CN113846016A - 一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明的提出了一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用，其中高通量多孔阵列芯片至少包括宏观高通量阵列孔板；其中所述宏观高通量阵列孔板包括微观三维多孔支架芯片以及粘合在微观三维多孔支架芯片上的储液板。本发明公开的高通量多孔阵列芯片、装置细胞接种操作简单，不仅适用于各种干细胞的培养，而且可方便地构建多种细胞共培养微环境，更加接近于体内三维情况，为高通量和高内涵的模型构建和抗癌药物筛选等研究提供了方便而实用的平台，使得药物筛选结果更加真实可靠。

Description

一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及属于生物医学工程技术领域，特别涉及到一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用。

背景技术

近年来，再生医学的不断发展为复杂重大疾病的治疗带来了新的希望，其中，干细胞治疗作为再生医学一个重要分支，因其在临床试验中显示出良好效果而受到广泛关注。干细胞是指具有分化潜能并能够自我更新的一类细胞。由于其能够不断增殖自我更新，同时能分化产生多种下游细胞，通常还具有一些其他调控功能，因此多种干细胞具有重要的研究意义和临床应用价值。常见的例如间充质干细胞，具有成骨、成脂、成软骨等多项分化潜能，并被证明具有免疫调节功能，已被广泛应用于细胞治疗研究；又例如造血干细胞则能够分化为造血谱系所有祖细胞及成熟血细胞，即能够产生整个血液系统的所以细胞，因此造血干细胞移植被用于多种血液疾病的治疗。

但目前大部分干细胞体外培养效果并不理想。干细胞体外培养普遍策略是在传统二维细胞培养板/培养皿中，依靠调配的特定培养基及细胞因子、小分子等支持干细胞生长。然而基于这种策略，许多干细胞在体外培养后无法维持其干性及其重要生理功能。例如造血干细胞在体外培养后会难以维持自我更新的状态，过度分化而丧失其干性，也即丢失其能够重建血液系统的功能。这种二维培养的干细胞状态与其在体内的状态呈现出巨大差异，对于在体外对干细胞进行研究或利用干细胞进行下游研究例如药筛、在体外扩增干细胞用于临床治疗等造成了巨大阻碍。

细胞在体内以三维的细胞外基质包括胶原蛋白、纤连蛋白等基质蛋白构成的网络为生长基底，与传统二维细胞培养板/培养皿具有很大差异。且已有大量文献证明，多种细胞在三维培养条件下，其形态、核型、杨氏模量、基因/蛋白表达谱等表型都相对于二维培养条件发生明显变化，且三维培养的细胞状态及对外界信号的响应更接近其在体内的真实状态。这一现象提示了为干细胞构建模拟体内细胞外基质的三维培养环境的重要性。

体内细胞外基质网络存在很强的异质性，不同器官、组织或部位的细胞外基质网络的成分、拓扑结构、杨氏模量等物理化学性质都存在差异。例如血管内皮细胞的主要胞外基质成分为四型胶原蛋白、层粘连蛋白等，而骨组织的主要胞外基质成分为一型胶原。以小鼠肉瘤细胞分泌的混合胞外基质Matrigel为代表的细胞基质已被广泛应用于多种干细胞的培养，其突出的效果提示了胞外基质成分的重要性，但Matrigel存在批次差异和致瘤风险的问题，为满足临床应用需求还需要更稳定、可调控的细胞培养基底。此外，许多研究证明，单一调控基底的杨氏模量即可调控干细胞状态，如分化倾向。最为代表性的研究包括间充质干细胞在硬度递减的基质上依次呈现出成骨(25-40kPa)、成肌(8-17kPa)、成神经(0.1-1kPa)分化倾向。这表明调节基底的杨氏模量对培养不同类型干细胞的重要性。基底材料的拓扑结构、对细胞的空间位阻(或体现为材料的孔径)、交联形式或交联程度等均已被证明会影响细胞状态，因此要针对不同干细胞构建特定的三维培养环境亟需对培养基底的物理化学性质进行筛选优化。

为配合不同细胞类型、应用以及测试场景，此干细胞三维培养环境筛选平台的培养规格应可灵活调整，类似商品化6孔板、12孔板、24孔板等。同时，与上述商品化细胞培养板规格匹配的筛选平台，也因此能够适配各种检测仪器，便于对干细胞进行原位监测、观察。此外，干细胞的数量很少，且分离、纯化难度较大，因此，干细胞经该平台培养后应能够扩增出一定规模数量，进而满足下游流式或其它生化检测手段对不同亚群的定量表征。

因此，如何提供一种用于干细胞体外三维培养的高通量多孔阵列芯片，克服干细胞体外三维培养技术中无法同时实现培养规格可控可调、物理化学性质可调的仿生三维培养基底、便于干细胞原位监测及观察和培养后干细胞的数量满足下游流式细胞仪、WesternBlot等对不同亚群的定量表征的目的。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，提供一种用于干细胞体外三维培养的高通量多孔阵列芯片，实现培养规格可控可调、物理化学性质可调的仿生三维培养基底、便于干细胞原位监测及观察、培养后干细胞的数量满足下游流式细胞仪对不同亚群的定量表征的目的。

有鉴于此，根据本发明的第一个目的提出了一种高通量多孔阵列芯片，至少包括宏观高通量阵列孔板；其中宏观高通量阵列孔板包括微观三维多孔支架芯片以及粘合在微观三维多孔支架芯片上的储液板；

微观三维多孔支架芯片包括若干微圆组成若干集约化大圆的图形化多孔阵列模板和若干三维多孔支架；其中若干微圆内布设若干微孔；三维多孔支架嵌入若干微孔内；和

储液板上包含若干与集约化大圆相适配的储液孔，微观三维多孔支架芯片设置在储液孔内。

根据本发明中的一个实施例，若干微孔为圆形阵列式排布分散在若干微圆内，三维多孔支架嵌入图形化多孔阵列模板上的若干微孔内形成上下通孔结构。

根据本发明中的一个实施例，三维多孔支架厚度为0.5mm-2mm，为可自主吸收并承载含水样品的可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成。

根据本发明的第二个目的提出了制备前述高通量多孔阵列芯片的方法，包括如下步骤：

(1)分别将可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料、和交联剂溶解于交联反应溶剂中，并按照体积比1:1混合，形成预混液；

(2)将图形化多孔阵列模板进行等离子体表面处理3-5分钟，将预混液滴加到图形化多孔阵列模板上或将图形化多孔阵列模板浸入预混液3-5分钟，均匀填充微孔，将图形化多孔阵列模板再进行-20℃冷冻20h-40h；

(3)将冷冻后的图形化多孔阵列模板室温自然融化，去除交联剂后干燥。

根据本发明中的一个实施例，可交联的人工合成生物材料选自聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或聚氧化乙烯中的一种或多种。

根据本发明中的一个实施例，可交联的天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的一种或多种。

根据本发明中的一个实施例，交联剂选自戊二醛(GA)、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或多种。

根据本发明的第三个目的提出了包含前述高通量多孔阵列芯片的装置，至少还包括顶盖、边框和底座；其中宏观高通量阵列孔板组装完成后可拆卸卡入边框内；边框接触设置在底座内部；宏观高通量阵列孔板与底座底部存在一定高度的空间；顶盖可拆卸连接在底座上方。

根据本发明的第四个目的提出了前述的高通量多孔阵列芯片或装置在体外研究中的应用；其中体外研究包括细胞培养、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型。

根据本发明的第五个目的提出了利用前述包含高通量多孔阵列芯片装置进行细胞体外三维培养的方法，包括如下步骤：

A在灭菌后的装置的底座中加入15-20毫升琼脂溶液；

B将单细胞悬浮液逐一加入微孔中，由微孔中的三维多孔支架吸收；

C在储液孔内加入细胞培养液，37℃、5％CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养，隔天更换细胞培养液。

通过以上技术方案，本发明提出了，具有如下技术效果：

1、本发明中高通量多孔阵列芯片由众多微孔组成，具有且超过384孔板的高通量优势。

2、本发明提供干细胞体外三维培养的高通量多孔阵列芯片接种细胞简单，无需单个接种，每个微孔中间所含的三维多孔支架为海绵状蓬松的三维生物材料，周围是疏水的聚甲基丙烯酸甲酯，因此，主要依靠每个三维多孔支架的主动虹吸作用即可被接种，且分布较均匀。

3、本发明所提供的高通量多孔阵列芯片为无底且上下通透的三维材料支撑，可以允许激光共聚焦显微镜的各个不同通道直接进行激光通透扫描，相对于平皿或者其它有底的材料来说，收集的荧光信号强度更强，具有3D成像的优势。

4、本发明所提供的高通量多孔阵列芯片培养干细胞后，可以轻易实现将细胞从三维支架体系中无损的收获，从而完成传代和下游的表征。

5、本发明所提供的高通量多孔阵列芯片在细胞的数量上可实现规模化扩增，相较于之前单微孔三维培养模式，细胞数量充分满足下游流式分析、Western Blot等对于细胞数的需求。

6、本发明所提供的高通量多孔阵列芯片在清晰的3D成像基础上，不仅适用于各种干细胞的培养，同时可方便地构建多种细胞共培养仿生微环境，更加接近于体内三维情况，为高通量和高内涵的模型构建和抗癌药物筛选等研究提供了方便而实用的平台，使得药物筛选结果更加真实可靠。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1提供的高通量多孔阵列芯片装置制造流程示意图。

图2为实施例1提供的不同规格的高通量多孔阵列芯片装置。

图3为实施例1提供的高通量多孔阵列芯片装置和三维多孔支架微观结构。

图4为实施例1提供的利用高通量多孔阵列芯片装置进行体外细胞培养的效果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1

如图1-4有鉴于此，根据本发明的第一个目的提出了一种高通量多孔阵列芯片，至少包括；宏观高通量阵列孔板；其中宏观高通量阵列孔板包括微观三维多孔支架芯片以及粘合在微观三维多孔支架芯片上的储液板；

微观三维多孔支架芯片包括若干微圆组成若干集约化大圆的图形化多孔阵列模板和若干三维多孔支架；其中若干微圆内布设若干微孔；三维多孔支架嵌入若干微孔内；和

储液板上包含若干与集约化大圆相适配的储液孔，微观三维多孔支架芯片设置在储液孔内。

为进一步理解本实施例，图形化多孔阵列模板的材料为疏水材料，具体可理解为聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸甲酯疏水，使得细胞培养基可轻松被接种于三维多孔支架中。其中图形化多孔阵列模板可采用本领域成熟的微加工技术获得，如激光切割和雕刻，3D打印等在聚甲基丙烯酸甲酯板上加工而成，结合计算机辅助设计并绘制如Coredraw等画图软件，可定制化设计不同的规格。如利用激光切割和雕刻中激光雕刻机的主要加工参数为：切割能量100％，切割次数2，切割线速度10％。

具体地，根据商品化的不同规格的细胞培养孔板的孔径尺寸，可相应的设计对应规格的阵列芯片，在集约化大圆中可根据需要设计不同数量和不同直径的若干微圆，图形化多孔阵列模板中集约化大圆的直径为5-50毫米；集约化大圆之间的的孔边间距不小于0.5mm；微圆直径为0.5mm～5mm不等；微圆中设置按照圆形阵列排布的微孔，其中微孔的孔径为20-100微米，微孔孔壁硬度为10-200kpa。图形化多孔阵列模板的厚度决定了三维多孔支架的厚度，为确保细胞在三维多孔支架中生长的营养物质传输的需求，图形化多孔阵列模板的厚度一般为0.5mm-2mm，优选为0.5mm。将加工成型的图形化多孔阵列模板用75％的酒精清洗1min，然后用去离子水漂洗两次，超声清洗30min，然后进行热处理以改善平整度：取平整清洁的加热板，温度设置90℃，在受压状态下热处理1h使之平整，于真空罐内保存备用。

示例性但非限制的，本实施例中的微观三维多孔支架芯片和储液板通过丙烯酸胶粘合。为进一步理解本实施例，其中，储液板为具有多个储液孔的结构，类似细胞培养板，在储液孔底部开设若干与微观三维多孔支架芯片大小相同的圆孔，将微观三维多孔支架芯片外周涂覆丙烯酸胶，卡在储液孔底部圆孔内进行粘合。

为进一步理解本实施例，本实施例中的三维多孔支架为三维多孔支架液体材料(即本实施例中的预混液)通过涂布或者蘸取的方式，通过三维多孔支架液体材料的表面张力均匀布设在若干微孔内，通过低温冷冻形成占位冰晶后融化为三维多孔支架。

根据本发明中的一个实施例，若干微孔为圆形阵列式排布分散在若干微圆内，三维多孔支架嵌入图形化多孔阵列模板上的若干微孔内形成上下通孔结构。

根据本发明中的一个实施例，三维多孔支架厚度为0.5mm-2mm，为可自主吸收并承载含水样品的可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成。

有利的，三维多孔支架呈圆柱状或片状，厚度优选为0.5mm；其中含水样品包括但不限于培养基或PBS缓冲液等液体。

根据本发明的第二个目的提出了制备前述高通量多孔阵列芯片的方法，包括如下步骤：

(1)分别将可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料、和交联剂溶解于交联反应溶剂中，并按照体积比1:1混合，形成预混液；

(2)将图形化多孔阵列模板进行等离子体表面处理3-5分钟，将预混液滴加到图形化多孔阵列模板上或将图形化多孔阵列模板浸入预混液3-5分钟，均匀填充微孔，将图形化多孔阵列模板再进行-20℃冷冻20h-40h；

(3)将冷冻后的图形化多孔阵列模板室温自然融化，去除交联剂后干燥。

根据本发明中的一个实施例，可交联的人工合成生物材料选自聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或聚氧化乙烯中的一种或多种。

根据本发明中的一个实施例，根据权利要求4的方法，可交联的天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的一种或多种。

根据本发明中的一个实施例，交联剂选自戊二醛(GA)、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或多种。

具体的，示例性但非限制的，步骤(1)中的预混液示例配置为：配置pH＝6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，用作明胶和EDC交联反应的溶剂；2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液由2.13g 2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶于100mL去离子水得到，2-(N-吗啡啉)乙磺酸为商品化试剂，去离子水为实验室纯水仪制备得到，pH＝6可通过1M氢氧化钠进行调节，使用pH计进行测定。

将明胶溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，得到明胶溶液，明胶溶液中明胶的含量为每10ml 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中含有0.6g明胶；

将EDC溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，得到EDC溶液，EDC溶液中EDC的含量视具体实验需求而定，例如每10ml 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中含有0.1gEDC；将EDC溶液置于37℃水浴中，保温30分钟，第15分钟时取出并振荡一次。

将明胶溶液和EDC溶液放置在冰水浴中，维持15分钟；

将冰浴15分钟后的明胶溶液和EDC溶液按体积比1:1的比例混合，得到预混液。

为进一步了解本实施例，步骤(2)中在安全柜中按照无菌操作规范将预混液涂覆的方法有两种，分别如下：

第一种：将图形化多孔阵列模板进行等离子体表面处理3-5分钟，并于4℃低温预冷处理，将预混液滴加到图形化多孔阵列模板上通过玻片或玻璃棒在阵列芯片表面来回移动实现预混液在阵列芯片上均匀涂布并填充微孔；第二种将等离子体表面处理3-5分钟后的图形化多孔阵列模板添加表面防护层后浸入预混液3-5分钟后用镊子取出图形化多孔阵列模板；揭掉表面防护层以去除微孔周围残余的预混液。将按照第一种或第二种方式将预混液涂覆完成的图形化多孔阵列模板放置于-20℃冰箱中，冷冻反应20h-40h。

步骤(3)中将冷冻后的图形化多孔阵列模板室温自然融化，去除交联剂后干燥。具体操作为将冷冻后的图形化多孔阵列模板取出室温自然融化，加入去离子水清洗去除多余的交联剂，得到高通量多孔阵列芯片。将高通量多孔阵列芯片放入冷冻干燥机中冻干，之后于真空罐内保存待用。

本实施例中的三维多孔支架为细胞生长提供三维空间结构，利于在体外培养中构建接近细胞体内生存的三维微环境，为细胞在体外的扩增培养创造更适宜的环境。三维多孔支架为采用可交联的天然生物材料(高分子聚合物)天然和/或可交联人工合成生物材料(高分子聚合物)，与交联剂在低温冷冻的条件下交联制成，通过液态水形成占位冰晶再融化形成多孔结构。可交联的天然生物材料包括明胶及其衍生物、胶原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐及其衍生物等，可交联人工合成生物材料包括聚乙二醇二丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸2-羟乙基酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚乳酸等，其中交联剂种类视所用的具体材料而定，交联剂用量可改变材料的交联程度最终影响三维多孔支架的杨氏模量，从而影响细胞与三维多孔支架的相互作用。低温冷冻条件通常是0℃以下，-10℃～-80℃之间，冷冻温度和冷冻时间会影响材料的交联程度以及液态水形成占位冰晶的大小，从而影响三维多孔支架的杨氏模量和孔径大小。

根据本发明的第三个目的提出了包含前述高通量多孔阵列芯片的装置，具体的如图1提供了高通量多孔阵列芯片装置的制造流程示意图，其中a为激光雕刻图形化多孔阵列模板和对应尺寸的储液板，b为通过冷冻冰晶制孔技术制备三维多孔支架，c为高通量多孔阵列芯片装置爆炸图，d为组装完成的高通量多孔阵列芯片装置，e为在高通量多孔阵列芯片装置中接种细胞。

高通量多孔阵列芯片的装置至少还包括顶盖、边框和底座；其中宏观高通量阵列孔板组装完成后可拆卸卡入边框内；边框接触设置在底座内部；宏观高通量阵列孔板与底座底部存在一定高度的空间；顶盖可拆卸连接在底座上方。

有利的，顶盖为长方形，位于阵列芯片下方的边框。其中底座为长方形，包含相应规格均匀分布的保湿孔。

顶盖、边框与底座和阵列芯片可自由拆卸或组装，以便细胞培养过程中进行换液处理等操作。顶盖、边框和底座规格固定，与商品化的细胞培养孔板尺寸一致。

具体的，将微观三维多孔支架芯片通过3M双面胶粘合在储液板上，并借助平口钳等工具压紧，完成宏观高通量阵列孔板的组装，将宏观高通量阵列孔板直接套在边框内，其中宏观高通量阵列孔板与边框大小相适配，然后将宏观高通量阵列孔板放入底座内，其中底座内设置凹槽，与边框可接触拆卸连接，最后在将宏观高通量阵列孔板上方盖上顶盖即可。组装过程均在生物安全柜中进行。组装好的装置即时使用或真空保存待用。组装完成的高通量多孔阵列芯片装置具体如图2-3。

根据本发明的第四个目的提出了前述的高通量多孔阵列芯片或装置在体外研究中的应用；其中体外研究包括细胞培养、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型。

本实施例中高通量多孔阵列芯片或装置在体外研究中的应用，可实现干细胞体外稳定均匀生长，可模拟体内不同干细胞所处生理微环境的理化性质在体外再现干细胞仿生微环境。

根据本发明的第五个目的提出了利用前述包含高通量多孔阵列芯片装置进行细胞体外三维培养的方法，包括如下步骤：

A在灭菌后的装置的底座中加入15-20毫升琼脂溶液；

B将单细胞悬浮液逐一正面接种加入微孔中，由微孔中的三维多孔支架吸收；单细胞悬浮液的浓度1x10⁵个/mL^-1x10⁷个/mL，优选的，单细胞悬浮液的浓度为6x10⁵个/mL；

C在储液孔内加入细胞培养液，37℃、5％CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养，隔天更换细胞培养液。

本实施例中的三维多孔支架可吸收1-3微升的细胞培养液。

示例性但非限制性的，步骤(1)中的装置在培养细胞前都需要进行灭菌处理；灭菌处理方式包括紫外辐照和环氧乙烷灭菌等。具体地，可通过紫外辐照2h达到灭菌效果，期间将上述组件进行正反面紫外照射以达到充分的灭菌。灭菌处理完成之后，在底座中加入15-20毫升琼脂溶液，用以达到保湿效果；其中琼脂溶液为含1％琼脂粉的水溶液经高温煮沸溶解后使用；底座在加入琼脂溶液后放置冷却凝固后备用。

利用高通量多孔阵列芯片装置进行细胞体外三维培养，如图4，以人脂肪源间充质干细胞为例，人脂肪源间充质干细胞在高通量多孔阵列芯片中接种：

准备所需培养的细胞悬液，用人脂肪源间充质干细胞无血清培养基将细胞重悬至6.09×10⁵个/ml的细胞密度，按每个微孔接种2微升液体体积计算，每个大圆孔中包含41个微孔，即接种细胞悬液体积为82微升，使得最终每个大圆孔接种的细胞数为5万。用移液枪吸取82微升体积的细胞悬液，均匀推出细胞悬液的同时吸头沿着微孔匀速移动，三维多孔支架为海绵状，具有海绵样的虹吸作用，推出的细胞悬液即被微孔中的三维多孔支架吸收。待所有微孔接种完成后，静置1-2分钟让三维多孔支架充分吸收细胞悬液，然后在每个储液孔中加入600ul人脂肪源间充质干细胞无血清培养基。将接种细胞后的高通量多孔阵列芯片放在装置中，即可置于37℃、5％CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养。

人脂肪源间充质干细胞在高通量多孔阵列芯片中的培养和表征：细胞接种后隔天换液，加入600ul人间充质干细胞无血清培养基进行继续培养，因为人脂肪源间充质干细胞为经人工构建的带GFP荧光基团的干细胞，因此在本装置中可以实现培养的同时进行成像观察，可以通过实时荧光成像对细胞生长进行监测。

人脂肪源间充质干细胞在高通量多孔阵列芯片消化收集和传代培养：细胞培养2-4天后，进行传代培养。首先去除储液板内的培养基，加入100微升酶解液，37℃孵育20min，支架材料会被完全降解而不损伤细胞，细胞在三维支架中裂解后被释放出来，用移液器将含有细胞的消化液收集到离心管内，经过1000rpm，5min离心即可无损收获细胞，经过细胞计数仪计数后即按照1的步骤将细胞接种于新的高通量多孔阵列芯片中，完成传代培养。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种高通量多孔阵列芯片，其特征在于，至少包括宏观高通量阵列孔板；其中所述宏观高通量阵列孔板包括微观三维多孔支架芯片以及与微观三维多孔支架芯片粘合的储液板；

所述微观三维多孔支架芯片包括若干微圆组成若干集约化大圆的图形化多孔阵列模板和若干三维多孔支架；其中若干微圆内布设若干微孔；三维多孔支架所述嵌入若干所述微孔内；和

所述储液板上包含若干与所述集约化大圆相适配的储液孔；所述微观三维多孔支架芯片设置在所述储液孔内。

2.根据权利要求1所述的高通量多孔阵列芯片，其特征在于，若干所述微孔为圆形阵列式排布分散在若干微圆内，所述三维多孔支架嵌入若干所述微孔内形成上下通孔结构。

3.根据权利要求1或2所述的高通量多孔阵列芯片，其特征在于，所述三维多孔支架厚度为0.5mm-2mm，为可自主吸收并承载含水样品的可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料所构成。

4.制备如权利要求1-3任一所述高通量多孔阵列芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别将可交联的人工合成生物材料和/或可交联的天然生物材料、和交联剂溶解于交联反应溶剂中，并按照体积比1:1混合，形成预混液；

(2)将所述图形化多孔阵列模板进行等离子体表面处理3-5分钟，将所述预混液滴加到所述图形化多孔阵列模板上或将所述图形化多孔阵列模板浸入所述预混液3-5分钟，均匀填充所述微孔后，将所述图形化多孔阵列模板-20℃冷冻20h-40h，

(3)将冷冻后的所述图形化多孔阵列模板室温自然融化，去除交联剂后干燥。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述可交联的人工合成生物材料选自聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或聚氧化乙烯中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述可交联的天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸、层连接蛋白和纤维连接蛋白中的一种或多种。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种或多种。

8.包含权利要求1-3任一所述高通量多孔阵列芯片的装置，其特征在于，至少还包括顶盖、边框和底座；其中所述宏观高通量阵列孔板组装完成后卡入所述边框内；所述边框接触设置在所述底座内部；所述所述宏观高通量阵列孔板与所述底座底部存在一定高度的空间；所述顶盖可拆卸连接在所述底座上方。

9.根据权利要求1-3任一所述的所述的高通量多孔阵列芯片或权利要求8所述的装置在体外研究中的应用；其中所述体外研究包括细胞培养、细胞生物学研究、药物开发、药物筛选、药物检测、药物测试、构建药理模型、病理模型、组织/器官模型和肿瘤模型。

10.利用权利要求8所述的装置进行细胞体外三维培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A在灭菌后装置的所述底座中加入15-20毫升无菌琼脂溶液；

B将单细胞悬浮液逐一加入所述微孔中，由所述微孔中的所述三维多孔支架吸收；

C在所述储液孔内加入细胞培养液，37℃、5％CO₂饱和湿度恒温培养箱中培养，隔天更换细胞培养液。

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