 コラーゲンゲノレやマトリゲルに動物細胞を播種して 3次元培養を開始す る手段としては、 ゲル化する前の冷たいゾルに細胞を懸濁し、 保温することで細 胞をゲル内に培養する方法と、 あらかじめゲル化した後に、 細胞をゲル上に播種 する方法が開発されてきた。
しかしながら、 前者においては、 ゲル調製時と同様の問題、 すなわちピぺッテ ィング操作の際にゲルィ匕が始まってしまうという問題があった。 さらに、 前者後 者ともに、 ゲルが柔らかいことからその取扱いが困難であり、 またゲル培養を維 持するための培養液の交換が困難であった。 さらに、 特にゲル収縮を誘導する細 胞を播種した際には、 顕微鏡観察の際に光の透過性が悪くなり、 ゲル內構成細胞 の顕微鏡による観察が全くできなくなることもあった。 それゆえに、 細胞外マト リックス構成成分をはじめとするハイドロゲル培養担体は、 基礎研究においては 活用されてきたが、 産業分野には普及するには至っていなかった。
また、 2種類の細胞を細胞外マトリックス構成成分のハイド口ゲル培養担体を 用いて共培養する手段としては、 両方の細胞をゲル内に包埋培養する方法、 一方 の細胞をゲル内に培養し他方の細胞をゲル上に培養する方法、 さらに両方の細胞 をゲル上に共培養する方法が開発されてきたが、 ハイドロゲルの表面と裏面に異 なる細胞を共培養する方法は、 片面に細胞を播種した後にハイドロゲル培養担体 を裏返すことが困難であるがゆえに、 これまで開発されていなかった。
そこで、 竹澤等は細胞外マトリックス成分含有の溶液を保持体と共にゲル化さ せ、 さらに乾燥させてガラス化し、 次いで再水和することで保持体と一体ィヒした 細胞外マトリックス含有ハイドロゲル薄膜を作製する技術を既に開発してきた
(日本国特許第 3 0 8 1 1 3 0号)。すなわち、 この特許技術は、細胞外マトリツ クス成分をはじめとするハイドロゲノ kfc咅養担体が、 柔らかく、 取扱いが難しいこ と等の問題点があることを解決すべく、 ハイド口ゲルよりも強度を高め、 さらに 支持体をつけることでその取扱いを簡便にしたものである。
しかしながら、 この技術では、 細胞外マトリックス含有ハイド口ゲル薄膜を再 現性良く作製するための条件が設定できておらず、 また、 充分な透明性を持たせ ることができていなかった。 すなわち、 日本国特許第 3 0 8 1 1 3 0号公報に示 された方法では、 ハイドロゲル薄膜の強度をハイドロゲルよりも 2倍程度上昇さ せることには成功していたものの、 両面培養等の操作、 もしくは細胞播種済みの 状態での移動には、 その強度は未だ不十分なものであった。 また、 顕微鏡観察に はハイドロゲル薄膜の透明性が必要であるが、 日本国特許第 3 0 8 1 1 3 0号公 報に示された方法では、 ハイドロゲル薄膜に濁りが残るという問題点があった。
[発明の目的]
本発明の目的は、 コラーゲンやマトリゲルをはじめとするハイドロゲルからな る 3次元培養担体を、 用事調製の必要がない状態で提供し、 かつ 3次元培養に伴 う動物細胞播種の困難さを克服し、 2次元細胞の播種と同様の手段で 3次元培養 を実現できる培養担体を提供し、 さらに、 細胞による極度なハイド口ゲルの収縮 が起きないゲル担体であり、 さらに培養液の交換が容易であるハイドロゲルから なる培養担体を提供することにある。
また、 本努明の他の目的は、 当該培養担体上での細胞特性を解析する機能アツ セィ、 上皮間充織をはじめとする組織や器官のモデルの再構築、 および当該培養 担体上で培養した細胞の移植方法を提供することにある。
さらに、 本発明の他の目的は、 動物細胞の培養担体となる細胞外マトリックス 成分等のハイドロゲル薄膜を、 再現性良く安定した物性を伴って製作する工程を 確立し、 また、 当該培養担体の一方の面に上皮細胞、 他方の面に間充織細胞を培 養することで、 上皮間充織相互作用の細胞機能ァッセィを可能とした再構築体の 作製方法を提供することにある 発明の開示
本発明は、 ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、 再水和して作製 されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、 ハイドロゲル薄膜の強 度がハイドロゲルの強度より 2倍〜 2 0倍に増加するように、 または、 ハイドロ ゲル薄膜の 4 0 0 n mにおける吸光度が、 ハイドロゲルの 7 0 %〜1 0 %に減少 するように、 その乾燥時間を設定して作製することにより、 2次元細胞の播種と 同様の手段で 3次元培養を実現できる培養担体を提供し、 さらに、 細胞による極 度なハイドロゲルの収縮が起きないゲル担体であり、 さらに培養液の交換が容易 であるハイドロゲルからなる培養担体を提供することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ドーナツ状支持体の構成を示す平面図であり、 図 2は、 ゲル化直後の コラーゲンハイド口ゲルの位相差顕微鏡写真であり、 図 3は、 乾燥 7 2 S後のコ ラーゲンハイド口ゲル薄膜の位相差顕微鏡写真であり、 図 4は、 強度測定試験の 結果を示したグラフであり、 図 5は、 透明度試験の結果を示したグラフであり、 図 6は、 両面培養を行った場合の位相差顕微鏡写真であり、 図 7は、 両面培養を 行つた場合の蛍光顕微鏡写真であり、 図 8は、 実施例 6のマトリゲルハイドロゲ ル薄膜を示す写真であり、 図 9は、 実施例 8のスライ ドグラス上のコラーゲンゲ ル薄膜に薄切片が移し取られた状態を示す概略図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明者等は、ハイドロゲル薄膜を作製する際のガラス化の工程に特に着目し、 ガラス化の工程における乾燥時間の違いが、 ハイド口ゲル薄膜の圧縮破壊強度、 透明度等に及ぼす影響について鋭意検討を重ねた結果、 本発明を完成させるに至 つたものである。
なお、本明細書において、 「ハイド口ゲル」 とは、高分子が化学結合によって網 目状構造をとり、 その網目に多量の水を保有した物質を指し、 より具体的には、 上記天然物由来素材や人工素材等の培養担体をィンキュベータ一でゲル化させた ものをいう。 また、 「ハイドロゲル乾燥体」 とは、 上記 「ハイドロゲル」 を以下に 述べる種々の方法で乾燥させたものをいい、 「ハイド口ゲル薄膜」 とは、上記「ハ イド口ゲル乾燥体」 を再水和させたものをいうものとする。
また、本明細書において、 「ガラス化（vitr ication)」 とは、鶏卵のタンパク 質 （白身） を熱変性させたもの （ハイド口ゲル） を、 風乾することで固くて透明 な物質に変えるガラス化技術 (Takushi E. , Edible eyeballs from fish. Nature 345, 298, 1990) で定義される。 (乾燥時間） , ハイド口ゲルを充分に乾燥させる時間は、 それぞれの物質毎で異なり、 また、 同じコラーゲンを用レヽた場合でも、 その含有水分量の違レヽによつて必要な乾燥時 間は異なるが、 ハイド口ゲル薄膜の圧縮破壊強度、 透明度、 重量の変化を検討し た結果、 （ a )ハイドロゲル薄膜の圧縮破壌強度が、ハイドロゲルの 2倍〜 2 0倍 に増加する範囲、 （b )ハイドロゲル薄膜の 4 0 0 n mにおける吸光度が、ハイド 口ゲルの 7 0 %〜 1 0 %に減少する範囲、 （ c )コラーゲンハイドロゲル薄膜の乾 燥重量が、 コラーゲンハイドロゲルの重量の 1 Z 5 0〜1 / 1 0 0に減少する範 囲となるように乾燥時間を設定することにより、 強度及び透明性に優れたハイド 口ゲル薄膜を作製することができることが判明した。
(乾燥方法）
乾燥方法としては、 風乾、 密閉容器内で乾燥 （容器内の空気を循環させ、 常に 乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用 いることができる。
なお、 上記風乾の方法としては、 1 0 °C 4 0 %湿度で無菌に保たれたインキュ ベータ一で 2日間乾燥させる、 もしくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、 室温で乾燥する等といった方法がある。 さらに、 風乾後は無菌状態を保ったまま で、室温もしくは 4 °Cで無菌的に保管する。後述するように、本発明においては、 この保管時間が 1ヶ月以上になると、 強度 ·透明度が有意に上昇することが確認 された,
(天然物由来高分子）
本発明でハイドロゲルの作製に用いられる天然物由来高分子としては、 細胞外 マトリックス成分、 マウス E H S腫瘍抽出物より再構成された基底膜成分 （商品 名：マトリゲノレ)、 ゼラチン、 寒天、 ァガロース等が挙げられる。 さらに、 前記細 胞外マトリックスとしては、 コラーゲン、 ラミニン、 コンドロネクチン、 グリコ サミノダリカン、 ヒアルロン酸、 プロテオグリ力ンなどが挙げられ、 それぞれの ゲルイ匕に至適な塩成分、 その濃度、 p Hなどを選択しハイドロゲルを作製するこ とが可能である。 · '
特に、 細胞外マトリックスとしてコラーゲンゲルを用いた場合には、 至適な塩 濃度を与える溶媒が、 PB S ( Phosphate Buffered Saline ) , HB S S ( Hank's Balanced Salt Solution )、 基礎培溶液、 無血清培養液、 あるいは血清含有培養 液などであってもよい。 また、 コラーゲンハイド口ゲル薄膜の単位面積あたりの コラーゲン含有量は、 100 μ g/cm2〜： Lmg/cm2が望ましく、 250 μ g/ cm2が最適濃度である。 コラーゲン含有量が 100 μ g/ cm2以下だと、 コラーゲンの濃度が薄すぎてゲル化が弱く、 充分な強度のコラーゲンゲル薄膜を 作製することができない。 さらに、 コラーゲンゲルイ匕の際の溶液の pHは、 6か ら 10が好ましい。 この範囲外であるとコラーゲンゲルィ匕しにくくなる。
(合成高分子）
また、 ハイド口ゲルの作製に用いられる合成高分子としては、 ポリアクリルァ ミド、 ポリビュルアルコーノレ、 メチルセルロース、 ポリエチレンォキシド、 o 1 y (,2— hy d r o xy e t hy lme t h a c r y l a t e) / p o 1 y c a p r o 1 a c t o n eなどが挙げられる。 また、 これらの高分子を 2種以上用 いてハイドロゲルを作製することも可能である。
(生理活性物質の添加）
また、 ハイド口ゲル薄膜が、 ゲル構成要素である高分子以外に生理活性物質を 有していても良い。 この生理活性物質としては、 細胞増殖因子、 分化誘導因子、 細胞接着因子、 抗体、 酵素、 サイトカイン、 ホルモン、 レクチン、 またはゲルィ匕 しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、 ビトロネクチン、 ェ ンタクチン、 ォステオポェチン等が挙げられる。 また、 これらを複数含有させる ことも可能である。
上記の様な生理活性物質を含んだハイドロゲル薄膜は、 まずゲル化する前のゲ ル構成高分子溶液に、 含有させたい生理活性物質を混合し、 その後、 ゲルィ匕 'ガ ラス化等のハイドロゲル薄膜の作製工程を経て作製することができる。 これによ り、 細胞増殖 ·分ィ匕 ·接着などに必要な因子をハイドロゲル薄膜側から供給する ことができるので、 より良い培養環境を実現することができる。 また、 含有させ た生理活性物質の細胞に対する影響を調べる試験を行うのに非常に有用である。
(ハイドロゲル薄膜の作製方法）
上述した高分子を、 各高分子に固有の至適塩濃度、 p Hに調製し、 各至適温度 でゲル化する。 なお、 このゲルィ匕の条件は、 用いる高分子によって異なるが、 当 業者にとっては自明の事実である。 続いて、 このゲル体を風乾等で乾燥させ、 ガ ラス化する。 本発明においては、 このガラス化工程において、 充分時間乾燥する ことにより、 透明度、 強度を安定的に上昇させることを実現したものである。 こ のようにして作製されたハイド口ゲル乾燥体を再水和することで、 強度のあるハ ィドロゲル薄膜を得ることができる。
また、 本発明によれば、 ハイド口ゲル薄膜の厚みを 1 μ ΐη〜 l mmの範囲で作 製することができる。 なお、 ハイド口ゲル薄膜の厚みが 1 μ πιより薄いと、 必要 な強度を得られない。 一方、 乾燥前のゲルの量を增やすことで、 1 mm以上の厚 みのハイド口ゲル薄膜を作製することは可能であるが、 コラーゲンの場合、 可溶 化濃度は 0 . 5 %が限界であるため、 0 . 5 %濃度のコラーゲン水溶液を大量に 使用しなくてはならず、 乾燥させるのに長時間を要する。
(物質透過作用）
上記のような方法で作製されたハイドロゲル薄膜について物質透過試験を行つ たところ、 コラーゲンゲル薄膜の場合、 分子量 1万ダルトン以上のタンパクを透 過することが確認された。 つまり、 本発明の方法で作製されたハイド口ゲル薄膜 は、 分子量の大きな生理活性物質を透過することが可能であり、 それにより、 こ のハイドロゲル薄膜の異なる 2つの面に播種された各々の細胞の間での生理活性 物質を介した相互作用の試験 ·研究に大きく貢献できると考えられる。
(細胞培養担体としての利用）
上記のような方法で作製されたハイドロゲル薄膜は、 培養容器に揷入して動物 細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。 培養する動物細胞とし ては、 初代培養細胞、 株化細胞、 受精卵、 およびそれらの細胞に外来遺伝子を導 入した細胞が挙げられる。 さらにそれらの細胞が、 未分化な幹細胞、 分化過程に ある細胞、 終末分ィ匕した細胞、 およぴ脱分化した細胞であっても良い。 また、 そ れらの細胞の培養を開始する手段としては、 細胞懸濁液、 細切組織片、 受精卵、 または三次元再構築した多細胞性凝集塊の播種が挙げられる。 つまり、 既存の方 法で培養できる接着性の細胞は本ハイドロゲル薄膜上で培養することが可能であ る。
また、上述したような動物細胞を、ハイドロゲル薄膜の片面はもちろんのこと、 両面に 1種類以上の細胞を培養することが可能である。 さらに、 両面培養におい ては、 各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。 特に、 ハイドロゲル 薄膜の一方の面には上皮系細胞、 他方の面には間充織細胞を培養することで、 上 皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、 また、 一方の 面には血管内皮細胞、 他方の面にはガン細胞を培養することで、 血管新生モデル やガン浸潤モデルなどの細胞機能ァッセィを可能とする。 (動物実験の代替）
さらに、 本発明に係る培養担体を用いて培養した上皮間充織相互作用のある再 構築体を、 動物実験の代替モデル、 培養臓器の開発および培養臓器の移植に適応 することができる。 上記日本国特許第 3 0 8 1 1 3 0号公報に示したように、 ハ イド口ゲル培養担体のみで、 臓器癒着防止に応用可能であるが、 さらにハイド口
0 ゲル薄膜の片面もしくは両面に細胞を培養し、 かつその透明性を生かした角膜上 皮細胞を播種した後、 ハイド口ゲル薄膜を角膜欠損患者へ移植する方法、 あるい は高齢化社会に伴い、 数回に渡る開腹手術により腹膜中皮組織が欠損し、 腸管臓 器癒着から腸閉塞等の合併症を引き起こす問題が起きているが、 これに対し本培 養担体上で腹膜のみならず胸膜、 心膜の中皮を培養して、 潤滑成分 （ヒアルロン 酸等） を分泌する優れた培養担体を移植することが可能となる。 実施例
以下、 さらに詳しくコラーゲン、 EHS腫瘍から抽出した基底膜成分及ぴァガ ロースを例とする実施例を示し、 この発明の構成並びに作用効果について説明す る。
(実施例 1 ：支持体付きコラーゲンハイドロゲル薄膜の作製）
図 1に示したような外径 33mm、 内径 24 mmの円形の支持体をナイロンメ ンブレン （Amersham#RPN 1782 B) を切り抜いて作製し、 滅菌処理後、 疎 水性ポリスチレン製培養用シャーレ (Φ 35mm： I WAK 1 #3000— 03 5 X) に入れた。 氷上で冷却した 50 m 1容量の滅菌コニカルチューブ （ I WA K I # 2342— 050) に 2. 5mlの細胞培養液 ( 10 %非動化ゥシ胎児血 清、 20mmo l/l HEPES (G I BCO# 15630-023), 100 un i t s/m 1ペニシリン · 100 g/m 1ストレプトマイシン (G I B C O# 15140— 031) 含有ダルべッコ改変イーグル培地 （G I B C O # 1 1 885-084)) と 2. 5mlの 0. 5 % I型コラーゲン水溶液（C E L L G E N I— AC 高研製） を加え、 均一に混和した。 最終濃度 0. 25%のコラーゲ ン混合液を先の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに 2. 0 m 1入れた後、 5%C02/95%空気存在下の 37°Cの保湿インキュベーターで 2時間維持してゲルイ匕した。 この終濃度 0. 25%コラーゲンゲルを、 10°C4 0 %湿度の条件下のクリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に 2日間完 全に乾燥することでガラス化させた。 これに 3 m 1の PB Sを加えることで、 ガ ラス化したコラーゲンハイドロゲル乾燥体を再水和した。 さらに数回 3 m 1の P B Sでリンスした。 さらにこのコラーゲンゲノレ薄膜を、 1 0 °C 4 0 %湿度の条件 下のクリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に 2日間完全に乾燥させた。 その後、 室温で無菌的に保管維持した。 さらに、 使用前に P B Sもしくは使用す る培養液で水和し、 シャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞ ることで、 支持体がついた強度のあるコラーゲンハイド口ゲル薄膜としてシヤー レより脱着回収できた。
図 2は、 ゲル化直後のコラーゲンハイドロゲルの位相差顕微鏡写真であり、 図 3は、 乾燥 7 2日後のコラーゲンハイドロゲル薄膜の位相差顕微鏡写真である。 これらの位相差顕微鏡写真から明らかなように、 ゲル化直後のコラーゲンハイド 口ゲルには、 太い繊維構造が観察されたが、 乾燥 7 2日後のコラーゲンハイドロ ゲル薄膜にはそれが観察されず、 全体に粒状構造が観察された。 この結果より、 乾燥工程において、 なんらかの構造変化が起きていることが示唆された。
(実施例 2 ：コラーゲンハイドロゲル薄膜の強度測定試験）
上記 （実施例 1 ) に示した方法で作製したハイド口ゲル薄膜 （以下、 薄膜 Aと いう） について、 室温で無菌的に保管する時間を 8日〜 1 3 3日と種々変えた複 数のサンプル （A 1〜A 9 ) と、 日本国特許第 3 0 8 1 1 3 0号公報に示した方 法に従って作製したハイド口ゲル薄膜 （以下、 薄膜 Bという） の乾燥 1日目のサ ンプルのそれぞれについて、 以下のようにして強度測定試験を行った。 強度測定 試験は、 ョ本電産工業株式会社製の強度測定機 （デジタルフォースゲージ） に、 接触面積 1 . 1 3 c m2の円形アダプターを取りつけ、 9 mm/m i nの速度で 各薄膜を押し、 薄膜破断時の最大負荷を測定した。
図 4は、 強度測定試験の結果を示したものである。 すなわち、 充分に乾燥がな されていない薄膜 B (図中、 △) の強度は約 1 0 9 . 3 gであり、 一方、 充分に 乾燥された薄膜 A (図中、 ▲) の強度は、 その乾燥時間に比例して、 1 0 0. 9 〜8 1 3 . 0 gと上昇した。 すなわち、 両者を比較すると、 薄膜 Aの方が薄膜 B よりも 1倍〜 8倍の強度を有していることが分かった。 特に、 乾燥時間が 4 0日 以降で、 強度の上昇が著しいことが分かった。
また、 ガラス化していないハイド口ゲル （図中、 秦） の強度は約 4 1 . 4 gで あり、 ガラス化したハイド口ゲル薄膜は、 ガラス化していないハイド口ゲルより も 2倍〜 20倍の強度を有していることが分かった。 上述した日本国特許第 3081130号公報に示した方法では、 乾燥時間に関 する規定がなく、 短い乾燥時間であったため、 強度にばらつきが見られたが、 図 — 4から明らかなように、 本発明に係るハイド口ゲル薄膜では、 充分時間乾燥する ことで強度を安定的に上昇させることができた。
このように、 ハイドロゲルを充分に乾燥させることによりハイドロゲル薄膜の 強度が向上する理由は、 ハイドロゲル中に含まれていた水分が抜けていくことが 関係していると考えられる。 また、 乾燥時間が 40日を経過するとさらに強度が 向上する理由は、 結合水が抜けていっている可能性があると考えられる。
なお、 本実施例では、 コラーゲンを例に説明したが、 コラーゲン以外の細胞外 マトリックス構成成分を用いて同様にハイドロゲル薄膜を作製することができる。 その場合、 その物質ごとに必要な乾燥時間は異なることは多言を要しない。 例え ば、 EHS腫瘍から抽出した基底膜成分 （本明細書の実施例では、 MATR I G EL (登録商標：べクトン 'ディッキンソン 'アンド 'カンパニー製） を用いた） を用いた場合には、 以下のようにして MATR I GELハイドロゲル薄膜を作製 することができる。すなわち、 MATR I GELを培養液（DMEM)で希釈し、 1 Omg/m 1の MATR I GEL溶液を作製する。 この溶液 2m 1を 35mm 培養皿に添加した後、 37°Cのインキュベーターの中で 30分間維持してゲル化 させる。 その後、 クリーンベンチ内で 2日間乾燥させた後に、 再水和することで MATR I GELのハイドロゲル薄膜を作製することができる。 また、 乾燥時間 を長くするに従って、 コラーゲンハイドロゲル薄膜と同様に強度と透明度が向上 する。
また、 ァガロースを用いた場合には、 以下のようにしてァガロースハイドロゲ ル薄膜を作製することができる。 すなわち、 1 Om 1の PB Sに粉末ァガロース 0. 1 gを加え、 オートクレープにかけ溶解して 1%ァガロースを作製する。 こ の溶液 2 m 1を 35 mm培養皿に添加した後、 室温で 30分間維持してゲル化さ せる。 その後、 クリーンベンチで一昼夜乾燥させた後に再水和することでァガロ ースハイドロゲル薄膜を作製することができる
(実施例 3 ：コラーゲンハイドロゲル薄膜の透明度試験）
上記 （実施例 2) と同様にして調製した薄膜 A (A1〜A9) と薄膜 Bのそれ ぞれについて、 以下のようにして透明度試験を行った。 透明度試験は、 支持体の 付いた各ハイドロゲル薄膜おょぴガラス化されていないハイドロゲルについて、 400 nmにおける吸光度を、 分光光度計 （日本分光株式会社製） で測定した。 図 5は、 透明度試験の結果を示したものである。 すなわち、 400 nmにおけ る吸光度が、 充分に乾燥された薄膜 A (図中、 ▲) では 0. 115〜0. 208 であり、 ガラス化していないハイドロゲノレ （図中、 ） の吸光度 （0. 342) の 33%〜60%に減少した。 特に、 乾燥時間が 40日以降で、 吸光度の低下、 換言すれば透明度の向上が著しいことが分かった。 また、 充分に乾燥がなされて いない薄膜 B (図中、 △) の吸光度は 0. 204であり、 ガラス化していないハ ィドロゲルの約 60%に減少した。 上述した日本国特許第 3081130号公報に示した方法では、 乾燥時間に関 する規定がなく、 短い乾燥時間であったため透明度にばらつきが見られたが、 図 5力 ら明らかなように、 本発明に係るハイドロゲル薄膜では、 充分時間乾燥する- ことで、 透明度を安定的に上昇させることができた。
このように、 ハイド口ゲルを充分に乾燥させることによりハイド口ゲル薄膜の 透明度が向上する理由は、 上記 （実施例 2) に示したと同様に、 ハイド口ゲル中 に含まれていた水分が抜けていくことが関係していると考えられる。 また、 乾燥 時間が 40日を経過するとさらに透明度が向上する理由は、 結合水が抜けていつ ている可能性があると考えられる。
(実施例 4 ：物質透過試験）
薬剤添加槽と薬剤透過槽とを膜を介して設定することができるガラス器具であ るパームセル （ビードレックス製） を用い、 ハイド口ゲル薄膜の血清タンパク質 の透過性を検討した。 薬剤添加槽に 30%FBS/PBSを入れ、 薬剤透過槽の 溶液を 1回当たり 100 μ 1ずつ採取して、 7日間にわたってサンプリングした。 採取したサンプルを電気泳動し、 銀染色でタンパクを染色したところ、 1 1万ダ ルトン以上のタンパクがハイドロゲル薄膜を透過していることが確認された。 (実施例 5 ：コラーゲンハイドロゲル薄膜培養担体を用いた細胞培養） 上記 (実施例 1 )で作製したシャーレに挿入されたハイドロゲル薄膜の片面に、 ΡΚΗ26で染色された 2mlの CACO—2細胞懸濁液 （1 X 105 c e 1 1 s/m 1 ) を播種して、 5%。〇2 95%空気存在下の37°〇保湿ィンキュべ ータ内で培養した。 4日間培養の後、 シャーレの内壁をピンセットでなぞること で、 片面に C AC O— 2が培養されたハイド口ゲル薄膜を剥がし、 回収した。 回 収されたハイドロゲル薄膜を、 中心部分に 3mlの培養液を入れた体外受精用の シャーレ （falcon# 3653) に細胞培養面が下になるように置き、 上面に PK H 2で染色されたヒト真皮由来繊維芽細胞 （4X 105c e l l sZ350Ai I) を播種して、 5%C〇2Z95%空気存在下の 37 °C保湿インキュベーター内で 2時間培養した。 その後、 2m 1の培養液を加えられた細胞培養用の表面処理の 施されていないシャーレに、 両面に細胞を播種したハイドロゲル薄膜を移し、 上 記と同様に 3日間培養した。 その後、 位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡で観察した 結果、 それぞれの面に異種の細胞を培養できることが確認された （図 6、 図 7)。 さらに、 両面に細胞を播種したコラーゲンゲル薄膜の垂直な凍結切片を作製した 結果、 ハイド口ゲル薄膜の厚みは約 50 ^ mであつた。
(実施例 6 ： M A T R I G E Lハイド口ゲル薄膜の作製）
図 1に示したような外径 33mm、 内径 24 mmの円形の支持体をナイロンメ ンブレン （Amersham#RPN 1782 B) を切り抜いて作製し、 無菌処理後、 疎水性ポリスチレン製培養用シャーレ （<i) 35mm : IWAKI # 3000— 0 35 X) に入れた。 19. 2mg /m 1マトリゲル溶液 (BD B i o s c i e n c e s # 354234) 2m lを先の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培 養用シャーレに入れた後、 5%C02 95%空気存在下の 37 °Cの保湿インキ ュベータ一で 1時間維持してゲル化した。 この 19. 2 mg/m 1のマトリゲル を、 室温でふたをはずした状態で無菌的に一昼夜完全に乾燥することで、 ガラス 化させた。 これに 3mlの PBSを加えることで、 ガラス化したマトリゲルハイ ド口ゲル薄膜を水和した。 さらに数回 3mlの PBSでリンスした。 さらにこの マトリゲル薄膜を、 室温でふたをはずした状態で無菌的に一昼夜完全に乾燥させ た。 その後、 室温で無菌的に保管維持した。 さらに、 使用前に PBSもしくは使 用する培養液で水和し、 シャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットで なぞることで、 支持体に支持された強度のあるマトリゲル薄膜としてシャーレよ り脱着回収できた （図 8参照)。 (実施例 7 ：各分子量タンパクの物質透過速度）
薬剤添加槽と薬剤透過槽を、 膜を介して設定することができるガラス器具であ るパームセル （ビードレックス製） を用い、 ハイド口ゲル薄膜の各分子量タンパ ク質の透過性を検討した。 薬剤添加槽に各分子量タンパク質を 10%FBSZD MEMに溶かした溶液を、 薬物透過槽に 10%FB S/DMEMを加え、 一回あ たり 200 μ 1ずつ採取して 7日間にわたってサンプリングを行った。 各分子量 タンパク質としては、 グルコース （分子量； 180) インターロイキン 8 (分子 量 9， 000) インターロイキン 6 (分子量 23, 200) を用い、 それぞれ 1 0 m g /m 1、 500 p g /m 1、 250 p g /m 1を薬剤添加槽に添加した。 採取したサンプル中に含まれるグルコース、 インターロイキン 8、 インターロイ キン 6を定量したところ、 それぞれ 22. 4mg/h、 30. 41 g/h, 1 6. 54 p g/hの平均速度で透過していた。 タンパクの分子量に依存して、 そ のタンパク透過速度が変化することが確認された。
(実施例 8 ：哺乳動物由来の組織切片を含んでいるコラーゲンゲル薄膜） 実施例 1と同様に、 外径 24mm、 内径 16 mmの円形のナイロンメンブレン を支持体として用いてコラーゲンゲル薄膜を作製し、 再水和後、 それをスライ ド グラス上で乾燥させた。 一方、 OCTc omp ound (サクラ精機、 Co d e #4583)で包埋した未固定の凍結組織切片を、クリオスタツト（LE I CA、 C o d e # CM 3050 S )の試料ホルダーに取り付け、ミクロトームで薄切し、 組織の薄切片を得た。 通常は、 得られた薄切片をスライドグラスに貼付するが、 本実施例では、 図 9に示すように、 上記のようにして得られたスライドグラス上 のコラーゲンゲル薄膜に薄切片を移し取ることができた。 なお、 組織切片を含ん でいるコラーゲンゲル薄膜を 7 0 %エタノール中で保存したが、 組織切片ははが れなかった。 産業上の利用可能性
2次元細胞の播種と同様の手段で 3次元培養を実現できる培養担体を提供する ことができるので、 専門分野の基礎研究者のみならず、 医薬品をはじめとする化 学品開発の分野での利用が極めて容易なものとなる。
また、 本発明に係る培養担体上での細胞特性を解析する機能アツセィ、 上皮間 充織をはじめとする組織や器官のモデルの再構築、 および当該培養担体上で培養 した細胞の移植を容易なものとしたので、 3次元培養による器官様構造体の作製、 培養臓器の開発、 もしくは培養臓器の移植の分野の試験 ·研究に大きく貢献し得 る。
7

Claims

1 . ハイド口ゲルを充分乾燥させる工程を経てガラス化した後に、 再水和して 作製されるハイド口ゲル薄膜から成る細胞培養担体。
2 . ハイド口ゲルを充分時間乾燥させる工程を経てガラス化した後に、 再水和 して作製されるハイドロゲル薄請膜から成る請求の範囲第 1項に記載の細胞培養担 体。
の
3 . ハイド口ゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、 再水和して作製される ハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって囲、 該ハイドロゲル薄膜の厚さが 1 m〜 1 mmであることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 2項に記載の 細胞培養担体。
4 . ハイド口ゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、 再水和して作製される ハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、 ハイドロゲル薄膜の強度がハ ィドロゲルより 2倍〜 2 0倍に増していることを特徴とする請求の範囲第 1項な いし第 2項に記載の細胞培養担体。
5 . ハイド口ゲルを乾燥させてガラス化した後に、 再水和して作製されるハイ ドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、 ハイドロゲル薄膜の 4 0 0 n mに おける吸光度が、 ハイドロゲルの 7 0 %〜1 0 %に減少していることを特徴とす る請求の範囲第 1項ないし第 2項に記載の細胞培養担体。
6 . ハイドロゲル薄膜が乾燥状態で提供されることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載の細胞培養担体。
7 . ハイドロゲルが 1種類以上の高分子の化学結合により形成されることを特 徴とする請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれかに記載の細胞培養担体。
8
8. ハイドロゲルを構成する高分子が、 天然物由来高分子もしくは合成高分子 のレ、ずれか一方、 あるいは両方であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載 の細胞培養担体。
9. 天然物由来高分子が細胞外マトリックス成分であることを特徴とする請求 の範囲第 8項に記載の細胞培養担体。
10. 細胞外マトリックス成分がコラーゲンであることを特徴とする請求の範 囲第 9項に記載の細胞培養担体。
11. コラーゲンハイドロゲル薄膜の単位面積あたりのコラーゲン含量が 10 0 μ §/。1112〜 11118/。1112でぁることを特徴とする請求の範囲第10項に 記載の細胞培養担体。
12. コラーゲンハイド口ゲル薄膜の乾燥重量が、 コラーゲンハイドロゲノレの 重量の 1/50〜1/100であることを特徴とする請求の範囲第 6項または請 求の範囲第 11項に記載の細胞培養担体。
13. ハイドロゲル薄膜が、 生理活性物質を透過できることを特徴とする請求 の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載の細胞培養担体。
14. ハイドロゲル薄膜が、 分子量 1万ダルトン以上の生体高分子を透過でき ることを特徴とする請求の範囲第 13項に記載の細胞培養担体。
15. 細胞外マトリックス成分含有のハイドロゲル薄膜が、 生理活性物質を含 有していることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 12項のいずれかに記載 の細胞培養担体。
9
1 6 . ハイドロゲル薄膜に形状を維持するための支持体が付いていることを特 徴とする請求の範囲第 1項 1ないし第 5項のいずれかに記載の細胞培養担体。
1 7. 請求の範囲第 1項ないし第 1 6項のいずれかに記載の細胞培養担体を、 培養容器に揷入して動物細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
1 8 . 一種類以上の動物細胞をハイドロゲル薄膜の片面あるいは両面に培養で きることを特徴とする請求の範囲第 1 7項に記載の細胞培養方法。
1 9 . ハイドロゲル薄膜のそれぞれの面に異なる動物細胞を培養することを特 徴とする請求の範囲第 1 8項に記載の細胞培養方法。
2 0 . ハイドロゲル薄膜の片面あるいは両面に細胞を培養することで細胞機能 のアツセィを実現することを特徴とする請求の範囲第 1 7項ないし第 1 9項のい ずれかに記載の細胞培養方法。
2 1 . 細胞機能のアツセィが、 特にハイド口ゲル薄膜の一方の面には上皮系細 胞、 他方の面には間充織細胞を培養することで上皮間充織相互作用を可能とした アツセィであることを特徴とする請求の範囲第 2 0項に記載の細胞培養方法。
2 2 . ハイドロゲル薄膜を介して上皮間充織モデルを再構築して生体内におけ る細胞機能を外揷することで、 動物実験を代替することを特徴とする請求の範囲 第 2 0項または第 2 1項に記載の細胞培養方法。
2 3 . 請求の範囲第 1 7項ないし第 2 0項のいずれかに記載の細胞培養方法に より動物細胞を三次元培養して再構築した生体外組織モデル。
2 4 . 請求の範囲第 1 7項ないし第 1 9項のいずれかに記載の細胞培養方法に より培養した動物細胞を保持する細胞移植担体。
2 5 . 請求の範囲第 2 3項に記載の生体外組織モデル、 または請求の範囲第 2 4項に記載の細胞移植担体を、 動物に移植することを特微とする細胞移植方法。
2 6 . 移植する動物が哺乳動物であることを特徴とする請求の範囲第 2 5項に 記載の細胞移植方法。
2 7 . 請求の範囲第 1項に記載の細胞培養担体が、 哺乳動物由来の細組織切片 を含んでいることを特徴とする細胞培養担体。
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