UA125020C2 - Спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів - Google Patents

Description

Винахід стосується способу адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів, що включає стадії культивування зазначених мікроорганізмів з поетапною подвійною індукцією оксидативного стресу за допомогою поетапного підвищення прикладеної напруги та дифузії кисню і поетапного зниження концентрації антиоксиданту в комбінації з поетапним підвищенням концентрації окисненого варіанта для зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу, де концентрацію розчиненого кисню в середовищі для культивування підтримують на рівні сублетальної концентрації, при якій гинуть деякі, але не всі мікроорганізми.

Також винахід стосується способу підвищеної продукції анаеробних мікроорганізмів, адаптованого до кисню штаму мікроорганізму для застосування як пробіотика, штаму Раєсаїїрасієеєпит ргаиймзпіїгії для застосування як пробіотика.

Даний винахід в основному належить до вирощування бактерій. Більш конкретно, винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів до окисного середовища і його застосування в розробці нових пробіотиків. Даний винахід також належить до нових (адаптованих) штамів, отриманих способами за винаходом.

Передумови винаходу

Мікробіота кишечнику дорослої людини складається з до 100 трильйонів мікроорганізмів, що еквівалентно десяти загальним кількостям соматичних і статевих клітин організму. Сукупність геномів мікроорганізмів кишечнику (мікробіом) може містити більш ніж в 150 раз більше генів, ніж власний ген людини і наділяє людей фізіологічними здатностями, які людям не доводилося розвивати самостійно. Однак ці угруповання залишаються, головним чином, недослідженими, що залишає майже повністю невідомим їх вплив на розвиток, фізіологію, імунітет, харчування та здоров'я людини. Мікробне угруповання має необмежену здатність впливати на біологію носія і є фундаментальним для розвитку імунної системи людини, здатності перетравлювати в іншому випадку неперетравлювані харчові полісахариди, на додаток до того, що вони є джерелом для утворення вітамінів і гормонів і т.д. Мікробні угруповання в товстому кишечнику відіграють життєво важливу роль у регуляції стану кишечнику та патогенезі декількох захворювань.

Традиційна мікробіологія фокусується на дослідженні окремих видів як ізольованих одиниць.

Однак, багато з них, якщо не більшість, ніколи не були успішно виділені як життєздатні зразки для аналізу, імовірно, через те, що їх ріст залежить від конкретного мікрооточення, не відтвореного в експериментальних умовах. Прогрес у технологіях секвенування ДНК створив нову галузь досліджень, названу метагеномікою, що робить можливою всебічне дослідження мікробних угруповань, що навіть складаються із організмів, які не культивуються. Замість дослідження генома окремого бактеріального штаму, вирощеного в лабораторії, метагеномний підхід дозволяє аналізувати генетичний матеріал, отриманий з повних мікробних угруповань, зібраних із природніх середовищ.

Мікробіом кишечнику людини служить як ресурс корисних мікроорганізмів, потенційних пробіотиків. Незважаючи на профілактичну і стимулюючу роль мікробіоти кишечнику в таких захворюваннях, як запальне захворювання кишечнику, серцево-судинне захворювання, діабет і розлади аутистичного спектра, жодний з доступних лікарських засобів не містить нові

Зо пробіотики або так звані пробіотики наступного покоління, що описано в декількох метагеномних дослідженнях. Навіть при успішному виділенні, для багатьох мікробів, виділених з кишечнику, необхідні строгі анаеробні умови вирощування, і вони не можуть існувати більше пари хвилин під впливом навколишнього повітря. Це ускладнює розробку стабільних і стійких складів пробіотиків. Таким чином, існує потреба в більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмах, і даний винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів, а також нових штамів мікроорганізмів, отриманих такими способами.

Суть винаходу

Даний винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів до окисного середовища, таким чином, що дозволяє таким організмам бути відносно більш толерантними до кисню під впливом навколишнього повітря. Він має додаткову перевагу поліпшеного культивування та зберігання мікроорганізмів, наприклад, більш тривалого зберігання.

Даний винахід належить до імітаційної моделі окиснення-відновлення в кишечнику людини (ЗНІКМ), у якій відбувається поетапна подвійна індукція оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню та поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксидант/окиснений варіант для корекції окисно-відновного статусу.

Кисень летальний для анаеробних мікроорганізмів, тому розчинений кисень, використовуваний для оксидативного стресу, (концентрація кисню) буде підвищуватися, але зберігатися на рівні сублетальної концентрації при використанні пари антиоксидант/окиснений варіант для корекції окисно-відновного статусу середовища. Оксидативний стрес також індукують за допомогою прикладеної напруги. Оксидативний стрес підвищує толерантність бактерій до окисного середовища та дозволяє підтримувати життєздатність мікроорганізмів у навколишньому повітрі протягом відносно більш тривалих періодів часу.

Підходящі сублетальні концентрації кисню (концентрації, що не призводять до загибелі всіх присутніх бактерій, або, інакше кажучи, концентрації, при яких гинуть деякі, але не всі, бактерії) легко можна визначати, наприклад, таким чином, що щонайменше деякі (але, як правило, не всі) бактерії можуть виживати, а потім їх можна вибирати для наступної стадії способів. Потім бактерії що вижили, знову вирощують, наприклад, з підвищенням оксидативного стресу (наприклад, за допомогою підвищення концентрації розчиненого кисню), таким чином, що знову щонайменше деякі (але, як правило, не всі) бактерії можуть виживати, а потім їх можна бо вибирати для наступної стадії способів. Потім цю стадію підвищення оксидативного стресу можна повторювати знову стільки раз, скільки необхідно або бажано для одержання більш толерантних до кисню мікроорганізмів.

Даний винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів, що включає стадії культивування зазначених мікроорганізмів з поетапною подвійною індукцією оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню та поетапною зміною окисно-відновного статусу, де переважно відбувається поетапна зміна окисно-відновного статусу при використанні поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу.

Даний винахід належить до способу адаптації (або тренування) анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню (наприклад, щодо більш толерантних до кисню) анаеробних мікроорганізмів, де мікроорганізми культивують із комбінацією поетапної подвійної індукції оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню та поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно- відновного статусу.

Даний винахід додатково належить до способу поліпшеного одержання анаеробних мікроорганізмів, де мікроорганізми культивують із комбінуванням константи окисного потенціалу/прикладеної напруги, дифузії кисню і співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта, таким чином, роблячи можливим селективний тиск і одержуючи високий вихід конкретних штамів мікроорганізмів. Зазначена культура перебуває в оптимальних умовах або, інакше кажучи, комбінацію константи окисного потенціалу/прикладеної напруги, дифузії кисню і співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта оптимізують для одержання анаеробних мікроорганізмів.

Короткий опис креслень

На фігурі 1 показана сукупність окиснення-відновлення просвіту кишечнику людини.

Незважаючи на наявність безперервного припливу кисню при споживанні їжі і за допомогою дифузії зі слизової оболонки кишечнику, сукупний окисно-відновний потенціал кишечнику залишається негативним, приблизно -300 мВ.

На фігурі 2 показане потенційне ушкодження чутливих до кисню ферментів, викликане оксидативним стресом, і механізм відновлення.

На фігурі З показаний основний ферментативний шлях, використовуваний мікробіотою в кишечнику людини.

Фігура 4а

Зроблена на замовлення 3-камерна імітаційна модель окиснення-відновлення в кишечнику людини (ЗНІКМ).

Фігура 4р

Схема потоку електронів з бактеріальних клітин до акцепторів електронів в ЗНІЕМ. Окисно- відновні потенціали (відновний потенціал і окисний потенціал), вимірювані в (Ес) вольтах.

Фігура 4с

Схема 5НІЕМ проміжних сполук, залучених у перенос електронів від бактеріальної клітини до акцепторів електронів, що включає окисно-відновні потенціали.

Фігура 5

Основний хід операцій ЗНІКМ.

Фігура 6

Зображення анодної камери 5НІЕМ, з'єднаної з невеликим об'ємом шару, приблизно 100 мл, кисневого фідера.

Фігура 7

ЗНІКМ зі споживанням повітря: пряма дифузія кисню з повітря в анодну камеру через бічне відгалуження.

Фігура 8

Хід операцій ЗНІКМ, 10 стадій.

Фігура 9

Селекція адаптованих штамів.

Фігура 10

Стратегія дослідження профілів толерантності адаптованих штамів до кисню.

Докладний опис винаходу і переважні варіанти його здійснення

Визначення "Адаптація" є динамічним еволюційним процесом, наприклад, результатом природного добору, за допомогою якого організм стає більш пристосованим до життя його природнього бо середовища. Процес адаптації (або тренування) мікроорганізмів також переважно можна здійснювати в ненативному/штучному/п мійго середовищі, наприклад, способами за даним винаходом. "Антиоксидант" є засобом, що запобігає утворенню реактивних форм кисню, азоту, гідроксилу і ліпідів за допомогою утилізації вільних радикалів або репарації, або видалення ушкоджених молекул. Антиоксиданти часто можуть діяти прямо як відновники. "Відновник" є речовиною, елементом або сполукою, що втрачає (або "що віддає") електрон іншому засобу в окисно-відновній хімічній реакції. Оскільки відновник втрачає електрони, говорять, що він окиснюється. "Окиснені варіанти" є хімічними речовинами, що викликають видалення електрона з інших молекул. Окиснений варіант є окисненою формою антиоксиданту. "Медіатори окиснення-відновлення" або переносники електронів є сполуками, які можуть зазнати оборотної реакції окиснення-відновлення і сприяти переносу електронів до бактерій і від них.

Терміни "прикладена напруга", "зовнішня напруга", "окисний потенціал", "прикладений електричний окисний потенціал", "прикладений електродний потенціал", "напруга" і "потенціал напруги" можна використовувати взаємозамінно і вони належать до напруги, прикладеної до камер біореактора. "Дифузія кисню" є рухом молекул кисню від високої концентрації до низької. "Приплив кисню" є кількістю кисню, що надходить у камеру за одиницю часу, наприклад, анодну камеру, що містить мікроорганізми.

Мікробіота кишечнику разом із поступаючими з їжею окисно-відновними активними сполуками і донорами електронів, такими як вуглеводи та білки, відіграють роль у підтримці відновного середовища в кишечнику. Це означає, що мікробіота кишечнику адаптована до того, щоб справлятися із припливом розчиненого кисню в просвіті кишечнику (фігура 1). Розчинений кисень у високих концентраціях може бути летальним для великої кількості мікроорганізмів кишечнику і відновне середовище допомагає їм відновлюватися від оксидативного ушкодження (фігура 2). Більш докладно на фігурі З показаний основний ферментативний шлях, використовуваний мікробіотою в кишечнику людини. Диспропорція електронів при анаеробному рості збалансована ферментацією з утворенням суміші органічних кислот і утворенням газу.

Зо Деякі мікроорганізми віддають електрони позаклітинним акцепторам електронів, таким як нітрат, сульфат або нерозчинний комплекс металу. Крім того кисень може діяти як непрямий акцептор електронів, тому що деякі з мікроорганізмів кишечнику можуть споживати кисень у невеликих кількостях. Окисно-відновні активні сполуки, такі як галати, рутин, ресвератрол, кофеїн і флавіни, присутні у звичайній їжі, імовірно, у формі, окисненій в травному тракті, вони також можуть діяти як акцептори електронів (фігура 1). Окисно-відновний статус кишечнику може впливати на біодоступність конкретних лікарських засобів або метаболітів. Незважаючи на наявність безперервного припливу кисню при споживанні їжі і за допомогою дифузії зі слизової оболонки кишечнику сукупний окисно-відновний потенціал кишечнику залишається негативним, приблизно -300 мВ. Це відновне середовище з недостатністю кисню сприяє росту певних анаеробних мікроорганізмів у просвіті кишечнику.

Висока чутливість до кисню є характерною ознакою багатьох мікроорганізмів кишечнику, що робить вкрай утрудненим культивування та зберігання цих мікроорганізмів протягом тривалого періоду часу. Іншою перешкодою при виділенні і культивуванні представників мікробіоти кишечнику для розробки нових потенційних пробіотиків є складність кишкового середовища в термінах різних ніш і місць проживання. Склад пробіотику повинен бути стабільним у навколишньому повітрі протягом декількох місяців, але це важко, враховуючи чутливість багатьох мікроорганізмів кишечнику до кисню. Деякі мікроорганізми кишечнику перехресно живляться від інших мікроорганізмів і для них також можуть знадобитися деякі фактори росту носія, що утрудняє імітацію цих умов іп міїго.

Еаесаїїрасіегішт ргайзпії;і являє приклад потенційного пробіотику із протизапальними властивостями при різних метаболічних захворюваннях. Вони складають більш 5 95 бактерій у кишечнику людини, що робить їх одними з найбільш численних бактерій у мікробіоті кишечнику.

Е. ргаихпіїгії продукує відносно більші кількості бутирату, що відіграє важливу роль у фізіології кишечнику, що і є основним метаболітом у просвіті товстого кишечнику. Бутират також стимулює проліферацію клітин і сприяє секреції слизу зі слизової оболонки товстого кишечнику.

Е. ргаихзпійлі є вкрай чутливою до кисню бактерією і живе всього кілька хвилин при впливі навколишнього повітря.

Автори даного винаходу неочікувано виявляли новий спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів до кисню і у даному описі описують спосіб зазначеної адаптації до кисню, таким 60 чином, що дозволяє таким організмам ставати відносно більш толерантними до кисню і, таким чином, стабільними та стійкими при зберіганні і застосуванні як пробіотичних штамів і в складах або композиціях пробіотиків для впливу на ссавців. Новий спосіб, зокрема, зробить можливими розробку та застосування Р. ргаизпіїгії як пробіотичного штаму зі стійкими характеристиками так, що вони будуть толерантними при одержанні в промислових масштабах і здатними адаптуватися до середовища кишечнику людини в умовах кишкових порушень, для яких основною ознакою є оксидативний стрес.

Даний винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції щодо більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів, де мікроорганізми культивують із використанням комбінації поетапної подвійної індукції оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню та поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу. Таким чином, способи за винаходом, як правило, здійснюють іп міїго.

Подвійна індукція оксидативного стресу підвищує толерантність мікроорганізмів до окисного середовища, таким чином дозволяючи мікроорганізмам бути більш, або відносно більш, толерантними до кисню (наприклад, при впливі навколишнього повітря). Термін "мікроорганізми, більш (або відносно більш) толерантні до кисню (наприклад, при впливі навколишнього повітря)" може належати до порівняння з початковими штамами (або батьківськими штамами), використовуваними в способах адаптації за винаходом.

Підвищена толерантність до кисню дозволяє зберігати життєздатність мікроорганізмів у навколишньому повітрі протягом відносно більш тривалих періодів часу, що очевидно є перевагою.

Прикладену напругу або прикладену зовнішню напругу, як правило, прикладають до анода, наприклад, анода із графіту, графітової повсті або вуглецевої повсті, або вуглецевого волокна, наприклад, через потенціостат, і підвищують його поетапно. Для додатка напруги до мікроорганізмів, їх поміщають у підходящу анодну камеру або іншу посудину, наприклад, біореактор, до якого прикладають напругу. Ланцюг замикають, наприклад, з'єднуючи катодну камеру з анодною камерою, наприклад, за допомогою одного бічного відгалуження анодної камери, переважно розділеної іонообмінною мембраною (наприклад, катіон-селективною мембраною або протонообмінною мембраною). Прикладену напругу можна підвищувати

Зо (переважно поетапно підвищувати) до максимуму 0,6 В, більш конкретно - 0,6 В відносно

Ад/АдсСІ.

Як правило, способи включають використання дифузії кисню, наприклад, за допомогою припливу кисню до мікроорганізмів. Приплив кисню (наприклад, приплив кисню через анодну камеру) можна підтримувати, продуваючи кисневий фідер чистим газоподібним киснем або повітрям таким чином, щоб досягати бажаних концентрацій розчиненого кисню (зокрема, бажаних концентрацій розчиненого кисню, що контактує з мікроорганізмами). Розчинений кисень буде дифундувати через кисневий фідер до анодної камери, таким чином, створюючи дифузію кисню (або приплив кисню) описуваними способами. Приплив (або дифузію) кисню, наприклад, можна контролювати будь-якими підходящими способами, наприклад, з'єднуючи кисневий фідер або інше джерело кисню з анодною камерою, наприклад, іншим бічним відгалуженням анодної камери, розділеної, наприклад, змінною перегородкою (наприклад, змінною мембраною, такою як напівпроникна мембрана), що має інші константи дифузії кисню.

Додатково або альтернативно приплив кисню можна контролювати, змінюючи об'єм шару кисневого фідера. Наприклад, на фігурах представлені кисневі фідери об'ємом 100 мл і 250 мл (див. фігури 6 і 4а). Кисневий фідер також можна видаляти, роблячи можливою пряму дифузію кисню в анодну камеру, як показано, наприклад, на фігурі 7. Мембрану, наприклад, мембранну перегородку, між анодною камерою і кисневим фідером (або джерелом кисню) можна додатково покривати муциновим агаром, щоб уможливити краще контрольовану дифузію кисню з кисневого фідера в анодну камеру.

Крім того, відновники або антиоксиданти, що є присутніми в середовищі, будуть видаляти розчинений кисень і, таким чином, впливати на кінетику дифузії кисню і, таким чином, приплив кисню. Наприклад, у способах за даним винаходом антиоксиданти (зокрема, кількість або рівень антиоксидантів), присутні в середовищі для культивування мікроорганізмів, можна використовувати для видалення кисню і, таким чином, як засіб для контролю рівнів або кількості, або концентрації кисню (розчиненого кисню), присутнього в культурі мікроорганізмів.

Наприклад, низький (або більш низький) рівень антиоксиданту в культурі мікроорганізмів, як правило, означає, що доступно більше кисню (або має місце більш високий оксидативний стрес), у той час як високий (або більш високий) рівень антиоксиданту, як правило, буде означати, що доступно менше кисню (або низький рівень кисню) (або має місце більш низький бо оксидативний стрес).

Будь-який із цих способів контролю дифузії або припливу кисню, або їх комбінацію, легко можна використовувати для досягнення бажаної кількості або концентрації розчиненого кисню в середовищі для культивування мікроорганізмів і, таким чином, досягнення поетапної зміни (переважно, поетапного підвищення) дифузії кисню, припливу кисню або концентрації розчиненого кисню (або кількості або рівня розчиненого кисню), використовуваних для індукції оксидативного стресу в способах за даним винаходом.

Таким чином, у способах за винаходом початкові умови переважно являють собою низький (або нульовий) приплив кисню (або дифузію кисню або концентрацію кисню), і способи включають поетапне підвищення припливу кисню (або дифузії кисню або концентрації кисню), наприклад, аж до високого припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню). Термін "нульовий приплив кисню" (або дифузія кисню, або концентрація кисню) належить до 0 молей кисню, що є присутнім в середовищі для культивування мікроорганізмів (наприклад, в анодній камері). Приклад низького припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню) належить до до приблизно 10 мкМ розчиненого кисню, що є присутнім в середовищі для культивування мікроорганізмів (наприклад, в анодній камері), наприклад, що дифундує в середовище для культивування мікроорганізмів"'анодну камеру в годину. Приклад високого припливу кисню (або дифузії кисню або концентрації кисню) належить до приблизно 50-250 мкМ розчиненого кисню, що є присутнім в середовищі для культивування мікроорганізмів (наприклад, в анодній камері), наприклад, що дифундує в середовище для культивування мікроорганізмів/анодну камеру в годину.

Фактично оксидативний стрес, що досягається за допомогою припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню), також залежить від наявності антиоксидантів у середовищі для вирощування. Наприклад, якщо присутні сильні антиоксиданти, високий приплив кисню буде призводити до меншого оксидативного стресу. Якщо присутні дуже слабкі антиоксиданти в середовищі, невеликий приплив кисню може призводити до високого оксидативного стресу. І знову, контроль цих умов для досягнення поетапної індукції оксидативного стресу перебуває в межах навичок фахівця в цій галузі.

Для контролю початкової концентрації розчиненого кисню (наприклад, для зниження початкової концентрації кисню до низького (або нульового) рівня) середовище для вирощування

Зо можна дегазувати щодо кисню, наприклад, продуваючи азотом, що не містить кисень.

Антиоксидант включають у середовище для культивування для захисту мікроорганізмів від летальних концентрацій кисню і для імітації окисно-відновного середовища кишечнику.

Наприклад, антиоксидант може бути цистеїном, глутатіоном, аскорбіновою кислотою, дитіотреїтолом або галовою кислотою. Антиоксидант, наприклад, цистеїн або будь-який інший підходящий антиоксидант, будуть використовувати, щоб впливати або коректувати окисно- відновний потенціал або окисно-відновний статус. Для багатьох бактерій необхідний цистеїн як джерело сірки. Якщо цистеїн знижений, як у деяких зі способів за даним винаходом, це буде призводити до зниження загального змісту сірки в середовищі для вирощування. Для компенсації цього зниження додають окиснений варіант, наприклад, цистин (у випадку цистеїну). Іншими окисненими варіантами (наприклад, у випадку антиоксидантів, наведених вище), при необхідності, можуть бути окиснений глутатіон, дегідроаскорбат, окиснений дитіотреїтол або окиснена галова кислота. Крім того, у середовища для культивування також можна включати підходящі медіатори окиснювання-відновлення.

Поетапна зміна окисно-відновного статусу, наприклад, поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта, здійснюють для корекції окисно-відновного статусу середовища для вирощування. Окисно-відновний потенціал можна обчислювати з використанням рівняння Нернста (а). Його можна використовувати для будь-якого підходящого антиоксиданту і його окисненого варіанта.

ВЕ (Окиснений варіанті сУкЯ З -

Е. ве ва - Ме Дурні пнннютютююютююююоюе Х (а) пе ІВідновникюАнтиоксиданти де:

Ен: окисно-відновний потенціал (В)

Ес - Стандартний окисно-відновний потенціал пари (Відновник/Антиоксидант)уОкиснений варіант

КЕ - Універсальна газова стала - 8,31451 Дж К" моль"

Е - Стала Фарадея-96,485 Кл/моль

Т - Абсолютна температура (К) п - Кількість задіяних електронів

Таким чином, фахівець у цій галузі легко може обчислювати окисно-відновні потенціали будь-якого співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта. Як приклад, значення окисно-відновного потенціалу (Ен), обчислені для різних концентрацій окисно- відновної пари цистеїн/цистин, представлені в таблиці 1.

Ес для пари цистин/цистеїн-:0,25 В при рН 7,4, і п-2.

При використанні цистеїну/уцистину як пари антиоксидант/окиснений варіант переважну початкову концентрацію цистеїну можна обчислювати відповідно до рівняння реакції (Б). 48-5НО- -2К-55-8-НгО (Б)

Відповідно до рівняння (Б) 4 моля цистеїну (К-5Н) реагують із одним молем кисню з утворенням 2 молів цистину (К-55-Н).

Концентрація розчиненого кисню у воді при 25 "С становить приблизно 200 мкМ, ї, якщо середовище для вирощування не продувають азотом перед експериментом, приблизно 800

МКМ цистеїну будуть реагувати з 200 мкМ кисню, утворюючи 400 мкМ цистину.

Таким чином, у випадку середовища для вирощування, що містить 8 мМ цистеїну, будуть спостерігати початковий окисно-відновний потенціал приблизно -223 мВ. Однак повне дегазування кисню в середовищі для вирощування з використанням азоту, що не містить кисень, призводить до окисно-відновного потенціалу приблизно -283 мВ, близького до окисно- відновного потенціалу в просвіті кишечнику (приблизно -300 мВ). Таким чином, якщо як пару використовують цистеїн/цистин, переважна початкова концентрація цистеїну (або іншого антиоксиданту) становить 8 мМ. Це являє приклад високої концентрації антиоксиданту, коли як пару використовують цистеїн/цистин, однак, слід розуміти, що легко можна обчислювати еквівалентні високі концентрації антиоксидантів для інших пар. Крім того, переважна початкова концентрація цистину (або іншого окисненого варіанта) становить 0 мМ або є іншою низькою концентрацією для досягнення бажаного початкового окисно-відновного потенціалу. Також переважно повністю дегазувати використовуване середовище для вирощування від кисню (або повністю видаляти кисень із середовища для вирощування). Інакше кажучи, переважні умови вибирають так, щоб якнайбільше наблизитися до окисно-відновного потенціалу просвіту кишечнику -300 мВ як початкових умов способу. При здійсненні способів переважно здійснювати поетапне зниження концентрації антиоксиданту в комбінації з поетапним підвищенням концентрації окисненого варіанта для загального поетапного підвищення окисно-відновного

Зо потенціалу. Зокрема, для цистеїну/цистину (або іншої пари антиоксидант/окиснений варіант) воно може бути поетапним зниженням концентрації цистеїну на 1 мМ і підвищенням концентрації цистину на 1 мМ. Однак також можна використовувати інші поетапні підвищення/зниження за умови, що здійснюють поетапну зміну окисно-відновного статусу.

Цей принцип можна адаптувати до будь-якої підходящої пари антиоксидант/окиснений варіант. При зниженні концентрації антиоксиданту її балансують еквівалентною кількістю відповідного окисненого варіанта.

Спосіб, зокрема, можна здійснювати в підходящому біореакторі і, як правило, він включає кілька стадій пересівання бактеріальної культури (наприклад, у нові середовища для культивування). У деяких переважних варіантах здійснення винаходу кожна стадія поетапної зміни або індукції, як презентовано в даному описі, наприклад, поетапної подвійної індукції оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню, і поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу, наприклад, кожну стадію поетапного зниження концентрації антиоксиданту в комбінації з поетапним підвищенням концентрації окисненого варіанта, поетапним підвищенням прикладеної напруги і поетапного підвищення припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню), може включати пересівання. Термін "пересівання" у даному описі також може належати до стадії субкультивування або стадії культивування.

Спочатку окрему колонію бактерій можна сіяти в підходящі середовища для культивування, як відомо в цій галузі, і дозволяти їм рости до досягнення культурою стаціонарної фази.

Початкові умови можуть являти собою одне або декілька, або всі, з низького припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню), переважно, нульового припливу кисню (або дифузії кисню або, концентрації кисню), низької прикладеної напруги, переважно 0,1 В, більш конкретно - 0,1 В відносно Ад/Адсі, високої концентрації антиоксиданту (див. рівняння Нернста вище), низької концентрації або нульової концентрації окисненого варіанта (див. рівняння

Нернста вище). У випадку наступних пересівань можна здійснювати поетапне зниження концентрації антиоксиданту, підвищення окисненого варіанта, підвищення прикладеної напруги і підвищення припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню).

Якщо ріст мікроорганізмів значно знижений, умови можна зберігати постійними в досягнутих оптимізованих (або кінцевих) умовах, прикладом яких можуть бути З мМ цистеїну, 5 мМ цистеїну, 0,6 В відносно Ад/АдСІ і 0,2 нмоль-мл'хв', відповідно (див. фігури 5 і 8), щоб дозволити штамам адаптуватися. Інакше кажучи, коли поетапні зміни призводять до значного зниження росту мікроорганізмів, ці поетапні зміни припиняють і культивують мікроорганізми протягом однієї або декількох стадій з використанням постійних умов (або оптимізованих, або кінцевих умов), відповідних до умов, що досягаються до кінця поетапних змін. Ці постійні стадії дозволяють штамам адаптуватися. Після повторних посівів при постійних умовах, коли штам адаптований, у деяких варіантах здійснення посіви можна продовжувати з використанням одного або декількох (або переважно усіх) з додаткового поетапного зниження концентрації антиоксиданту, підвищення окисненого варіанта, підвищення прикладеної напруги і підвищення припливу кисню (або дифузії кисню, або концентрації кисню) (див. фігуру 5).

Усі субкультури, отримані на кожній стадії способу, можна аналізувати одночасно для селекції найбілош адаптованого штаму або субкультуру можна аналізувати безпосередньо після одержання, щоб вирішити, чи необхідно продовжувати посіви чи ні. Якщо субкультура не адаптована, тоді слід продовжувати посіви, в іншому випадку, якщо штам адаптований, можна вибирати цей штам і припиняти здійснення способу (див., наприклад, фігуру 8). Наприклад, отримані субкультури можна аналізувати на толерантність до кисню Ї, якщо вони демонструють бажаний рівень толерантності до кисню, наприклад, підвищений (переважно, значно підвищений) рівень толерантності до кисню в порівнянні з відповідним контрольним штамом (наприклад, початковим або батьківським штамами) або достатній рівень стабільності (наприклад, час зберігання) при впливі кисню (наприклад, у навколишньому повітрі), то штам адаптований і можна його вибирати. Можна вимірювати толерантність до кисню, оцінюючи ріст мікроорганізмів в аеробних умовах (наприклад, при впливі навколишнього повітря). Наприклад, можна здійснювати вимір кількості колонієутворюючих одиниць (КУО), якщо штами піддають впливу кисню, наприклад, у формі вимірювання КУО/мл. Приклади адаптованих (толерантних до кисню) штамів будуть мати щонайменше 1х102 або 1х103 КУО/мл, переважно - щонайменше 1х107 або 1х105 КУО/мл, при впливі кисню, наприклад, повітря, що оточує. Відповідний спосіб описують у прикладах (див., наприклад, таблицю 3). Якщо штам не адаптований, то посіви можна продовжувати.

Таким чином, у переважних варіантах здійснення винаходу початкові умови вибирають із

Зо одного або декількох, або всіх з: 8 мМ цистеїну (або еквівалентної концентрації альтернативного антиоксиданту), 0 мМ цистину (або альтернативного окисненого варіанта), прикладеної напруги 0,1 В і нульового або низького припливу кисню. У таких варіантах здійснення поетапні зміни можна продовжувати до досягнення одного або декількох, або всіх з: мінімальної концентрації цистеїну З мМ (або еквівалентної концентрації альтернативного антиоксиданту), максимальної концентрації цистину 5 мМ (або еквівалентної концентрації альтернативного окисненого варіанта), максимально прикладеної напруги 0,6 В і високого припливу кисню.

Таким чином, у переважних способах за винаходом прикладена напруга не перевищує 0,6 В і/або концентрація цистеїну становить не менше З мМ, і/або концентрація цистину не перевищує 5 мМ, і/або концентрацію розчиненого кисню в середовищі для культивування підтримують на рівні сублетальної концентрації.

Як видно із наведеного вище опису, у деяких варіантах здійснення винаходу після завершення поетапних змін спосіб включає одну або декілька додаткових стадій культивування (субкультивування) зазначених мікроорганізмів у кінцевих (оптимізованих або постійних) умовах прикладеної напруги, дифузії кисню (припливу кисню або концентрації кисню) і співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта, що досягаються після поетапних змін (див., наприклад, фігуру 8).

В інших варіантах здійснення спосіб додатково включає наступні стадії, на яких здійснюють подальші поетапні зміни (див., наприклад, фігуру 5).

Кількість стадій поетапних змін, що підлягають здійсненню, може визначати фахівець у цій галузі за допомогою моніторингу поведінки мікроорганізмів або скринінгу мікроорганізмів (наприклад, як представлено будь-де у даному описі) у той час, як вони проходять адаптацію.

Наприклад, переважні варіанти здійснення способів за даним винаходом можуть включати до 5 або 6 стадій поетапних змін, наприклад, 3, 4, 5 або 6 стадій поетапних змін або щонайменше 5 стадій поетапних змін, наприклад, до 10 стадій поетапних змін, наприклад 7, 8, 9 або 10 стадій.

Загальна кількість стадій, наприклад стадій культивування (включаючи стадії поетапних змін і стадії, що підлягають здійсненню в постійних або оптимізованих умовах), для досягнення адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів може визначати фахівець у цій галузі за допомогою моніторингу поведінки бо мікроорганізмів або скринінгу мікроорганізмів (наприклад, як представлено де-небудь у даному описі) у той час, як вони проходять адаптацію. Наприклад, переважні варіанти здійснення способів за даним винаходом можуть включати до 6, 7, 8, 9, 10 або 12 стадій, або до 15, 20, 25, 30 або 35 стадій.

У способах, які включають стадії культивування, що підлягають здійсненню в постійних або оптимізованих умовах, кількість стадій, наприклад, стадій культивування, що підлягають здійсненню, може визначати фахівець у цій галузі за допомогою моніторингу поведінки мікроорганізмів або скринінгу мікроорганізмів (наприклад, як представлено будь-де у даному описі) у той час, як вони проходять адаптацію. Наприклад, переважні варіанти здійснення способів за даним винаходом можуть включати до 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 12 стадій, або до 15, 20, 25, 30 або 35 стадій, здійснюваних у постійних або оптимізованих умовах.

У деяких варіантах здійснення адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів можна досягати до кінця цих стадій, здійснюваних у постійних або оптимізованих умовах (або фактично іноді до кінця стадій поетапних змін). Таким чином, фахівець у цій галузі легко може визначати кількість таких стадій, що підлягають здійсненню, наприклад, за допомогою моніторингу досягнення значної або достатньої, або максимальної адаптації (толерантності до кисню).

Спосіб також можна використовувати для одержання адаптованого і вибраного штаму (наприклад, для одержання або вирощування мікроорганізму, вибраного цим способом). У таких способах умови культивування зберігають постійними в оптимальних умовах, наприклад, оптимізованих (або постійних) умовах, визначених описаними вище способами за винаходом, наприклад, З мМ антиоксиданту, 5 мМ окисненого варіанта, 0,6 В і 0,2 нмоль-:мл'хв'". Це приводить до високого виходу вибраного бактеріального штаму.

Спосіб, зокрема, здійснюють у біореакторі за назвою "Імітаційна модель окиснення- відновлення в кишечнику людини" (ЗНІКМ), фігура 4а, Б і с. В ЗНІКМ подвійного оксидативного стресу досягають за допомогою зовнішньої напруги (прикладеної напруги) і дифузії кисню (припливу кисню), і окисно-відновний потенціал/окисно-відновний статус системи контролюють за допомогою пари антиоксидант/окиснений варіант. Оскільки кисень летальний для організмів, що культивуються, розчинений кисень буде підвищуватися, але зберігатися на рівні сублетальної концентрації у той час як поетапну зміну співвідношення концентрацій

Зо антиоксиданту/окисненого варіанта використовують для корекції окисно-відновного статусу середовища (див., наприклад, фігуру 5 або фігуру 8, на яких представлені приклади концентрацій цистеїнууцистину, які легко можна адаптувати до інших пар антиоксидант/окиснений варіант). Оксидативний стрес за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню підвищує толерантність бактерій до окисного середовища, і клітини повторно піддають впливу нових оксидативних умов (наприклад, фігура 5 або фігура 8). Адаптовані або поліпшені штами піддають скринінгу на толерантність до кисню. Штами також можна піддавати скринінгу на метаболічні характеристики, такі як профіль жирних кислот (наприклад, продукція бутирату у випадку бутират- продукуючих бактерій, таких як Раесаїїрасієгійт ргаизпілії), і оцінці кінетики росту для селекції найбільш адаптованого штаму. Таким чином, адаптовані або поліпшені штами адаптують для ліпшої толерантності (наприклад, ніж у відповідних початкових або батьківських мікроорганізмів) до середовища, що містить кисень, або для ліпшої толерантності до стресових умов, таких як вплив навколишнього повітря (оксидативний стрес) або, наприклад, солей жовчних кислот. Таким чином, якщо, наприклад, штами являють собою

Еаеєсаїїрасіегішт ргаизпіїгії вибирають штами, у яких метаболічні характеристики, такі як продукція бутирату або інших жирних кислот, зберігають або поліпшують, але штами демонструють поліпшену толерантність до кисню (наприклад, у порівнянні з відповідним початковим або батьківським штамом ГРаєесаїїрасіегішт ргаизпіїлії).

У переважному варіанті здійснення даний винахід належить до способу адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції щодо більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів, де мікроорганізми культивують із використанням комбінації поетапної подвійної індукції оксидативного стресу за допомогою прикладеної напруги і дифузії кисню та поетапної зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно- відновного статусу.

В іншому переважному варіанті здійснення спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів до кисню здійснюють із використанням біореактора за назвою "Імітаційна модель окиснення- відновлення в кишечнику людини" (ЗНІКМ), і він включає, як необмежуючі приклади, наступні стадії: а) Посів окремої колонії бактерій у середовища для культивування (як відомо в цій галузі) підходящі медіатори, що включають, окиснення-відновлення і відновники для захисту бактеріальних клітин від летальних концентрацій кисню і для імітації окисно-відновного середовища кишечнику.

БЮ) Коли культура досягає пізньої екпоненціальної фази, одну частину культури можна використовувати для аналізу, а іншу частину можна використовувати для можливого пересівання в реактор ЗНІКМ. с) Посів культури в реакторі ЗНІКМ, що містить ті ж середовища для культивування, які використовували при первинному виділенні і рутинному культивуванні бактеріального штаму.

Середовище для вирощування тепер має назву "середовище для культивування Зпіпт Веа" (З5ВСМ).

І. Концентрація відновника/антиоксиданту, як необмежуючі приклади, цистеїну, глутатіону, аскорбінової кислоти, дитіотреїтолу і галової кислоти, знижена і збалансована еквівалентною кількістю відповідного "окисненого варіанта", як необмежуючі приклади, цистину, окисненого глутатіону, дегідроаскорбату, окисненого дитіотреїтолу і окисненої галової кислоти.

ІЇ. Прикладені електричні окисні потенціали підтримують за допомогою зовнішньої напруги, наприклад, на аноді із графіту, графітової повсті, або вуглецевої повсті, або вуглецевого волокна за допомогою потенціостата. Ланцюг замикають, наприклад, з'єднуючи катодну камеру з одним бічним відгалуженням анодної камери, розділеної протонообмінною мембраною.

І. Приплив кисню контролюють, з'єднуючи кисневий фідер з іншим бічним відгалуженням анодної камери, розділеною змінною перегородкою, що має різні константи дифузії кисню.

Поточний приплив кисню вимірюють, наприклад, за допомогою датчика розчиненого кисню

Кларка, див. фігуру 4А.

ЇМ. Приплив кисню підтримують, продуваючи кисневий фідер чистим газоподібним киснем або повітрям, і досягають бажаних концентрацій розчиненого кисню, дотримуючись закону розчинності газів Генрі. Потім розчинений кисень дифундує через кисневий фідер в анодну камеру.

М. Крім того, приплив кисню контролюють, змінюючи об'єм шару кисневого фідера. Кисневий фідер також можна видаляти, щоб уможливити пряму дифузію кисню в анодну камеру.

МІ. Мембранну перегородку між анодною камерою і кисневим фідером можна додатково покривати муциновим агаром, щоб уможливити краще контрольовану дифузію кисню з

Зо кисневого фідера в анодну камеру.

МІ. ЗНІКМ містить середовища для культивування Зпіпт Вей (ЗВСМ), що продуваються азотом, що не містить кисень, для видалення розчиненого кисню.

МІ. Біореактор ЗНІКМ включений до досягнення культурою стаціонарної фази. а) Одну частину першої субкультури використовують для посіву в реактор ЗНІКМ. е) Починають пересівання в реактор ЗНІКМ, маючи поетапно знижену концентрацію антиоксиданту, підвищену концентрацію окисненого варіанта і підвищену прикладену напругу (максимум 0,6 В). Менша кількість антиоксиданту буде видаляти менше кисню, таким чином, буде доступно більше кисню, і клітини випробують більше оксидативного стресу. Кисневий фідер додатково регулює дифузію або приплив кисню.

Цю стадію повторюють до зниження росту.

І) Зберігаючи всі умови постійними, повторюють пересівання і аналізують нову субкультуру на порівняльні метаболічні характеристики, кінетику росту, стабільність і толерантність. Якщо результати аналізу є задовільними, то цю субкультуру вибирають, а якщо ні, то повторюють стадію Її).

У таких способах кожну субкультуру можна аналізувати до наступного пересівання (або аналізувати після кожної стадії), і припиняють здійснення способу, якщо штам відповідним чином адаптований до кисню. Потім вибирають цей штам. У таких способах перед припиненням здійснення способу можна аналізувати до приблизно 30 субкультур або до приблизно 10 субкультур (або іншу кількість субкультур, як представлено будь-де у даному описі).

При необхідності одну або декілька із зазначених вище стадій можна використовувати в будь-якому зі способів за винаходом, як презентовано в даному описі.

В іншому переважному варіанті здійснення одержують приблизно 30 субкультур (див., наприклад, фігуру 5) або одержують приблизно 10 субкультур (див., наприклад, фігуру 8), або одержують будь-яку кількість субкультур (як представлено будь-де у даному описі), а потім всі з них аналізують, щоб знайти найбільш підходящий штам. Таким чином, не обов'язково аналізувати субкультури після кожної стадії, замість цього всі аналізи можна здійснювати одночасно, наприклад, для оцінки того, яка субкультура найбільш адаптована або толерантна до кисню. Спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів до кисню здійснюють із використанням біореактора за назвою "Імітаційна модель окиснення-відновлення в кишечнику людини" бо (ЗНІКМ), і він включає, як необмежуючі приклади наступні стадії:

а) Посів окремої колонії бактерій у загальноприйняті середовища для культивування, як відомо в цій галузі, що включають підходящі медіатори окиснення-відновлення і відновники для захисту бактеріальних клітин від летальних концентрацій кисню і для імітації окисно-відновного середовища кишечнику.

Б) Коли культура досягає пізньої екпоненціальної фази, одну частину культури використовують для посіву в реактор ЗНІКМ, а іншу частину залишають для аналізу. с) Посів культури в реактор ЗНІКМ, що містить ті ж середовища для культивування, які використовували при первинному виділенні та рутинному культивуванні бактеріального штаму.

Середовище для вирощування тепер має назву "середовище для культивування Зпіпт Веа" (З5ВСМ).

І. Концентрація відновника/антиоксиданту, як необмежуючі приклади, цистеїну, глутатіону, аскорбінової кислоти, дитіотреїтолу і галової кислоти, знижена та збалансована еквівалентною кількістю відповідного "окисненого варіанта", як необмежуючі приклади, цистину, окисненого глутатіону, дегідроаскорбату, окисненого дитіотреїтолу та окисненої галової кислоти.

ІЇ. Прикладені електричні окисні потенціали підтримують за допомогою зовнішньої напруги, наприклад, на аноді із графіту, графітової повсті або вуглецевої повсті, або вуглецевого волокна за допомогою потенціостата. Ланцюг замикають, наприклад, з'єднуючи катодну камеру з одним бічним відгалуженням анодної камери, розділеної протонообмінною мембраною.

І. Приплив кисню контролюють, з'єднуючи кисневий фідер з іншим бічним відгалуженням анодної камери, розділеної змінною перегородкою, що має різні константи дифузії кисню.

Поточний приплив кисню вимірюють, наприклад, за допомогою датчика розчиненого кисню

Кларка, див. фігуру 4А.

ЇМ. Приплив кисню підтримують, продуваючи кисневий фідер чистим газоподібним киснем або повітрям, і досягають бажаних концентрацій розчиненого кисню, дотримуючись закону розчинності газів Генрі. Потім розчинений кисень дифундує через кисневий фідер в анодну камеру.

М. Крім того, приплив кисню контролюють, змінюючи об'єм шару кисневого фідера. Кисневий фідер також можна видаляти, щоб уможливити пряму дифузію кисню в анодну камеру.

МІ. Мембранну перегородку між анодною камерою і кисневим фідером можна додатково

Зо покривати муциновим агаром, щоб уможливити краще контрольовану дифузію кисню з кисневого фідера в анодну камеру.

МІ. ЗНІКМ містить середовища для культивування 5піпт Вей (ЗВСМ), що продуваються азотом, що не містить кисень, для видалення розчиненого кисню.

МІ. Потім ЗВСМ, використовувану для першого посіву, можна позначати як ЗВСМ Х, У/М7, де Х належить до концентрації антиоксиданту (мМ), У належить до концентрації окисненого варіанта (мМ) і М» належить до прикладеної напруги щодо АЛад/АдсІ (М). Біореактор ЗНІКМ включений до досягнення культурою стаціонарної фази.

ЇХ. Культуру, отриману після першої інкубації, можна позначати як "популяція Р1".

Я) Наступний посів у реактор 5НІКМ починають, маючи знижену концентрацію антиоксиданту, підвищену концентрацію окисненого варіанта і підвищену прикладену напругу.

Менша кількість антиоксиданту буде видаляти менше кисню, таким чином, буде доступно більше кисню, і клітини випробують більше оксидативного стресу. Кисневий фідер додатково регулює дифузію або приплив кисню. е) Пересівання продовжують до одержання приблизно 6-ої субкультури, див., наприклад, фігури 5 і 8 (коли комбінований ефект антиоксидантів/медіаторів окиснення-відновлення, припливу кисню і напруги значно впливає (знижує) на ріст).

І) Прикладену напругу, як правило, не будуть підвищувати вище 0,6 В відносно Ад/Адсі через надлишок напруги. Більш високі потенціали можуть викликати забруднення електродів і, крім того, летальне окиснення цитохромів мікроорганізмів, наприклад, цитохром аЗ має відновний потенціал приблизно 0,385 В відносно 5НЕ. 9) Зберігаючи всі умови постійними, здійснювали повторні посіви до одержання приблизно 27-ої субкультури (див., наприклад, фігуру 5) або приблизно 10-ої субкультури (див., наприклад, фігуру 8), більш точної кількості субкультур (для підвищення ймовірності адаптації) до адаптації штаму до умов, при цьому для кожної субкультури використовували свіже середовище.

Р) Після 27-ої субкультури продовжували посіви до приблизно 30-ої субкультури, як показано на фігурі 5. Альтернативно, після 10-ої субкультури посіви припиняли, як показано на фігурі 8. її При одержанні всіх субкультур їх аналізують на порівняльні метагеномні, метаболічні характеристики, кінетику росту, стабільність і толерантність до оксидативного стресу для 60 вибору найбільш адаптованого штаму.

При необхідності, одну або декілька із зазначених вище стадій можна використовувати в будь-якому зі способів за винаходом, як презентовано в даному описі.

У ще одному варіанті здійснення спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів до кисню здійснюють із використанням біореактора за назвою "Імітаційна модель окиснення-відновлення в кишечнику людини" (ЗНІКМ), і він включає, як необмежуючі приклади наступні стадії: а) Посів окремої колонії бактерій у загальноприйняті середовища для культивування, як відомо в цій галузі. Цистеїн використовують для імітації окисно-відновного потенціалу товстого кишечнику в середовищі для вирощування, а резазурин використовують як індикатор окиснювання-відновлення.

Б) Коли культура досягає пізньої екпоненціальної фази, одну частину культури використовують для посіву в реактор ЗНІКМ, а іншу частину залишають для аналізу. с) Посів культури в реактор ЗНІКМ, що містить ті ж середовища для культивування, які використовували при первинному виділенні і рутинному культивуванні бактеріального штаму.

Середовище для вирощування тепер має назву "середовище для культивування Зпіпт Веа" (З5ВСМ).

І. Концентрація відновника/антиоксиданту, цистеїну, знижена і збалансована еквівалентною кількістю відповідного "окисненого варіанта", цистину.

ІЇ. Прикладені електричні окисні потенціали підтримують за допомогою зовнішньої напруги, наприклад, на аноді із графіту, графітової повсті, або вуглецевої повсті, або вуглецевого волокна за допомогою потенціостата. Ланцюг замикають, наприклад, з'єднуючи катодну камеру з одним бічним відгалуженням анодної камери, розділеної протонообмінною мембраною.

І. Приплив кисню контролюють, з'єднуючи кисневий фідер з іншим бічним відгалуженням анодної камери, розділеної змінною перегородкою, що має різні константи дифузії кисню.

Поточний приплив кисню вимірюють, наприклад, за допомогою датчика розчиненого кисню

Кларка, див. фігуру 4А.

ЇМ. Приплив кисню підтримують, продуваючи кисневий фідер чистим газоподібним киснем або повітрям, і досягають бажаних концентрацій розчиненого кисню, дотримуючись закону розчинності газів Генрі. Потім розчинений кисень дифундує через кисневий фідер в анодну камеру.

Зо М. Крім того, приплив кисню контролюють, змінюючи об'єм шару кисневого фідера. Кисневий фідер також можна видаляти, щоб уможливити пряму дифузію кисню в анодну камеру.

МІ. Мембранну перегородку між анодною камерою і кисневим фідером можна додатково покривати муциновим агаром, щоб уможливити краще контрольовану дифузію кисню з кисневого фідера в анодну камеру.

МІ. ЗНІКМ містить ЗВСМ, що продуваються азотом, що не містить кисень, для видалення розчиненого кисню.

МІ. Потім ЗВСМ, використовувану для першого посіву, можна позначати як ЗВСМ 8,0/Мо, де перший з показників означає концентрацію цистеїну, у той час як останній означає концентрацію цистину в мМ, і "М" означає прикладену напругу щодо Ад/АдсІі. Біореактор ЗНІКМ включений до досягнення культурою стаціонарної фази при окисному потенціалі 4100 мВ.

ЇХ. Культуру, отриману після першої інкубації, можна позначати як "популяція Р1". а) Наступний посів у реактор ЗНІКМ починають, маючи знижену концентрацію цистеїну, підвищену концентрацію цистину і підвищену прикладену напругу, див. фігуру 5 і фігуру 8.

Менша кількість антиоксиданту буде видаляти менше кисню, таким чином, буде доступно більше кисню, і клітини випробують більше оксидативного стресу. Кисневий фідер додатково регулює дифузію або приплив кисню. е) Пересівання продовжують до одержання приблизно 6-ої субкультури. На цій стадії концентрацію антиоксиданту знижують до З мМ, а концентрацію "окисненого варіанта" підвищують до 5 мМ, у той час як окисний потенціал становить 0,6 В (щодо Аад/Адсі).

Потенційну напругу не будуть підвищувати вище 0,6 В щодо Ад/АдсСІ через надлишок напруги.

Більш високі потенціали можуть викликати забруднення електродів і, крім того, летальне окиснення цитохромів мікроорганізмів, наприклад, цитохром аз має відновний потенціал приблизно 0,385 В щодо ЗНЕ.

І) Зберігаючи всі умови постійними, здійснювали повторні посіви до одержання приблизно 27-ої субкультури (фігура 5) або 10-ої субкультури (фігура 8), при цьому для кожної субкультури використовували свіже середовище. 9) У ситуації, представленій на фігурі 5, після 27-ої субкультури продовжували посіви до приблизно 30-ої субкультури, як показано на фігурі 5. Альтернативно, наприклад, як показано на фігурі 8, після 10-ої субкультури посіви припиняли.

При необхідності одну або декілька із зазначених вище стадій можна використовувати в будь-якому зі способів за винаходом, як презентовано в даному описі.

Поетапна зміна співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу відповідає рівнянню Нернста. Далі наданий приклад для окисно-відновної пари цистеїн/цистин:

Ен-ЕоТ/2РІп(ІЦистин|/Цистеїні") (а)

Де:

Екхокисно-відновний потенціал (В)

Ес-Стандартний окисно-відновний потенціал пари цистин/цистеїн-:0,25 В при рн 7,4

Кк: Універсальна газова стала-8,31451 Дж К7" моль" ге Стала Фарадея-96,485 Кл/моль

ТЕАбсолютна температура (К)

Значення окисно-відновного потенціалу (Ен), обчислені для різних концентрацій окисно- відновної пари цистеїн/цистин, представлені в таблиці 1.

Таблиця 1: мМ 11111711 мв С

Насичене киснем середовище 776 1 2 | ющ 98 9 Щ ЗЖЗуУ

Позбавлене кисню середовище для вирощування, отримане за допомогою продування азотом 712116 | юЮюДщф(фЗЖ 55 Ж ККЗ 60177178 7771-31 48-5НО--2К-55-8-НгО (Б)

Відповідно до рівняння (Б) 4 моля цистеїну (К-5Н) реагують із одним молем кисню з утворенням 2 молів цистину (К-55-Н).

Концентрація розчиненого кисню у воді при 25 "С становить приблизно 200 мкМ, ї, якщо середовище для вирощування не продувають азотом перед експериментом, приблизно 800

МКМ цистеїну будуть реагувати з 200 мкМ кисню з утворенням 400 мкМ цистину. Таким чином, у випадку середовища для вирощування, що містить 8 мМ цистеїну, будуть спостерігати початковий окисно-відновний потенціал приблизно -223 мВ. Однак повне дегазування кисню в середовищі для вирощування з використанням азоту, що не містить кисень, призводить до окисно-відновного потенціалу приблизно -283 мВ, близькому до окисно-відновного потенціалу просвіту кишечнику (приблизно -300 мВ).

Даний винахід додатково належить до прикладів адаптованих мікроорганізмів, отриманих способами за даним винаходом.

Таким чином, додатковий аспект винаходу належить до мікроорганізму (адаптованому мікроорганізму), наприклад, штаму мікроорганізму, одержаному, одержуваному, ідентифікованому або вибраному способами за винаходом. Такі штами можуть бути пробіотичним мікроорганізмом або бактеріальним штамом. У рамках винаходу, термін "пробіотик" належить до мікроорганізмів, що приносять користь здоров'ю при їх споживанні.

Наприклад, Продовольча і сільськогосподарська організація ООН визначає пробіотики як "живі мікроорганізми, які при введенні в адекватних кількостях приносять користь здоров'ю носія".

Такі мікроорганізми або штами можуть бути виділеними штамами або чистими культурами і не будуть відповідати природним мікроорганізмам або штамам, тому що вони піддані способам адаптації за винаходом. Переважними мікроорганізмами або штамами є РК. ргаизпіїлії.

Прикладами адаптованих штамів, отриманих і т.д. способами адаптації за даним винаходом, є штами ЕК. ргаийзпіїгії, позначені в даному описі як ТС51, ОС5-1 і 0С5-2. Ці штами депоновані відповідно до Будапештського договору в О5МА (І еїрпі7 Іпзійше Ю5М2-Септап

Соїесііоп ої Містоогдапізтв апа Сеї! Сийигев, ІппоїМепвіг. 78, 0-38124 Вгашп5спмеїд, Сегтапу) на 12 жовтня 2016 року під реєстраційними номерами Ю5М 32380, Ю5М 32378 і О5М 32379, відповідно.

Мікроорганізми або штами, отримані і т.д. способами за винаходом (наприклад, один або декілька штамів, що депонуються), можуть мати форму сполуки (засобу) або композиції, наприклад, фармацевтичної сполуки або композиції або харчової сполуки або композиції.

Таким чином, даний винахід також належить до композиції або складу, що містять: () мікроорганізм або штам, одержаний, одержуваний, ідентифікований або вибраний способом за винаходом, або мікроорганізм, або штам за винаходом, іншим способом визначений у даному описі (наприклад, один або декілька штамів, що депонуються); і (ї) щонайменше один додатковий компонент, вибраний із групи, що складається з носія, дилюенту або ексципієнту (наприклад, фармацевтично прийнятного носія, дилюенту або ексципієнту), продукту харчування або харчової добавки, або додаткового терапевтичного або харчового засобу. Таким чином, зазначені композиції можна складати у вигляді фармацевтичних композицій або харчових композицій, наприклад, харчового продукту.

Даний винахід також належить до терапевтичного застосування мікроорганізмів, штамів, композицій і складів за винаходом, як визначено в даному описі (наприклад, одного або декількох штамів, що депонуються).

Підходящий спосіб введення і склад мікроорганізмів, штамів, композицій, складів і т.д. вибирають залежно від локалізації захворювання. Переважними способами введення є пероральний або ректальний, однак, однаковою мірою можуть підходити внутрішньовенні або внутрішньом'язові ін'єкції.

Фахівець у цій галузі легко може вибирати або визначати підходящі дози мікроорганізмів, штамів, композицій і складів за винаходом, як визначено в даному описі, залежно від порушення, що підлягає лікуванню, способу введення і розглянутого складу. Наприклад, дозу і схему введення вибирають таким чином, що мікроорганізми, штами, композиції або склади за винаходом, що вводяться індивідуумові, можуть приносити терапевтичну користь або користь здоров'ю. Наприклад, можна використовувати добові дози мікроорганізмів від 107 до 1072, наприклад, від 10» до 1079, або від 105 до 108, або від 108 до 1079 КУО бактерій.

Таким чином, даний винахід належить до продуктів або композицій, або складів, або наборів, що містять більш толерантні до кисню анаеробні мікроорганізми, отримані і т.д. способами за даним винаходом або іншим чином визначені в даному описі. Переважно такі

Зо продукти мають збільшений строк придатності або більш тривалий час зберігання.

Переважні продукти або композиції містять заморожені, ліофілізовані або висушені бактерії (також див. приклади) і, переважно, мають формат однократної дози, наприклад, капсули, таблетки або гелю. Підходящі дози (наприклад, у формі кількості бактерій або КУО) для застосування в таких продуктах і т.д. описують будь-де у даному описі і у прикладах. У такі продукти також можна включати інші компоненти і т.д., наприклад, консерванти (наприклад, гліцерин), стабілізатори, гелеутворюючі засоби і/або кріопротектори. У деяких варіантах здійснення такі додаткові компоненти є неприродними засобами.

Якщо в даному описі згадують знижені концентрації, рівні або ріст, то, переважно, таке зниження (і, фактично, інше зниження або негативні ефекти, як зазначено будь-де у даному описі) є вимірюваним зниженням, більш переважно - значним зниженням, переважно - статистично значимим зниженням, наприклад, з імовірністю «0,05, при порівнянні з відповідним рівнем або значенням.

Якщо в даному описі згадують підвищені концентрації, рівні, напругу, толерантність або ріст і т.д., наприклад, поетапне підвищення або підвищення оксидативного стресу, припливу кисню (або дифузії, або концентрації), або толерантності до кисню, то, переважно, таке підвищення (і, фактично, інше підвищення або позитивні ефекти, як зазначено будь-де у даному описі), є вимірюваним підвищенням, більш переважно - значним підвищенням, переважно - статистично значимим підвищенням, наприклад, з імовірністю «0,05, при порівнянні з відповідним рівнем або значенням.

Фактично, якщо в даному описі наведені значні зміни, переважно, щоб такі зміни були статистично значимими змінами, наприклад, з імовірністю «0,05, при порівнянні з відповідним рівнем або значенням.

Далі йдуть деякі приклади винаходу, призначені не для обмеження винаходу в даному описі, а для докладної демонстрації практичних прикладів того, як можна використовувати винахід.

Приклади

Приклад 1

Адаптація анаеробного мікроорганізму до окисненого середовища

Штам Раєсаїїрасіегішт ргаибепії;лі виділяли з екскрементів здорового добровольця мікробіологічним способом чистої культури в строгих анаеробних умовах (5 95 Н», 15 95600» та бо 8095 Мг), використовуючи камеру від Соу, і називали його ЕВТ-22 (05М 32186). (ЕВТ-22 депонований відповідно до Будапештського договору в ОМА (І еїбпі2 Іпоійшще ЮО5М2-Септап

СоПесійоп ої Місгоогдапізт5 апа Сеї! Сийигев, ІппойПепвіг. 7В, 0-38124 Вгайп5спугеід, сСепгтапу) на 20 жовтня 2015 року під реєстраційним номером ЮО5М32186). Загальноприйняте середовище для культивування, використовуване для виділення, містить наступне (г/л); дріжджовий екстракт: 2,5; казитон: 10; глюкозу: 4,5; хлорид натрію: 0,9; гідроортофосфат калію: 0,45; дигідроортофосфат калію: 0,45; сульфат амонію: 1,32; бікарбонат натрію: 4 г; цистеїн: 1, резазурин: 0,001; гемін: 0,01. Суміш вітамінів містить: 10 мкг біотину, 10 мкг кобаламіну, 30 мкг р-амінобензойної кислоти, 50 мкг фолієвої кислоти і 150 мкг піридоксамину. Кінцеві концентрації жирних кислот з коротким ланцюгом (ЗСЕА) у середовищі становили 33 мМ ацетату, 9 мМ пропіонату і по 1 мМ кожного з ізобутирату, ізовалерату і валерату. Усі компоненти додавали асептично, у той час як пробірки обробляли струменем СО». Термолабільні вітаміни стерилізували фільтрацією з використанням фільтра 0,22 мкм і додавали після автоклавування середовища для одержання кінцевої концентрації 0,05 мкг-мл" тіаміну і 0,05 мкг.-мл" рибофлавіну. Кінцевий рН середовища доводили до 7,2--0,2 з використанням 1 Н Маон або 1 Н

НС. Середовища автоклавували при 100 кПа, 121 "С протягом 15 хв. Цистеїн використовували для імітації окисно-відновного потенціалу товстого кишечнику в середовищі для вирощування, і резазурин використовували як індикатор окиснювання-відновлення. Посівний матеріал для біореактора ЗНІКМ одержували за допомогою посіву окремої колонії в 7 мл середовища для культивування. Після 12-16 год. інкубації при 37 "С культура досягала пізньої екпоненціальної фази (ОЮОвоо 70,7). Дві пробірки із приблизно 0,5 мл основної культури зберігали в 20 95 гліцерині при -80 С ї позначали як РЕК. Ці стоки РЕК позначали як ЕЕК-М1.1 ії ЕРЕК-М1.2. РЕКМІ.1 і прямо висівали в 7 мл середовища для культивування без розморожування. Посівні матеріали інкубували анаеробно протягом 12-16 год. при 37" С, коли культура досягала пізньої екпоненціальної фази (20600 --0,7), 2,5 мл культури висівали в 250 мл біореактора ЗНІКМ.

Частку цієї основної культури зберігали у двох екземплярах (як зазначено вище) і позначали як

ЕЕВ-М2.1 ії РЕК-М2.2. У випадку будь-якої контамінації або невдачі експеримент можна продовжити з використанням відповідних культур ЕЕКМ. Композиція середовища для культивування ЗНІКМ Вей (ЗВСМ) є такою ж, як використовували для первинного виділення штаму ЕВТ-22 (О5М 32186); згодом концентрацію цистеїну знижували і збалансували

Зо еквівалентною кількістю цистину. Прикладені електричні окисні потенціали підтримували за допомогою зовнішньої напруги на графітовому аноді (8,5 см х 0,25 см х 2,5 см) за допомогою потенціостата. Ланцюг замикали, з'єднуючи катодну камеру з одним бічним відгалуженням, розділену протонообмінною мембраною. Приплив кисню контролювали, з'єднуючи кисневий фідер з анодною камерою, розділеною змінною перегородкою, що має різні постійні дифузії кисню. Поточний приплив кисню вимірювали з використанням датчика розчиненого кисню

Кларка. Приплив кисню контролюють, продуваючи кисневий фідер чистим киснем, що дифундують в анодну камеру через напівпроникну мембрану. Коефіцієнти дифузії (Оот) і сталі переносу маси (Кот) кисню для мембрани становлять 2,4х1056 см/с і 1,3х10"см/с, відповідно.

Крім того, приплив кисню контролювали, змінюючи об'єм шару кисневого фідера, наприклад, 250 мл або 100 мл, як показано на фігурі 6. Кисневий фідер також можна видаляти, щоб уможливити пряму дифузію кисню в анодну камеру, як показано на фігурі 7. Покриття мембранної перегородки муциновим агаром додатково дозволяє контролювати дифузію кисню в анодну камеру. Муциновий агар одержували за допомогою розчинення і автоклавування наступних компонентів (г/л): агар: 2; масі: 8; КСІ: 0,2; МагНРО»: 1,42; КНгРО»: 0,24; муцин типу

І: 5. Середовища автоклавували при 100 кПа, 121 "С протягом 15 хв. ЗНІКМ містить ЗВСМ, що продувається азотом, що не містить кисень, протягом 15 хв для видалення розчиненого кисню.

Кінцеву концентрацію клітин у реакторі ЗНІКМ доводили до приблизно ОЮвоо 70,005.

Потім 5ВСМ, використовувану для першого посіву РЕЕК-М2.1, позначали як ЗВСМ 8,0/Мон, де перший з показників ("8") означає концентрацію цистеїну (мМ), останній ("0") - концентрацію цистину (мМ), ії "М" означає прикладену напругу щодо Ад/АдсСІ. Кожний експеримент будуть починати з нульового припливу кисню і кисень дифундує з кисневого фідера із заздалегідь визначено постійною швидкістю. Біореактор ЗНІКМ був включений протягом 24 год. при 37 С до досягнення культурою стаціонарної фази при окисному потенціалі 4100 мВ.

Культуру, отриману після першої інкубації, можна позначати як "популяція РІ", і вона має вік приблизно 5 поколінь. Заморожені стоки із цієї партії позначали як ЕЕК-Р1.1 і ЕЕК-Р1.2. 2,5 мл

ЕЕВ-Р1.1 висівали в новий реактор 5НІКМ, що містить 5ВСМ 7,1/М/о2». Пересівання продовжували до одержання 6-ої субкультури ЕЕК-Рб і відповідну ЕЕК-Р зберігали на стадії кожної проміжної субкультури. На цій стадії концентрація цистеїну знижувалася до З мМ і концентрація цистину підвищувалася до 5 мМ, у той час як окисний потенціал становив 600 мВ бо відносно Ад/Адсі. На цій стадії повторні посіви здійснювали до 27-ої субкультури, зберігаючи всі умови постійними, при цьому для кожної субкультури використовували свіже середовище. Після 27-ої субкультури посіви продовжували до 30-ої субкультури, як показано на фігурі 5.

Приклад 2

Селекція поліпшеного штаму, адаптованого до окисного середовища

Різні ЕЕК-Р із прикладу 1 аналізують для селекції штаму, адаптованого до окисного середовища і кисню, який можна використовувати для подальшого одержання.

Аналіз оснований на порівняльних метагеномних, метаболічних характеристиках, кінетиці росту, стабільності і толерантності.

Порівняльну метаболічну характеризацію здійснюють за допомогою профілювання жирних кислот, більш конкретно - продукції бутирату на різних пребіотиках, таких як інулін і резистентний крохмаль.

Порівняльну характеризацію кінетики росту, що включає виходи біомаси і швидкість росту, здійснюють у нормальних середовищах для культивування із солями жовчних кислот і пребіотиками або без них.

Порівняльну характеризацію стабільності і толерантності здійснюють у присутності імітації рідини шлунка/імітації рідини кишечнику з ферментами або без них і впливом навколишнього повітря протягом 30 хв.

Тестовий розчин (Т5) імітації рідини шлунка одержують відповідно до керівництв

Фармакопеї США (О5Р), розчиняючи 2,0 г хлориду натрію і 3,2 г очищеного пепсину (отриманого зі слизової оболонки шлунка свині, з активністю від 800 до 2500 одиниць на мг білка) в 7,0 мл соляної кислоти і воді об'ємом до 1000 мл. Цей тестовий розчин має рН приблизно 1,2.

Тестовий розчин (Т5) імітації рідини кишечнику відповідно до ЮР одержують, розчиняючи 6,8 г дигідроортофосфату калію в 250 мл води, а потім додаючи 77 мл 0,2 Н гідроксиду натрію і 500 мл води. Додають 10,0 г панкератину і отриманий розчин доводять до рН 6,8-0,1 з використанням 0,2 Н гідроксиду натрію або 0,2 Н соляної кислоти і, в остаточному підсумку, розводять до 1000 мл.

Мікробну паливну батарею і флавін-залежне відновлення 5,5'-дитіобіс-2-нітробензоату використовували для оцінки експресії цитохромів у популяціях клітин ЕЕК-М і ЕЕЕБ-Р, у той час як активність діафорази тестували з використанням солі нітросинього тетразолію.

Ко) Вибирають найбільш адаптований штам.

Приклад З

Додатковий приклад адаптації анаеробного мікроорганізму до окисненого середовища

Дотримувалися всіх стадій прикладу 1 до стадії одержання культури після першої інкубації, позначеної як "популяція Рі", вік якої становить приблизно 5 поколінь. Заморожені стоки із цієї партії позначали як РЕК-Р1.1 і ЕЕК-Р1.2. 2,5 мл ЕЕК-РІ11.1 висівали в новий реактор ЗНІКМ, що містить ЗВСМ 7,1//02. Пересівання продовжували до 6-ої субкультури, одержуючи ЕЕБ-Рб, і відповідну ЕЕК-Р зберігали на стадії кожної проміжної субкультури. На цій стадії концентрація цистеїну знижувалася до З мМ їі концентрація цистину підвищувалася до 5 мМ, у той час як окисний потенціал становив 600 мВ відносно Ад/Адсі.

Але в цьому прикладі З, у порівнянні із прикладом 1, цю стадію повторних посівів здійснювали всього до 10-0ої субкультури, зберігаючи всі умови постійними, при цьому для кожної субкультури використовували свіже середовище, як показано на фігурі 8.

Приклад 4

Селекція поліпшеного штаму із прикладу З

Різні ЕЕК-Р із прикладу З аналізують для селекції штаму, адаптованого до окисного середовища та кисню, який можна використовувати для подальшого одержання.

Селекція адаптованого штаму основана на наступних стадіях: а. На кожній стадії, представленій на фігурі 8, відбирали аліквоту 100 мкл. р. Зразок "стадії а" серійно розводили (до 103) у насиченому повітрям фосфатно-сольовому буфері (РВ5), як показано на фігурі 9, і інкубували в повітронепроникних посудинах при температурі навколишнього середовища. с. Посудини поміщали в анаеробну камеру і аліквотою 50 мкл висівали середовище УСЕАС (таблиця 4). а. Планшети інкубували анаеробно протягом 24-72 год. е. Після інкубації візуально оцінювали кількість життєздатних клітин.

Її. Залежно від морфологічного типу колоній, будь-який варіант, отриманий після поліпшення, вибирали і очищали класичним способом чистої культури. д. Адаптовані штами перевіряли на чистоту за допомогою забарвлювання за Грамом.

І. П'ять адаптованих штамів, вибраних на стадії ї, позначали як ТС51, І ТС5, 55, ОС5-1 і бо Ос05-2.

і Подробиці про виділені адаптовані штами, що включають відповідні умови і стадії виділення, надано в таблиці 2.

Попередня ідентифікація адаптованих штамів основана на забарвлюванні за Грамом, метаболічному фенотипуванні (профілях жирних кислот з коротким ланцюгом) і кількісної ПЛР (ДРСЕ) з використанням специфічних для РЕ. ргаизпіїгії праймерів.

К. Ідентифікацію штамів підтверджували за допомогою секвенування рибосомальної ДНК 165.

І. Толерантність до кисню і стабільність адаптованих штамів оцінювали, як показано на фігурі 10. Відповідні адаптовані штами анаеробно культивували в середовищі УСЕАС протягом 12-14 год. і серійно розводили до 10", 102, 103, 107 або 105. 100 мкл або 50 мкл серійно розведених культур висівали на чашках із середовищем УСЕАС у двох паралелях. Один набір чашок інкубували в анаеробних умовах і він служив як контроль, у той час як інший набір інкубували аеробно протягом 20 хв. Протягом 20 хв впливу навколишнього повітря кисень повністю дифундує в чашку з агаром, змінюючи її колір на рожевий. Індикатор окиснення- відновлення, барвник резазурин, що є безбарвним у відновленому стані, стає рожевим після окиснення. Це забезпечує повну дифузію кисню в культуральне середовище в чашці. Після відповідних обробок, зображених на фігурі 10, тестові і контрольні чашки інкубували в анаеробних умовах протягом 48-72 год. і візуально оцінювали кількість життєздатних клітин. т. Після підтвердження штаму за допомогою секвенування рибосомальної ДНК 165, вибирали адаптовані штами РЕ. ргаизпіїгії ТС51, 0С5-1 і 0С5-2 з урахуванням їх толерантності до кисню, і їх депонують відповідно до Будапештського договору в О5МА (І еірпі? Іп5ійшще ЮО5М2-

Септап СоПесіп ої Містоогдапізт5 апа СеїЇ Сипйигев5, ІппоМепвіг. 7В, 0-38124 Вгайпезспмеїа,

Септапу) під реєстраційними номерами О5М 32380, ОМ 32378 і О5М 32379, відповідно. п. Толерантність до кисню штаму типу РЕ. ргайзпіїгії, батьківського штаму і адаптованих штамів наведено в таблиці 3.

Таблиця 2:

Виділені адаптовані штами на різних циклах о ДКодштаму, 0 Повнаназва/////////// | Умовивиділення///З:

Таблиця 3:

Профілі стабільності адаптованих штамів після впливу повітря нІЬШИОВВООТИТИТЛТИТОИОЛВЛОЛЛТЛОТЛТЛИТИТВИТИТИТ СТИ 11111111 Анаєеробна | Аеробна 11111111 Кум (Еаесаїрасіейит ргаивпігі А2-165(05М 17677): | 008 | 0 (Еаесаїрасіейит ргаивпігі ЕВТ-22(05М32186)....-./ | 56507 | 0 «

Таблиця 4:

Середовище УСЕАС для Р. ргаизпіїлії 11Ї1т 1 мас! 77777771 Ї11109

МмозО.7НнО 77777771 111009

ШШШШЗЗШ

11111111 | о мкуло |Додавання після автоклавування

Стерилізація через фільтрацію

ЗШ

11111111 мМ |Додавання після автоклавування спропонато//////777777777777111Ї119

Скоректований кінцевий рН становить приблизно 7,2

ПРИКЛАД 5

Генетична характеризація поліпшених штамів

Поліпшені штами, отримані при кожному субкультивуванні в прикладі 1, охарактеризовують за допомогою секвенування нового покоління (МО5). ЕЕК-М і всі культури ЕЕК-Р піддають МО5 для ретельного геномного аналізу для виявлення будь-яких можливих мутацій, що виникають у потомства поліпшених/адаптованих ЕЕК-Р. Відмінності між штамами ЕЕК-М і БЕК-Р також досліджують на транскриптомному рівні за допомогою секвенування РНК.

ПРИКЛАД 6

Підвищена продукція анаеробного мікроорганізму

Умови одержання будуть включати оптимізовані умови, досягнуті в прикладі 1. Умови культивування мікроорганізмів із прикладу 2 будуть тими ж, що і у прикладі 1, але будуть включати лише одну стадію з фіксованими умовами окиснення, що включають напругу, пару цистеїн/цистин і приплив кисню.

Оптимізовані умови ферментації є наступними: мембранна перегородка, що має коефіцієнт переносу маси (Кот) кисню 1,3х10- см/с і швидкість дифузії кисню в анодну камеру приблизно 0,2 нмоль-мл'хв'", прикладена напруга 0,6 В щодо Ла/АасСі, цистеїн З мМ, цистин 5 мМ і початковий окисно-відновний потенціал середовища для вирощування 5ВСМ приблизно -188 мВ.

Стадію ферментації здійснюють в 150-літровій електрично ізольованій посудині, зробленій із пластикового матеріалу на основі фторполімеру, з потрійною конфігурацією камер. Фігура 4с.

Його висівали з використанням препарату, як у прикладі 2 вище.

Суспензію клітин при ферментації розділяють за допомогою центрифуги безперервної дії від

АМа Гама! і змішують зі стандартними кріопротекторами, як відомо в цій галузі. Стадію промивання здійснюють, щоб уникнути зниження точки замерзання при ліофілізації.

При ліофілізації суспензію клітин наливають на кожну чашку в ліофілізаторі. Суспензія клітин Раесаїїрасіегішт ргаийизпіїгії має вміст сухої речовини 18 95 і її ліофілізують протягом від чотирьох до п'яти днів.

В іншому випадку ферментацію та ліофілізацію мікроорганізму здійснюють, як відомо в цій галузі.

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб адаптації анаеробних мікроорганізмів і селекції більш толерантних до кисню анаеробних мікроорганізмів, що включає стадії культивування зазначених мікроорганізмів з поетапною подвійною індукцією оксидативного стресу за допомогою поетапного підвищення прикладеної напруги та дифузії кисню і поетапного зниження концентрації антиоксиданту в комбінації з поетапним підвищенням концентрації окисненого варіанта для зміни співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта для корекції окисно-відновного статусу, де концентрацію розчиненого кисню в середовищі для культивування підтримують на рівні сублетальної концентрації, при якій гинуть деякі, але не всі, мікроорганізми.

2. Спосіб за п. 1, у якому антиоксидант/окиснений варіант вибраний із групи, що складається із цистеїну/цистину, глутатіону/окисненого глутатіону, аскорбінової кислоти/дегідроаскорбату, дитіотреїтолу/окисненого дитіотреїтолу і галової кислоти/окисненої галової кислоти.

3. Спосіб за п. 1 або 2, у якому початкові умови для зазначеного способу вибрано з одного або декількох, або всіх з: низького або нульового припливу кисню, низької прикладеної напруги, високої концентрації антиоксиданту і низької концентрації або нульової концентрації окисненого варіанта і середовища для культивування, з якого вилучений кисень. Ко)

4. Спосіб за п. 3, у якому початкові умови вибрано з одного або декількох, або всіх з: 8 мМ цистеїну, 0 мМ цистину, прикладеної напруги 0,1 В і нульового або низького припливу кисню.

5. Спосіб за п. 4, у якому поетапну зміну продовжують до досягнення одного або декількох, або всіх 3: мінімальної концентрації цистеїну З мМ, максимальної концентрації цистину 5 мМ, максимальної прикладеної напруги 0,6 В і високого припливу кисню.

6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, у якому прикладена напруга не перевищує 0,6 В і/або концентрація цистеїну становить не менше З мМ, і/або концентрація цистину не перевищує 5

ММ.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який після завершення поетапної зміни включає одну або декілька додаткових стадій культивування зазначених мікроорганізмів у кінцевих умовах прикладеної напруги, дифузії кисню і співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта, що досягаються після поетапних змін, що необов'язково додатково включає стадії, на яких здійснюють додаткові поетапні зміни.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, у якому зазначений спосіб або додаткові стадії включають пересівання анаеробних мікроорганізмів у нові середовища для культивування, необов'язково в якому зазначені пересівання включають зазначені поетапні зміни умов культивування.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-8, у якому мікроорганізмами є Раєсаїїбасіегпит рга!имзпіїзії.

10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, який відрізняється тим, що включає додаткову стадію, на якій адаптовані штами піддають скринінгу на толерантність до кисню, і, необов'язково, продукцію бутирату і/або оцінку кінетики росту для селекції найбільш адаптованого штаму, переважно з підтримуваними метаболічними характеристиками.

11. Спосіб підвищеної продукції анаеробних мікроорганізмів, що включає адаптацію анаеробних мікроорганізмів і вибір більш стійких до кисню анаеробних мікроорганізмів способом за будь- яким із пп. 1-10 ії подальше культивування мікроорганізмів із використанням комбінації константи окисного потенціалу/прикладеної напруги, дифузії кисню та співвідношення концентрацій антиоксиданту/окисненого варіанта, який був оптимізований для виробництва адаптованих до кисню мікроорганізмів, при цьому концентрацію розчиненого кисню в середовищі для культивування підтримують на рівні сублетальної концентрації, таким чином, роблячи можливим селективний тиск і одержуючи високий вихід мікроорганізмів.

12. Спосіб за п. 11, у якому

(|) зазначені умови культивування включають З мМ цистеїну, 5 мМ цистину, прикладену напругу 0,6 В і приплив кисню 0,2 нмольхмл' хв"; і/або (і) зазначеним мікроорганізмом є Раєсаї/їрасіепит ргаизпіїгії.

13. Адаптований до кисню штам мікроорганізму для застосування як пробіотика, одержуваний способом за будь-яким із пп. 1-10, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм є штамом "Раєсаїїрасіелит ргайвпіїгії і де зазначений штам мікроорганізмів демонструє підвищений рівень толерантності до навколишнього повітря порівняно з вихідним або батьківським штамом, який не був виконаний адаптованим до кисню.

14. Штам Раеєсаїїрасієпит ргаиймзпіїгії для застосування як пробіотика, вибраний із групи, що складається з О5М 32380, О5М 32378 і О5М 32379. Приалив ник: ПО ям вт. ст Базчивений кишені Козчинений кисен» о ідифуя чярна слизову ДАК КК КК ке | с: х Рог ке ск З Живе я Коантиндейдратена оно Я ши ока шо В Пвисно-віднОовНний Фермену ї в З о 1 бюфасори КАОРНАЮНИМАЮНОВВ ЄВ ох 5 о ; ми ; в ОО ї 7 їх на МОХ ї ! ; че, Бе . З Цитокроми ГУ Ки : зиск лан зе Є ЕН. З пансндааи Ве Я Я в С ; і се . за ж МКК Х : пк соти кв ДЖ Ко и ВОК х З ірийофаввів, СН ще КЕ 1 с. ї ща ВЕД С ї пря о. с. ї уко свія мовні нема ЩЕ М поз с х ще І вис де кеемобітики У а ХЕ -шо0о:х попливе; МеТоВАи, ше ї салона куки, ї Зк Що 5 ; 5 г ПИШИ з механі дини ЕЗ роя Е: | і в ЩО з ий щи "дою ооо ооо ов, ТЕ й Вод пероксид жив радикала Пимененіивідновлев метіболітм збо ксевосютики Фіг

ОО ММ М МЛН НОНОБОООБОООООООООСИХОООООООООООООССООЕО І й пнно-віднодне активний лак ке я . й с й яке-ЯХ й со : ія КУ кНаЄТВ У и ЕН

Й і. кп В и док З то лю УКХ У и . с з в ПОД ван В м каш МЕН КЕ Я Е ще шт к х с . хе ЕК них Кк В С с 5 З СЯ МО В. Я ох хх З Я Кон В г о. . з с ща В ї о. я о Ву ї В о о Оу о ПАК КЕ

І. п і КУ ЗХ ОКХ х ОВ ПИ КИК, СУ ї ЕЙ В ОО АН | Е М МОХ ММА с ї з ЄМ ПИПИИКИЙИШИИ ТК ї ї і; ОО ПІШПЛІЙИИЕНИКИНИЕ . В вав нази Ї з | скщт Кк и що; КИ ГУ -- вв К и Пгроксини вих ас : К и гронсини вит ДОМОС етинніс . . фаааиаав В Метали ТС | . г ; сво фа я | В Кк пе МЕ й | В г Ріпак пакту, ВЕ й і. Кк ї з. КІЗ БІ вутав'язують заліза КО . г. М й КК й Б М З ОК с - у ї З ОО З Є Кк У КК в КК, СУ їх МОМ ОН КЕ х о у ОХ я хе УМО ВОМУ Ко У МНН ПКЕЕ Й Мо НН КН А Фіг Ферментатввнй шлах пробіотиків ЯК кину звикос Хм МАН НАХ У ОО КРУК. шия СН: - Хахецох ке І: с дн В ВВ ин КУ кни еВ х Й : М це : ше ВАНН МЕ і 5 Блектйени

: . ОВУ. зх дит Ме : - : форма пого У зн А ПЕрубАх НЕД ух Мне Н МК Ох п І сту й : Я кино: : ї зе У ЖОВ нт, : ШЕ як Мона мех ние : БУ СВК я в ен нар лх. : : Кох В ей фу: м щ : ВЕК, дея ТЕМІВНЕВ Зо ВЖК МАЮКОООК дя : й : : у Ко. т й і: : Ве Й тома о. мах грант : 1 АжЖевевнхх ан ин Ом : сонна ШИ Ше ее БИ й АННИ : АЦВК ши НН : ву ! Боже Ї ші Я самім ги Кіннвманоне М я : " Мові мо МАРК р : уп яй в і. Крах : її: 2» шен : і іПіаапннат «а : Ок сте ВІ, їЕ гий мае онов ; сн ЕМ вв ЗВИ-На ев х АВИТІ фз уже З х НН ОВНА й і Шо 14 : й 1 Ї Бипаве 0 АщеНо Я оерментм, ЗУТВИНІ ді окисвемна відновниния пккрЄВСКСОЮОС МНК КМИНОМ ОН нн о ОН НН ПКТ НВ ПО ОМ М НЕ 5» ння с ї ПК НН дя ох о

БИ . В НН ОО в НН с ТІ ж о с ЕНН КН ВХ ОН ее а КК КК ОКО с М о МО З В с ЗВ 1 7 ндедвохи бою В каподна аю вИМх «КА Фіг4ад Ммавн о Рабофлавів Феозницівній кан) КРеени Відновний ї ї ; ї ї . кущення потенція ї ї : : ї І потенціал БЗЖКЯ -ЕХ нЗ «МЕ с Переноєвикх електравів о Переноснини елентвонь ПОМ Н вх | ще з Ї вав - ШЕ однина ТТ дутодна камера! і Анодна намера з Н ії скатодна яамера: З Гпущек ї ж і БО ї ї Я ЛЮБОВ ї ЕЕ т КЕ ї шин с. ЖК ї й х х Щ відненаеняк . що : ! ОЗ я і и о в ОК чо 0 пе ешн Ох й ІЗ те вай ї . ЕН Е СХ ХХ йо дно ЕК в о я я иа ВСІ : Е 5 З орд юн Х сх ї ще й ї . й 5 вавтерівльна влітима КЕ ОН Е Зх ; ШЕ в Прафновнят з : - правив: :

о. Я» Жийні кислоти ана Х | : СОТНЯ її х пн в нн в БО сення й Мапівнронинна я Капсн-свлективна їі й раса й хаееабрана Фіг 4

Е ЖЕ Я Ж и их к : т дя «В КЗ ЗВО п с Еіднивний Ме я ХХ. ЩО в : ЗО Обов а з я Й ще -Е КО я ДУМ Б У позтомці хх РО Вени ЕЙ «т аю Ва ОВ ПЕ пстенціяя о Фо ВО» КО 5. Б Кф Ен ще Б Ех. я ЗВО І 0 - ефе й. п я СК дв ЕКО ПО чере ПЕ щкисний МОЯ п По г КК МВ тя Ки су . перевость ШОН Б ПЕН «кх я й ТЕ 3 пізтенціав Мисень КО ск ог І вх Од " КВ МОХ ПН СКК Я ОКО ОО ОКО с й ОО ЕК дних чККуХ ЖЕ ЕД; ВН М пане шо ЛЕТ я КОЛ : ШЕ : : клею. УКХ я ЩЕ : Н ЗОНУ моя р ХХХ с г КОКО

Я п.

о. Не о. її пноно о. в, УКХ : а - ще ОО ВО МАХ ХХ о МОУ Оу сх с с о. що ЕЕ. о п ха с о. сш хх СО КСО о З ЕК я ; с Ох МО "ОО дО З М ОКХ ОО ЗО я т с о с що нн Ох о. о. ХНУ ОО ООН я а ї шен о. їх АК . її х. Напівлров я Її й з В Ко пн Хо у . ХО вна Міуциноне Прах е за їзЕх іростонеос 7 КВАС ННЯ Гиврона Е й нах « занох УНН ма Миття м це і мемблина ФІ г,йе Я віяння Назьний Зв жовиї ЗСНННВІ рда «спини н нс Жувильце сер Й ЧеНЕЖКНКХ сищи, де середовище т Си сен приклади МК їх - УК пихпиденик ск їй АХ зарсевім І агудкух й пектрадкий потенці еденоя уекультува ще потанцеях ке о не ЩЕ ЕЗ5АУ кекаркування Тккв пеки агуркульту пт темаму ще ек ум купина Мо : : Звіт ще й : Як чксеен За субкулигув ПЕ : ХВУкЦнсти ЩО тура що й ви цисткнк ак луку ноя ІК : ЗАККХ цит пох УЖ по кидки . Фев й х я : й АЖ уже В сукуп пав : ЗУ ти ш на ше ЛИШ Й Й ПЕ ТИ Н ШОУ зідя дет сх Бо ствв низ «я КУКА ДИсТИх В й Шок ШОЕ й й й Ме шо и ВЕНОКВ ПЕН шк і й Е о. зугдиствйх сх памувки шк : Б Іі мл Й ПЕ ЕЕ : ПЕКИ СО пови маска ПО роя й : і що Здати ПЕВ : ЗО ке асубенечна ов ТК мук ПШШУ На щк о Бдоза бите зу те Ко : доз НО ана х Б ХО ІМВКуєьИй МЕНЕ й телеванянисті З аналах р дим це окулктуре й Й ост до км Високий ЗАТ знсчи а ХУ ; стани чесне КАК ПЕНАЛ Ви ЯК цисте, а х ї св Н Яленосі їй ком мист ю дики : пе Крему : о в й Зк ак Енн ПОВ сежвенування і: ува я ЩЕ темному Я 8 яв певних ме мені чкзви я піти :

НК І о КК сот поки о ТОК Я ОБ 0. пошко ТВО М І М М ОМ В В В по ВН КН КЕ їх з ХК ВХ НЕ с с с мона с 0. Х о Се с ОО ОО а ит не о ІА я М с 0. п В о Б п Б а ВН пт 1 Є дінокна кнвевй п шо о 5 ШИН мли ОО ПІТИ й яння ПИЛИ НЕМА Р Кат вал вия Ффіг.о

Е о Ша

ПООКХ ОО дер

КІ ОАмЛН НИК ПИ ЗХ и і; х.

З с о а КК В

З по КА Не НЕ ХХ г сш о о ОО в

0 1 І о с жк,

її

Во ЗК КО ВВ с М

С о о

Й Куздка камиса Й шо Фіг

Відновий уми Жраидьне новин 00 Овен евенродний . , ПОД МИН пот и віднос ВХ Низький ензвнз лена мк под ТНК сш я п виткі сх ШЖ ай МН МВВНУуЮЗнНя З - й ке хуВкуаьв ДЕ СК й : ММ пунк: шт ЩЕ МОЗ геному : ДМК манку 7 ї п пт Я их явку гура БО : Зам циотеВ па М : ЇМ) друем З пок : пох Здуувкрий рн дош : еВ зок ультуюа КЗ : есе хе. пит Ма : КО сСупкулетивування 0 ЯМЩ дної ще цк ше й ще ІК СИМ пише т КЕКВ с, : . ДЕ ї. ОО оо ЗМ ми дип ШЕ я зва тих ЩЕ - І ки таки ще пак Щ ОКХ мит ри ОКО БЕК я-ВУвкультемя Е : М ЗК КЕ цастийх полон а : ЗЕ ПЕТ ре 1 Ям ет Би вк : М ї Я че я зх х : ЖЖ ов еукувотвв ке | шен НЕ : суб ана ! що В ва ле й В й : Гидрвауних НУЄ т аналі хи шисц о Ї ня Жди о теному : х м НИКИ цевих - БЯ КЗ еВ о певпхаценеях : ТОНерВНТНаСк де яеСНККь Й Я щі М й шо : стання

«В. Ше шибкиль МОВ шив : плн Високий прийди вястюо й 9 Ожнові уки Щ

Фіг. 8 т Ки утиски сег ем у ще ря їх пу де ІК Кк Возчаненога кис в насвзенаму мін рям ВХ мнФгхкесенмесеммоеннннммнмммннмммммоХх КК ї58 НН щя а ет и Я ; а Ме ОО М хх ОХ їх УКХ . с х х х ЗХ ОК ОМ о. а . с: ОО М ЕНН ОО і ОК ММ ще кни нен Оп Ї, онкекнкнюкенкекессунтекокототекотосгосоонютотонеотогоосононоогоностоновноснозелоннмовнньмо іннтовція протя 0 хе ПО КОВО нх КОКО: ВН тя МК и КК ВИН Я С о В КК ЩЕ ЕН КК ХВ Пет ОМ М МДЖ. т тю п. ОО з щкЗ ДАТА ж шк Бо від КН ОК ЗВ ЗВ МО Я ЗХ окон ШХ ОО ЕЗ вовна: хх о т ЯН СЕ Ко КК ВЕ ї 5 5 Б ан с. . ОК ВВЕ : п У ОО Ко В с нн ні МНН

5 . Бо Ж хе ВЕ її 5. ух ЕХ ЗМ ПК І КОХ МОХ піде чемік інже знвераонеМм пек знкУуая 3

Фіг.