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WO2008143149A1 - 寸法が保持された細胞シート、その製造方法、及びそのための細胞培養担体 - Google Patents

寸法が保持された細胞シート、その製造方法、及びそのための細胞培養担体 Download PDF

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Publication number
WO2008143149A1
WO2008143149A1 PCT/JP2008/058985 JP2008058985W WO2008143149A1 WO 2008143149 A1 WO2008143149 A1 WO 2008143149A1 JP 2008058985 W JP2008058985 W JP 2008058985W WO 2008143149 A1 WO2008143149 A1 WO 2008143149A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
support
thin film
cell sheet
organic thin
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/058985
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiko Hase
Hideshi Hattori
Original Assignee
Dai Nippon Printing Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dai Nippon Printing Co., Ltd. filed Critical Dai Nippon Printing Co., Ltd.
Priority to US12/599,675 priority Critical patent/US8685733B2/en
Priority to EP08752839.4A priority patent/EP2151492B1/en
Priority to JP2009515198A priority patent/JP5257355B2/ja
Publication of WO2008143149A1 publication Critical patent/WO2008143149A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • Cell sheet having dimensions, manufacturing method thereof, and cell culture carrier therefor
  • the present invention can be used in fields related to cell tissue-based pharmaceuticals, for example, therapeutic fields such as regenerative medicine, drug discovery fields, diagnostic fields, examination fields, and the like. Manufacturing method and use in such method
  • the present invention relates to a cell culture carrier.
  • the technology for producing cell sheets is an important technology in the field of tissue engineering, but there are several problems.
  • Patent Document 1 discloses a technique in which a temperature-responsive polymer is disposed on the surface of a cell culture substrate to facilitate cell sheet peeling, and the cell sheet is peeled off by changing the temperature after cell sheet culture.
  • this technique is not applicable to all cell types, and some cell types are difficult to detach.
  • the problem that the cell sheet after detachment contracts has not been solved.
  • it is difficult to make a thick cell sheet with this technology is also the problem that it is difficult to make a thick cell sheet with this technology.
  • Patent Document 2 discloses a technique for coating the surface of a support with fibrin glue for the purpose of facilitating cell sheet peeling.
  • Patent Document 2 describes that fibrin glue is decomposed and lost by an enzyme contained in cells, and the cells are suspended while being bound in a sheet shape, so that the cell sheet can be easily detached.
  • it is difficult to say that sufficient peelability is achieved since the cell sheet is peeled off using a scraper.
  • Some may not be able to fully degrade fibrin glue.
  • the problem that the cell sheet shrinks after peeling has not been solved.
  • This technique also discloses a technique for facilitating peeling of the cell sheet by controlling the adhesive force between the cell sheet and the culture substrate (see, for example, Patent Documents 3 to 6).
  • neither technique is applicable to all cell types.
  • the problem that the cell sheet contracts cannot be solved by these techniques.
  • Patent Documents 7 and 8 describe a hydrogel thin film that has been vitrified to increase its shape maintenance power.
  • Patent document 1 International publication WO 2002/008 38 No. 7 pamphlet Patent literature 2
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-94 79 9
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-26 1 292
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-296896
  • Patent Document 7 International Publication WO 2005/0 1 4 7 74 Pamphlet Patent Document 8 JP-A-8-228768 Disclosure of Invention
  • the present invention aims to solve these problems.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the organic thin film is formed of a polymer compound, and the dry weight per unit area of the polymer compound is 5 to 100 / ⁇ (: 111 2.
  • the cell layer is used as the support-supporting culture membrane.
  • a method for producing a support-carrying cell sheet comprising peeling off from the substrate to obtain a support-carrying cell sheet comprising the support-carrying culture membrane and a cell layer.
  • FIG. 1 (a) is a top view of the cell culture carrier of the present invention.
  • FIG. 1 (b) is a cross-sectional view taken along the line AA ′ of the cell culture carrier of the present invention shown in FIG. 1 (a).
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing how to use the cell culture carrier.
  • FIG. 3 shows a multilayer support-carrying cell sheet 9 obtained by laminating a plurality of support-carrying cell sheets 8.
  • FIG. 4 is a schematic view showing a method for producing a contraction-inhibiting cell sheet.
  • FIG. 5 is a top view of a cell culture carrier having a patterned organic thin film.
  • Fig. 6 shows a phase contrast micrograph of the support-retaining cell sheet of sushi aortic vascular endothelial cells.
  • Fig. 7 shows a confocal micrograph of the support-retaining cell sheet of sushi aortic vascular endothelial cells.
  • (1) indicates the cell nucleus and (2) indicates the collagen thin film.
  • FIG. 8 shows a confocal photomicrograph of a laminate of support-retaining cell sheets of sushi aortic vascular endothelial cells stained with force Lucin.
  • Figure 9 shows the results of cross-sectional observation of a confocal microscope (bottom of Fig. 9) and a schematic view of the cross-section when a sheet of support-retaining cell sheets of sushi aortic vascular endothelial cells is stained with force Lucin. 9 Top)
  • Fig. 10 shows a phase contrast micrograph (bottom of Fig. 10) after laminating a support-supporting culture membrane on a support-supporting cell sheet of sushi aortic vascular endothelial cells and culturing for 2 days, and a schematic diagram of the cross section (Fig. 1 above).
  • Fig. 11 is a phase contrast micrograph of a laminate of fibroblast support-retaining cell sheets.
  • Figure 12 shows the co-lamination of the vascular endothelial cell and fibroblast support-supporting cell sheet.
  • Fig. 13 shows the observation results of the patterned support-bearing cell sheet.
  • Fig. 4 shows an organic thin film-coated support-supporting cell sheet 1 in which the organic thin film 2 of the support-supporting culture membrane 4 is coated on the surface of the support-supporting cell sheet 8 on which the cell layer is formed
  • Fig. 15 shows an organic thin film-coated multilayer support-carrying cell sheet 1 3 formed by coating the organic thin film 2 of the support-carrying culture film 4 on the surface of the cell layer of the multilayer support-carrying cell sheet 9 formed on the surface.
  • FIG. Fig. 1 (a) is a top view of the cell culture carrier 1
  • Fig. 1 (b) is a cross-sectional view taken along the line A-A '.
  • the cell culture carrier 1 is composed of an organic thin film 2 having cell adhesiveness and biodegradability, and a frame-like support for holding the dimensions of the organic thin film 2 fixed to the periphery of the organic thin film 2 3 and a substrate 6 having a surface 5 having a static water contact angle of 45 ° ′ or less.
  • the support-supporting culture membrane 4 is detachably installed on the surface 5 of the substrate 6. (How to use cell culture carrier)
  • FIG. 2 (a) A method of using the cell culture carrier 1 will be described with reference to FIG.
  • desired cells are cultured on the organic thin film 2 to form a sheet-like cell layer 7.
  • the cell layer 7 is peeled off from the substrate 6 together with the support-supporting culture membrane 4 (FIG. 2 (b)), and consists of the support-supporting culture membrane 4 and the cell layer 7 formed on the membrane 4.
  • a support-retaining cell sheet 8 is obtained (FIG. 2 (c)).
  • a plurality of support-supporting cell sheets 8 may be laminated to form a multilayer support-supporting cell sheet 9.
  • the support-supporting cell sheet 8 or the multilayer support-supporting cell sheet 9 produced in this manner is easily contracted because it does not shrink even if it is peeled off from the substrate 6 because the peripheral edge is held by the support 3. it can.
  • the support-supporting cell sheet 8 or the multilayer support-supporting cell sheet 9 can be separated from the support 3 after being transplanted into a living body or the like. Further, if the support 3 is formed of a biodegradable material, it is not necessary to separate the support 3 after transplantation.
  • the individual support-carrying cell sheet for producing the multilayer support-carrying cell sheet may be a cell sheet of the same type of cells or a cell sheet of different types of cells.
  • the surface of the support-carrying cell sheet 8 or the multilayer support-carrying cell sheet 9 on which the cell layer is formed may be further coated with an organic thin film having cell adhesion and biodegradability.
  • the organic thin film used for coating may be the same as the organic thin film constituting the support-holding culture membrane.
  • a support-supported culture membrane shown in FIG. 1 or the like having a peripheral edge supported by a frame-like support can be preferably used.
  • Fig. 14 shows the surface of the support-carrying cell sheet 8 on which the cell layer is formed, which is coated with the organic thin film 2 of the support-carrying culture membrane 4. An example is shown.
  • the support-carrying cell sheet 8 or the multilayer support-carrying cell sheet 9 can be further processed into a contraction-inhibiting cell sheet 11. That is, a biodegradable sheet 10 having sufficient strength and cell adhesion is laminated on the multilayer support-carrying cell sheet 9 (FIG. 4 (b)), and maintained for a certain period of time to adhere both. Subsequently, the shrinkage-suppressing cell sheet 11 is obtained by removing the support 3 (FIG.
  • FIG. 4 shows an example using the multilayer support-carrying cell sheet 9
  • a single-layer support-carrying cell sheet can be similarly processed into a contraction-inhibiting cell sheet.
  • Multiple biodegradable sheets may be used.
  • a laminate of a plurality of contraction-inhibiting cell sheets is also included in the contraction-inhibiting cell sheet of the present invention.
  • the organic thin film may be patterned.
  • the support-carrying cell sheet produced using the cell culture carrier 1 ′ having the organic thin film 2 patterned in this manner has pores at desired positions.
  • a multilayer cell sheet obtained by laminating a plurality of such support-carrying cell sheets has a void at a desired position, so that oxygen or the like can be supplied to the inside of the thick cell sheet, resulting in cell necrosis. It is expected that problems such as these can be solved.
  • the organic thin film is not particularly limited as long as it has cell adhesion and biodegradability, but is preferably made of a biological material.
  • Specific materials include various collagens, peptide hydrogenores, laminin, chondronectin, glycosaminodarlicans, hyaluronic acid, proteodaricans, extracellular matrix component proteins other than those described above, and mouse EHS tumor extracts.
  • Examples include gels made of polymer compounds such as membrane components (trade name: Matrigel), gelatin, agarose, oligonucleic acid, and polynucleic acid.
  • artificially synthesized biomaterial imitation materials that are not extracted from living organisms are also preferred.
  • examples thereof include various artificial peptides and derivatives thereof, artificial oligopeptides and derivatives thereof, artificial polypeptides and derivatives thereof, artificial polysaccharides and derivatives thereof.
  • the dry weight per unit area of the polymer compound is 5 to 100 ⁇ g / cm 2 , preferably 20 to 40 ⁇ 8 ⁇ .
  • the thickness is m 2 . Since the organic thin film is so thin, it is considered that when the cell sheets produced according to the present invention are stacked, a network is easily formed between the cell layers, and a paraclinic cell-layer interaction is expected. You can also Since the support-supported cell sheet obtained in the present invention suppresses the dimensional change of the organic thin film due to shrinkage of the cell sheet or the like by the peripheral support, a thin organic thin film that can be expected to have such advantageous effects is used. But it is easy to handle.
  • the base material having a surface with a static water contact angle of 45 ° or less used in the present invention has a sufficiently weak adhesion to an organic thin film (however, it does not peel off naturally under normal cell culture conditions) Therefore, even a very thin organic film can be recovered without being damaged when it is peeled off from the substrate surface.
  • the organic thin film may be patterned into a desired shape.
  • a patterning method after the organic thin film is formed, the organic thin film is etched only in a specific region with a dissolving agent, a liquid organic material is directly applied to the substrate in a pattern with an ink jet or the like, and dried.
  • There are methods such as adhering to a substrate and then producing an organic thin film to remove the resist, and applying a liquid organic substance to the substrate through a mask with holes and drying.
  • a frame-shaped support for holding the dimensions of the organic thin film is fixed to the periphery of the organic thin film.
  • the material of the support is not particularly limited as long as it can be bonded to the organic thin film.
  • it is a polymer such as polyimide, polyester, nylon, or a biodegradable polymer such as polylactic acid.
  • the thickness of the support is not particularly limited as long as it is strong enough to withstand the lateral contraction of the cell layer, but it is preferably thinner than the cell layer to be cultured. 1 to 20 m is preferred. It is more preferable that the support is biodegradable and can be transplanted as it is.
  • the whole including the organic thin film and the support fixed to the periphery thereof is referred to as a support-supporting culture membrane.
  • the support-supporting culture membrane is detachably installed on the base material, and after cell culture on the organic thin film, the support portion can be picked using tweezers and peeled off from the base material.
  • the substrate has a surface with a static water contact angle of 45 ° or less, and the support-supporting culture membrane is in contact with the surface.
  • a substrate surface having such a static water contact angle generally tends to have cell adhesion inhibition properties.
  • Such a cell adhesion-inhibiting surface can be obtained by forming a film of an organic compound having a carbon-oxygen bond on the surface of the substrate.
  • the base material is preferably a material capable of forming a film of an organic compound having a carbon-oxygen bond on its surface.
  • inorganic materials such as metal, glass, ceramics, silicon, elastomers, plastics (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin) And organic materials represented by polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, and chlorinated vinyl resin).
  • the shape is not limited, and examples thereof include flat shapes such as flat plates, flat membranes, films, and porous membranes, and three-dimensional shapes such as cylinders, stamps, multi-well plates, and micro flow channels.
  • its thickness is not particularly limited, but is usually 0.1 to 1 000; / m, preferably 1 to 500 ⁇ , more preferably 10 to 2 000 m. is there.
  • the cell adhesion-inhibiting surface can be formed by a hydrophilic film formed of an organic compound having a carbon-oxygen bond and having a static water contact angle of 45 ° or less.
  • the carbon-oxygen bond means a bond formed between carbon and oxygen, and is not limited to a single bond but may be a double bond.
  • the main raw materials for the hydrophilic film include hydrophilic organic compounds such as water-soluble polymers, water-soluble oligomers, water-soluble organic compounds, surfactants, and amphiphiles. These are physically or chemically cross-linked with each other and physically or chemically bonded to the base material to form a hydrophilic film.
  • Specific water-soluble polymer materials include polyalkylene dallicol and derivatives thereof, polyacrylic acid and derivatives thereof, polymethacrylic acid and derivatives thereof, polyacrylamide and derivatives thereof, polyvinyl alcohol and derivatives thereof, Examples include zwitterionic polymers, polysaccharides, and the like. Examples of the molecular shape include linear, branched, and dendrimers. More specifically, a copolymer of polyethylene glycol, polyethylene glycolate and polypropylene darconole, for example, Pluronic F108, Pluronic F127, poly (N-isopropylalkylamide), poly (N-vinyl-2-pyrrolidone).
  • water-soluble oligomer materials and water-soluble low-molecular compounds include alkylene glycol oligomers and derivatives thereof, acrylic acid oligomers and derivatives thereof, methacrylic acid oligomers and derivatives thereof, acrylamide oligomers and derivatives thereof, and blu-oligomer acetate.
  • zwitterionic monomers oligomers and derivatives thereof acrylic acid and derivatives thereof, methacrylic acid and derivatives thereof, acrylamide and derivatives thereof, zwitterionic compounds, water-soluble silane coupling agents, water-soluble A thiol compound etc. can be mentioned.
  • ethylene diol oligomer (N-isopropyl acrylamide) oligomer, methacryloyloxychetyl phosphorylcholine oligomer, low molecular weight dextran, low molecular weight heparin, oligoethylene glycol thiol Nore, Ethylene Glycol Nole, Diethylene Glycol Nore, Triethylene Glycol Nore, Tetraethylene Daricol, 2- (Methoxy (Polyethyleneoxy)) Propyltrimethoxysilane, and Triethylene Daricol One Terminate One Thirty However, it is not limited to these.
  • the average thickness of the hydrophilic membrane is 0.8 ⁇ ! ⁇ 500 m, preferably 0.8 n m to l 0 0 / x m, 1 ⁇ ! ⁇ 10 ⁇ m is more preferable, and 1.5 ⁇ to 1 ⁇ m is most preferable.
  • An average thickness of 0.8 nm or more is preferable because it is difficult to be affected by a region not covered with a hydrophilic film on the substrate surface in protein adsorption or cell adhesion. If the average thickness is 500 / xm or less, coating is relatively easy.
  • the method of forming a hydrophilic film on the substrate surface is to directly absorb the hydrophilic organic compound into the substrate.
  • a method of coating, a method of directly coating a substrate with a hydrophilic organic compound, a method of coating a substrate with a hydrophilic organic compound and then a crosslinking treatment, and a hydrophilicity in a multi-stage manner to improve adhesion to the substrate A method of forming a film, a method of forming a base layer on a base material in order to improve adhesion to the base material, and then coating a hydrophilic organic compound, forming a polymerization initiation point on the substrate surface, and then hydrophilicity Examples thereof include a method for polymerizing a polymer brush.
  • particularly preferable methods include a method of forming a hydrophilic film in a multistage manner, and a base layer is formed on the base material in order to improve adhesion to the base material, and then hydrophilicity is formed. And a method of coating a conductive organic compound. This is because it is easy to improve the adhesion of the hydrophilic organic compound to the substrate by using these methods.
  • the term “bonding layer” is used. The bonding layer means a layer existing between the outermost hydrophilic film layer and the substrate when a film of a hydrophilic organic compound is formed in a multistage manner, and a base layer is provided on the substrate surface.
  • the binding layer is preferably a layer containing a material having a binding portion (linker).
  • the combination of the linker and the functional group at the end of the material to be bonded to the linker includes epoxy group and hydroxyl group, phthalic anhydride and hydroxyl group, carboxyl group and N-hydroxysuccinimide, canoleboxyl group and carbodiimide. And amino groups and dartal aldehydes. In each combination, either may be the linker.
  • a bonding layer is formed from a material having a linker on a substrate.
  • the density of the material in the tie layer is an important factor that defines the bond strength.
  • the density can be easily evaluated using the contact angle of water on the surface of the bonding layer as an index. For example, taking an epoxy group-terminated silane coupling agent (epoxysilane) as an example, the water contact angle of the substrate surface to which epoxy silane is added is typically 45 ° or more, preferably 47 ° or more. If there is, a substrate having sufficient cell adhesion inhibitory property can be produced by adding an ethylene-based recall material in the presence of an acid catalyst.
  • epoxy group-terminated silane coupling agent epoxysilane
  • the biodegradable sheet for producing the shrinkage-suppressing cell sheet Therefore, there is no particular limitation as long as it has a strength that does not deform, that is, a strength sufficient to withstand deformation due to contraction of the cell sheet (referred to as “sufficient strength” in the present invention) and cell adhesion.
  • Examples include polylactic acid, poly (lactic acid monobutyric acid) copolymer, polybutyric acid, polydaricolic acid, collagen and its cross-linked body, gelatin and its cross-linked body, artificial polypeptide and its cross-linked body.
  • the method for producing the cell culture carrier of the present invention is not particularly limited.
  • a solution for forming the organic thin film is applied on the surface of the base material, and then a support is placed on the coating film of the solution. And it can manufacture by completing the formation process of organic thin films, such as gelatinization, in the state which mounted the support body.
  • the cells cultured using the cell culture carrier of the present invention may be floating cells such as blood cells and lymphoid cells, and may be adhesive cells, but the present invention is directed to cells having adhesiveness.
  • the present invention is directed to cells having adhesiveness.
  • examples of such cells include liver cells that are liver cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, and periodontal ligaments.
  • epidermal cells such as epidermal keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, breast cells, perisite, smooth muscle cells and muscle cells such as cardiomyocytes
  • epidermal cells such as epidermal keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, breast cells, perisite, smooth muscle cells and muscle cells such as cardiomyocytes
  • Examples include cells, kidney cells, knee Langerhans islet cells, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, cartilage cells, and bone cells. These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or they may be passaged several times.
  • these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, and unipotent stem cells such as unidirectional vascular endothelial progenitor cells. Any of the cells obtained may be used. In addition, the cells may be cultured as a single species, or two or more cells may be co-cultured.
  • a sheet-like cell layer By culturing a cell culture carrier seeded with these cells in a culture solution, a sheet-like cell layer can be formed.
  • any cell culture medium usually used in the art can be used without any particular limitation.
  • use MEM medium, BME medium, DME medium, ⁇ medium, I MDM medium, ES medium, ⁇ —60 medium, Fisher medium, F 12 medium, WE medium and RPM I 1 640 medium And the like for example, the basic culture medium described in “Tissue Culture Technology 3rd Edition” edited by Asakura Shoten, edited by the Japanese Tissue Culture Society, page 58
  • serum such as rabbit fetal serum
  • various growth factors, antibiotics, amino acids, etc. may be added to the basal medium.
  • a commercially available serum-free medium such as Gibeo serum-free medium (Invitrogen) can also be used.
  • Example 1 The present invention will be specifically described below based on examples, but the contents of the present invention are not limited to the contents of the examples.
  • Example 1 The present invention will be specifically described below based on examples, but the contents of the present invention are not limited to the contents of the examples.
  • O g, TS L 83 50 (manufactured by GE Toshiba Silicone) 0.8 g were mixed, and triethylamine 450 1 was added while stirring. After stirring for several minutes at room temperature, the whole amount was transferred to a glass dish.
  • a 10 cm square glass substrate that had been cleaned with UV was immersed and allowed to stand at room temperature for 16 hours. Thereafter, the glass substrate was washed with ethanol and water and dried by nitrogen blowing. Next, 25 g of concentrated sulfuric acid was added dropwise while stirring 50 g of tetraethylene glycol (TEG). After stirring for several minutes, the whole amount was transferred to a glass dish. Immerse the above substrate here, 8
  • the reaction was carried out at 0 ° C for 20 minutes. After the reaction, the substrate was thoroughly washed with water and dried by nitrogen blowing. As a result, a film containing TEG was formed on the glass substrate surface.
  • the surface static water contact angle was approximately 30 °. This substrate was cut into a size of 25 mm ⁇ 15 mm and used as a base material having a static water contact angle of 45 ° or less and cell adhesion inhibition.
  • a polyethylene terephthalate film (thickness 16 ⁇ , outer dimension 25 mm ⁇ 15 mm, inner dimension 20 mm ⁇ 9 mm, Teijin DuPont Finolem) was used.
  • Collagen gel culture kit (Cellmatrix I 1 A, Nitta Gelatin) was used to prepare a collagen solution with a final concentration of 2.4 mg nom 1 on ice. Of this, 40 ⁇ 1 was prepared at 1 _ 1 In addition to the base material, it was gelled with the support at 37 ° C for 1 hour, and then dried in a clean bench for 3 hours to produce a collagen thin film.
  • the result of measuring the thickness of the collagen thin film with a stylus type surface shape measuring instrument was 7 70 ⁇ 19 l nm.
  • the collagen thin film produced in this way was adhered to the substrate even after PBS was added and hydrated.
  • Example 1 Change the collagen content per unit area of substrate in the range of 5 to 1 50 Ug Z cm 2
  • the substrate was compared with polystyrene (cell culture dish, FALCON), glass, and a substrate chemically treated by the method of 1 of 1 of Example 1. Otherwise, the experiment was performed in the same manner as in Example 1. went.
  • the support-supporting cell sheet is detached from the substrate, the collagen thin film is torn, so that most of the cells remain on the substrate, or the collagen thin film is not torn and most of the cells remain in the cell sheet.
  • Table 1 and Table 2 show the relationship between defective products and non-defective products.
  • the static water contact of the polystyrene, glass, and substrates chemically treated by the method of 1 in 1 of Example 1 was 51 °, almost 0 ° (unmeasurable), and 30 °, respectively. It was.
  • the support-retained cell sheet produced in the same manner as described above in Example 1 is overlaid so that the collagen thin film and the cells are in contact with each other, and the support-retained cell sheet is slightly immersed in the medium.
  • the medium was sucked out and the same support-supporting cell sheet was brought into contact with the surface tension.
  • the culture medium was added so that the multilayer support-supporting cell sheet was sufficiently immersed in the culture medium after 4 hours of overlap, the support-supporting cell sheets were adhered to each other and moved together when one of the support-supporting cell sheets was moved. Laminate 4 layers by the same operation
  • Example 5 Add a suitable amount of MEM medium containing 5% urchin fetal serum to the cell culture carrier containing the collagen thin film prepared in 1 and 1 and 1 and 1 in Example 1, and after hydration, the support is picked up with tweezers and pulled up. The retention culture membrane (collagen thin film) was desorbed and recovered from the substrate. This support-supporting culture membrane was laminated on the support-supporting cell sheet prepared in Example 1 and cultured for 2 days to form an organic thin film-coated support-supporting cell sheet. The results observed with a phase contrast microscope (FIG. 10) ), Usashi aortic vascular endothelial cells were transformed into a network.
  • MEM medium containing 5% urchin fetal serum
  • Example 6 An appropriate amount of DMEM medium containing 10% sushi fetal serum was added to the cell culture carrier containing the collagen thin film prepared in 1 and 1 and 1 and 1 of Example 1.
  • 2.0 ⁇ 10 5 mouse fibroblasts were seeded per substrate.
  • the support-carrying cell sheet could be detached and recovered from the substrate in the same manner as in Example 1 1-13, and the support-carrying cell sheet did not cause cell contraction and could be handled by the support.
  • the support-retaining cell sheets were laminated in the same manner as in Example 3, and after laminating the three layers and culturing for 2 days, the results were observed with a phase-contrast microscope (FIG. 11). There was no change in the shape of the network like vascular endothelial cells.
  • Example 6 An appropriate amount of DMEM medium containing 10% sushi fetal serum was added to the cell culture carrier containing the collagen thin film prepared in 1 and 1 and 1 and 1 of Example 1.
  • 2.0 ⁇ 10 5 mouse fibroblasts were seeded per substrate.
  • Example 5 Co-lamination of cell sheets of vascular endothelial cells and fibroblasts
  • the mouse fibroblast support-supporting cell sheet prepared in Example 5 was overlaid on the susceptor aortic vascular endothelial cell support-supporting cell sheet prepared in Example 1 so that the cells and the collagen thin film were adhered.
  • DMEM medium containing 10% sushi fetal serum was added so that the support-retaining cell sheet was slightly immersed in the medium, and the layers were laminated in the same manner as in Example 3.
  • Example 7 the urinary aortic vascular endothelial cell support-retaining cell sheet prepared in Example 1 was laminated in the same manner, and the vascular endothelial cell and fibroblast support-retaining cell sheet were co-laminated and cultured for 3 days. As a result of observation with a phase contrast microscope (Fig. 12), the cell layers were adhered to each other.
  • Example 7 the urinary aortic vascular endothelial cell support-retaining cell sheet prepared in Example 1 was laminated in the same manner, and the vascular endothelial cell and fibroblast support-retaining cell sheet were co-laminated and cultured for 3 days. As a result of observation with a phase contrast microscope (Fig. 12), the cell layers were adhered to each other.
  • Fig. 12 phase contrast microscope
  • Example 8 After laminating a strong collagen sheet (thickness: 30 / im, two strands) on the support-retaining cell sheet laminated in two layers in Example 3, the support was ultrasonicated. As a result of separation with a force cutter, the cell sheet did not contract.
  • a strong collagen sheet thickness: 30 / im, two strands
  • Example 9 When collagenase is added to one part of the cell culture carrier containing the collagen thin film prepared in Example 1, the collagen at that part is decomposed, and the decomposed collagen is detached from the base material.
  • a cell culture carrier was prepared. Here, 2.0 ⁇ 10 5 rabbit aortic vascular endothelial cells were seeded per substrate. 24 After culturing for 4 hours, the cells did not adhere to the site where the collagen was detached, and the cells adhered only to the site where the collagen thin film was present. The support-supported cell sheet patterned by picking up the support with tweezers was pulled up and removed from the substrate (FIG. 13).
  • Example 9 Example 9
  • the reaction was carried out at 0 ° C for 20 minutes. After the reaction, the substrate was thoroughly washed with water and dried by nitrogen blowing. As a result, a film containing TEG was formed on the glass substrate surface.
  • the static water contact angle of the surface was approximately 30 °.
  • This substrate was cut into a size of 25 mm ⁇ 15 mm and used as a base material having a static water contact angle of 45 ° or less and cell adhesion inhibition. After autoclaving the base material, add an appropriate amount of 5% ushi fetal serum-containing MEM medium, seeding 2.0 x 10 5 sushi aortic vascular endothelial cells per substrate, and in the incubator ( When cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 ), no cells adhered to the substrate surface.
  • Polyethylene terephthalate film (thickness 16 ⁇ m outer dimension 2)
  • Example 9 Experiments were performed in the same manner as in Example 9 except that the collagen content per unit area of the base material was changed within the range of SS / zg Z cm 2 .
  • the collagen thin film is torn, for example, so that most of the cells remain on the substrate, or the collagen thin film does not break and most of the cells are separated from the cell sheet.
  • Table 3 shows the relationship between defective products and non-defective products.
  • the support-retained cell sheet prepared in the same manner is overlaid on the support-retained cell sheet prepared in Example 9 so that the collagen thin film and the cells are in contact with each other, and the support-retained cell sheet is slightly immersed in the medium.
  • the medium was sucked out and the same support-supporting cell sheet was brought into contact with the surface tension.
  • the culture medium was added so that the multilayer support-supporting cell sheet was sufficiently immersed in the culture medium after 4 hours of overlap, the support-supporting cell sheets were adhered to each other, and moved together with the movement of one support-supporting cell seed.
  • a cell sheet that can be easily detached from a cell culture carrier and in which shrinkage after the separation is suppressed.
  • the peeling of the cell sheet according to the present invention does not use the change in the binding property between the cells and the substrate, and therefore can be applied regardless of the cell type.
  • the organic thin film is appropriately patterned in the cell culture carrier of the present invention, the distribution of cells can be easily controlled, and a thick tissue body can be formed.
  • the cell sheet comprising the organic thin film and the cell layer obtained by the present invention can make the organic thin film layer portion thinner than the techniques described in Patent Documents 7 and 8, the cell sheet adjacent at the time of stacking However, it is thought that it is easy to form a network, and a paracrine cell-layer interaction can be expected.

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Abstract

　本発明は剥離が容易であり、なお且つ剥離後の収縮が抑制された細胞シート製造用の細胞培養担体を提供することを目的とする。　本発明の細胞培養担体１は、細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜２と、該有機薄膜の周縁部に固定された、前記有機薄膜の寸法を保持するための枠状の支持体３とを備える支持体保持培養膜４、及び、静的水接触角が４５°以下である表面５を有する基材６を備え、前記支持体保持培養膜４が前記基材表面５上に剥離可能に設置されていることを特徴とする。

Description

寸法が保持された細胞シート、 その製造方法、 及びそのための細胞培養担体
技術分野
本発明は細胞組織利用医薬品に関する分野、たとえば再生医療などの治療分野、 創薬分野、 診断分野、 検査分野などで用いることができる、 収縮が抑制され寸法 が保持された細胞シート、 かかる細胞シートの製造方法、 及びかかる方法に用い 明
る細胞培養担体に関する。 書
背景技術
細胞シートを製造する技術はテツシュエンジニアリングの分野において重要な 技術であるが、 幾つかの問題点が存在する。
まず、 細胞培養基板上で培養された細胞シートを基板から剥離することが困難 であるという問題がある。 また、 細胞シートを基板から剥離することができたと しても、 剥離後に細胞シートが収縮してしまい、 以後の細胞シートの取り扱いが 困難となるという問題もある。
例えば特許文献 1には細胞シートの剥離を容易にするために細胞培養基材表面 上に温度応答性ポリマーを配置し、 細胞シート培養後に温度を変化させて細胞シ ートを剥離する技術が開示されている。 しかしながらこの技術は全ての細胞種に 適用できるわけではなく、 剥離の困難な細胞種も存在する。 また剥離後の細胞シ ートが収縮するという問題点は解決していない。 また、 この技術では厚い細胞シ ートを作ることが難しいという問題点もある。
特許文献 2には、 細胞シートの剥離を容易にする目的で、 支持体表面をフイブ リン糊でコーティングする技術が開示されている。 特許文献 2には、 フイブリン 糊は細胞の有する酵素により分解されて消失し、 細胞がシート状に結合したまま 宙吊り状態になり、 容易に細胞シートを剥離できると記載されている。 しかしな がら特許文献 2では細胞シー卜の剥離はスクレイパーを用いて行われていること から、 十分な剥離性が達成されているとは言いがたい。 また、 細胞種によっては フイブリン糊を十分に分解できないものもあると考えられる。 また、 細胞シート が剥離後に収縮するという問題.も解消されていない。
このほ力 こも、 細胞シートと培養基板との接着力を制御することにより細胞シ ートの剥離を容易にする技術が開示されている （例えば特許文献 3〜6参照）。 し かしながらいずれの技術も全ての細胞種に適用できるとは限らない。 また、 細胞 シートが収縮する問題点はこれらの技術では解決されない。
またより困難な技術として、 細胞シートを多層化する技術がある。 テツシユエ ンジニアリングの分野では、 皮膚などの薄い組織や、 軟骨などの細胞が占める割 合の小さい組織を再生する技術は既に実用化されている。 また治療に役立つ細胞 を患部に注射する治療法も多く臨床試験がされている。 しかしながら細胞が占め る割合の大きい組織 （多くの組織がそうである） についてはまだテツシユエンジ ニアリングの技術が確立していない。 特に、 酸素要求性が高い組織体 （血管が張 り巡らされた組織体） や、 心臓や肝臓のような実質細胞からなる組織体を人工的 に製造するには、 細胞シートの厚みを 2 0 0 μ m以上にする必要があるが、 通常 の細胞シー I：をこの厚さ以上に積層すると内部の細胞に酸素 行き渡らず壊死し てしまう、 という問題がある。 ，
これまでに、 細胞に酸素を供給する目的で、 例えば生体吸収性材嵙からなる多 孔性足場 （担体） に細胞を播種し細胞組織体を形成す ¾技術が多く検討されてい る。 しかしながらこれらの技術は、 細胞を均一に足場内部まで分布させることが 難しく、 また、 移植組織が線維化しやすいという問題点がある。
また細胞シートを多層化すると単層の細胞シートと比較してより収縮が起こり やすい、 という問題点もある。
一方、 特許文献 7及び 8にはガラス化して形状維持力を高めたハイ ドロゲル薄
.· % ，
膜上に細胞を培養する技術が開示ざれている。 特許文献 7及び 8に記載のコラー ゲン等のハイ ドロゲル薄膜は物理的に強固であるため、 この薄膜上で培養さ^ ¾た 細胞シートは収縮する可能性は低いものと考えられる。 しかしながら用いられる ハイ ドロゲル層は非常に厚いことから、 特'許文献 7及び 8で得られたハイ ドロゲ ル層を伴う細胞層を複数積層したとしても、.隣接する細胞層間の間隙が大きくな るため細胞層同士のネッ トワークが形成されにくく、 また、 液性因子の拡散等に ン的な細胞層間相互作用も得にく く、 再生組織を製造するには適 していない。
特許文献 1 国際公開 WO 2002/008 38 7号パンフレツト 特許文献 2 国際公開 WO 2005/0286 38号パンフレツ ト 特許文献 3 特開 2006— 346 29 2号公報
特許文献 4 特開 2006— 94 79 9号公報
特許文献 5 特開 2005— 26 1 292号公報
特許文献 6 特開 2006— 296896号公報
特許文献 7 国際公開 WO 2005/0 1 4 7 74号パンフレツト 特許文献 8 特開平 8— 228 76 8号公報 発明の開示
上記のように、 細胞シートの製造において細胞培養担体から細胞シートを容易 に剥離でき、 なお且つ細胞シートの収縮を回避する技術として満足できるものは 未だ確立されていない。 また、 多層化するのに適した細胞シートも未だ提供され ていない。
本発明はこれらの課題を解決することを目的とする。
本発明は以下の発明を包含する。
(1) 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜と、 該有機薄膜の周縁部 に固定された、 前記有機薄膜の寸法を保持するための枠状の支持体とを備える支 持体保持培養膜、 及び、 静的水接触角が 4 5° 以下である表面を有する基材を備 え、 前記支持体保持培養膜が前記基材表面上に剥離可能に設置されていることを 特徴とする細胞培養担体。
(2) 前記基材表面が細胞接着阻害性である、 （1) 記載の細胞培養担体。
( 3 )前記有機薄膜が生体由来材料である、 （ 1 )又は（ 2 )記載の細胞培養担体。 ( 4 ) 前記有機薄膜が人工的に合成された生体由来材料模倣材料により形成され ている、 （1) 又は （2) 記載の細胞培養担体。
(5) 前記有機薄膜が高分子化合物により形成されており、 該高分子化合物の単 位面積当たりの乾燥重量が 5〜1 00 / § (： 1112でぁる、 （1) 〜 （4) のいず れかに記載の細胞培養担体。
(6) 前記有機薄膜がパターンユングされたものである、 （1) 〜 （5) のいずれ かに記載の細胞培養担体。
(7) (1) 〜 （6) のいずれかに記載の細胞培養担体の前記有機薄膜上で細胞を 培養してシート状の細胞層を形成した後、 該細胞層を前記支持体保持培養膜ごと 前記基材から剥離して、 前記支持体保持培養膜と細胞層とからなる支持体保持細 胞シートを得ることを特徴とする、 支持体保持細胞シートの製造方法。
(8) (7) 記載の方法により製造された支持体保持細胞シート。
(9) (8) 記載の支持体保持細胞シートの、 細胞層が形成された表面上に、 細胞 接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜を被覆してなる、 有機薄膜被覆支持 体保持細胞シート。
(1 0) (7)記載の方法により製造された支持体保持細胞シートを複数積層して なる多層支持体保持細胞シート。
(1 1) (1 0)記載の多層支持体保持細胞シートの、細胞層が形成された表面上 に、 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜を被覆してなる、 有機薄膜 被覆多層支持体保持細胞シート。
(1 2) (8) 記載の支持体保持細胞シート、 （9) 記載の有機薄膜被覆支持体保 持細胞シート、 （1 0) t己載の多層支持体保持細胞シート、 又は （1 1) 記載の有 機薄膜被覆多層支持体保持細胞シートと、 十分な強度を有し且つ細胞接着性であ る生分解性シートとを積層して接着させ、 その後に前記支持体を取り除くことを 特徴とする、 収縮抑制細胞シートの製造方法。
(1 3) (1 2) 記載の方法により製造された収縮抑制細胞シート。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007- 126677号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 (a)は本発明の細胞培養担体の上面図である。
図 1 (b)は図 1 (a)に示す本発明の細胞培養担体の A— A' 断面図である。 図 2は、 細胞培養担体の使用方法を示す模式図である。
図 3は、 支持体保持細胞シート 8を複数積層して得た多層支持体保持細胞シー ト 9を示す。
図 4は、 収縮抑制細胞シートの製造方法を示す模式図である。
図 5は、パターンニングされた有機薄膜を有する細胞培養担体の上面図である。 図 6は、 ゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートの位相差顕微鏡写真 を示す。
図 7は、 ゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートの共焦点顕微鏡写真 を示す。 図 7中 （1 ) は細胞核を指し、 （2 ) はコラーゲン薄膜を指す。
図 8は、 ゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートを積層したものを力 ルセィンにより染色した場合の共焦点顕微鏡写真を示す。
図 9は、 ゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートを積層したものを力 ルセィンにより染色した場合の共焦点顕微鏡の断面観察の結果（図 9下）、及び断 面の模式図 （図 9上） を示す。
図 1 0は、 ゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートに支持体保持培養 膜を積層し 2日培養した後の位相差顕微鏡写真（図 1 0下）、及び断面の模式図（図 1 0上） を示す。
図 1 1は、 繊維芽細胞の支持体保持細胞シートを積層したものの位相差顕微鏡 写真である。
図 1 2は、 血管内皮細胞と繊維芽細胞の支持体保持細胞シートの共積層を行い
3日培養した後、 位相差顕微鏡により観察した結果を示す。
図 1 3は、 パターンニングされた支持体保持細胞シートの観察結果を示す。 図 1 4は、 支持体保持細胞シート 8の細胞層が形成された表面上に、 支持体保 持培養膜 4の有機薄膜 2を被覆してなる、 有機薄膜被覆支持体保持細胞シート 1
2を示す。
図 1 5は、 多層支持体保持細胞シート 9の細胞層が形成された表面上に、 支持 体保持培養膜 4の有機薄膜 2を被覆してなる、 有機薄膜被覆多層支持体保持細胞 シート 1 3を示す。 符号の説明
1 - •細胞培養担体
2 · •有機薄膜
3 · •支持体
4 · •支持体保持培養膜
5 · '静的水接触角が 45° 以下である表面
6 · •基材
7 · • シート状の細胞層
8 · •支持体保持細胞シート
9 · •多層支持体保持細胞シート
10 • ·生分解性シート
1 1 • ·収縮抑制細胞シート
1 2 • ·有機薄膜被覆支持体保持細胞シート
1 3 • ·有機薄膜被覆多層支持体保持細胞シート 発明を実施するための最良の形態
(細胞培養担体の構造）
本発明の細胞培養担体の構造を図 1に基づいて説明する。 図 1 (a) は細胞培 養担体 1の上面図、 図 1 (b) は A— A' 断面図である。 細胞培養担体 1は、 細 胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜 2と、 有機薄膜 2の周縁部に固定 された、 有機薄膜 2の寸法を保持するための枠状の支持体 3とを備える支持体保 持培養膜 4、 及び、 静的水接触角が 45°' 以下である表面 5を有する基材 6を備 える。 支持体保持培養膜 4は、 基材 6の表面 5上に剥離可能に設置されている。 (細胞培養担体の使用方法）
細胞培養担体 1の使用方法を図 2に基づいて説明する。 まず図 2 (a) に示す ように所望の細胞を有機薄膜 2上で培養してシート状の細胞層 7を形成する。 次 に、 細胞層 7を支持体保持培養膜 4ごと基材 6から剥離して （図 2 (b))、 支持 体保持培養膜 4とこの膜 4上に形成された細胞層 7とからなる支持体保持細胞シ ート 8を得る （図 2 (c))。 支持体保持細胞シート 8は、 例えば図 3に示すように複数積層して多層支持体 保持細胞シート 9としてもよい。 こうして製造された支持体保持細胞シート 8又 は多層支持体保持細胞シート 9は、 周縁部が支持体 3で保持されているため基材 6から剥離しても収縮がなく、 容易に扱うことができる。 支持体保持細胞シート 8又は多層支持体保持細胞シート 9は生体等に移植した後に支持体 3を切り離す ことができる。 また支持体 3を生分解性材料で形成すれば、 移植後に支持体 3を 切り離す必要は無い。 多層支持体保持細胞シートを製造する際の個々の支持体保 持細胞シートは、 同種の細胞の細胞シートであってもよいし、 異種の細胞の細胞 シートであってもよい。 支持体保持細胞シート 8又は多層支持体保持細胞シート 9の細胞層が形成された表面を更に、 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有 機薄膜で被覆してもよい。 被覆に使用される有機薄膜は、 支持体保持培養膜を構 成する有機薄膜と同一のものであってよい。 また、 被覆に使用される有機薄膜と しては、 その周縁部が枠状の支持体で保持された、 図 1等に示す支持体保持培養 膜の形態のものが好適に使用できる。 図 1 4には、 支持体保持細胞シート 8の細 胞層が形成された表面上が、支持体保持培養膜 4の有機薄膜 2により被覆された、 有機薄膜被覆支持体保持細胞シート 1 2の例を示す。 図 1 5には、 多層支持体保 持細胞シート 9の細胞層が形成された表面上が、 支持体保持培養膜 4の有 m薄膜 2により被覆された、 有機薄膜被覆多層支持体保持細胞シート 1 3の例を示す。 また図 4に示すように、 支持体保持細胞シート 8又は多層支持体保持細胞シー ト 9は更に収縮抑制細胞シート 1 1に加工することもできる。 すなわち十分な強 度を有し且つ細胞接着性である生分解性シート 1 0を多層支持体保持細胞シート 9に積層し （図 4 ( b ) )、 一定時間維持して両者を接着させる。 次いで、 支持体' 3を取り除くことにより収縮抑制細胞シート 1 1を得る （図 4 ( c ) )。 図 4では 多層支持体保持細胞シート 9を用いた例を示したが、 単層の支持体保持細胞シー トも同様に収縮抑制細胞シートに加工することができる。 また生分解性シートは 複数用いても良い。 また収縮抑制細胞シートを更に複数積層したものも本発明の 収縮抑制細胞シートに包含される。
また有機薄膜はパターンニングされていてもよい。 例えば図 5では、 有機薄膜
2， は開口部を二箇所有するようにパターンニングされており、 基材 6 ' の表面 5 ' が露出している。 基材 6 ' の表面 5， は静的水接触角が 4 5 ° 以下であり親 水性であるため細胞は接着せず、 有機薄膜 2 ' のパターンに沿った細胞層 （図示 せず） が形成される。 このようにパターンニングされた有機薄膜 2， を有する細 胞培養担体 1 ' を用いて製造された支持体保持細胞シートは所望の位置に孔を有 するものとなる。 かかる支持体保持細胞シートを複数積層して得られる多層細胞 シートは所望の位置に空隙を有しているため、 厚みのある細胞シート内部にまで 酸素等を供給することができ、 細胞が壊死するなどの問題点を解消することがで きると期待される。
次に本発明の構成について詳細に説明する。
(有機薄膜）
有機薄膜は、 細胞接着性を有し且つ生分解性を有するものであれば特に限定さ れないが、 好ましくは生体由来材料からなるものである。 具体的な材料としては 各種コラーゲン、 ペプチドハイ ドロゲノレ、 ラミニン、 コンドロネクチン、 グリコ サミノダリカン、 ヒアルロン酸、 プロテオダリカン、 上記記載以外の細胞外マト リックス成分タンパク質、 マウス E H S腫瘍抽出物より再構成された基底膜成分 ( 商品名 ： マトリゲル）、 ゼラチン、 ァガロース、 オリゴ核酸、 ポリ核酸などの 高分子化合物によるゲルが挙げられる。
また、 将来、 動物由来の生体由来材料の治療的使用が制限される可能性を考慮 すると、 生体から抽出したものではなく、 人工的に合成された生体由来材料模倣 材料も好ましい。 例えば、 各種の人工ペプチド及びその誘導体、 人工オリゴぺプ チド及びその誘導体、 人工ポリペプチド及びその誘導体、 人工多糖類及びその誘 導体等が挙げられる。
有機薄膜の厚さは、 例えば高分子化合物の単位面積当たりの乾燥重量が 5 〜 1 0 0 μ g / c m 2、 好ましくは 2 0 〜 4 0 ^ 8 Ζ 。 m 2となる厚さである。 このよ うに有機薄膜の厚さが非常に薄いため、 本発明により製造される細胞シートを積 層すると、 細胞層間にネットワークが形成され易いと考えられ、 またパラクライ ン的な細胞層間相互作用を期待することもできる。 本発明で得られる支持体保持 細胞シートは周縁部の支持体によって細胞シートの収縮等による有機薄膜の寸法 変化が抑制されるため、 このように有利な効果が期待できる薄い有機薄膜を用い ても取り扱いが容易である。 また本発明で用いられる、 静的水接触角が 4 5 ° 以 下である表面を有する基材は有機薄膜との接着力が十分に弱い （ただし、 通常の 細胞培養条件では自然に剥がれることはない程度の接着力はある） ため、 非常に 薄い有機薄膜であっても、 基材表面からの剥離時に損傷することなく回収するこ とができる。
有機薄膜は所望の形状にパターンニングされたものであってよい。 パターン二 ング方法としては、 有機薄膜を作製後に有機薄膜を特定の領域のみ溶解剤により エッチングする、 液状の有機物をインクジエツトなどで直接基板上にパターン状 に塗布し乾燥させる、 予めレジストをパターン状に基板に接着させておきその後 有機薄膜を作製しレジストを除去する、 穴の開いたマスクを介して基板に液状の 有機物を塗布し乾燥させるなどの方法がある。
(支持体）
有機薄膜の周縁部には、 有機薄膜の寸法を保持するための枠状の支持体が固定 される。 支持体の材料は、 有機薄膜と結合し得るものであれば特に限定されない が、 例えばポリイミ ド、 ポリエステル、 ナイロンなどの高分子や、 ポリ乳酸など の生分解性高分子である。 支持体の厚さは細胞層の横方向の収縮に耐えられる強 度を確保できる厚さであれば特に限定されないが、 培養される細胞層の厚さより も薄いことが好ましく、 具体的には、 1〜 2 0 mが好ましい。 また支持体が生 分解性であればそのまま移植できより好ましい。
(支持体保持培養膜）
本発明では、 上記有機薄膜とその周縁部に固定された上記支持体とを含む全体 を支持体保持培養膜と称する。 支持体保持培養膜は基材上に剥離可能に設置され ており、有機薄膜上での細胞培養後にピンセッ ト等を用いて支持体の部分を摘み、 基材から剥離することができる。
(基材）
基材は、 静的水接触角が 4 5 ° 以下である表面を有し、 この表面上に前記支持 体保持培養膜が接触している。 このような静的水接触角を有する基材表面は一般 に細胞接着阻害性を有する傾向がある。 基材表面が細胞接着性であると、 有機薄 膜を上述のように非常に薄く した場合には培養された細胞が有機薄膜を介して基 材表面に接着してしまったり、 細胞が有機薄膜を酵素で分解して基材表面に接着 してしまい支持体保持細胞シートの基材からの剥離が困難となるが、 基材表面が 細胞接着阻害性であればこのような問題が無く'、 有機薄膜を上述のように非常に 薄く した場合であっても支持体保持細胞シートを基材から容易に剥離することが できる。 このような細胞接着阻害性の表面は、 炭素酸素結合を有する有機化合物 の皮膜を基材の表面上に形成することにより得ることができる。
基材の材料は、 その表面に炭素酸素結合を有する有機化合物の皮膜を形成する ことが可能な材料であることが好ましい。 具体的には、 金属、 ガラス、 セラミツ ク、 シリコン等の無機材料、 エラストマ一、 プラスチック （例えば、 ポリエステ ル樹脂、 ポリエチレン樹脂、 ポリプロピレン樹脂、 A B S樹脂、 ナイロン、 ァク リル樹脂、 フッ素樹脂、 ポリカーボネート樹脂、 ポリウレタン樹脂、 メチルペン テン樹脂、 フエノール樹脂、 メラミン樹脂、 エポキシ樹脂、 塩化ビュル樹脂） で 代表される有機材料を挙げることができる。 その形状も限定されず、 例えば、 平 板、 平膜、 フィルム、 多孔質膜等の平坦な形状や、 シリンダ、 スタンプ、 マルチ ゥエルプレート、 マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。 フィルムを使用 する場合、 その厚さは特に制限されないが、 通常 0 . 1〜 1 0 0 0 ;/ m、 好まし くは 1〜5 0 0 πι、 より好ましくは 1 0〜2 0 0 mである。
細胞接着阻害性表面は、 炭素酸素結合を有する有機化合物により形成される、 静的水接触角が 4 5 ° 以下である親水性膜により形成することができる。
本発明において炭素酸素結合とは、 炭素と酸素との間に形成される結合を意味 し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としては C一〇結合、 C (= 0 ) — O結合、 c = o結合が挙げられる。
親水性膜の主原料としては、 水溶性高分子、 水溶性オリゴマー、 水溶性有機化 合物、 界面活性物質、 両親媒性物質等の親水性有機化合物が挙げられる。 これら が相互に物理的または化学的に架橋し、 基材と物理的または化学的に結合するこ とにより親水性膜となる。
具体的な水溶性高分子材料としては、 ポリアルキレンダリコールおよびその誘 導体、 ポリアクリル酸およびその誘導体、 ポリメタクリル酸およびその誘導体、 ポリアクリルアミ ドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、 双性イオン型高分子、 多糖類、 等を挙げることができる。 分子形状は、 直鎖状、 分岐を有するもの、 デンドリマー等を挙げることができる。 より具体的には、 ポ リエチレングリコール、 ポリエチレングリ コーノレとポリプロピレンダリ コーノレの 共重合体、 例えば、 Pluronic F108、 Pluronic F127、 ポリ （N—イソプロピルァ クリルアミ ド）、 ポリ （N—ビニル一 2—ピロリ ドン）、 ポリ （2—ヒ ドロキシェ チルメタク リ レート）、ポリ （メタク リ ロイルォキシェチルフォスフォリルコリン）. メタク リ ロイルォキシェチルフォスフォリノレコリンとアタリノレモノマーの共重合 体、 デキス トラン、 およびへパリンが挙げられるがこれらには限定されない。 具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、 アルキレング リコールオリゴマーおよびその誘導体、ァクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、 メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、 アクリルアミ ドオリゴマーおよびそ の誘導体、 酢酸ビュルオリ ゴマーの鹼化物およびその誘導体、 双性イオンモノマ 一からなるオリゴマーおよびその誘導体、 アクリル酸およびその誘導体、 メタク リル酸およびその誘導体、ァクリルアミ ドおよびその誘導体、双性イオン化合物、 水溶性シランカツプリング剤、 水溶性チオール化合物等を挙げることができる。 より具体的には、エチレンダリ コールオリ ゴマー、 （N—イソプロピルァク リルァ ミ ド） オリ ゴマー、 メタクリ ロイルォキシェチルフォスフォリルコリンオリ ゴマ 一、 低分子量デキストラン、 低分子量へパリン、 オリゴエチレングリコールチオ 一ノレ、 エチレングリコーノレ、 ジエチレングリ コーノレ、 トリエチレングリ コーノレ、 テトラエチレンダリコール、 2— 〔メ トキシ （ポリエチレンォキシ）〕 プロピルト リメ トキシシラン、 およびトリエチレンダリコール一ターミネ一ティッド一チォ ールが挙げられるがこれらには限定されない。
親水性膜の平均厚さは、 0 . 8 η π！〜 5 0 0 mが好ましく、 0 . 8 n m〜 l 0 0 /x mがより好ましく、 1 η π！〜 1 0 μ mがより好ましく、 1 . 5 η πι〜 1 μ mが最も好ましい。 平均厚さが 0 . 8 n m以上であれば、 タンパク質の吸着や細 胞の接着において、 基板表面の親水性膜で覆われていない領域の影響を受けにく いため好ましい。 また、 平均厚さが 5 0 0 /x m以下であればコーティングが比較 的容易である。
基材表面への親水性膜の形成方法と.しては、 基材へ親水性有機化合物を直接吸 着させる方法、 基材へ親水性有機化合物を直接コーティングする方法、 基材へ親 水性有機化合物をコーティングした後に架橋処理を施す方法、 基材への密着性を 高めるために多段階式に親水性膜を形成させる方法、 基材との密着性を高めるた めに基材上に下地層を形成し、次いで親水性有機化合物をコーティングする方法、 基板表面に重合開始点を形成し、 次いで親水性ポリマーブラシを重合する方法等 を挙げることができる。
上記成膜方法のうち特に好ましい方法としては、 多段階式に親水性膜を形成さ せる方法、 並びに、 基材との密着性を高めるために基材上に下地層を形成し、 次 いで親水性有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。 これらの 方法を用いると、 親水性有機化合物の基材へ密着性を高めることが容易だからで ある。 本明細書では 「結合層」 という用語を用いる。 結合層とは、 多段階式に親 水性有機化合物の皮膜を形成する場合には最表面の親水性膜層と基板との間に存 在する層を意味し、 基材表面に下地層を設け当該下地層の上に親水性膜層を形成 する場合には当該下地層を意味する。 結合層は、 結合部分 （リンカ一） を有する 材料を含む層であることが好ましい。 リンカーとリンカーに結合させる材料の末 端の官能基の組み合わせとしては、 エポキシ基と水酸基、 フタル酸無水物と水酸 基、 カルボキシル基と N—ハイ ドロキシスクシイミ ド、 カノレボキシル基とカルボ ジイミ ド、 ァミノ基とダルタルアルデヒ ド等が挙げられる。 それぞれの組み合わ せにおいて、 いずれがリンカ一であっても良い。 これらの方法においては、 親水 性材料によるコーティングを行う前に、 基板上にリンカーを有する材料により結 合層を形成する。 結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子 である。 前記密度は、 結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価 することができる。例えば、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（ェ ポキシシラン） を例にとると、 エポキシシランを付加した基板表面の水接触角が 典型的には 4 5 ° 以上、 望ましくは 4 7 ° 以上であれば、 次に酸触媒存在下ェチ レンダリコール系材料等を付加することによって十分な細胞接着阻害性を有する 基板を作ることができる。
(生分解性シート）
収縮抑制細胞シートを製造するための生分解性シートは、 細胞シートの収縮に よっては変形しない強度、 すなわち細胞シートの収縮による変形に耐えられる十 分な強度 （本発明では 「十分な強度」 と称する） を有し且つ細胞接着性であるも のであれば特に限定されない。 たとえばポリ乳酸、 ポリ （乳酸一酪酸）共重合体、 ポリ酪酸、ポリダリコール酸、コラーゲンやその架橋体、ゼラチンやその架橋体、 人工ポリペプチドやその架橋体などがある。
(細胞培養担体の製造方法）
本発明の細胞培養担体の製造方法は特に限定されないが、 例えば、 前記基材の 表面上に前記有機薄膜を形成するための溶液を塗布し、 次いでこの溶液の塗膜上 に支持体を载置し、 支持体を載置した状態でゲル化等の有機薄膜の形成工程を完 了させることにより製造することができる。
(細胞）
本発明の細胞培養担体を用いて培養する細胞としては、 血球系細胞ゃリンパ系 細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、 本発明は、 接着性を有す る細胞に対して好適に使用される。 そのような細胞としては、 例えば、 肝臓の実 質細胞である肝細胞、 クッパー細胞、 血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細 胞、 繊維芽細胞、 骨芽細胞、 砕骨細胞、 歯根膜由来細胞、 表皮角化細胞などの表 皮細胞、 気管上皮細胞、 消化管上皮細胞、 子宮頸部上皮細胞、 角膜上皮細胞など の上皮細胞、 乳腺細胞、 ペリサイ ト、 平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、 腎細 胞、 膝ランゲルハンス島細胞、 末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、 軟骨 細胞、 骨細胞などが挙げられる。 これらの細胞は、 組織や器官から直接採取した 初代細胞でもよく、 あるいは、 それらを何代か継代させたものでもよい。 さらに これら細胞は、 未分化細胞である胚性幹細胞、 多分化能を有する間葉系幹細胞な どの多能性幹細胞、 単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、 分 化が終了した細胞の何れであっても良い。 また、 細胞は単一種を培養してもよい し二種以上の細胞を共培養してもよい。
(培養）
これらの細胞を播種した細胞培養担体を培養液中で培養することにより、 シー ト状の細胞層を形成することができる。 培養液としては、 当技術分野で通常用い られる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。 例えば、 用い る細胞の種類に応じて、 MEM培地、 BME培地、 DME培地、 αΜΕΜ培地、 I MDM培地、 E S培地、 ρΜ— 1 60培地、 F i s h e r培地、 F 1 2培地、 WE培地および RPM I 1 640培地等の基礎培地 （例えば、 朝倉書店発行 「日 本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」 58 1頁に記載されている基礎培地） を用いることができる。 さらに、 基礎培地に血清 （ゥシ胎児血清等）、 各種増殖因 子、 抗生物質、 アミノ酸などを加えてもよい。 また、 G i b e o無血清培地 （ィ ンビトロジェン社） 等の市販の無血清培地等を用いることができる。 最終的に得 られる細胞組織体の臨床応用を考えると動物由来成分を含まない培地を使用する ことが好ましい。
以下に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、 本発明の内容は実施例 の内容には限定されない。 実施例 1
支持体保持細胞シートの回収
1 - 1■ 静的水接触角が 45° 以下でかつ細胞接着阻害性である基材の作製
トルエン 39. O g、 TS L 8 3 50 (GE東芝シリ コーン製） 0. 8 gを混 合し、 攪拌しながらトリエチルアミンを 450 1添加した。 そのまま室温で数 分間攪拌した後、 全量をガラス皿へ移した。 ここに UV洗浄済みの 1 0 c m角の ガラス基板を浸漬し、 室温で 1 6時間放置した。 その後、 ガラス基板をエタノー ルと水で洗浄し、 窒素ブローで乾燥させた。 次に 50 gのテトラエチレングリコ ール （TEG) を攪拌しながら 25 / lの濃硫酸を一滴ずつ添加した。 そのまま 数分間攪拌してから、 全量をガラス皿に移した。 ここに上記の基板を浸漬し、 8
0°Cで 20分間反応させた。 反応後、 基板をよく水洗し、 窒素ブローで乾燥させ た。 これにより、 ガラス基板表面に T EGを含む皮膜が形成された。 表面の静的 水接触角はおよそ 30° であった。 この基板を 25 mmX 1 5 mmの大きさに切 断し、 静的水接触角が 45° 以下でかつ細胞接着阻害性である基材として使用し た。 基材をオートクレープ滅菌後、 5%ゥシ胎児血清入り MEM培地を適量添加 し、 基材一枚あたり 2. 0 X 1 05個のゥシ大動脈血管内皮細胞を播種しインキ ュベータ一内 （3 7°C、 5 %C02) で 24時間培養したところ基材表面には細 胞がまったくに接着しなかった。
1 — 2. コラーゲン薄膜の作製と厚み測定
支持体としてはポリエチレンテレフタラートフィルム （厚み 1 6 μ πι、 外寸 2 5 mmX 1 5 mm, 内寸 2 0 mm X 9 mm、 帝人デュポンフイノレム） を用いた。 コラーゲンゲル培養キッ ト （C e l l m a t r i x I 一 A、 新田ゼラチン） を 用いて氷上でコラーゲン溶液を最終濃度 2. 4 m gノ m 1に調製した. このうち 4 0 μ 1を 1 _ 1で作製した基材上に加え支持体とともに 3 7 °Cで 1時間ゲル化 させ、 その後クリーンベンチ内で 3時間乾燥させコラーゲン薄膜を作製した。 触 針式表面形状測定器 （Dektak FPD- 6 5 0、 日本真空技術） によりコラーゲン薄 膜の厚みを測定した結果 7 7 0 ± 1 9 l nmであった。この様に作製したコラーゲ ン薄膜は PBSを加え水和させた後も基材に接着していた。
1 - 3. 支持体保持細胞シートの回収
1一 2で作製したコラーゲン薄膜に 5 %ゥシ胎児血清入り MEM培地を適量添 加した。 ここに、 基材一枚あたり 2. 0 X 1 05個のゥシ大動脈血管内皮細胞を 播種した。 インキュベーター内で 2 4時間培養したところ， 細胞はコラーゲン薄 膜に接着 '増殖を起こしコンフルェントになっていた。 その後、 支挎体をピンセ ットで摘み引き上げることで、 コラーゲン薄膜上に保持された支持体保持細胞シ ートを基材から脱着回収することができた。 このように作製した支持体保持細胞 シートを位相差顕微鏡 （1X7 1、 オリンパス） により観測した結果 （図 6)、 支持 体保持細胞シートは細胞収縮を起こさず、 そのままの形状を維持しつつ支持体に よりハンドリングすることが可能であった。 コラーゲン薄膜を免疫染色し （1次 体： rabbit anti type I collagen^ 2次 f九体： alexa f luor 488 goat anti rabbitj 細胞の核を hoechstにより染色し、 共焦点顕微鏡 （Axiovert 200M、 zeiss) によ り 2重染色観測した結果（図 7)、作製した細胞層がコラ"ゲン薄膜に保持されて いた。 実施例 2
基材単位面積あたりのコラーゲン含有量と基材の種類の比較例
基材単位面積あたりのコラーゲン含有量を 5〜 1 5 0 U g Z c m 2の範囲で変 ィ匕させ、また基材についてポリスチレン（細胞培養ディッシュ、 FALCON)、ガラス、 実施例 1の 1一 1の方法で化学処理した基材で比較し、 それ以外は実施例 1と同 様に実験を行った。 支持体保持細胞シートを基材から脱着させる際にコラーゲン 薄膜が破れるなどして細胞の大部分が基材に残ったままになるか、 あるいはコラ 一ゲン薄膜が破れず大部分の細胞が細胞シートとして得られるかを判断指標にし、 不良品と良品の関係を表 1と表 2に示した。 実験に使用したポリスチレン、 ガラ ス、実施例 1の 1一 1の方法で化学処理した基材の静的水接触はそれぞれ 5 1 ° 、 ほぼ 0 ° (測定不能な程度）、 3 0 ° であった。
表 1
Figure imgf000018_0001
* Ron X ：不良ロロ
実施例 3
支持体保持細胞シ一トの積層
実施例 1で作製した支持体保持細胞シートの上に同様の方法で作製した支持体 保持細胞シートをコラーゲン薄膜と細胞が接触するように重ね、 支持体保持細胞 シートがわずかに培地に漬かる程度に培地を吸い取り、 支持体保持細胞シート同 士を表面張力で接触させた。 4時間重ねた後に多層支持体保持細胞シートが培地 に十分漬かるように培地を加えると支持体保持細胞シート同士が接着しており片 方の支持体保持細胞シートを動かすと一緒に動いた。 同じ操作により 4層積層し
2日培養した後に、 細胞を力ルセインにより染色し共焦点顕微鏡により観測した 結果 （図 8 )、 ゥシ大動脈血管内皮細胞がネッ トワーク状に形体変化していた。 ま た共焦点顕微鏡の断面観察の結果（図 9 )、細胞に比べて非常に薄いコラーゲン薄 膜が細胞層間に存在しているため、 細胞層間には非常に薄い蛍光に染まらない領 域があった。 実施例 4
支持体保持培養膜を回収後、 1層の支持体保持細胞シートに積層
実施例 1の 1一 1、 1一 2で作製したコラーゲン薄膜を含む細胞培養担体に 5 %ゥシ胎児血清入り M E M培地を適量添加し、 水和後に支持体をピンセットで 摘み引き上げることで支持体保持培養膜 （コラーゲン薄膜） を基材から脱着回収 した。 この支持体保持培養膜を実施例 1で作製した支持体保持細胞シートに積層 し 2日培養して有機薄膜被覆支持体保持細胞シートを形成した後、 位相差顕微鏡 により観測した結果（図 1 0 )、 ゥシ大動脈血管内皮細胞がネッ トワーク状に形体 変化していた。 実施例 5
繊維芽細胞の細胞シートの回収と積層
実施例 1の 1一 1、 1一 2で作製したコラーゲン薄膜を含む細胞培養担体に 1 0 %ゥシ胎児血清入り D M E M培地を適量添加した。ここに、基材一枚あたり 2 . 0 X 1 0 5個のマウス繊維芽細胞を播種した。 ィンキュベータ一内で 2 4時間培 養したところ、 細胞はコラーゲン薄膜に接着 ·増殖を起こしコンフルェントにな つていた。 実施例 1の 1一 3と同様の方法で支持体保持細胞シートを基材から脱 着回収することがき、 支持体保持細胞シートは細胞収縮を起こさず支持体による ハンドリングが可能であった。 実施例 3と同様の方法で支持体保持細胞シートを 積層し、 3層積層し 2日培養した後に位相差顕微鏡により観察した結果（図 1 1 )、 細胞層同士が接着しておりゥシ大動脈血管内皮細胞の様なネッ トワーク状への形 体変化は起こさなかった。 実施例 6
血管内皮細胞と繊維芽細胞の細胞シートの共積層 実施例 1で作製したゥシ大動脈血管内皮細胞の支持体保持細胞シートの上に実 施例 5で作製したマウス繊維芽細胞の支持体保持細胞シートを細胞とコラーゲン 薄膜が接着するように重ね、 培地を完全に吸い取った後に支持体保持細胞シート が僅かに培地に漬かる程度に 1 0 %ゥシ胎児血清入り D M E M培地を添加し、 実 施例 3と同様の方法で積層した。 さらに実施例 1で作製したゥシ大動脈血管内皮 細胞の支持体保持細胞シートを同様の方法で積層して血管内皮細胞と繊維芽細胞 の支持体保持細胞シートの共積層を行い 3日培養した後、 位相差顕微鏡により観 察した結果 （図 1 2 )、 細胞層同士が接着していた。 実施例 7
支持体の細胞シー卜からの分離
実施例 3で 2層積層した支持体保持細胞シートの上に強度のあるコラーゲ シ ート （厚み： 3 0 /i m、 二ツビ） を実施例 4と同じ方法で積層した後に支持体を 超音波力ッターにより分離した結果、 細胞シートは細胞収縮を起こさなかった。 実施例 8
パターンユングしたコラーゲン薄膜を有する、 パターンニングされた支持体保持 細胞シート
実施例 1で作製したコラーゲン薄膜を含む細胞培養担体の一部位にコラゲナー ゼを加えると、 その部位のコラーゲンが分解され、 分解したコラーゲンが基材か ら脱着することで、 パターンユングしたコラーゲン薄膜を含む細胞培養担体を作 製した。 ここに基材一枚あたり 2 . 0 X 1 0 5個のゥシ大動脈血管内皮細胞を播 種した。 2 4時間培養することにより、 コラーゲンが脱着した部位に細胞は接着 せず、 コラーゲン薄膜が存在する部位のみ細胞が接着した。 支持体をピンセッ ト で摘み引き上げることでパターンニングされた支持体^ ¾持細胞シートを基材から '脱着回収した （図 1 3 )。 実施例 9
支持体保持細胞シートの回収 9- 1. 静的水接触角が 45° 以下でかつ細胞接着阻害性である基材の作製 トルエン 39. 0 g、 TS L 8 350 (GE東芝シリ コーン製） 0. 8 gを混 合し、 攪拌しながら トリェチルァミンを 450 μ 1添加した。 そのまま室温で数 分間攪拌した後、 全量をガラス皿へ移した。 ここに UV洗浄済みの 1 0 cm角の ガラス基板を浸漬し、 室温で 1 6時間放置した。 その後、 ガラス基板をエタノー ルと水で洗浄し、 窒素ブローで乾燥させた。 次に 50 gのテトラエチレングリコ ール （TEG) を攪拌しながら 25 1の濃硫酸を一滴ずつ添加した。 そのまま 数分間攪拌してから、 全量をガラス皿に移した。 ここに上記の基板を浸漬し、 8
0°Cで 20分間反応させた。 反応後、 基板をよく水洗し、 窒素ブローで乾燥させ た。 これにより、 ガラス基板表面に T EGを含む皮膜が形成された。 表面の静的 水接触角はおよそ 3 0° であった。 この基板を 25 mmX 1 5 mmの大きさに切 断し、 静的水接触角が 45° 以下でかつ細胞接着阻害性である基材として使用し た。 基材をオートクレープ滅菌後、 5%ゥシ胎児血清入り MEM培地を適量添加 し、 基材一枚あたり 2. 0 X 1 05個のゥシ大動脈血管内皮細胞を播種しインキ ュベータ一内 （3 7°C、 5 %C02) で 24時間培養したところ基材表面には細 胞がまったくに接着しなかった。
9 -2. コラーゲン薄膜の作製と厚み測定
支持体としてはポリエチレンテレフタラートフイルム （厚み 1 6 μ m 外寸 2
5 mmX 1 5 mm, 内寸 20mmX 9mm、 帝人デュポンフィルム） を用いた。 抗原性を除去したコラーゲンであるァテロコラーゲン （コラーゲン酸性溶液 I一
PC, 高研） を H e p e sバッファー及び N a HC〇3により中性に調整し最終 濃度が 1. ZmgZm 1のコラーゲン溶液を作製し、 このうち 20 /z lを 9— 1 で作製した基材上に加え支持体とともに 3 7°Cで 4時間ゲル化させ、 その後クリ ーンベンチ内で 3時間乾燥させ UV架橋してコラーゲン薄膜を作製した。 触針式 表面形状測定器 （D e k t a k F PD— 6 50、 日本真空技術） によりコラー ゲン薄膜の厚みを測定した結果 1 03 ± 9 nmであった。 この様に作製したコラ 一ゲン薄膜は P B Sを加え水和させた後も基材に接着していた。
9一 3. 支持体保持細胞シートの回収
9 - 2で作製したコラーゲン薄膜に 5 %ゥシ胎児血清入り M E M培地を適量添 加した。 ここに、 基材一枚あたり 2 . 0 X 1 0 5個のゥシ大動脈血管内皮細胞を 播種した。 インキュベーター内で 2 4時間培養したところ， 細胞はコラーゲン薄 膜に接着 ·増殖を起こしコンフルェントになっていた。 その後、 支持体をピンセ ットで摘み引き上げることで、 コラーゲン薄膜上に保持された支持体保持細胞シ 一トを基材から脱着回収することができた。 このように作製した支持体保持細胞 シートを位相差顕微鏡 （1X 7 1、 ォリンパス） により観測した結果、 支持体保持 細胞シートは細胞収縮を起こさず、 そのままの形状を維持しつつ支持体によりハ ンドリングすることが可能であった。 実施例 1 0
基材単位面積あたりのコラーゲン含有量の比較例
基材単位面積あたりのコラーゲン含有量を S S /z g Z c m 2の範囲で変化 させ、 それ以外は実施例 9と同様に実験を行った。 支持体保持細胞シートを基材 から脱着させる際にコラーゲン薄膜が破れるなどして細胞の大部分が基材に残つ たままになる力 、 あるいはコラーゲン薄膜が破れず大部分の細胞が細胞シートと して得られるかを判断指標にし、 不良品と良品の関係を表 3に示した。
表 3
Figure imgf000022_0001
実施例 1 1
支持体保持細胞シートの積層
実施例 9で作製した支持体保持細胞シートの上に同様の方法で作製した支持体 保持細胞シートをコラーゲン薄膜と細胞が接触するように重ね、 支持体保持細胞 シートがわずかに培地に漬かる程度に培地を吸い取り、 支持体保持細胞シート同 士を表面張力で接触させた。 4時間重ねた後に多層支持体保持細胞シートが培地 に十分漬かるように培地を加えると支持体保持細胞シート同士が接着しており片 方の支持体保持細胞シードを動かすと一緒に動いた。 実施例 1 2
繊維芽細胞の細胞シートの回収と積層
実施例 9の 9一 1、 9 - 2で作製したコラーゲン薄膜を含む細胞培養担体に 1 0 %ゥシ胎児血清入り D M E M培地を適量添加した。ここに、基材一枚あたり 2 . 0 X 1 0 5個のマウス繊維芽細胞を播種した。 ィンキュベータ一内で 2 4時間培 養したところ、 細胞はコラーゲン薄膜に接着 ·増殖を起こしコンフルェントにな つていた。 実施例 9の 9一 3と同様の方法で支持体保持細胞シートを基材から脱 着回収することがき、 支持体保持細胞シートは細胞収縮を起こさず支持体による ハンドリングが可能であった。 産業上の利用可能性
本発明により、 細胞培養担体からの剥離が容易であり、 なお且つ剥離後の収縮 が抑制された細胞シートが提供される.。 本発明による細胞シートの剥離は細胞と 基材との結合性の変化を利用していないため、 細胞種を選ばず適用可能である。 また本発明の細胞培養担体において有機薄膜を適宜パターンニングすれば、 細胞 の分布を容易に制御することができ、 厚い組織体を形成することが可能である。 また、 本発明により得られる有機薄膜と細胞層とからなる細胞シートは、 有機薄 膜層の部分を特許文献 7及び 8記載の技術よりも薄くすることができるため、 積 層時に隣接する細胞シートがネッ トワークを形成し易いと考えられ、 またパラク ライン的な細胞層間相互作用を期待することもできる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜と、 該有機薄膜の周縁 部に固定された、 前記有機薄膜の寸法を保持するための枠状の支持体とを備える 支持体保持培養膜、 及び、 静的水接触角が 4 5 ° 以下である表面を有する基材を 備え、 前記支持体保持培養膜が前記基材表面上に剥離可能に設置されていること を特徴とする細胞培養担体。
2 . 前記基材表面が細胞接着阻害性である、 請求項 1記載の細胞培養担体。
3 . 前記有機薄膜が生体由来材料である、 請求項 1又は 2記載の細胞培養担 体。
4 . 前記有機薄膜が人工的に合成された生体由来材料模倣材料により形成さ れている、 請求項 1又は 2記載の細胞培養担体。
5 . 前記有機薄膜が高分子化合物により形成されており、 該高分子化合物の 単位面積当たりの乾燥重量が 5〜 1 0 0 /X g Z c m 2である、 請求項 1〜4のい ずれか 1項記載の細胞培養担体。
6 . 前記有機薄膜がパターンユングされたものである、 請求項 1〜5のいず れか 1項記載の細胞培養担体。
7 . 請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の細胞培養担体の前記有機薄膜上で細 胞を培養してシート状の細胞層を形成した後、 該細胞層を前記支持体保持培養膜 ごと前記基材から剥離して、 前記支持体保持培養膜と細胞層とからなる支持体保 持細胞シートを得ることを特徴とする、 支持体保持細胞シートの製造方法。
8 . 請求項 7記載の方法により製造された支持体保持細胞シート。
9 . 請求項 8記載の支持体保持細胞シートの、細胞層が形成された表面上に、 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜を被覆してなる、 有機薄膜被覆 支持体保持細胞シート。
1 0 . 請求項 7記載の方法により製造された支持体保持細胞シートを複数積 層してなる多層支持体保持細胞シート。
1 1 . 請求項 1 0記載の多層支持体保持細胞シートの、 細胞層が形成された 表面上に、 細胞接着性を有し且つ生分解性を有する有機薄膜を被覆してなる、 有 機薄膜被覆多層支持体保持細胞シート。
1 2 . 請求項 8記載の支持体保持細胞シート、 請求項 9記載の有機薄膜被覆 支持体保持細胞シート、 請求項 1 0記載の多層支持体保持細胞シート、 又は請求 項 1 1記載の有機薄膜被覆多層支持体保持細胞シートと、 十分な強度を有し且つ 細胞接着性である生分解性シートとを積層して接着させ、 その後に前記支持体を 取り除くことを特徴とする、 収縮抑制細胞シートの製造方法。
1 3 . 請求項 1 2記載の方法により製造された収縮抑制細胞シート。
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