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TWI881004B - 用於治療ｈｂｖ之靶向ｈｂｖ的治療性寡核苷酸及ｔｌｒ７促效劑之醫藥組合 - Google Patents

用於治療ｈｂｖ之靶向ｈｂｖ的治療性寡核苷酸及ｔｌｒ７促效劑之醫藥組合 Download PDF

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Abstract

本發明係關於用於治療 B 型肝炎病毒感染之組成物及方法。特別而言，本發明係關於一種組合療法，該組合療法包含投予用於治療慢性 B 型肝炎患者之靶向 HBV 的治療性寡核苷酸及 TLR7 促效劑。

Description

用於治療　HBV　之靶向　HBV　的治療性寡核苷酸及　TLR7　促效劑之醫藥組合
本發明係關於用於治療B型肝炎病毒感染之組成物及方法。特別而言，本發明係關於一種組合療法，該組合療法包含投予用於治療慢性B型肝炎患者之靶向HBV的治療性寡核苷酸及TLR7促效劑。
HBV感染仍然是遍及全球之重要的健康問題，涉及估計3.5億慢性帶原者。可以預測大約25%的帶原者死於慢性肝炎、肝硬化或肝癌。B型肝炎病毒是僅次於菸草的第二大致癌物，佔所有原發性肝癌的60%至80%。
HBV的外套膜蛋白統稱為B型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg由三個相關的多肽組成，稱為S、M和L，其由重疊的開讀框(ORF)編碼。最小的套膜蛋白是具有226個胺基酸的S，稱為S-ORF。M和L由上游轉譯起始位產生並分別向S添加55和108個胺基酸。HBVS、M和L的醣蛋白存在於完整的傳染性HBV病毒粒子的病毒套膜中，被稱為Dane顆粒，且三種醣蛋白的產生和分泌都過多，形成發現與慢性HBV患者血液中的非感染性亞病毒之 球形和絲狀的顆粒(均稱為誘餌顆粒)。誘餌顆粒表面的大量HBsAg被認為抑制了慢性HBV感染(CHB)患者的體液免疫和自發清除。
當前用於慢性HBV感染的護理標準是使用口服核苷(酸)類似物(例如恩替卡韋(entecavir)或替諾福韋(tenofovir))進行治療，它們藉由抑制HBV DNA合成但並不直接作用於病毒抗原(例如HBsAg)來抑制HBV複製。核苷(酸)類似物，即使經過長期治療，也只能顯示出低水準的HBsAg清除率。在這方面，慢性B型肝炎患者表現出非常弱的HBVT細胞反應，並且缺乏抗HBs抗體，這被認為是這些患者無法清除病毒的原因之一。
臨床上重要的目標是實現對慢性HBV感染的功能性治愈，其定義為HBsAg血清轉化和血清HBV-DNA排除。預期這將導致持久的反應，從而防止肝硬化和肝癌的發展，並延長生存期。目前，由於作為被感染肝細胞核中的共價閉合環狀DNA(cccDNA)的病毒基因組長期或永久性的殘存，因此無法完全消除慢性HBV感染。要完全治愈慢性HBV感染，就需要從感染的肝細胞中排除這種cccDNA。
綜述文章Soriano等人2017年《研究藥物的專家意見》第26卷，第843頁描述了現行藥物開發的狀態是致力於達成功能性HBV治愈或完全治癒。本文著重介紹了目前正在HBV治療中測試的30多種藥物中的一些，同時提到任何有效的治愈方法都可能需要結合病毒靶向療法和免疫療法。
類鐸受體(toll-like receptor)TLR7是對病毒感染的先天免疫反應的組成部分，其主要在漿細胞和B細胞上表現。此類免疫細胞的反應性改變可能會導致慢性病毒感染期間先天免疫反應降低。因此，促效劑誘導的TLR7活化代表了使用免疫療法治療慢性病毒感染的一種可能的方法。一些TLR促效劑 正在臨床試驗中進行測試，包括GS-9620。替代的TLR7促效劑例如WO 2006/066080、WO 2016/055553及WO 2016/91698所述。
反義寡核苷酸基本上是單股寡核苷酸，其能夠藉由與目標核酸雜交來調節目標基因的表現。目標調節可以經由核糖核酸酶H介導的降解或藉由轉錄的封阻而調降。反義寡核苷酸還可以調升目標，例如經由剪接切換或微小RNA壓抑。對於肝臟中的目標，已證明GalNAc結合作用對於遞輸反義寡核苷酸非常有效。WO 2014/179627和WO2015/173208描述了HBV治療，其透過使用單股反義寡核苷酸結合GalNAc結合作用，來降解肝細胞中的HBV mRNA。WO2015/173208中簡要提及了各種組合療法，包括TLR7促效劑GS-9620。
WO2016/077321描述了HBV治療，其透過使用雙股siRNA結合有義股上的GalNAc結合作用，來降解肝細胞中的HBV mRNA。各種包括TLR7促效劑在內的組合療法已被簡要提及了。
據我們所知，尚未在體外或體內測試過治療性寡核苷酸和TLR7組效劑的特定組合。
本發明確認了靶向HBV的治療性寡核苷酸和TLR7促效劑之新穎組合，其就延長血清HBV-DNA降低和延遲HBsAg反彈而言，其提供了優於單一化合物治療的優勢。此外，由於當使用組合治療時，使用比單一治療中使用的藥物濃度低3至5倍的劑量即可獲得顯著改善效果，且使用比相同組合 之高劑量低3至5倍的劑量，組合治療可以達到基本上相同的效果，因此組合治療可以實現治療範圍的增加。
本發明之一方面是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物和第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物為治療性寡核苷酸，該第二醫學化合物為如下式(I)或式(II)所定義之TLR7促效劑。本發明一個優選的實施例是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物以及第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物為RNAi寡核苷酸，優選地為用於降低HBsAg mRNA表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為19至30個核苷酸的反義股，其中，該反義股包含與ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)中列出的HBsAg mRNA序列互補之區域，該二醫學化合物為如下式(I)或式(II)所定義之TLR7促效劑。本發明另一個實施例是醫藥組合，其包含或由第一醫學化合物以及第二醫學化合物所組成，該第一醫學化合物是反義寡核苷酸，優選地長度為13至22個核苷酸之GalNAc結合的反義寡核苷酸，其具有至少12個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與SEQ ID NO：1的位置1530至1602的連續序列100%互補，該第二醫學化合物為如下式(I)或式(II)所定義之TLR7促效劑。
式(I)及式(II)：
Figure 109145408-A0305-12-0004-1
其中，X為CH2或S； 針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
本發明的另一方面涉及用於治療HBV感染受試者的醫藥組合，特別是患有慢性HBV的受試者。
本發明的另一方面是治療性寡核苷酸用於製備治療B型肝炎病毒感染之第一藥物的用途，其中該第一藥物是如本申請中所述之治療性寡核苷酸，且其中將該第一藥物與第二藥物組合投予，其中該第二藥物是如本申請中所述之TLR7促效劑。
在一個實施例中，將治療性寡核苷酸化合物(第一藥物或第一醫學化合物)調製成用於皮下注射，並將TLR7促效劑化合物(第二藥物或第二醫學化合物)調製成用於口服投予。由於醫學化合物將透過兩種不同的投予途徑投予，因此它們可以遵循不同的投予方案。為了達到最佳的組合效果，第一和第二醫學化合物的投予間隔小於一個月，例如間隔小於一周，例如間隔兩天，例如在同一天。
本發明的另一方面是部件套組，其包括第一醫學化合物(第一藥物)和包裝插頁，其具有在HBV的治療中之第二醫學化合物(第二藥物)的投予說明。在一個實施例中，部分套組包含第一和第二醫學化合物兩者。
本發明的另一方面是用於治療B型肝炎病毒感染的方法，其包括將治療有效量之如本申請中所述的治療性寡核苷酸(第一藥物)，以及治療 有效量之如本申請中所述的TLR7促效劑(第二藥物)，組合投予感染B型肝炎病毒的個體，例如慢性感染的受試者。
在高度優選的實施例中，本申請中提及的治療性寡核苷酸是RNAi寡核苷酸，優選地為小干擾RNA(siRNA)，優選地為用於降低HBsAg mRNA表現的RNAi寡核苷酸或siRNA。在不同的實施例中，治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，優選地為GalNAc結合的反義寡核苷酸，優選地為靶向HBV的反義寡核苷酸或GalNAc結合的反義寡核苷酸。
圖1：說明示例性的反義寡核苷酸結合物，其顯示各種立體異構體，其中寡核苷酸以波浪線(A至D)或「寡核苷酸」(E至H和K)或T2(I至J)表示，且去唾液酸糖蛋白受體靶向結合物部分為三價N-乙醯半乳胺糖部分。化合物A至D包含二離胺酸支鏈分子、PEG3間隔基和三個末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A和B中，寡核苷酸不具有連接子(linker)，其係直接連附至靶向結合物部分的去唾液酸糖蛋白受體。在化合物C和D中，寡核苷酸經由C6連接子連附至靶向結合物部分的去唾液酸糖蛋白受體。化合物E至J包含市售的三支鏈分子(trebler brancher molecule)和不同長度和結構的間隔基以及三個末端GalNAc碳水化合物部分。化合物K由單體GalNAc亞磷醯胺組成，X=S或O，且n=1至3(參見WO 2017/178656)，其添加到寡核苷酸中但同時仍在固相支持物上作為合成的一部分。圖1B和1D在本文中也分別稱為GalNAc2或GN2，分別不具有和具有C6連接子。
圖2：CMP ID NO：29_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖3：CMP ID NO：23_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖4：CMP ID NO：16_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖5：CMP ID NO：15_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖6：CMP ID NO：15_2的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖7：CMP ID NO：26_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖8：CMP ID NO：20_1的結構式。其藥學的鹽包括單價或二價陽離子，例如Na+、K+和Ca2+或這些與化合物結合的混合物。
圖9：顯示各種單一和組合治療對AAV/HBV小鼠血清中HBV-DNA的影響。圖A：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每隔一天(QOD)以100mg/kg的劑量投予(虛線；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。圖B：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每週(QW)以100mg/kg的劑量投予(虛線，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。圖C：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每隔一天(QOD)以100mg/kg的劑量投予(虛線；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg 的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。圖D：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每週(QW)以100mg/kg的劑量投予(虛線，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。
圖10：顯示各種單一和組合治療對AAV/HBV小鼠血清中HBsAg的影響。圖A：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每隔一天(QOD)以100mg/kg的劑量投予(虛線；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。圖B：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每週(QW)以100mg/kg的劑量投予(虛線，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後的小鼠。圖C：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每隔一天(QOD)以100mg/kg的劑量投予(虛線；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。圖D：用食鹽水(媒液，虛線和圓圈)；CMP ID NO：VI(TLR7促效劑)，每週(QW)以100mg/kg的劑量投予(虛線，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg的劑量給藥(虛線；三角形)；或兩者的組合(實線和正方形)治療後。
圖11：在HBV基因組組織的示意圖上顯示RNAi目標位的實例。
圖12：顯示用於降低HDI小鼠中HBsAg表現之寡核苷酸的單一劑量評估。
圖13：顯示使用靶向HBsAg的寡核苷酸的指定給藥方案期間，血漿HBsAg水準隨時間變化的圖示。如該實例中所示，寡核苷酸顯示出臨床前的效力，並且在給藥期間後仍保持減少的水準。
圖14：顯示的圖表描述了使用報告測定法(reporter assay)在HeLa細胞中進行HBsAg作圖的結果。靶向HBV基因組之位置254的未修飾siRNA，在指定濃度下，用以作為正調控。由市售的Thermo Fisher的Silencer siRNA作為這些實驗的負調控。誤差線代表SEM。
圖15：顯示基因型保守性比較，其顯示在靶向HBsAg的寡核苷酸(HBV-219)中經設計的錯配，增加HBV基因型中的覆蓋率。
圖16：說明為psiCHECK2報告測定法設計的載體，使用HBV基因型A作為原型序列。
圖17：顯示一些寡核苷酸的實例，該寡核苷酸被設計來以評估導入錯配的影響。針對親代和錯配股的寡核苷酸序列在框中對齊且具有錯配位置顯示。進一步描述在psiCHECK2報告測定法中使用之對應的報告序列。
圖18：顯示在錯配研究中評估寡核苷酸的單一劑量滴定圖，其說明在體內可耐受引導股中的錯配。
圖19：顯示體內的劑量滴定圖，其說明對靶向HBsAg的寡核苷酸中錯配的併入，不會對體內效力產生不利的影響。
圖20：顯示具有化學修飾且呈雙股螺旋形式之靶向HBsAg的寡核苷酸(HBV(s)-219)的實例。較深的陰影表示2’-O-甲基核糖核苷酸。較淺的陰影表示2’-氟-去氧核糖核苷酸。
圖21A：描述免疫組織化學染色的結果，其檢測肝細胞中HBV核心抗原(HBcAg)的次細胞分佈。
圖21B：描述RNA定序結果，其將檢測到之針對HBV pgRNA的RNA轉錄序列作圖。
圖22A：描述在HBV的流體動力學注射(HDI)模型中，與媒劑調控和靶向HBV X抗原(HBxAg)mRNA的RNAi寡核苷酸相比，使用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前驅物HBV(s)-219P2治療後之HBsAg mRNA表現的時間進程。
圖22B：描述在AAV-HBV模型中，與媒劑調控和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸相比，使用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前驅物HBV(s)-219P2治療後之HBsAg mRNA表現的時間進程。
圖23：顯示免疫組織化學染色的結果，該結果顯示肝細胞中HBcAg的次細胞分佈，與媒劑調控和靶向HBxAg mRNA(GalXC-HBVX)的RNAi寡核苷酸相比，該肝細胞是取自使用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸治療後的HBV的AAV-HBV模型和HDI模型。
圖24A-24D：顯示在PXB-HBV模型中，HBV(s)-219前驅物1(HBV(s)-219P1)的抗病毒活性。向9隻小鼠的分群皮下投予3週劑量為0或3mg/kg的HBV(s)-219P1PBS溶液。在所示的每個時間點(圖24A和24B)，藉由非末端下頜頰出血(non-terminal mandibular cheek bleeds)分析來自每個分群之六隻小鼠的血清HBsAg和血清HBV DNA。在第28天(從HBV(s)-219P1的第一劑開始)，對所有剩餘的小鼠實施安樂死，並收集肝臟生檢以藉由RT-qPCR看肝的HBV DNA(圖24C)和肝的cccDNA(圖24D)。
圖25A-25C：顯示HBV(s)-219前驅物2(HBV(s)-219P2)增強了恩替卡韋的抗病毒活性。在HBV小鼠流體動力學注射(HDI)模型中，在第1天皮下投予小鼠單一劑量之HBV(s)-219P2，之後每天透過口服投藥500ng/kg的恩替卡韋(ETV)，持續14天。藉由qPCR測量循環病毒量(HBV DNA)(圖25A)。藉由 ELISA測量血漿HBsAg水準(圖25B)。藉由qPCR測量肝臟HBV mRNA和pgRNA水準(圖25C)。結果顯示組合療法具有明顯的累加效果。單獨的ETV療法顯示對循環HBsAg或肝臟病毒RNAs無效。藉由HBsAg或HBV RNA測量之HBV(s)-219P2的抗病毒活性，不受ETV共同給藥的影響。「BLOD」是指「低於檢測極限」。
圖26A-26B：顯示靶向S抗原(HBV(s)-219P2)或X抗原(命名為GalXC-HBVX)之GalNac結合的寡核苷酸之HBsAg抑制活性的比較。結果顯示，與GalXC-HBVX或兩種RNAi試劑的等莫耳組合相比，HBVS-219P2抑制HBsAg的持續時間更長。圖26A顯示RNAi目標位在HBV基因組中的位置，會影響表現HBV之小鼠的HBsAg恢復動力學。圖26B顯示投藥後2週(左圖)和投藥後9週(右圖)的血漿HBsAg水準，說明靶向HBVX編碼區域(單獨或與HBV(s)-219P2組合)可縮短活性持續時間。顯示受試者動物數據。幾個數據點(最淺的灰色圓圈)低於檢測極限。
圖27A-27C：顯示在用HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1：1組合來治療表現HBV的小鼠中，HBV核心抗原(HBcAg)的次細胞位置。圖27A顯示肝臟切片中代表性的肝細胞，其在投予後第1、2、6、9和13週取得，並對HBcAg染色。圖27B顯示每隻動物中核染色之HBcAg陽性細胞的百分比(n=3/組，在給藥後2週，每隻動物計數50個細胞)。設計並測試具有靶向X和S開讀框內的替代序列。圖27C顯示肝細胞中HBcAg的次細胞分佈，該肝細胞是在投予靶向S抗原或X抗原的替代RNAi寡核苷酸後之第2、3和9週取得的。
圖28：顯示分群劑量資訊，其是為了評估在健康患者中HBV(s)-219的安全性和耐受性，以及在HBV患者中HBV(s)-219的治療功效所設計的研究。
圖29A-29B：顯示HBV(s)-219和HBV(s)-219P2的化學結構。(圖29A)HBV(s)-219的化學結構。(圖29B)HBV(s)-219P2的化學結構。
圖30：顯示HBV-LNA(CMP ID NO：15_1，如本發明所述之反義寡核苷酸)和DCR-S219(如本發明所述之RNAi寡核苷酸，特別是siRNA)隨時間降低HBsAg力價的效果。「DCR-AUD1」(靶向HBV以外之序列的對照siRNA)和「媒液」(無菌水)是負調控。圖30中的HBV-LNA劑量為6.6mg/kg，而DCR-S219的劑量為9mg/kg，但HBV-LNA的莫耳劑量約為DCR-S219的劑量的三倍。
定義
寡核苷酸
本文所用的術語「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連接核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中製作，先經固相化學合成後再加以純化和分離。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連接核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如2’糖修飾核苷。
此外，寡核苷酸是短核酸，例如，長度為小於100個核苷酸。寡核苷酸可以是單股或雙股。寡核苷酸可以具有或可以不具有雙股螺旋區域。舉一組非限制性的實例，寡核苷酸可以是但不限於小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、切丁酶底物干擾RNA(dsiRNA)、反義寡核苷酸、短siRNA或單股siRNA。在一些實施例中，雙股寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
合成
如本文所使用，術語「合成物(synthetic)」是指人工合成的核酸或其他分子(例如，使用機器(例如，固相核酸合成儀))，或不是由其他通常產生該分子之天然來源(例如，細胞或生物體)所獲得的核酸或其他分子。
雙股寡核苷酸
如本文所使用，術語「雙股寡核苷酸(double-stranded oligonucleotide)」是實質呈雙股螺旋形式的寡核苷酸。在一些實施例中，在共價分離的核酸股之核苷酸的反向平行序列之間，形成雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，在共價連接的核酸股之核苷酸的反向平行序列之間，形成雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對。在一些實施例中，雙股寡核苷酸之雙股螺旋區域的互補鹼基配對是由單一核酸股形成，該單一核酸股是折疊的(例如，經由髮夾)，以提供鹼基配對在一起之核苷酸的互補反向平行序列。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含彼此完全雙股螺旋的兩條共價分離的核酸股。然而，在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分雙股螺旋的兩條共價分離的核酸股，例如，在一個或兩個末端具有突出。在一些實施例中，雙股寡核苷酸包含部分互補之核苷酸的反向平行序列，因此可以具有一個或多個錯配，其可以包括內部錯配或末端錯配。
股
如本文所使用，術語「股」是指透過核苷酸間鍵聯(例如，磷酸二酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯)連接在一起之核苷酸的單一連續序列。在一些實施例中，一股具有兩個自由端，例如5'端和3'端。
雙股螺旋
如本文所使用，關於核酸(例如，寡核苷酸)的術語「雙股螺旋」是指透過核苷酸的兩個反向平行序列的互補鹼基配對形成的結構。
突出
如本文所使用，術語「突出(overhang)」是指末端非鹼基配對核苷酸，其由延伸超過互補股之末端的一股或一個區域所形成，該一股或一個區域與該互補股形成雙股螺旋。在一些實施例中，突出包含從雙股寡核苷酸的5'末端或3'末端的雙股螺旋區域延伸的一個或多個未配對的核苷酸。在某些實施例中，突出是在雙股寡核苷酸的反義股或有義股上的3'或5'突出。
環圈
如本文所使用，術語「環圈(loop)」是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配對區域，其側翼為核酸的兩個彼此充分互補的反向平行區域，從而在適當的雜交條件下(例如，在磷酸鹽緩衝液中、在細胞中)，兩個反向平行區域(為未配對區域的側翼)雜交形成雙股螺旋(稱為「主幹」)。
RNAi寡核苷酸
如本文所使用，術語「RNAi寡核苷酸(RNAi oligonucleotide)」是指(a)具有有義股(隨從)和反義股(引導)的雙股寡核苷酸，其中藉由Argonaute 2(Ago2)核酸內切酶使用該反義股或部份的該反義股分切割目標mRNA，或(b)具有單獨反義股的單股寡核苷酸，其中藉由Ago2核酸內切酶使用該反義股(或部分的該反義股)切割目標mRNA。
RNAi試劑
本文中可互換使用的術語「iRNA」、「RNAi試劑(RNAi agent)」、「iRNA試劑(iRNA agent)」和「RNA干擾劑(RNA interference agent)」，是指一種試劑(例如，RNAi寡核苷酸)，在本文中，該試劑包含RNA核苷並經由RNA誘導型緘默化複合體(RISC)途徑，中介RNA轉錄本之靶向切割。iRNA透過稱為RNA干擾(RNAi)的過程引導mRNA的序列特異性降解。iRNA調節(例如抑制)細胞中目標核酸的表現，例如哺乳動物個體的 細胞中。RNAi試劑包括單股RNAi試劑和雙股siRNA，以及小髮夾RNAs(shRNAs)。本發明的寡核苷酸或其連續核苷酸序列可以是RNAi試劑的形式，或者是RNAi試劑的一部分，例如siRNA或shRNA。在本發明的一些實施例中，本發明的寡核苷酸或其連續核苷酸序列是RNAi試劑，例如siRNA。
siRNAs
術語siRNA是指小干擾核糖核酸RNAi試劑，是一類雙股RNA分子，在本領域中也稱為短干擾RNA或緘默化RNA。siRNAs通常包含有義股(也稱為隨從股)和反義股(也稱為引導股)，其中每股的長度為17至30個核苷酸，通常長度為19至25個核苷，其中反義股與目標核酸(合適地是成熟的mRNA序列)互補(例如完全互補)，且有義股與反義股互補，使得有義股和反義股形成雙股螺旋或雙股螺旋區域。siRNA股可形成鈍端雙股螺旋，或有利地，正義和反義股的3'端可形成例如1、2或3個核苷的3'突出。在一些實施例中，有義股和反義股均具有2nt 3'突出。因此，雙股螺旋區域的長度可以為例如17至25個核苷酸，例如21至23個核苷酸。
一旦進入細胞內，反義股就被併入RISC複合體中，該複合物中介目標核酸的目標降解或目標抑制。siRNAs除了RNA核苷外，通常還包含經修飾的核苷，或者在某些實施例中，可以修飾siRNA股的所有核苷酸(可以將正義2'糖修飾的核苷，例如LNA(參見WO2004083430、WO2007085485為例))、2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基併入siRNAs)。在一些實施例中，siRNA的隨從股可以是不連續的(參見WO2007107162為例)。已經報導了在siRNA之反義股的種子區域(seed region)中出現的熱不穩定核苷酸的併入，對於降低siRNA的脫靶活性是有用的(參見WO18098328為例)。
在一些實施例中，dsRNA試劑，例如本發明的siRNA，包含至少一個經修飾的核苷酸。在一些實施例中，有義股之實質上所有核苷酸均包含 修飾；反義股之實質上所有核苷酸均包含修飾；或有義股之實質上所有核苷酸和反義股之實質本上所有核苷酸均包含修飾。在其他實施例中，有義股之所有核苷酸均包含修飾；反義股之所有核苷酸均包含修飾；或有義股之有核苷酸和反義股之所有核苷酸均包含修飾。
在一些實施例中，修飾的核苷酸可獨立地選自由以下各項組成之群組或其組合：去氧核苷酸、3’-末端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、經2'-O-甲基修飾的核苷酸、經2'-氟修飾的核苷酸、經2'-去氧修飾的核苷酸、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、構型上限制的核苷酸、受拘乙基核苷酸、無鹼基的核苷酸、經2'-胺基修飾的核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、經2'-C-烷基修飾的核苷酸、經2'-羥基修飾的核苷酸、經2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、經2'-O-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸的非天然鹼基、未連接的核苷酸、經四氫哌喃修飾的核苷酸、經1,5-去水己糖醇修飾的核苷酸、經環己烯基修飾的核苷酸、包含硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含5'-磷酸鹽的核苷酸、包含5'-磷酸模擬物的核苷酸、經乙二醇修飾的核苷酸和經2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾的核苷酸。適當地，siRNA在反義股的5'端包含5'磷酸基團或5'-磷酸模擬物。在一些實施例中，反義股的5'端是RNA核苷。
在一個實施例中，dsRNA試劑還包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。硫代磷酸酯或甲基磷酸酯的核苷酸間鍵聯可以在一或兩股的3’-末端(例如，反義股；或有義股)上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷間鍵聯可以在一或兩股的5’-末端(例如，反義股；或有義股)上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷間鍵聯可以在一或兩股的3’-末端及5’-末端兩者(例如，反義股；或有義股)上。在一些實施例中，剩餘的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。
dsRNA試劑可以進一步包含配體。在一些實施例中，該配體結合至有義股的3’端。在生物學分佈，例如，可將siRNA結合至靶向配體及/或調製成脂質奈米顆粒。
本發明的其他方面涉及包含這些dsRNA的醫藥組成物，例如適合治療用途的siRNA分子，以及藉由投予dsRNA分子(例如本發明的siRNA)來抑制目標基因表現的方法，例如用於治療本文所揭露之各種疾病狀況。
四鹼基環圈
如本文所使用，術語「四鹼基環圈(tetraloop)」是指藉由核苷酸之兩旁序列的雜交，形成增加相鄰雙股螺旋之穩定性的環。穩定性的增加是可檢測到的，由於相鄰的主幹雙股螺旋(adjacent stem duplex)之熔解溫度(Tm)的升高，比一組可比長度的環所預期之相鄰的主幹雙股螺旋之平均Tm高，該可比長度之環是由隨機選擇的核苷酸序列所組成的。例如，在10mM NaHPO4中，四鹼基環圈可以賦予包含至少2個鹼基對長度之雙股螺旋的髮夾至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的熔解溫度。在一些實施例中，四鹼基環圈可藉由堆疊的相互作用來穩定相鄰之主幹雙股螺旋中的鹼基對。另外，四鹼基環圈中核苷酸之間的相互作用包括但不限於非瓦特生克立克鹼基配對(non-Watson-Crick base-pairing,)、堆疊的相互作用、氫鍵和接觸相互作用(Cheong等人，Nature 1990年8月16日，346(6285)：680-2；Heus和Pardi，Science 1991年7月12日，253(5016)：191-4)。在一些實施例中，四鹼基環圈包含4至5個核苷酸。在某些實施例中，四鹼基環圈包含或由三、四、五或六個核苷酸所組成，該核苷酸可以被或可以不被修飾(例如，可以與或可以不與靶向部分結合)。在一個實施例中，四鹼基環圈由四個核苷酸組成。在四鹼基環圈中可以使用任何核苷酸，此類核苷酸 可以使用的標準IUPAC-IUB符號如Cornish-Bowden(1985)，Nucl.Acids Res.，13，3021-3030中所述。例如，字母「N」可以用來表示任何鹼基都可以在該位置，字母「R」可以用來表示A(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)可以在該位置，而「B」可用於表示C(胞嘧啶)、G(鳥嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在該位置。四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈的UNCG家族(例如，UUCG)、四鹼基環圈的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四鹼基環圈(Woese等人，Proc Natl Acad Sci USA，1990年11月，87(21)，8467-71；Antao等人，Nucleic Acids Res，1991年11月11日，19(21)：5901-5)。DNA四鹼基環圈的實例包括四鹼基環圈的d(GNNA)家族(例如d(GTTA))、四鹼基環圈的d(GNRA)家族、四鹼基環圈的d(GNAB)家族、四鹼基環圈的d(CNNG)家族和四鹼基環圈的d(TNCG)家族(例如d(TTCG))。參見，例如：Nakano等人，Biochemistry，41(48)，14281-14292，2002年。SHINJI等人，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu，第78卷，第2期，第731頁(2000)，其相關公開內容藉由引用併入本文。在一些實施例中，四鹼基環圈包含在帶切口的四鹼基環圈結構內。
「帶切口的四鹼基環圈結構」
「帶切口的四鹼基環圈結構(nicked tetraloop structure)」是RNAi寡核苷酸的結構，其特徵在於存在分離的正義(隨從)和反義(引導)股，其中有義股具有與反義股互補之區域，且其中至少一股(通常是有義股)具有四鹼基環圈，該四鹼基環圈經組態以穩定在該至少一股中所形成之相鄰的主幹區域。
反義寡核苷酸
本文所用的術語「反義寡核苷酸」的定義是能夠藉由與目標核酸雜交而調節目標基因之表現的寡核苷酸，其所雜交的對象具體而言是目標核 酸上的連續序列。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是siRNA或shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應理解的是，只要在寡核苷酸全長內或全長間，自我互補性低於50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙股螺旋結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙股螺旋)。
有利的是，本發明之單股反義寡核苷酸不包含RNA核苷，因為這樣會降低核酸酶抗性。
有利的是，本發明之反義寡核苷酸含有一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如2’糖修飾核苷。此外，有利的是，所述未經修飾的核苷是DNA核苷。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」意指寡核苷酸的與目標核酸互補的區域。在本文中，該術語可與「連續核鹼基序列」和「寡核苷酸模體序列」交替使用。在某些實施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸構成所述連續核苷酸序列。在某些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列，例如F-G-F’缺口體區域，且可隨選包含其他核苷酸，例如可用於將官能基團附加至該連續核苷酸序列的核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與目標核酸互補或不互補。應當理解的是，寡核苷酸的連續核苷酸序列不能比寡核苷酸本身長，且寡核苷酸不能短於連續核苷酸序列。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中包括自然產生及非自然產生核苷酸。在本質上，例如DNA及RNA核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根(核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
去氧核糖核苷酸
如本文所使用，術語「去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)」是指與核糖核苷酸相比，在其五碳糖的2'位置具有氫代替羥基的核苷酸。經修飾的去氧核糖核苷酸是在2'位置以外，具有一個或多個原子之修飾或取代的去氧核糖核苷酸，包括在糖、磷酸基或鹼基中的修飾或取代，或者包含糖、磷酸基或鹼基的修飾或取代。
核糖核苷酸
如本文所使用，術語「核糖核苷酸(ribonucleotide)」是指具有核糖作為其五碳糖的核苷酸，其在其2'位置含有羥基。經修飾的核糖核苷酸是在2'位置以外，具有一個或多個原子之修飾或取代的核糖核苷酸，包括在核糖、磷酸基或鹼基中的修飾或取代，或者包含核糖、磷酸基或鹼基的修飾或取代。
修飾核苷
本文中所用的術語「修飾核苷」或「核苷修飾」意指藉由導入糖部分或(核)鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等DNA或RNA核苷進行修飾的核苷。於一較佳實施例中，所述修飾核苷包含修飾糖部分。術語經修飾之核苷在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾DNA或RNA糖部分的核苷稱為DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克(Watson Crick)鹼基配對，則大體上仍稱為DNA或RNA。
經修飾的核苷酸
如本文所使用，術語「經修飾的核苷酸(modified nucleotide)」是指與選自以下相應之參考核苷酸相比，具有一種或多種化學修飾的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤去氧核糖核苷酸、鳥嘌呤去氧核糖核苷酸、胞嘧啶去氧核糖核苷酸及胸腺嘧啶去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾的核苷酸是非自然產生 的核苷酸。在一些實施例中，經修飾的核苷酸在其糖、核鹼基及/或磷酸基團中具有一個或多個化學修飾。在一些實施例中，經修飾的核苷酸具有一個或多個化學部分結合至相應的參考核苷酸。通常，經修飾的核苷酸給予其中存在經修飾之核苷酸的核酸一個或多個所需的特性。例如，經修飾的核苷酸可以改善熱穩定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解性、生體可用率、生物活性、降低的免疫原性等。
經修飾之核苷間鍵聯
術語「經修飾之核苷間鍵聯」，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯(PO)鍵聯以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵聯。因此本發明之寡核苷酸可包含修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，所述修飾核苷間鍵聯可使寡核苷酸的核酸酶抗性相較於磷酸二酯鍵聯增加。就自然產生寡核苷酸而言，核苷間鍵聯包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵結的磷酸根。經修飾的核苷間鍵聯特別能夠穩定寡核苷酸，利於體內使用，且可防於止在本發明之寡核苷酸中，在DNA或RNA核苷區域發生核酸酶切割的情形，例如在缺口體寡核苷酸的缺口區域G內，以及在經修飾的核苷區域內，例如區域F及F’。
在一個實施例中，寡核苷酸包含經天然磷酸二酯修飾的一個或多個核苷間鍵聯，例如對核酸酶攻擊更具抗性的一個或多個經修飾的核苷間鍵聯。核酸酶抗性可以藉由在血清中培養寡核苷酸，或藉由使用核酸酶抗性測定法(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))來確定，這都是本領域眾所周知的。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性的核苷間鍵聯稱為核酸酶抗性核苷間鍵聯。在某些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少50%的該核苷間經修飾，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少60%，例如至少70%，例如至少75%，例如至少80%或例如至少90%的該鍵聯核苷間鍵聯經修飾。在某些實 施例中，修飾範圍包括所述寡核苷酸的全部所述核苷間鍵聯或其連續核苷酸序列。應知在某些實施例中，將本發明之寡核苷酸連結至例如結合物等非核苷酸功能基團的核苷可為磷酸二酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列的全部所述核苷間鍵聯皆為抗核酸酶核苷間鍵聯。
有利的是在本發明之寡核苷酸中使用硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
硫代磷酸酯核苷間鍵聯由於具有核酸酶抗性、優良藥物動力學且易於製造，因此特別適用。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少50%的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少60%，例如至少70%，例如至少75%，例如至少80%或例如至少90%的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸除了包含二硫代磷酸酯鍵聯外，還包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯和至少一個磷酸二酯鍵聯，例如2、3或4個磷酸二酯鍵聯。在缺口體寡核苷酸中，當存在磷酸二酯鍵聯時，該磷酸二酯鍵聯適當地不位於缺口區域G中的連續DNA核苷之間。
核酸酶抗性鍵聯(例如硫代磷酸酯鍵聯)在寡核苷酸區域中特別有用，其在與目標核酸形成雙股螺旋時能夠招募核酸酶，例如缺口體的區域G中。然而，硫代磷酸酯鍵聯也可用於非核酸酶招募區及/或親和力增強區，如缺口體的區域F和F'。在一些實施例中，缺口體寡核苷酸可在區域F或F'，或區域F和F'兩者中，包含一個或多個磷酸二酯鍵聯，其中在區域G中的所有核苷間鍵聯可為硫代磷酸酯。
有利的是，所述寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或所述寡核苷酸的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯 鍵聯。特別是，該反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或該反義寡核苷酸的所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。
應當理解的是，如EP 2 742 135中所揭露，治療性寡核苷酸可包含其他核苷間鍵聯(磷酸二酯及硫代磷酸酯除外)，例如磷酸烷酯/磷酸甲酯核苷間連結，其依據EP 2 742 135可例如耐受於缺口區域中不同狀態之DNA硫代磷酸酯。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，術語核鹼基亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變異體。此類變體例如是Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055以及Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中所描述的變異體。
在某些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為經修飾的嘌呤或嘧啶而經修飾，例如被取代的嘌呤或被取代的嘧啶，例如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可隨選包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在 例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。隨選的是，5-甲基胞嘧啶LNA核苷可用於LNA缺口體。
經修飾之寡核苷酸
術語經修飾之寡核苷酸描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵聯的寡核苷酸。有些文獻中使用的術語「嵌合(chimeric)」寡核苷酸來描述具有經修飾核苷的寡核苷酸。
互補性
如本文所用，「互補(complementary)」是指兩個核苷酸之間的結構關係(例如，在兩個相對的核酸上或在單一核酸股的相對區域上)，或在兩個核苷酸序列之間，其允許兩個核苷酸或兩個核苷酸序列彼此形成鹼基對。舉例而言，與相對核酸之嘧啶核苷酸互補的核酸之嘌呤核苷酸，可以藉由彼此形成氫鍵將鹼基配對在一起。在一些實施例中，互補的核苷酸可以以瓦特生克立克方式或以允許形成穩定雙股螺旋的任何其他方式將鹼基配對。瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基對是鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此术語互補性包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基配對(見例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055以及Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
本文所使用的術語「%互補(% complementary)」是指核酸分子(例如寡核苷酸)中的連續核苷酸序列中與參考序列(例如標靶序列或序列模體)互補之核苷酸所佔的比例(百分比)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。因此，互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補(例如形成瓦特生克立克鹼基對)之對齊核鹼基(當對齊於標靶序列5’-3’及寡核苷酸序列從3’-5’) 的數目，將該數字除以該寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以100。在該等比對中，未對齊(例如形成鹼基對)的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的%互補性時不可進行插入和刪除。應當理解的是，在判定互補性時，只要在形成例如瓦特生克立克鹼基配對時能保持核鹼基的功能，即可不考量核鹼基的化學修飾(例如在計算%相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
術語「完全互補」意指具有100%互補性。
以下是與HBV轉錄物之區域完全互補的連續核苷酸序列的實例。
以下是與HBV目標區域(SEQ ID NO：28)完全互補的連續核苷酸序列(SEQ ID NO：6)的實例。
Figure 109145408-A0305-12-0025-2
在一些實施例中，兩個核酸可具有多個彼此互補的多核苷酸區域，以形成如本文所述的互補性區域。
互補之區域
如本文所使用，術語「互補之區域(region of complementarity)」是指核酸的核苷酸序列(例如，雙股寡核苷酸)，其與核苷酸的反向平行序列充分互補，以允許兩個核苷酸序列之間在適當的雜交條件下(例如在磷酸鹽緩衝液、在細胞等中)雜交。
相同度
本文所使用的術語「相同度(Identity)」是指核酸分子(例如寡核苷酸)中的連續核苷酸序列中與參考序列(例如序列模體)相同的核苷酸所佔的比例(以百分比表示)，該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列(在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在 參考序列中)之間相同(為一個匹配)的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以100。因此，相同度百分比=(匹配數x 100)/對齊區域(例如連續核苷酸序列)長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時，不可進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾(例如在計算%相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的術語「雜交」是指兩股核酸(例如一股寡核苷酸及一股目標核酸)在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙股螺旋。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度(Tm)來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與目標核酸形成雙股螺旋時的溫度。在生理條件下，Tm並非完全地與親和力成比例(Mergny與Lacroix,2003年，Oligonucleotides 13：515-537)。標準狀態吉布斯自由能ΔG°更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數(Kd)之間具有ΔG°=-RTln(Kd)的關係，其中R是氣體常數，而T是絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間反應的非常低的ΔG°體現所述寡核苷酸與目標核酸之間的強勢雜交。ΔG°是與含水濃度為1M、pH為7、溫度為37℃的反應關聯的能量。寡核苷酸與目標核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的ΔG°小於零。ΔG°可經由實驗來測量，例如，利用如Hansen等人1965年在Chem.Comm.36-38及Holdgate等人2005年在Drug Discov Today中所描述的等溫滴定微量熱法(ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量ΔG°的商用設備。ΔG°亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用SantaLucia於1998年在Proc Natl Acad Sci USA.95：1460-1465中所描述的最近鄰模型或利用Sugimoto等人於1995年在Biochemistry 34：11211-11216中及McTigue等人於2004年在Biochemistry 43：5388-5405中所描述的適當取得的熱 動力學參數。為了能夠經由雜交調節本發明之寡核苷酸的預期核酸目標，將長度為10-30個核苷酸的寡核苷酸以低於-10千卡的估計ΔG°值雜交至目標核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能ΔG°來測量。長度為8至30個核苷酸的寡核苷酸可以低於-10千卡範圍的估計ΔG°值雜交至目標核酸，例如低於-15千卡，例如低於-20千卡，及例如低於-25千卡。在某些實施例中，寡核苷酸以-10至-60千卡，例如-12至-40千卡，例如自-15至-30千卡或-16至-27千卡，例如-18至-25千卡的估計ΔG°值雜交至目標核酸。
目標核酸
依據本發明，目標核酸是將B型肝炎病毒編碼的核酸，且可為例如基因、RNA、mRNA、病毒mRNA或cDNA序列。目標核酸由SEQ ID NO：1及其自然產生的變異體表示。
在體內或體外應用上，本發明之寡核苷酸通常能夠在表現HBV目標核酸的細胞中，抑制HBV目標核酸的表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基之連續序列，在整個寡核苷酸長度上測量的結果通常是與HBV目標核酸為互補，隨選的是有一個或兩個錯配的例外，且隨選的是不包含能夠將寡核苷酸連結至例如結合物等隨選官能基團，或其他非互補的末端核苷酸(例如區域D’或D”)之核苷酸基連接子區域。
標靶序列
本文所用的術語「標靶序列」意指出現在目標核酸中的核苷酸的一個序列，其包含與本發明之寡核苷酸為互補的核鹼基序列。在某些實施例中，所述標靶序列包含目標核酸上的一個區域，所述區域的核鹼基序列與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列為互補。所述目標核酸的此一區域也可互換地稱為目標核苷酸序列、標靶序列或目標區域。在某些實施例中，所述標靶序列 比單一寡核苷酸的互補序列更長，且可能例如代表所述目標核酸的較容易受本發明之數種寡核苷酸所標定的區域。
本文所述的是治療性寡核苷酸的HBV mRNA目標區域，該區域由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28的位置1530至1602的序列表示。可以將該目標區域分成較小的標靶序列，並選自由以下位置組成之群組：SEQ ID NO：1的位置1530至1602、1530至1598、1530至1543、1530至1544、1531至1543、1551至1565、1551至1566、1577至1589、1577至1591、1577至1592、1578至1590、1578至1592、1583至1598、1584至1598、1585至1598或1583至1602。
在一個實施例中，本發明之治療性寡核苷酸包含與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28的位置1530至1602之標靶序列互補或雜交的連續核苷酸序列。特別是選自以下各項所組成之群組的標靶序列1530至1544、1531至1543、1585至1598和1583至1602。
與反義寡核苷酸互補或雜交的標靶序列，通常包含至少10個核苷酸的連續核鹼基序列。該目標區域的連續核苷酸序列具有10至50個核苷酸，例如12至30個，例如14至20個，例如15至18個連續核苷酸。
目標細胞
本文所用的術語「目標細胞」是指正在表現目標核酸的細胞。在某些實施例中，所述目標細胞可以是體內或體外的。在一些實施例中，目標細胞是HBV感染的哺乳動物細胞，例如囓齒動物細胞，例如小鼠細胞或人類細胞，特別是HBV感染的肝細胞。
在優選的實施例中，目標細胞表現HBV mRNA，並分泌HBsAg和HBeAg。
肝細胞
如本文所使用，術語「肝細胞(hepatocyte或hepatocytes)」是指肝實質組織的細胞。這些細胞約佔肝臟質量的70%至85%，並製造血清白蛋白、纖維蛋白原和凝血因子(因子3和4除外)的凝血酶原群。肝細胞譜系細胞的標記可能包括但不限於：運甲狀腺素蛋白(Ttr)、麩醯胺酸合成酶(Glul)、肝細胞核因子1a(Hnf1a)和肝細胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝細胞的標記可能包括但不限於：細胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索醯乙醯乙酸水解酶(Fah)、6-磷酸葡萄糖(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。參見，例如，Huch等人，(2013)，Nature，494(7436)，247-250，其與肝細胞標記有關的內容藉由引用併入本文。
降低表現
如本文所使用，術語基因的「降低表現(reduced expression)」是指與適當的參考細胞或個體相比，在一個細胞或個體中，由基因編碼的RNA轉錄物或蛋白質之量的減少及/或基因活性之量的減少。例如，用醫藥組合或雙股寡核苷酸(例如，一個具有與HBsAg mRNA序列互補的反義股)治療細胞的行為，與未分別用醫藥組合或雙股寡核苷酸治療的細胞相比，可能導致RNA轉錄物、蛋白質及/或酶活性(例如，由HBV基因組的S基因編碼)的減少。類似地，本文所用的「降低表現」是指導致基因(例如，HBV基因組的S基因)表現降低的行為。
自然產生變體
術語「其自然產生的變異體(naturally occurring variant thereof)」是指目標核酸的變異體，其在所定義的分類群中是自然存在的，例如HBV基因型A-H。通常，當提及多核苷酸之「自然產生的變異體(naturally occurring variants)」時，該術語還可涵蓋任何藉由染色體易位或重複發現之編碼基因體DNA的標靶序列之對偶變異體，以及RNA(例如由其衍生的mRNA)。「自 然產生的變異體(naturally occurring variants)」也可以包括衍生自標靶序列mRNA之選擇式剪接的變異體。引用時，例如對於特定的多肽序列而言，該術語還包括蛋白質之自然產生的形式，其因此可以進行處理，例如藉由轉譯中或轉譯後修飾，例如訊息肽切割、蛋白酶切割、糖基化等。
高親和力經修飾之核苷
高親和力經修飾之核苷是一種修飾的核苷酸，當其併入寡核苷酸中時，可提升寡核苷酸對其互補目標的親和力，例如以融化溫度(Tm)所測定者。本發明之高親和力經修飾之核苷較佳的是造成每一修飾核苷的融化溫度增加+0.5至+12℃，更佳的是+1.5至+10℃，最佳的是+3至+8℃。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力經修飾之核苷，包括例如許多2’取代核苷以及鎖核酸(LNA)(見例如Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443及Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與DNA及RNA中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環(HNA)，或通常在核糖環上的C2與C4碳原子之間具有雙自由基橋的雙環(LNA)，或通常在C2與C3碳原子之間無鍵結的未連結核糖環(例如UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸(PNA)或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在DNA及RNA核苷中自然存有的氫或2’-OH基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在2’、3’、4’或5’位置導入。
2’糖修飾核苷
2’糖修飾核苷是在2’位置(2’取代核苷)具有非H或-OH的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的2’碳與第二碳之間形成架橋的2’連結雙自由基的核苷，例如LNA(2’-4’雙自由基架橋)核苷。
更確切地，2’糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多2’取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’取代修飾核苷的實例包括2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA及2’-F-ANA核苷。更多實例請參看例如Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443及Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及Deleavey與Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。以下為2’取代修飾核苷的圖解。
Figure 109145408-A0305-12-0031-3
在本發明中，2’取代糖修飾核苷並不包括2’橋接核苷，如LNA。
鎖核酸核苷(LNA核苷)
「LNA核苷」是一種2’-修飾核苷，所述2’-修飾核苷包含連結所述核苷的核糖環之C2’與C4’的雙自由基(此雙自由基亦稱為「2’-4’架橋」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。鎖定核糖的構造，可在將LNA併入寡核苷酸中而產生互補RNA或DNA分子時提升雜交親和力(雙股螺旋穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙股螺旋的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示性LNA核苷已於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人，Bioorganic & Med.Chem.Lett.12，73-76；Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81及Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009,37(4),1225-1238以及Wan與Seth，J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中揭露。
方案1中揭露了其他非限制性例示LNA核苷。
方案1：
Figure 109145408-A0305-12-0033-4
特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA，例如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。具有特定優勢的LNA為β-D-氧基-LNA。
磷酸酯類似物
如本文所使用，術語「磷酸酯類似物(phosphate analog)」是指模擬磷酸基的靜電及/或立體特性的化學部分。在一些實施例中，磷酸酯類似物位於寡核苷酸之5'末端的核苷酸處替代5'-磷酸鹽，其通常易於以酶除去。在一些實施例中，5'磷酸酯類似物含有抗磷酸酶鍵聯。磷酸酯類似物的實例包括5'膦酸酯，例如5'亞甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些實 施例中，寡核苷酸在5'-末端的核苷酸之糖的4'-碳位置上，具有磷酸酯類似物(稱為「4'-磷酸酯類似物」)。4'-磷酸酯類似物的一個實例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子結合到糖部分(例如在其4'-碳上)或其類似物。參見例如，2016年9月2日提交的美國臨時申請號62/383,207和2016年9月12日提交的美國臨時申請號62/393,401，其各自涉及磷酸酯類似物的內容藉由引用併入本文。針對寡核苷酸之5'端的其他修飾已被開發(參見，例如，WO 2011/133871；美國專利號8,927,513；和Prakash等人(2015)，Nucleic Acids Res.，43(6)，2993-3011，其各自涉及磷酸酯類似物的內容藉由引用併入本文。
核酸酶中介降解
核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙股螺旋時，居中影響所述序列的降解。
在某些實施例中，反義寡核苷酸可經由該目標核酸的核酸酶介導的降解而發揮作用，在其中，本發明之寡核苷酸能夠招募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳的是核糖核酸酶(RNase)，例如核糖核酸酶H。在經由核酸酶中介機轉而運作的寡核苷酸設計實例中，該寡核苷酸通常包含一個長度為至少5或6個連續DNA核苷的區域，且在該區域的一側或兩側上側接有親和力提升型核苷，例如缺口體、頭聚物及尾聚物。
核糖核酸酶H活性與招募
在一個實施例中，治療性寡核苷酸是能夠招募核糖核酸酶H的反義寡核苷酸。反義寡核苷酸的核糖核酸酶H活性是指當其與互補的RNA分子在雙股螺旋中時，招募核糖核酸酶H的能力。WO01/23613提供用於確定核糖核酸酶H活性的體外方法，其可用於確定招募核糖核酸酶H的能力。以具有與受測修飾之寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中的全部單體之間，僅 包含具有硫代磷酸酯鍵聯的DNA單體之寡核苷酸為基準，使用WO01/23613(經參照併入於此)提供的實例91至95所描述的方法，以皮莫耳/公升/分鐘(pmol/l/min)為單位判定初始速率，如果一寡核苷酸與互補目標核酸序列反應的初始速率為上述基準初始速率的至少5%，例如至少10%或超過20%，則通常認為該寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶H。在判定核糖核酸酶H活性時，可使用瑞士琉森Lubio Science GmbH的重組型人類核糖核酸酶H1。
缺口體
在一些實施例中，本發明的治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，本發明的核酸分子或其連續核苷酸序列是缺口體反義寡核苷酸。反義缺口體常用於透過核糖核酸酶H中介降解來抑制目標核酸。在本發明的一個實施例中，本發明的反義寡核苷酸能夠朝招募核糖核酸酶H。
一個缺口體反義寡核苷酸包含至少三個有區別的結構區域，也就是一個5’-側翼、一個缺口和一個3’-側翼，F-G-F’為‘5->3’方向。所述「缺口」區域(G)包含一段讓寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶H的連續DNA核苷酸。所述缺口區域側接包含一或多個糖修飾核苷的5’側翼區域(F)，有利的是高親和力糖修飾核苷，且側接包含一或多個糖修飾核苷的3’側翼區域(F’)，有利的是高親和力糖修飾核苷。區域F及F’中的一個或多個糖修飾核苷可提升寡核苷酸對於目標核酸的親和力(亦即其為親和力提升型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域F及F’中的一或多個糖修飾核苷是2’糖修飾核苷，例如高親和力2’糖修飾，例如獨立選自LNA及2’-MOE。
在缺口體設計中，缺口區域的5’及3’多數核苷為DNA核苷，且位置分別鄰近5’(F)或3’(F’)區域的糖修飾核苷。該側翼可進一步定義為在距離該缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，也就是在5’側翼的5’端及在3’側翼的3’端。
區域F-G-F’形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式F-G-F’的缺口體區域。
該缺口體設計F-G-F’的整體長度可為，例如12至30個核苷，例如13至24個，例如14至22個核苷，例如13至17個，例如14至16個核苷。
舉例而言，本發明之缺口體寡核苷酸可由下式代表：F1-6-G6-16-F’1-6，例如F1-4-G7-10-F’2-4
附帶條件是所述缺口體區域F-G-F’的整體長度為至少12個，例如至少13個核苷酸。
在本發明的一個方面，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含或由式5’-F-G-F’-3’的缺口體所組成，其中區域F和F'獨立地包含或由1至8個核苷所組成，其中1至4個核苷是2'糖修飾的，並定義區域F和F'的5'和3'端，而G是6至16個核苷之間的區域，其具有招募核糖核酸酶H的能力。
在本發明的一個實施例中，連續核苷酸序列是式5’-F-G-F’-3’的缺口體，其中區域F和F'獨立地由2至4個2'糖修飾的核苷酸所組成，並定義區域F和F'的5'和3'末端，而G是6至10個DNA核苷之間的區域，其具有招募核糖核酸酶H的能力。
在一些實施例中，缺口區域G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續的硫代磷酸酯連接的DNA核苷所組成。在一些實施例中，缺口區域G由7至10個DNA核苷所組成。在一些實施例中，缺口中的所有核苷間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，區域F和F'獨立地包括或由糖修飾的核苷的連續序列所組成。在一些實施例中，區域F之糖修飾的核苷可獨立地選自2'-O- 烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元和2'-氟-ANA單元。
在一些實施例中，區域F或F'或F和F'的所有核苷均為LNA核苷，例如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，區域F由1至5個，例如2至4個，例如3至4個，例如1、2、3、4或5個連續的LNA核苷所組成。在一些實施例中，區域F和F'的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，區域F或F’或F和F’的所有核苷都是2’取代的核苷，例如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，區域F由1、2、3、4、5、6、7或8個連續的OMe或MOE核苷所組成。在一些實施例中，僅一個側翼區域可以由2'取代的核苷所組成，例如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，是5'(F)側翼區域由2'取代的核苷所組成，例如OMe或MOE核苷，而3'(F')側翼區域包含至少一個LNA核苷，例如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，是3'(F')側翼區域由2'取代的核苷所組成，例如OMe或MOE核苷，而5'(F)側翼區域包括至少一個LNA核苷，例如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
其他缺口體設計已於WO2004/046160，WO2007/146511和WO2008/113832中揭露，在此藉由引用併入本文。
LNA缺口體
LNA缺口體是指其中區域F及F’中任一者或兩者都包含或具有LNA核苷的缺口體。β-D-氧基缺口體是指其中區域F及F’中任一者或兩者都包含或具有β-D-氧基LNA核苷的缺口體。
在某些實施例中，所述LNA缺口體係如下式：[LNA]1-5-[區域G]6-10-[LNA]1-5，其中區域G具有如該缺口體區域G定義中的定義。
MOE缺口體
MOE缺口體是其中區域F及F’由MOE核苷所構成的缺口體。在某些實施例中，MOE缺口體的設計為[MOE]1-8-[區域G]5-16-[MOE]1-8，例如[MOE]2-7-[區域G]6-14-[MOE]2-7，例如[MOE]3-6-[區域G]8-12-[MOE]3-6，其中區域G具有如該缺口體定義中的定義。具有5-10-5設計(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口體已廣泛用於本技術領域中。
混合型翼缺口體
混合型翼缺口體是一種LNA缺口體，其中區域F及F’中的一者或兩者都包含2’取代的核苷，例如獨立選自以下各項所組成之群組的2’取代核苷：2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2’-氟-ANA單元，例如MOE核苷。在某些實施例中，其中區域F及F’中之至少一者或區域F及F’兩者均包含至少一個LNA核苷，區域F及F’的其餘核苷係獨立選自以MOE及LNA所構成之群組。在某些實施例中，其中區域F或F’中的至少一者或區域F及F’兩者均包含至少兩個LNA核苷，區域F及F’的其餘核苷係獨立選自以MOE及LNA所構成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域F及F’中的一或兩者可進一步包含一或多個DNA核苷。
混合型翼缺口體設計已於WO2008/049085及WO2012/109395中揭露，這兩個文獻均藉由引用併入本文。
寡核苷酸中的區域D’或D”
本發明之寡核苷酸可在某些實施例中包含或具有所述寡核苷酸的所述連續核苷酸序列，其與所述目標核酸互補，所述連續核苷酸序列如是缺 口體F-G-F’以及進一步的5’及/或3’核苷。所述進一步的5’及/或3’核苷可與或不與所述目標核酸為完全互補。該等進一步的5’及/或3’核苷本文中可稱為區域D’及D”。
區域D’或D”的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如缺口體，連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切割型連接子。或者其可用於提供外核酸酶保護或促進合成或製造。
區域D’及D”可分別連附至區域F的5’端或區域F’的3’端，以產生下式設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D”或D’-F-G-F’-D”。在此實例中，F-G-F’是所述寡核苷酸的缺口體部位，且區域D’或D”構成所述寡核苷酸的一個分離部分。區域D'和F區域之間以及區域F'和D"區域之間轉換的特徵是核苷具有朝向D'或D"區域的磷酸二酯鍵聯，以及朝向F或F'區域的硫代磷酸酯鍵聯，且核苷被視為是缺口體的一部分(與目標核酸互補的連續核苷酸序列)。
區域D’或D”可獨立包含或具有1、2、3、4或5個外加核苷酸，其可與所述目標核酸為互補或不為互補。鄰接F或F’區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如DNA或RNA或其鹼基修飾版本。D’或D”區域可做為對核酸酶易感的生物可切割型連接子(見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加5’及/或3’端核苷酸是與磷酸二酯鍵聯連結，且為DNA或RNA。適用為區域D’或D”的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照WO2014/076195的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結DNA二核苷酸。在一些實施例中，區域D’或D”與目標核酸不互補或包含至少50%的錯配。
在一些實施例中，區域D'或D"包含或由以下各項組成：序列的二核苷酸AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，及/或T可以被U取代。 二核苷酸中的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，區域D'或D"包含或由以下各項組成：序列的三核苷酸AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG，其中C可以是5-甲基胞嘧啶及/或T可以被U取代。核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。應知悉的是，當提及(自然產生的)核鹼基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)、G(鳥嘌呤)、C(胞嘧啶)時，它們可以被核鹼基類似物取代，該核鹼基類似物的功能相當於天然的核鹼基(例如鹼基配對至互補的核苷)。
在一實施例中，本發明之反義寡核苷酸除包含構成缺口體的連續核苷酸序列之外，還包含區域D’及/或D”。
在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸可由下式代表：D’-F-G-F’；特別是D’1-3-F1-4-G6-10-F’2-4
F-G-F’-D”；特別是F1-4-G6-10-F’2-4-D”1-3
D’-F-G-F’-D”；特別是D’1-3-F1-4-G6-10-F’2-4-D”1-3
在某些實施例中，所述位在區域D’與區域F之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。在某些實施例中，所述位在區域F’與區域D”之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。
結合物
本文所用的術語結合物是指可以與治療性寡核苷酸共價連接的非核苷酸部分(結合物)，例如GalNAc簇。術語結合物和簇或結合物部分可 以互換使用。在某些情況下，結合的治療性寡核苷酸也可以稱為寡核苷酸結合物。在一個實施例中，結合物是靶向配體。
靶向配體
如本文所使用，術語「靶向配體(targeting ligand)」是指與關注之組織或細胞的同源分子(例如，受體)選擇性結合的一分子(例如，碳水化合物、胺醣、膽固醇、多肽或脂質)，且該分子為了將其他物質靶向至關注之組織或細胞，可與另一種物質結合。例如，在一些實施例中，可以將靶向配體與寡核苷酸結合，以將寡核苷酸靶向感興趣的特定組織或細胞。在一些實施例中，靶向配體選擇性結合細胞表面受體。因此，在一些實施例中，靶向配體當結合至寡核苷酸時，透過選擇性結合至細胞表面表現的受體和複合體細胞的核內體內化作用，從而促進將寡核苷酸遞輸至特定細胞中，該複合體包含寡核苷酸、靶向配體和受體。在一些實施例中，靶向配體經由連接子與寡核苷酸結合，該連接子在細胞的內化作用之後或過程中切割，從而在細胞中使靶向配體釋放寡核苷酸。
寡核苷酸連接子
鍵聯或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。結合物基團可直接或透過連結部分(例如連接子或繫鏈)連附至寡核苷酸。連接子用於將結合物基團共價連接至與目標核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列。
在本發明的一些實施例中，治療性寡核苷酸可任選地包含連接子區域，該連接子區域位於與目標核酸和結合物互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列之间的连接区域。
這種連接子可以是生物可切割型連接子，其包含或由生理不安定鍵結所組成，該生理不安定鍵在正常情況下或類似於哺乳動物體內遇到的條 件下是可切割的在一實施例中，所述生物可切割型連接子易感於S1核酸酶切割。
對於置於結合物和治療性寡核苷酸之間的生物可切割型連接子，優選地在目標組織(例如肌肉、肝臟、腎臟或腫瘤)中看到的切割速率大於在血清中發現的切割速率。在「材料與方法」部分中，描述了合適確定目標組織中相對於血清或由S1-核酸酶切割水準(%)的方法。在一些實施例中，當與標準品相比時，生物可切割型連接子至少約20%被切割，例如至少約30%被切割，例如至少約40%被切割，例如至少約50%被切割，例如至少約60%被切割，例如至少約70%被切割，例如至少約75%被切割。
於一較佳實施例中，所述核酸酶易感連接子包含的核苷數量在1與10之間，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷，更佳的是2個至6個核苷，最佳的是2個至4個相連結的核苷，所述相連結的核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵聯，例如至少3個或4個或5個連續磷酸二酯鍵聯。該核苷較佳的是DNA或RNA。包含磷酸二酯的生物可切割型連接子(PO連接子)在WO 2014/076195中進行了更詳細的描述(在此藉由引用併入本文)。
其他或替代的連接子也可以單獨或與PO連接子組合使用，其不一定要是生物可切割型，但要是主要用於將結合物共價連接至寡核苷酸的連接子。不可切割型連接子可包含鏈結構或重複單元的寡聚物，例如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基團。在一些實施例中，不可切割型連接子是胺基烷基，例如C2至C36胺基烷基團，包括例如C6至C12胺基烷基團。於一較佳實施例中，連接子是一個C6胺基烷基團。
B型肝炎病毒
如本文所用，「B型肝炎病毒」或「HBV」是指具有約3,200個鹼基對之小雙股DNA基因組且對肝細胞向性的肝病毒科家族成員。「HBV」包括感染各種哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物等)和禽類(鴨等)宿主中的任何一種的B型肝炎病毒。「HBV」括任何已知的HBV基因型，例如血清型A、B、C、D、E、F和G；任何HBV血清型或HBV亞型；任何HBV分離株；HBV變異體，例如，HBeAg陰性變異體、抗藥性HBV變異體等(例如，抗拉米夫定(lamivudine)變異體、抗阿德福韋(adefovir)突變、抗替諾福韋(tenofovir)突變、抗恩替卡韋(entecavir)突變等)。
「HBV」是屬於肝病毒科家族的小DNA病毒，被歸類為正肝去氧核糖核酸病毒属(Orthohepadnavirus)的類型物種。HBV病毒顆粒(病毒粒子)包含外部脂質套膜和由蛋白質組成的二十面體核酸蛋白殼核心。核酸蛋白殼通常包封病毒DNA和DNA聚合酶，其具有與反轉錄病毒相似的反轉錄酶活性。HBV外套膜包含嵌入的蛋白質，這些蛋白質參與易感細胞的病毒結合並進入易感細胞。攻擊肝臟的HBV已基於序列根據至少十種基因型(A-J)進行了分類。一般而言，基因組編碼四個基因，這些基因分別稱為C、P、S和X。核心蛋白由基因C(HBcAg)編碼，其起始密碼子之前是上游框內AUG起始密碼子，由此產生前核心蛋白。HBeAg是藉由蛋白酶處理前核心蛋白而產生的。DNA聚合酶由基因P編碼。基因S編碼表面抗原(HBsAg)。HBsAg基因是一個長開讀框，但包含三個框內的「起始」(ATG)密碼子，可將基因分為三個部分，即前S1(pre-S1)、前S2(pre-S2)和S。由於存在多個起始密碼子，因此產生了稱為大、中和小的三個不同大小的多肽(前S1+前S2+S、前S2+S或S)。它們的比例可以為1：1：4(Heermann等人，1984年)。
B型肝炎病毒(HBV)蛋白可以分為幾種類別和功能。聚合酶具有反轉錄酶(RT)的功能，可從前基因組RNA(pgRNA)製備病毒DNA，還具 有DNA依賴性聚合酶的功能，可從病毒DNA製備共價閉合環狀DNA(cccDNA)。它們共價地連附於負股的5'端。核心蛋白構成病毒殼體和分泌的E抗原。表面抗原是肝細胞內化作用的配體，也是病毒球形和絲狀顆粒的主要成分。產生的病毒顆粒是Dane顆粒(感染性病毒粒子)的1000倍以上，並可以作為免疫誘餌。
B型肝炎病毒表面抗原
如本文所使用，術語「B型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen)」或「HBsAg」是指由HBV基因組的基因S(例如，ORF S)編碼的S結構域蛋白。B型肝炎病毒顆粒在核心顆粒中帶有病毒核酸，該核心顆粒被由基因S編碼的三種蛋白包封，這三種蛋白是大表面、中表面和主要表面蛋白。在這些蛋白中，主要表面蛋白質通常約為226個胺基酸，並僅包含S結構域。
感染
如本文所使用，術語「感染(infection)」是指個體中病原的入侵及/或微生物的擴展，例如病毒。感染可能是溶原性的，例如病毒DNA在細胞內處於休眠狀態。或者，感染可以是裂解性的，例如其中病毒活躍地增殖並引起被感染細胞的破壞。感染可能會或可能不會導致臨床上明顯的症狀。感染可能停留在局部也可能擴散，例如透過個體的血液或淋巴系統。可以藉由測定病毒量、表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和本領域已知的各種其他檢測HBV感染的方法中之一種或多種，來鑑定患有HBV感染的受試者。用於測定HBV感染的檢測方法可包括測試血清或血液樣本中HBsAg及/或HBeAg的存在，並可選地進一步篩選一種或多種病毒抗體(例如IgM及/或IgG)的存在，以彌補在任何時期中HBV抗原可能處於不可檢測的水準。
HBV感染
術語「B型肝炎病毒感染(hepatitis B virus infection)」或「HBV感染(HBV infection)」在本領域中是眾所周知的，並且是指由B型肝炎病毒(HBV)引起並影響肝臟的傳染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。一些感染者在初次感染期間並沒有症狀，有些感染者會迅速出現嘔吐、皮膚發黃、疲倦、小便黃赤和腹痛的疾病(「Hepatitis B Fact sheet N°204」。世界衛生組織官方網站，2014年7月，檢索日期2014年11月4日)。這些症狀通常會持續數週，並可能導致死亡。出現症狀可能需要30到180天。在出生前後被感染的人中，有90%會發展為慢性B型肝炎，而在五歲以後才感染的人只有不到10%會發展為慢性B型肝炎。(「Hepatitis B FAQs for the Public-Transmission」，美國疾病控制和預防中心(CDC)，檢索日期2011-11-29)。大多數患有慢性疾病的人沒有症狀，然而，最終可能會發展為肝硬化和肝癌(Chang，2007，Semin Fetal Neonatal Med，12，160-167)。這些併發症導致15%至25%患有慢性疾病的人死亡(「Hepatitis B Fact sheet N°204」。世界衛生組織官方網站，2014年7月，檢索日期2014年11月4日)。在本文中，術語「HBV感染(HBV infection)」包括急性和慢性B型肝炎感染。術語「HBV感染(HBV infection)」還包括初始感染的漸進階段、症狀階段以及HBV感染的漸進慢性階段。
肝臟發炎
如本文所使用，術語「肝臟發炎(liver inflammation)」或「肝炎(hepatitis)」是指其中肝臟變得腫脹、功能障礙及/或疼痛的身體狀況，特別是由於受傷或感染所致，這可能是由於暴露於肝毒性介質而引起的。症狀可能包括黃疸(皮膚或眼睛發黃)、疲勞、虛弱、噁心、嘔吐、食慾下降和體重減輕。如果不加以治療，肝炎可能會發展為纖維化、肝硬化、肝衰竭或肝癌。
肝纖維化
如本文所使用，術語「肝纖維化(liver fibrosis)」或「肝的纖維化(fibrosis of the liver)」是指由發炎和肝細胞死亡引起的細胞外基質蛋白在肝中的過度積累，該細胞外基質蛋白可能包括膠原蛋白(I，III和IV)、纖連蛋白、粗纖維調節素、彈性蛋白、層連結蛋白、玻尿酸和蛋白多醣。如果不加以治療，肝纖維化可能會發展為肝硬化，肝衰竭或肝癌。
TLR7
如本文所使用，「TLR7」是指任何物種起源(例如人類、鼠類、土撥鼠等)的類鐸受體7(Toll-like receptor 7)。
TLR7促效劑
如本文所用，「TLR7促效劑」是指作為TLR7促效劑的化合物。除非另有說明，否則TLR7促效劑可以包括任何藥學上可接受形式的化合物，包括任何異構體(例如，非鏡像異構物或鏡像異構物)、鹽、溶劑合物、多晶型物等。對特定化合物的TLR促效作用可以以任何合適的方式確定。例如，用於檢測待測化合物之TLR促效作用的檢測法，已描述於如在2002年12月11日提交的美國臨時專利申請案序號60/432,650中，以及適用於這種測定法的重組細胞株，已描述於如2002年12月11日提交的美國臨時專利申請案序號60/432,651中。評估TLR7促效劑的另一種檢測法是WO2016/091698之實例43中所述的HEK293-Blue-hTLR-7細胞檢測法(該測定法藉由引用併入本文)。
非鏡像異構物
如本文所使用，術語「非鏡像異構物(diastereomer)」是指具有兩個或更多個手性中心並且其分子不是彼此的鏡像的立體異構體。非鏡像異構物具有不同的物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質、活性和反應性。
含有一個或多個手性中心的通式(I)-(V)化合物，可以以外消旋物、非鏡像混合物或光學活性單一異構體的形式存在。可以根據已知的方法將外消旋物分離為鏡像異構物。特別是，可藉由結晶而分離出非鏡像異構的鹽，該結晶是藉由與光學活性酸(例如，D-或L-酒石酸、杏仁酸、蘋果酸、乳酸或樟腦磺酸)反應，從外消旋的混合物所形成的。
藥學上可接受之鹽
如本發明之化合物可以以其藥學上可接受之鹽的形式存在。
術語「藥學上可接受之鹽」意指保有生物效應及自由鹼或自由酸特性，且並非在生物上或在其他方面有不利之處的鹽。該鹽是以無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、特別是鹽酸，以及以有機酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苄甲酸、肉桂酸、苷杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯半胱胺酸等。
或者，這些鹽可由將無機鹼或有機鹼加到游離酸中來製備。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於一級胺、二級胺、和三級胺的鹽、取代胺，包括天然存在的取代胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺樹脂。式(I)的化合物也可以兩性離子的形式存在。特別優選地，式(I)化合物之藥學上可接受之鹽是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的鹽。
將藥物化合物進行化學修飾成鹽是藥物化學家眾所周知的技術，以獲得改善之化合物的物理和化學穩定性、吸濕性、流動性和溶解性。例如，在Bastin,Organic Process Research & Development 2000,4,427-435，或在Ansel的以下文獻中對此進行了描述：Pharmaceutical Dosage Formsand Drug Delivery Systems，第六版，(1995)，第196頁和第1456-1457頁。例如，本文提供之化合物的醫藥上可接受之鹽可以是鈉鹽。
醫藥組合
如本文所使用，醫藥組合應理解為至少兩種不同之活性化合物或前藥(醫學化合物或藥物)的組合，用於治療疾病。醫藥組合可以包括物理、化學或其他方式組合(例如，在同一小瓶中)的化合物；包裝在一起的化合物(例如，作為同一包裝(部件套組)中的兩個分開的物體，用於同時投予或分開投予)；或單獨提供但意圖一起使用的化合物(例如，該組合在化合物標籤或包裝插頁上明確說明)。在一個實施例中，醫藥組合由調製為用於口服投予的醫學化合物和調製為用於皮下注射的醫學化合物所組成。
大約
如本文所使用，術語「大約(approximately)或約(about)」，如應用於一個或多個關注值，是指類似於所述參考值的值。在某些實施例中，除非另有說明或從上下文中可以明顯看出(除非其中此類數字會超過可能值的100%)，術語「大約(approximately或about)」是指在所述參考值的任一方向(大於或小於)，值的範圍落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%，11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少的範圍內。
投予或給藥
如本文所使用，術語「投予或給藥(administering或administration)」是指以藥理學上有用的方式(例如，治療個體的狀況)向個體提供物質(例如，醫藥組合或寡核苷酸)。
去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)
如本文所使用，術語「去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor)」或「ASGPR」是指由主要48kDa(ASGPR-1)和次要40kDa次單位(ASGPR-2)所形成的二分C型凝集蛋白。ASGPR主要在肝細胞的正弦表面表現，並在結合、內化作用和隨後循環醣蛋白(包含末端半乳糖或N-乙醯半乳胺糖殘基)(去唾液酸糖蛋白)的清除中具有主要作用。
前藥
如本文所使用，術語「前藥(prodrug)」是指一種化合物的形式或衍生物，其在體內代謝(例如，藉由個體在投予後透過生物體液或酶)為該化合物的藥理活性形式，以產生所需的藥理作用。前藥描述於如Richard B.Silverman撰寫的Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action，聖地亞哥，學術出版社，2004年，第8章Prodrugs and Drug Delivery Systems，第497-558頁。
個體
如本文所使用，術語「個體(subject)」是指任何哺乳動物，包括小鼠、兔子和人類。在一些實施例中，個體是人類或非人類的靈長類動物。術語「受試者(individual)」或「患者(patien)」可以與「個體(subject)」互換使用。
治療
本文所使用的術語「治療(treatment、treating或treats等)」通常是指獲得所需之藥理及/或生理的作用。就部分或完全治癒疾病及/或歸因於該疾病的不良影響而言，該作用是治療性的。透過向個體投予治療劑(例如，醫藥組合或寡核苷酸)來提供效果，用以針對存在的病症(例如，HBV感染)改善個體的身體及/或健康，或者預防或減少病症發生的可能性(例如，預防肝纖維化、肝炎、肝癌或其他與HBV感染有關的病症)。如本文所使用，術語 「治療(treatment)」涵蓋個體中任何HBV感染的治療，包括：(a)抑制疾病，即像是抑制HBsAg及/或HBeAg的增長一樣抑制其發展；(b)改善(即緩解)疾病，即導致疾病消退，例如壓抑HBsAg及/或HBeAg的產生。因此，改善及/或抑制HBV感染的化合物或化合物組合是治療HBV發明的化合物或化合物組合。優選地，本文所使用的術語「治療」涉及已經表現出的疾病的醫學介入，例如治療已經定義和表現出的HBV感染，特別是慢性HBV感染的治療。
在一些實施例中，治療涉及降低個體經歷的病症(例如，HBV感染或相關病症)的至少一種體徵、症狀或促成因素的頻率或嚴重性。在HBV感染期間，個體可能表現出諸如皮膚和眼睛發黃(黃疸)、小便黃赤、極度疲勞、噁心、嘔吐和腹痛等症狀。因此，在一些實施例中，治療，例如使用本文提供的醫藥組合治療可導致一種或多種此類症狀的頻率或嚴重性降低。但是，HBV感染會發展為一種或多種肝病，例如肝硬化、肝纖維化、肝炎或肝癌。因此，在一些實施例中，治療，例如使用本文提供的醫藥組合治療可導致一種或多種這樣的病症的頻率或嚴重性降低，或預防或減輕。
治療有效量
術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」表示本發明之醫藥組合之化合物的量，當將其投予於個體時，(i)治療或預防特定的疾病、病症或障礙；(ii)減輕、改善或消除一種或多種特定疾病、病症或障礙的症狀；或(iii)預防或延遲本文所述的一種或多種特定疾病、病症或障礙之症狀的發作。治療有效量取決於化合物、所治療的疾病狀態、所治療疾病的嚴重程度、個體的年齡和相對健康狀況、投予途徑和形式、主治醫師或獸醫師的判斷以及其他因素而有不同。
賦形劑
如本文所使用，術語「賦形劑(excipient)」是指可以包含在一種或多種包含藥物之組成物中的非治療劑，該非治療劑是醫藥組合的一部分，例如用以提供或有助於所需的黏稠度或穩定作用。
本發明涉及一種醫藥組合，包含兩類化合物：i)治療性寡核苷酸和ii)TLR7促效劑，其各自在藥學上可接受之載體中。該醫藥組合用於治療B型肝炎病毒感染，特別是治療慢性HBV患者。
以下將分別描述組合中每種化合物的類別，但應當理解的是，醫藥組合中存在每種類別之至少一種化合物。該化合物可以同時或分開投予。靶向HBV的治療性寡核苷酸類別之化合物，可以以非腸胃道的方式投予(例如靜脈、皮下或肌內)。TLR7促效劑可以以經腸道的方式投予(例如口服或透過胃腸道)。
在第一個實施例中，靶向HBV的治療性寡核苷酸是RNAi寡核苷酸，優選地是用於降低HBsAg mRNA之表現的RNAi寡核苷酸。在第二個實施例中，靶向UBV的治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，優選地是靶向HBV之GalNAc結合的反義寡核苷酸。
1.本發明之RNAi寡核苷酸
在一些實施例中，本發明之醫藥組合中的第一藥物是HBV表面抗原表現之基於寡核苷酸的抑製劑，其可用於達成治療的益處。透過HBV表面抗原mRNA的審查和不同寡核苷酸的測試，已開發出有效的寡核苷酸可，降低HBV表面抗原(HBsAg)的表現以治療HBV感染。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸被設計為靶向HBsAg mRNA序列，其涵蓋所有已知基因型中>95%之已知HBV基因組。在一些實施例中，此類寡核苷酸造成肝臟中的HBV前基因組RNA(pgRNA)和HBsAg mRNA降低超過90%。在一些實施例中，在單一劑量或治療方案後，HBsAg表現降低會持續延長一段時間。
因此，在一些實施例中，為了在細胞中靶向轉錄物並抑制其表現，本文所提供的寡核苷酸是被設計為具有與HBsAg mRNA有互補性的區域。互補之區域通常具有合適的長度和鹼基含量，以使寡核苷酸(或其股)能夠對HBsAg mRNA退火，以抑制其表現。在一些實施例中，互補之區域的長度為至少12個、至少13個、至少14個至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個或至少20個核苷酸。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸具有與HBsAg mRNA互補之區域，該區域的長度為12至30(例如12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)個核苷酸。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸具有與HBsAg mRNA互補之區域，該區域的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸被設計為靶向編碼HBsAg的mRNA序列。例如，在一些實施例中，提供具有反義股的寡核苷酸，該反義股具有與下述序列互補之區域：ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)，其中N是指任何核苷酸(A、G、T或C)。在一些實施例中，寡核苷酸進一步包含有義股，其與反義股形成雙股螺旋區域。在一些實施例中，有義股具有與如下序列互補之區域：UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ ID NO：34)。在一些實施例中，有義股包含與以下所示之序列(顯示5'至3')互補之區域：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO：35)。
在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO：36)。在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO：37)。在一些實施例中，反義股包含以下序列或由以下序列所組成：UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)。在一些實施例中， 有義股包含以下序列或由以下序列所組成：ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO：39)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：40)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)。在一些實施例中，有義股包含以下序列或由以下序列所組成：GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：42)。
在一些實施例中，用於減少HBsAg mRNA表現的寡核苷酸包含有義股，其與反義股形成雙股螺旋區域，其中該有義股包含如SEQ ID NO：39-42中任一項的序列，且該反義股包含如SEQ ID NO：36-38中任一項的序列。在一些實施例中，有義股包含經2'-氟和2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，有義股結合至N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分。在一些實施例中，反義股包含經2'-氟和2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，反義股的5'-核苷酸之糖的4'-碳包含磷酸酯類似物。在一些實施例中，每個反義股和有義股均包含經2'-氟和2'-O-甲基修飾之核苷酸，以及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中反義股的5'-核苷酸之糖的4'-碳包含磷酸酯類似物，且有義股結合至N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分。
在一些實施例中，有義股包含如SEQ ID NO：40-42中任一項序列，其在3、8至10、12、13和17的位置包含經2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，該有義股在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26和31至36包含經2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，該有義股包含一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該有義股在位置1和2的核苷酸之間包含 硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，有義股結合至N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分。
在一些實施例中，反義股包含如SEQ ID NO：36-38中任一項的序列，其在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19包含經2'-氟修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20至22包含經2'-O-甲基修飾之核苷酸。在一些實施例中，反義股包含三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該反義股在位置1和2的核苷酸之間、位置2和3的核苷酸之間、位置3和4的核苷酸之間、位置20和21的核苷酸之間以及位置21和22的核苷酸之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，反義股的5'-核苷酸之糖的4'-碳包含磷酸酯類似物。
I.靶向HBsAg mRNA的雙股寡核苷酸
有多種寡核苷酸的結構可用於如本文所公開之醫藥組合中靶向HBsAg mRNA表現，包括RNAi、反義、miRNA等。本文或其他地方所描述之任何結構，均可用作結合或靶向本文所述之序列的架構。用於靶向HBV抗原表現(例如，經由RNAi途徑)的雙股寡核苷酸，其通常具有彼此形成雙股螺旋的有義股和反義股。在一些實施例中，正義和反義股不是共價連接的。然而，在一些實施例中，正義和反義股是共價連接的。
在本發明的一些實施例中，用於降低HBsAg mRNA表現的雙股寡核苷酸從事RNA干擾(RNAi)。例如，已被開發出之RNAi寡核苷酸每股具有19至25個核苷酸的大小，並具有至少一個1至5個核苷酸的3'突出(參見，例如，美國專利號8,372,968)。更長的寡核苷酸也已被開發出來，其藉由切丁進行加工以產生活性RNAi產物(參見，例如，美國專利號8,883,996)。進一步的工作產生出延伸的雙股寡核苷酸，其中至少一股的至少一端延伸超出了雙股螺旋靶向區域，包括其中一股中含熱力學穩定之四鹼基環圈結構的結構 (參見，例如，美國專利號8,513,207及8,927,705，以及WO2010033225，其所揭露之該些寡核苷酸藉由引用併入本文)。這些結構可以包括單股延伸(在分子的一側或兩側)以及雙股延伸。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸是可被切丁酶切割的。此類寡核苷酸在有義股的3'端可以具有突出(例如，長度為1、2或3個核苷酸)。此類寡核苷酸(例如，siRNA)可包含與目標RNA反義之21個核苷酸引導股以及互補的隨從股，其中兩股退火以形成19-bp雙股螺旋，且在一個或兩個3'端具有2個核苷酸突出。還可以使用更長的寡核苷酸設計，包括具有23個核苷酸之引導股和21個核苷酸之隨從股的寡核苷酸，其中分子的右側(隨從股的3'端/引導股5'端)有一個鈍端，且在分子的左側(隨從股的5'端/引導股的3'端)有2個核苷酸3'-引導股突出。在這樣的分子中，有21個鹼基對的雙股螺旋區域。參見，例如，US9012138、US9012621和US9193753，它們各自的相關揭露併入本文。
在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸可包含正義和反義股，其長度都在17至26個(例如17至26、20至25、19至21或21至23)核苷酸範圍內。在一些實施例中，正義和反義股具有相等的長度。在一些實施例中，對於具有長度均在21至23個核苷酸範圍內的正義和反義股寡核苷酸，其在正義、反義或正義和反義股兩者上具有長度為1或2個核苷酸的3'突出。在一些實施例中，寡核苷酸具有23個核苷酸之引導股以及21個核苷酸之隨從股，其中分子的右側(隨從股的3'端/引導股5'端)有一個鈍端，且在分子的左側(隨從股的5'端/引導股的3'端)有2個核苷酸3'引導股突出。在這樣的分子中，有21個鹼基對的雙股螺旋區域。在一些實施例中，寡核苷酸包含25個核苷酸之有義股以及27個核苷酸之反義股，當藉由切丁酶在該寡核苷酸上作用時，其導致反義股被併入到成熟的RISC中。
與本文所揭露之組成物和方法一起使用的其他寡核苷酸設計包括：16-聚體siRNA(參見，例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn(編輯)，Royal Society of Chemistry，2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的主幹；參見，例如，Moore等人，Methods Mol.Biol.2010；629：141-158)、鈍端siRNAs(例如，長度為19bps；參見：例如，Kraynack和Baker，RNA卷12，第163-176頁(2006))、不對稱的siRNA(aiRNA；參見，例如，Sun等人，Nat.Biotechnol.26，1379-1382(2008))、不對稱之較短的雙股螺旋siRNA(參見，例如，Chang等人，Mol Ther.，2009年4月，17(4)：725-32)、分叉siRNAs(參見，例如，Hohjoh，FEBS Letters，第557卷，第1-3期，2004年1月，第193-198頁)、單股siRNA(Elsner,Nature Biotechnology 30,1063(2012))、啞鈴形環狀siRNA(參見，例如，Abe等人，J Am Chem Soc 129：15108-15109(2007))和小內部分段干擾RNA(sisiRNA；參見，例如，Bramsen等人，Nucleic Acids Res.，2007年9月，35(17)：5886-5897)。前述每個參考文獻中相關之揭露全文，藉由引用併入本文。寡核苷酸結構之其他非限制性實例可用於一些實施例的醫藥組合中，以降低或抑制HBsAg表現，該寡核苷酸結構為微小RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)和短siRNA(參見，例如，Hamilton等人，Embo J.,2002,21(17)：4671-4679；也參見美國申請號20090099115)。
a.反義股
在一些實施例中，寡核苷酸的反義股可被稱為「引導股」。例如，若反義股可以與RNA誘導的緘默化複合體(RISC)接合以及與Argonaut蛋白結合，或者與一種或多種類似的因子接合或結合，並指揮目標基因沉默，則該反義股可以稱為引導股。在一些實施例中，與引導股互補的有義股可以被稱為「隨從股」。
在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸包含長度為最多50個核苷酸(例如，長度最多30、最多27、最多25、最多21或最多19個核苷酸)的反義股。在一些實施例中，本文所提供的寡核苷酸包含長度至少12個核苷酸(例如，長度為至少12、至少15、至少19、至少21、至少25或至少27個核苷酸)的反義股。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸的反義股，其長度在12至50或12至30(例如12至30、11至27、11至25、15至21、15至27、17至21、17至25、19至27或19至30)個核苷酸的範圍內。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸的反義股，其長度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。
在一些實施例中，反義股包含與以下所示之序列(顯示5'至3')互補之區域：AATCCTCACA(SEQ ID NO：43)。在一些實施例中，反義股包含以下所示的序列(顯示5'至3')：UGUGAGGAUU(SEQ ID NO：44)。在一些實施例中，反義股包含以下所示的序列(顯示5'至3')：TGTGAGGATT(SEQ ID NO：45)。
在一些實施例中，用於減少HBsAg mRNA表現的寡核苷酸可包含反義股，該反義股具有與SEQ ID NO：43所示序列互補之區域，以及在其3'末端具有一個或兩個不互補的核苷酸。在一些實施例中，反義股包含SEQ ID NO：36-38中任一項所示的核苷酸序列。
在一些實施例中，用於降低HBsAg mRNA表現的寡核苷酸可包含反義股，該反義股具有與SEQ ID NO：43所示序列互補之區域，其中該反義股不具有任何以下所示的序列(顯示5'至3')：TATTGTGAGGATTCTTGTCA(SEQ ID NO：46)；CGGTATTGTGAGGATTCTTG(SEQ ID NO：47)；TGTGA GGATTCTTGTCAACA(SEQ ID NO：48)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAA(SEQ ID NO：49)；UGCGGUAUUGUGAGGAUUCTT(SEQ ID NO：50)；ACAGCATTGTGAGGATTCTTGTC(SEQ ID NO：51)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAACA(SEQ ID NO：52)；AUUGUGAGGAUUUUUGUCAACAA(SEQ ID NO：53)；和UUGUGAGGAUUUUUGUCAACAAG(SEQ ID NO：54)。在一些實施例中，反義股與SEQ ID NO：36、37或38所示的核苷酸序列相差不超過三個核苷酸。
b.有義股
在一些實施例中，雙股寡核苷酸可具有長度最多40個核苷酸的有義股(例如，長度最多40、最多35、最多30、最多27、最多25、最多21、最多19、最多17個或最多12個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度至少12個核苷酸的有義股(例如，長度至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少35個或至少38個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸可具有長度在12至50個核苷酸範圍內的有義股(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)。在某些實施例中，寡核苷酸可具有長度在12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸的有義股。在一些實施例中，寡核苷酸的有義股長於27個核苷酸(例如28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸)。在一些實施例中，寡核苷酸的有義股長於25個核苷酸(例如26、27、28、29或30個核苷酸)。
在一些實施例中，有義股在其3'端包括主幹-環圈。在一些實施例中，有義股在其5'端包括主幹-環圈。在一些實施例中，包含主幹環圈之一 股，其長度為2至66個核苷酸範圍內(例如，2至66、10至52、14至40、2至30、4至26、8至22、12至18、10至22、14至26或14至30個核苷酸長)。在某些實施例中，包含主幹環圈之一股，其為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長。在某些實施例中，主幹包含長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個核苷酸的雙股螺旋。在一些實施例中，主幹-環圈為分子提供了更好之針對降解(例如，酶降解)的保護，並促進靶向特徵以遞輸至目標細胞。例如，在一些實施例中，環圈提供額外的核苷酸，在實質上不影響寡核苷酸之基因表現抑制活性上，可以在該核苷酸上進行修飾。在某些實施例中，本文所提供之寡核苷酸，其中之有義股包含(例如，在其3'端)主幹-環圈，該主幹-環圈表示為：S1-L-S2，其中S1與S2互補，並且L在S1和S2之間形成長度為10個核苷酸的環圈(例如，長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸)。
在一些實施例中，主幹-環圈之環圈(L)為四鹼基環圈(例如在帶切口的四鹼基環圈結構內)。四鹼基環圈可包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸及其組合。通常，四鹼基環圈具有4至5個核苷酸。
c.雙股螺旋長度
在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度為至少12(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)個核苷酸。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度在12至30個核苷酸的範圍內(例如，長度在12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30個核苷酸)。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其並不橫跨有義股及/或反義股的整個長度。在一些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其橫跨正義或反義股的整個長度。在某些實施例中，在正義和反義股之間形成的雙股螺旋，其橫跨有義股及反義股兩者的整個長度。
d.寡核苷酸端
在一些實施例中，寡核苷酸包含正義和反義股，可在有義股或反義股、或者有義股和反義股兩者上具有3'突出。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸具有一個5'末，該5'端與其他5'端相比在熱力學上不穩定。在一些實施例中，提供不對稱的寡核苷酸，其包括在有義股之3'端的鈍端，以及在反義股之3'端的突出。在一些實施例中，反義股上3'突出的長度為1至8個核苷酸(例如，長度為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷酸)。
通常，用於RNAi的寡核苷酸在反義(引導)股的3'端具有兩個核苷酸突出。然而，其他突出也是可能的。在一些實施例中，突出是3'突出，其包含長度在1至6個之間的核苷酸，任選地為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4，2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或者1、2、3、4、5或6個核苷酸。然而，在一些實施例中，突出是5'突出，其包含長度在1至6個之間的核苷酸，任選地為1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4，2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6個核苷酸，或者1、2、3、4、5或6個核苷酸。
在一些實施例中，正義及/或反義股之3'端或5'端的一個或多個(例如，2、3、4)末端核苷酸被修飾。例如，在一些實施例中，反義股之3'端的一個或兩個末端核苷酸被修飾。在一些實施例中，反義股之3'端的最後一個核苷酸被修飾，例如，包含2’-修飾，例如，2'-O-甲氧基乙基。在一些實施 例中，反義股之3'端的最後一個或兩個末端核苷酸與目標互補。在一些實施例中，反義股之3'端的最後一個或兩個核苷酸與目標不互補。
在一些實施例中，提供在有義股3'端上具有帶切口的四鹼基環圈結構之雙股寡核苷酸，且在其反義股的3'端具有兩個末端突出的核苷酸。在一些實施例中，該兩個末端突出的核苷酸是GG。通常，該反義股的兩個末端GG核苷酸之一或兩者與目標互補或不互補。
在一些實施例中，正義或反義股的5'端及/或3'端具有反向的帽核苷酸。
在一些實施例中，在正義及/或反義股的3'端或5'端的末端核苷酸之間，提供一個或多個(例如2、3、4、5、6)經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，在正義及/或反義股的3'端或5'端的突出核苷酸之間，提供經修飾的核苷酸間鍵聯。
e.錯配
在一些實施例中，寡核苷酸可在正義和反義股之間具有一個或多個(例如1、2、3、4、5)錯配。如果正義和反義股之間存在一個以上之錯配，則它們可以被置於連續的位置(例如，2、3或更多個接續)，或者散佈在整個互補之區域中。在一些實施例中，有義股的3'末端包含一個或多個錯配。在一個實施例中，在有義股的3'末端併入兩個錯配。在一些實施例中，可能透過促進切丁的加工，在寡核苷酸有義股之3'端片段的鹼基錯配或去穩定作用，而改善RNAi中合成雙股螺旋的效力。
在一些實施例中，反義股可具有與HBsAg轉錄物有互性補之區域，與相應的轉錄物序列相比，其包含一個或多個錯配。只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與轉錄物形成互補之鹼基對的能力，該寡核苷酸上的互補之區域可具有最多1個、最多2個、最多3個、最多4個、最多5個等的錯 配。可替代地，只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與HBsAg mRNA形成互補之鹼基對的能力，該寡核苷酸的互補之區域可以具有不超過1、不超過2、不超過3、不超過4或不超過5個錯配。在一些實施例中，若在有互補性的區域中具有一個以上的錯配，只要寡核苷酸在適當的雜交條件下，保持與HBsAg mRNA形成互補之鹼基對的能力，則該些錯配可以被置於連續的位置(例如，2、3、4或更多個接續)，或者散佈在整個互補之區域中。
II.單股寡核苷酸
在一些實施例中，如本文所述之用於降低HBsAg表現的RNAi寡核苷酸，是具有與HBsAg mRNA有互補性的單股寡核苷酸。這樣的結構可以包括但不限於單股RNAi寡核苷酸。近期的成果已經證明單股RNAi寡核苷酸的活性(參見，例如，Matsui等人(2016年5月)，Molecular Therapy，卷24(5)，946-955)。
儘管這種單股RNAi寡核苷酸在技術上可以被認為是反義寡核苷酸，但它仍可以透過RNA干擾機制來發揮作用，並具有如本文所述之RNAi寡核苷酸的特徵。
2.本發明之特異性RNAi寡核苷酸
為了便於參考並避免不必要的重複，本文中闡述之本發明的一些RNAi寡核苷酸的定義，以下也稱為「RNAi ID NOs」。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是靶向HBV的寡核苷酸。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：1。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是靶向HBsAg mRNA的寡核苷酸。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：2。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是降低HBsAg mRNA表現的寡核苷酸。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：3。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是包含長度為19至30個核苷酸之反義股的寡核苷酸，其中該反義股包含與ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)所示之HBsAg mRNA序列互補之區域。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：4。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是用於降低HBsAg mRNA表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為19至30個核苷酸的反義股，其中該反義股包含與ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)所示之HBsAg mRNA序列互補之區域。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：5。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是用於降低B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股，其中：該有義股由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列組成，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸之各者經結合至單價GalNac部分；並且該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列組成，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20 至22的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間、介於在位置2與3的核苷酸之間、介於在位置3與4的核苷酸之間、介於在位置20與21的核苷酸之間、及介於在位置21與22的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中反義股的5'-核苷酸之糖的4'-碳包含甲氧基膦酸酯(MOP)。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：6。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸，是包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股的寡核苷酸，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之各者經結合至單價GalNac部分，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0065-5
；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0065-6
該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：7。在一個實施例中，RNAi ID NO：7是用於降低HBsAg mRNA表現的寡核苷酸。在一個實施例中，RNAi ID NO：7的有義股或反義股或反義和有義股兩者，是由上文對RN Ai ID NO：7所描述之該些股的各個序列所組成。在RNAi ID NO：7的一個實施例中，SEQ ID NO：41是5’-GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC-3’及/或SEQ ID NO：38是5’-UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG-3’。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸具有圖29A所示的結構。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：8。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的RNAi寡核苷酸是寡核苷酸HBV(s)-219。該RNAi寡核苷酸在本文中也稱為RNAi ID NO：9。
3.本發明之RNAi試劑的寡核苷酸修飾
在本節中討論的修飾，對於在本發明之RNAi寡核苷酸中的實施是特別優選的。
寡核苷酸可以以各種方式修飾，以改善或控制特異性、穩定性、遞輸、生體可用率、核酸酶降解的抗性、免疫原性、鹼基配對特性、RNA分佈和細胞攝入以及與治療或研究用途相關的其他特徵。參見，例如，Bramsen等人，Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsen和Kjems(Frontiers in Genetics,3(2012)：1-22)。因此，在一些實施例中，本揭露之治療性寡核苷酸可包括一種或多種合適的修飾。在一些實施例中，經修飾的核苷酸在其鹼基(或核鹼基)、糖(例如核糖、去氧核糖)或磷酸基團中具有修飾。
寡核苷酸上的修飾數目和那些核苷酸修飾的位置可能影響寡核苷酸的性質。例如，寡核苷酸可以藉由將它們結合或包裹在脂質奈米顆粒(LNP)或類似載體中而在體內遞輸。然而，當寡核苷酸沒有LNP或類似載體的 保護時，將至少一些核苷酸進行修飾會是有利的。因此，在本文所提供的任何治療性寡核苷酸的某些實施例中，寡核苷酸之所有或實質上所有核苷酸均被修飾。在某些實施例中，多於一半的核苷酸被修飾。在某些實施例中，少於一半的核苷酸被修飾。通常，在無包覆遞輸的情況下，每個糖都在2'位置被修飾。這些修飾可以是可逆的或不可逆的。在一些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸具有足以造成所需特徵(例如，防止酶降解、在體內投予後靶向所需細胞的能力及/或熱力學穩定性)之數量和類型的經修飾之核苷酸。
I.糖修飾
在一些實施例中，經修飾的糖(本文也稱為醣類似物)包含經修飾的去氧核糖或核糖部分，例如其中一個或多個修飾發生在糖的2’、3’、4'及/或5’碳的位置。在一些實施例中，經修飾的糖還可以包括非天然的替代碳結構，例如那些存在於鎖核酸(「LNA」)(參見，例如，Koshkin等人(1998)，Tetrahedron 54,3607-3630)、未鎖核酸(「UNA」)(參見，例如，Snead等人(2013)，Molecular Therapy-Nucleic Acids,2,e103)、以及橋接核酸(「BNA」)(參見，例如，Imanishi和Obika(2002),The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.,1653-1659)。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika，針對他們涉及糖修飾的揭露藉由引用併入本文。
在一些實施例中，糖中的核苷酸修飾包括2’-修飾。2'-修飾可以是2'-胺基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-去氧-2’-氟-β-d-阿糖核酸。通常，該修飾是2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些實施例中，糖中的修飾包括糖環的修飾，其可以包含糖環之一個或多個碳的修飾。例如，核苷酸之糖的修飾可以包含糖的2'-氧連接至糖的1'-碳或4'-碳，或2'-氧經由乙烯或亞甲基橋連接至1'-碳或4’-碳。在一些實施例中，經修飾的核 苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳鍵結的非環糖。在一些實施例中，經修飾的核苷酸置具有巰醇基團，例如在糖的4'位置。
在一些實施例中，末端3'-端基團(例如3'-羥基)是磷酸基團或其他基團，其可用於例如連附連接子、轉接子或標記，或用於指揮寡核苷酸連接至另一個核酸。
II.5'末端磷酸鹽
在一些實施例中，寡核苷酸的5’-末端磷酸基團可增強與Argonaut 2的相互作用。然而，包含5’-磷酸基團的寡核苷酸易於經由磷酸酶或其他酶降解，其可限制它們在體內的生體可用率。在一些實施例中，寡核苷酸包含抗此類降解的5'磷酸鹽之類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物可以是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二醯基膦酸酯。在某些實施例中，寡核苷酸股的5'端連附至模擬天然5’-磷酸基團之靜電和空間特性的化學部分(「磷酸鹽模擬物」)(參見，例如，Prakash等人(2015)，Nucleic Acids Res.,Nucleic Acids Res.，2015年3月31日，43(6)：2993-3011，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文)。許多可以連附到5'端的磷酸鹽模擬物已被開發出來(參見，例如，美國專利號8,927,513，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文)。針對寡核苷酸之5'端已經開發出其他修飾(參見，例如，WO 2011/133871，其與磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文)。在某些實施例中，羥基連附至寡核苷酸的5'端。
在一些實施例中，寡核苷酸在糖的4’-碳位置具有磷酸類似物(稱為「4’-磷酸酯類似物」)。參見，例如，2016年9月2日提交之題為4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美國臨時申請號62/383,207和2016年9月12日提交之題為4'-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美國臨時申請號62/393,401，其各自與 磷酸酯類似物有關的內容，藉由引用併入本文。在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸在5’-末端核苷酸包含4’-磷酸酯類似物。在一些實施例中，磷酸酯類似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子鍵聯至糖部分(例如，在其4'-碳)或其類似物。在其他實施例中，4'-磷酸酯類似物是硫代甲基膦酸酯或胺基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或胺基甲基的氮原子與糖部分或其類似物的4’-碳鍵聯。在某些實施例中，4’-磷酸酯類似物是氧甲基膦酸酯。在一些實施例中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2表示，其中R獨立地選自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保護基。在某些實施例中，烷基為CH2CH3。更典型地，R獨立地選自H、CH3或CH2CH3。
在某些實施例中，連附至寡核苷酸的磷酸酯類似物是甲氧基膦酸酯(MOP)。在某些實施例中，連附至寡核苷酸的磷酸酯類似物是5'單-甲基保護的MOP。在一些實施例中，可以在例如引導(反義)股的第一位置使用以下包含磷酸酯類似物的尿苷核苷酸：
Figure 109145408-A0305-12-0069-7
 該經修飾的核苷酸稱為[MePhosphonate-4O-mU]或5'-甲氧基、膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。
III.經修飾的核苷間鍵聯
在一些實施例中，磷酸修飾或取代可以產生包含至少一個(例如，至少1、至少2、至少3或至少5個)經修飾之核苷酸間鍵聯的寡核苷 酸。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸包含1至10(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2)個經修飾的核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本文所揭露之任何寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經修飾的核苷酸間鍵聯。
經修飾的核苷酸間鍵聯可以是硫代磷酸酯鍵聯、硫代磷酸酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、硫代烷基膦酸酯鍵聯、硫代烷基磷酸三酯鍵聯、亞磷醯胺鍵聯、膦酸酯鍵聯或硼酸磷酸酯鍵聯。在一些實施例中，本文所揭露之任何一種寡核苷酸的至少一個經修飾的核苷酸間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。
IV.鹼基修飾
在一些實施例中，本文所提供之寡核苷酸具有一個或多個經修飾的核鹼基。在一些實施例中，經修飾的核鹼基(在本文中也稱為鹼基類似物)在核苷酸糖部分的1'位置連接。在某些實施例中，經修飾的核鹼基是含氮鹼基。在某些實施例中，經修飾的核鹼基不包含氮原子。參見，例如，美國專利申請號20080274462。在一些實施例中，經修飾的核苷酸包含通用鹼基。然而，在某些實施例中，經修飾的核苷酸不包含核鹼基(無鹼基)。
在一些實施例中，通用鹼基是位於經修飾之核苷酸中核苷酸糖部分之1'位置上的雜環部分，或核苷酸糖部分取代中的等同位置，當存在於雙股螺旋中時，其可位於相對於一種類型以上的鹼基，而不會實質上改變雙股螺旋的結構。在一些實施例中，與目標核酸完全互補的參考單股核酸(例如，寡核苷酸)相比，含有通用鹼基的單股核酸與目標核酸所形成之雙股螺旋，相較於該單股核酸與互補之核酸所形成之雙股螺旋，具有較低的Tm。然而，在一些實施例中，與其中通用鹼基已被鹼基替代以產生單個錯配的參考單股核酸相比，含有通用鹼基的單股核酸與目標核酸所形成之雙股螺旋，相較於該單股核酸與含錯配鹼基之核酸所形成之雙股螺旋，具有較高的Tm。
通用結合核苷酸的非限制性實例包括肌苷、1-β-D-核呋喃糖苷基-5-硝基吲哚及/或1-β-D-核呋喃糖苷基-3-硝基吡咯(美國專利申請公開號20070254362，授予Quay等人；Van Aerschot等人，An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside,Nucleic Acids Res.，1995年9月11日，23(21)：4363-70；Loakes等人，3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR,Nucleic Acids Res.，1995年7月11日，23(13)：2361-6；Loakes和Brown，5-Nitroindole as an universal base analogue,Nucleic Acids Res.，1994年10月11日，22(20)：4039-43。前述中與鹼基修飾有關的揭露，各自藉由引用併入本文。
V.可逆的修飾
儘管可以進行某些修飾以保護寡核苷酸在到達目標細胞之前不受體內環境的影響，但是一旦寡核苷酸到達目標細胞的胞質液，它們可以降低寡核苷酸的效力或活性。可以進行可逆的修飾，使得分子在細胞外保留所期望的特性，然後在進入細胞的胞質環境時將其除去。可以藉由例如細胞內酶的作用或藉由細胞內部的化學條件(例如，透過細胞內麩胱甘肽的還原)來去除可逆的修飾。
在一些實施例中，可逆地經修飾的核苷酸包含麩胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已用環狀二硫化物部分進行化學修飾，以掩蓋核苷酸間二磷酸鍵聯所產生的負電荷，並改善細胞攝入和核酸酶抗性。參見最初給予Traversa Therapeutics,Inc.(「Traversa」)的美國公開申請號2011/0294869，Solstice Biologics,Ltd.(「Solstice」)的PCT公開號WO 2015/188197，Meade等人，Nature Biotechnology,2014,32：1256-1263(「Meade」)，Merck Sharp & Dohme Corp的PCT公開號WO 2014/088920，其關於此類修飾之揭露，各自藉由引用併入本文。核苷酸間二磷酸鍵聯的此類可逆的修飾，被設計成藉由胞質 液的還原環境在細胞內被切割(例如麩胱甘肽)。較早的實例包括中和磷酸三酯修飾，據報導該修飾在細胞內是可切割的(Dellinger等人，J.Am.Chem.Soc.2003,125：940-950)。
在一些實施例中，此類可逆的修飾在體內投予期間提供保護(例如，透過血液及/或細胞之胞溶體/胞內體的腔室轉運)，其中寡核苷酸將暴露於核酸酶和其他惡劣的環境條件(例如pH)。當將釋放到細胞之胞質液中的麩胱甘肽水準比在細胞外空間更高時，修飾被逆轉，結果是寡核苷酸被切割。與使用不可逆的化學修飾所能獲得的選擇相比，使用可逆的麩胱甘肽敏感部分，可以將空間較大的化學基團引入感興趣的寡核苷酸中。這是因為這些較大的化學基團將在胞質液中被去除，因此不應干擾細胞胞質液內寡核苷酸的生物學活性。結果，這些較大的化學基團可以被設計以賦予核苷酸或寡核苷酸各種優點，例如核酸酶抗性、親脂性、電荷、熱穩定性、特異性和降低的免疫原性。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分的結構可以被設計以改變其釋放的動力學。
在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分連附至核苷酸的糖在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分連附至經修飾的核苷酸之糖的2'-碳。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分位於糖的5'-碳上，特別是當經修飾的核苷酸是寡核苷酸的5'-末端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分位於糖的3'-碳上，特別是當經修飾的核苷酸是寡核苷酸的3'-末端核苷酸時。在一些實施例中，麩胱甘肽敏感部分包含磺醯基。參見，例如於2016年8月23日提交的名稱為Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides and Uses Thereof的美國臨時申請號62/378,635，其相關揭露內容藉由引用併入本文。
IV.靶向配體
在一些實施例中，可以期望將本揭露之寡核苷酸靶向一個或多個細胞或一個或多個器官。這樣的策略可以幫助避免在其他器官中之不期望的作用，或者可以避免寡核苷酸在不會有益於寡核苷酸的細胞、組織或器官中的不當損失。因此，在一些實施例中，可以修飾本文所揭露之寡核苷酸以促進靶向特定組織、細胞或器官，例如促進寡核苷酸向肝臟的遞輸。在某些實施例中，本文所揭露之寡核苷酸可以被修飾以促進寡核苷酸向肝臟的肝細胞的遞輸。在一些實施例中，寡核苷酸包含與一個或多個靶向配體結合的核苷酸。
靶向配體可以包含碳水化合物、胺基糖、膽固醇、肽、多肽、蛋白或蛋白的部分(例如抗體或抗體片段)或脂質。在一些實施例中，靶向配體是適體。例如，靶向配體可以是用於靶向腫瘤血管系統或神經膠質瘤細胞的RGD肽、用於靶向腫瘤血管系統或氣孔的CREKA肽、運鐵蛋白，乳鐵蛋白或靶向CNS血管系統上表現之運鐵蛋白受體的適體，或靶向神經膠質瘤細胞上之EGFR的抗EGFR抗體。在某些實施例中，靶向配體是一個或多個GalNAc部分。
在一些實施例中，寡核苷酸的1個或更多個(例如1、2、3、4、5或6)核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施例中，寡核苷酸的2至4個核苷酸各自與單獨的靶向配體結合。在一些實施例中，靶向配體在正義或反義股的任一端與2至4個核苷酸結合(例如，配體在正義或反義股的5'或3'端與2至4個核苷酸的突出或延伸結合)，使得靶向配體類似於牙刷的刷毛，而寡核苷酸類似於牙刷。例如，寡核苷酸可在有義股的5'或3'端包含主幹-環圈，且主幹之環圈的1、2、3或4個核苷酸可分別與靶向配體結合。
在一些實施例中，可以期望將降低HBV抗原表現的寡核苷酸靶向個體的肝細胞。任何合適的肝細胞靶向部分均可用於該目的。
GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的高親和力配體，其主要在肝細胞的正弦表面表現，並在結合、內化作用和隨後循環醣蛋白(包含末端半乳糖或N-乙醯半乳胺糖殘基(去唾液酸糖蛋白))的清除中具有主要作用。GalNAc部分與本揭露之寡核苷酸的結合作用(間接或直接)，可用於將這些寡核苷酸靶向到在這些肝細胞上表現的ASGPR。
在一些實施例中，本即時揭露之寡核苷酸直接或間接結合至單價GalNAc。在一些實施例中，寡核苷酸直接或間接結合至一個以上的單價GalNAc(即，結合至2、3或4個單價GalNAc部分，且通常結合至3或4個單價GalNAc部分)。在一些實施例中，本即時揭露之寡核苷酸與一個或多個二價GalNAc、三價GalNAc或四價GalNAc部分結合。
在一些實施例中，寡核苷酸的1個或更多個(例如1、2、3、4、5或6個)核苷酸各自與GalNAc部分結合。在一些實施例中，主幹-環圈之環圈(L)的2至4個核苷酸各自與單獨的GalNAc結合。在一些實施例中，靶向配體在正義或反義股的任一端與2至4個核苷酸結合(例如，配體在正義或反義股的5'或3'端與2至4個核苷酸的突出或延伸結合)，使得GalNAc部分類似於牙刷的刷毛，而寡核苷酸類似於牙刷。例如，寡核苷酸可在有義股的5'或3'端包含主幹-環圈，且主幹之環圈的1、2、3或4個核苷酸可分別與GalNAc部分結合。在一些實施例中，GalNAc部分與有義股的核苷酸結合。例如，可以將四個GalNAc部分與有義股之四鹼基環圈中的核苷酸結合，其中每個GalNAc部分都與一個核苷酸結合。
在一些實施例中，本文之寡核苷酸包含連附至胍核苷酸的單價GalNAc，稱為[ademG-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所示：
Figure 109145408-A0305-12-0075-8
在一些實施例中，本文之寡核苷酸包含連附至腺嘌呤核苷酸的單價GalNAc，稱為[ademA-GalNAc]或2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示。
Figure 109145408-A0305-12-0075-9
例如，以下顯示這些結合作用的實例，其顯示了包含5'至3'的核苷酸序列GAAA(L=連接子，X=雜原子)主幹連附點的環圈。例如，這樣的環圈可以存在於例如圖20所示分子的位置27至30。在化學式中，
Figure 109145408-A0305-12-0075-41
是寡核苷酸股的連附點。
Figure 109145408-A0305-12-0076-10
可以使用適當的方法或化學(例如點擊化學)將靶向配體連接至核苷酸。在一些實施例中，使用點擊連接子(click linker)將靶向配體與核苷酸結合。在一些實施例中，基於縮醛的連接子用於將靶向配體與本文所述之任一寡核苷酸的核苷酸結合。基於縮醛的連接子已被揭露，例如公開於2016年6月23日的國際專利申請公開號WO2016100401 A1中，且其涉及這種連接子之內容，藉由引用併入本文。在一些實施例中，連接子是不穩定的連接子。然而，在其他實施例中，連接子是相當穩定的。
以下顯示了一個實例，為包含5'至3'核苷酸GAAA的環圈，其中GalNAc部分使用縮醛連接子連附至環圈的核苷酸。例如，這樣的環圈可以存在於例如圖20所示分子的位置27至30。在化學式中，
Figure 109145408-A0305-12-0076-12
是寡核苷酸股的連附點。
Figure 109145408-A0305-12-0077-13
4.靶向HBV之其他GalNAc結合的治療性寡核苷酸
在一個實施例中，本發明之寡核苷酸是治療性寡核苷酸，其靶向HBV mRNA，並且透過靶向結合物(諸如二價、三價或四價的GalNAc簇(圖1中的示例))之去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的結合作用，改善向肝臟，特別是向肝細胞的遞輸。WO2015/173208描述了靶向HBV mRNA的此類GalNAc結合的反義寡核苷酸(SEQ ID NO：1)及其製作。
在本發明之醫藥組合中，經GalNAc結合之治療性寡核苷酸能夠降低HBV mRNA(目標核酸)的表現，特別是均由SEQ ID NO：1編碼的B型肝炎病毒之HBsAg和HBx的表現。此外，本發明之經GalNAc結合之治療性寡核苷酸，優選地能夠從染色體整合的HBV片段降低HBsAg表現。
在一些實施例中，本發明之經GalNAc結合之治療性寡核苷酸與目標核酸結合，且與正常表現水準相比，降低表現至少10%或20%，更優選地與正常表現水準相比，降低表現至少至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%(例如在不存在GalNAc結合的治療性寡核苷酸的表現水準)。
在一個實施例中，本發明之經GalNAc結合之治療性寡核苷酸能夠下調(例如抑制、降低或去除)HBx或HBsAg基因的表現。這種調降通常可以發生在目標細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞，特別是在HBV感染的肝細胞中。在一些實施例中，與正常表現水準相比，本發明之經GalNAc結合之治療性寡核苷酸結合至目標核酸，並影響至少50%表現的抑制，更優選地與正常表現水準相比，影響至少60%、70%、80%、90%或95%的抑制(例如在不存在GalNAc結合的治療性寡核苷酸的表現水準)。可以使用「材料和方法」部分中所描述的方法確定HBV mRNA和HBsAg和HBV DNA的表現水準的調節。
本發明之一方面涉及治療性寡核苷酸，其包含長度為12至30個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與SEQ ID NO：1之位置1530至1602具有至少90%的互補性。
在本發明的一個實施例中，治療性寡核苷酸與選自SEQ ID NO：1之位置1530至1602、1530至1598、1530至1543、1530至1544、1531至1543、1551至1565、1551至1566、1577至1589、1577至1591、1577至1592、1578至1590、1578至1592、1583至1598、1584至1598、1585至1598及1583至1602的序列互補。特別是，與位置1530至1544、1531至1543、1583至1602和1583至1598的標靶序列有100%互補性的治療性寡核苷酸是有利的。
在某些實施例中，治療性寡核苷酸包含長度為12個至30個核苷酸的連續序列，該連續序列與目標核酸或標靶序列的區域至少91%互補，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，99%或100%互補。
如果連續核苷酸序列與標靶序列中的連續序列(選自由以下各項所組成之群組：SEQ ID NO：1之位置1530至1602、1530至1598、1530至1543、1530至1544、1531至1543、1551至1565、1551至1566、1577至1589、1577至1591、1577至1592、1578至1590、1578至1592、1583至1598、1584至1598、1585至1598或1583至1602)完全互補(100%互補)，或在一些實施例中，可在治療性寡核苷酸和標靶序列之間包含一個或兩個錯配，這會是有利的。
在本發明的一個實施例中，經GalNAc結合之反義寡核苷酸，其長度為13至20個核苷酸，具有至少12個核苷酸的連續核苷酸序列，其與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28的位置1530至1602的連續序列100%互補。應當理解的是，如關於TLR7促效劑部分所述，該化合物與TLR7促效劑結合。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為13至24個核苷酸，例如長度為13至22，例如14至20個連續核苷酸。於一較佳實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為13至18，例如15至18個核苷酸。
在一些實施例中，其連續核苷酸序列包含或由以下各項組成：長度為12至20個核苷酸，例如12至18，例如13至17，例如13至15個核苷酸，例如長度為13、14、15、16或17個核苷酸。應當理解的是，連續核苷酸序列始終等於或短於反義寡核苷酸的總長度，因為反義寡核苷酸可以包含另 外的核苷，例如，其用作連續核苷酸序列和結合物之間的生物可切割型連接子。應當理解的是，在本文中給定之所有範圍均包括範圍端點。據此，若本文所述之寡核苷酸包括12至30個核苷酸，則12及30個核苷酸均包含在內。
在一些實施例中，連續核苷酸序列包含或由以下各項所組成之群組中選擇的序列組成：gcgtaaagagagg(SEQ ID NO：2)；gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO：3)；cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)；agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)；agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO：10)；cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：12)；aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO：13)；aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)及gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：29)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為12至22個核苷酸，其具有至少12個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少90%的相同度，較佳地100%的相同度：gcgtaaagagagg(SEQ ID NO：2)； gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO：3)及cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，其具有至少12個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自以下之序列具有至少90%的相同度，較佳地100%的相同度：agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；或gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為12至22個核苷酸，其具有至少12個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少90%的相同度，較佳地100%的相同度：agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO：10)；cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：12)aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO：13)；aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)及gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：29)。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為12至22個核苷酸，其具有至少12個核苷酸之連續核苷酸序列，與選自由以下各項所組成之群組的序列具有至少90%的相同度，較佳地100%的相同度： aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：12)aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO：13)；aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)及gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：29)。
5.本發明之反義寡核苷酸的寡核苷酸修飾
在本節中討論的修飾，對於在本發明之反義寡核苷酸中的實施是特別優選的。
應當理解的是，例如可以修飾連續的核鹼基序列(模體序列)以增加核酸酶抗性及/或對目標核酸結合的親和力。
在一個實施例中，寡核苷酸的連續核鹼基序列包含至少一個經修飾之核苷間鍵聯。合適的核苷間修飾描述於「定義」部分中「經修飾之核苷間鍵聯」下。如果連續核苷酸序列內的至少75%(例如所有)的核苷間鍵聯是核苷間鍵聯，則會是有利的。在一些實施例中，寡核苷酸的連續序列中，所有的核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
用經修飾之核苷和DNA核苷來設計本發明之寡核苷酸。有利的是，使用高親和力經修飾之核苷。
在一個實施例中，寡核苷酸包含至少3個經修飾之核苷，例如至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個至少13個、至少14個、至少15個或至少16個經修飾之核苷。在一個實施例中，寡核苷酸包含3至8個經修飾之核苷，例如4至6個經修飾之核苷，例如4、5或6個核苷，例如5或6個經修飾之核苷。合適的修飾描述在「定義」部分中「經修飾之核苷」、「高親和力經修飾之核苷」、「糖修飾」、「2'糖修飾」和「鎖核酸(LNA)」下。
在一個實施例中，寡核苷酸包含一個或多個糖修飾的核苷，例如2’糖修飾的核苷。本發明之較佳的寡核苷酸包含一個或多個2’糖修飾的核苷，其獨立地選自由以下各項所組成的群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟基-ANA及LNA核苷。如果一個或多個或所有的經修飾之核苷是鎖核酸(LNA)，則會是有利的。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸，例如連續核苷酸序列，包含至少一個LNA核苷，例如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA核苷，例如2至6個LNA核苷，例如3至6個LNA核苷、4至6個LNA核苷或4、5或6個LNA核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸中至少75%經修飾之核苷是LNA核苷，例如至少80%，例如至少85%，例如至少90%經修飾之核苷是LNA核苷。在另一個實施例中，寡核苷酸中所有經修飾之核苷均為LNA核苷。在另一個實施例中，LNA核苷選自β-D-氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA、ScET及/或ENA於β-D或α-L構型或其組合。在另一個實施例中，所有LNA核苷均為β-D-氧基-LNA。在另一個實施例中，胞嘧啶單元是5-甲基-胞嘧啶。對於寡核苷酸或連續核苷酸序列的核酸酶穩定性而言，有利的是在核苷酸序列的5’端具有至少1個LNA核苷並且在核苷酸序列的3’端具有至少2個LNA核苷。
6.用於核糖核酸酶H招募的反義寡核苷酸設計
在本發明的一個實施例中，其中治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，當與目標核酸雜交時，本發明之寡核苷酸能夠招募核糖核酸酶H。
將經修飾之核苷(例如高親和力經修飾之核苷)併入寡核苷酸序列的模式，通常稱為寡核苷酸設計。
在本發明的一個實施例中，其中治療性寡核苷酸是反義寡核苷酸，有利的結構設計是缺口體設計，如在「定義」部分中，例如在「缺口體」、「LNA缺口體」、「MOE缺口體」、和「混合型翼缺口體」下所描述的。缺口體設計包括具有均質側和混合型翼側的缺口體。在本發明中，如果本發明之連續核苷酸序列是具有F-G-F’設計的缺口體，則會是有利的。在一些實施例中，缺口體是具有以下均質側設計3-7-3、3-8-2、3-8-3、2-9-4、3-9-3、3-10-3或5-10-5的LNA或MOE缺口體。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：3)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：4)；AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：5)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：6)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：7)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：8)；GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：8)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：9)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：10)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：11)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：12)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：13)AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：13)；及 AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：14)；其中大寫字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示DNA核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：3)及CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：4)；其中大寫字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示DNA核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，且具有由以下項所組成的連續核苷酸序列：AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：5)；或GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：6)；其中大寫字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示DNA核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列：AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：7)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：8)；GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：8)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：9)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：10)； CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：11)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：12)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：13)AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：13)；及AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：14)；其中大寫字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示DNA核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項組成：長度為12至22個核苷酸，且具有選自由以下項所組成之群組的連續核苷酸序列：AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：12)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：13)AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：13)；及AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：14)；其中大寫字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，而小寫字母表示DNA核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含以下項或由以下項組成：長度為20至24個核苷酸，其具有GCAGAggtgaagcgaAGTGC(SEQ ID NO：29)之連續核苷酸序列。
其中，劃有底線的大寫字母表示MOE核苷，而小寫字母表示DNA核苷。
以下表1總結了靶向SEQ ID NO：1之位置1530至1602的反義寡核苷酸之連續核苷酸序列的模體序列，以及這些意圖用於本發明的缺口體設計。
表1
Figure 109145408-A0305-12-0087-14
在表1的「設計」欄中，大寫字母表示2'-糖修飾的核苷，特別是LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA或MOE核苷，而小寫字母表示DNA核苷。核苷間鍵聯可以是磷酸二酯或硫代磷酸酯。在一些實施例中，所有核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯。
在所有情況下，反義寡核苷酸還可在F-G-F’設計的5’或3’端進一步包括區域D’及/或D”，如「定義」部分中「寡核苷酸中的區域D’或D”」下所描述的。在一些實施例中，本發明的反義寡核苷酸在缺口體區域的5'或3'端具有1至5個(例如1、2或3個)磷酸二酯連接的核苷單元，例如DNA單元。DNA核苷通常具有如核鹼基定義所定義的核鹼基，例如自然產生的DNA核苷，其具有選自嘌呤(例如腺嘌呤和鳥嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧 啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的核鹼基。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸是由兩個5’磷酸二酯連接的DNA核苷，後接如「定義」部分所定義的F-G-F’缺口體區域所組成。寡核苷酸在5’或3’端含有磷酸二酯連接的DNA單元，其適用於結合作用，並可以進一步包含本文所述的結合物部分。對於遞輸至肝臟的ASGPR靶向部分，其作為結合物部分是特別有利的。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含或由以下各項所組成之群組中選擇的序列組成：
cagcgtaaagagagg(SEQ ID NO：15)
cagcgtaaagagaggt(SEQ ID NO：16)
cacgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO：17)
caagaaggcacagacgg(SEQ ID NO：18)
cagagaaggcacagacgg(SEQ ID NO：19)
caagcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO：20)
cagaagtgcacacgg(SEQ ID NO：21)
cagcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO：22)
caagcgaagtgcacacg(SEQ ID NO：23)
cacgaagtgcacacg(SEQ ID NO：24)
caaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：25)
caaggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO：26)
caaggtgaagcgaagt(SEQ ID NO：27)
在位置1至3(從5’端開始)的核苷之間，其中核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯，並且在位置3和4的核苷之間，其核苷間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯(其中位置3之核苷是連續核苷酸序列的5’端)。如果在寡核苷酸之3’端 的位置4之後，所有的核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯鍵聯的話，則其會是有利的。在一個實施例中，連續核苷酸序列具有表1中相應序列的設計。
7.結合物結合至去唾液酸糖蛋白
能夠結合去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的結合物，對於靶向肝臟中的肝細胞特別有用。結合物包含至少兩個選自以下各項所組成之群組的碳水化合物部分：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖和N-異丁醯基半乳胺糖，其通常能夠結合至ASGPR。N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分已顯示出在靶向ASGPR方面是有利的，但也可以使用以上列之替代物，例如半乳糖。在一個實施例中，結合物由連接至間隔基的2至4個末端GalNAc部分組成，該間隔基將每個GalNAc部分連接至支鏈分子，從而形成可以結合至治療性寡核苷酸的簇。
例如，可以藉由將GalNAc部分透過其C-l碳連接至間隔基來生成GalNAc簇。優選的間隔基是柔性親水性間隔基(美國專利5885968；Biessen等人，J.Med.Chem.1995，卷39，第1538-1546頁)。優選的柔性親水性間隔基是PEG間隔基。優選的PEG間隔基是PEG3間隔基。分支點可以是允許兩個至三個GalNAc部分(或其他去唾液酸糖蛋白受體靶向部分)連附並且進一步允許分支點與寡核苷酸連附的任何小分子，此類構建體稱為GalNAc簇或GalNAc結合物。示例性的分支點基團是二離胺酸。二離胺酸分子包含三個胺基和羧基反應基團，透過該三個胺基可連接三個GalNAc部分或其他去唾液酸糖蛋白受體靶向部分，而透過該羧基反應基團可將二離胺酸連附至寡聚物。Khorev等人，2008 Bioorg.Med.Chem.，卷16，第5216頁中也描述了合適之三價支鏈的合成。其他商業上可獲得的支鏈是1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊醯胺基]丙基-2-[((2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1920-xx)；三-2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧 甲基]乙基-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1922-xx)及三-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]亞甲氧基丙基-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺；和1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲氧基)戊醯胺基]-3-[5-氟甲氧基-羰基-氧基-戊醯胺基]-丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1925-xx)。其他GalNAc簇可以是連附有GalNAc部分的小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；與肝細胞上去唾液酸糖蛋白受體結合的糖三肽，參見，例如，Duff等人，Methods Enzymol,2000,313,297；離胺酸為基礎的半乳糖簇(例如，L3G4；Biessen等人，Cardovasc.Med.,1999,214)；以及膽烷為基礎的半乳糖簇(例如，去唾液酸糖蛋白受體的碳水化合物識別模體)。
在本發明的一個實施例中，將本發明之治療性寡核苷酸結合至GalNAc簇，以改善該寡核苷酸的藥理學，例如，藉由影響細胞分佈，特別是寡核苷酸在肝細胞中的細胞攝入。
合適的GalNAc結合物是能夠結合至去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的那些，例如二價、三價或四價GalNAc簇。特別是，三價N-乙醯半乳胺糖結合物適合用於與ASGPR結合，參見例如WO 2014/076196、WO 2014/207232、WO 2014/179620、WO 2016/055601和WO 2017/178656(藉由引用併入本文)。圖1是合適的GalNAc結合物代表，其已至少進行了體外測試。然而，如果替代的GalNAc結合物能夠結合去唾液酸糖蛋白受體，那麼它們也可能是合適的。此類結合物用於增強寡核苷酸向肝臟的攝入，同時減少其在腎臟中的存在，從而增加經GalNAc結合之寡核苷酸之肝臟/腎臟比率(與相同寡核苷酸的非經結合之形式相比)。
可以使用本領域已知的方法將GalNAc簇連附至寡核苷酸的3'-或5'-端。在一個實施例中，GalNAc簇連接至寡核苷酸的5'-端。
可以在結合物(例如在結合物部分的支鏈部分)和寡核苷酸之間插入一個或多個連接子。在結合物部分和治療性寡核苷酸之間具有生物可切割型連接子是有利的，任選地可與不可切割型連接子(例如C6連接子)結合。該連接子可以選自描述於「定義」部分中「連接子」下的連接子，特別是生物可切割型區域D’或D”的連接子是有利的。在結合物和缺口體或連續核苷酸序列之間，具有生物可切割型連接子之經GalNAc結合之寡核苷酸，是有效地前藥，由於GalNAc簇和生物可切割型PO連接子一旦進入細胞中，就會從缺口體或連續核苷酸序列中被去除。
在一個實施例中，結合物部分是三價N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)，例如圖1所示的那些。
在一個實施例中，其中與經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgs A s G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G s T-3' SEQ ID NO：16
5'-GN2-C6ocoao m C s G s m C s gstsasasasgsasgsas G s G s T-3' SEQ ID NO：17
5'-GN2-C6ocoao A s G s A s asgsgscsascsasgsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：18
5'-GN2-C6ocoao G s A s G s asasgsgscsascsasgsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：19
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：20
5'-GN2-C6ocoao G s A s A s gstsgscsascsas mcs G s G-3' SEQ ID NO：21
5’-GN2-C6ocoao G s A s A sgstsgscsascsas m C s G s G-3’ SEQ ID NO：21
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s asasgstsgscsascsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：22
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascs A s m C s G-3' SEQ ID NO：23
5'-GN2-C6ocoao m C s G s A s asgstsgscsascsas m C s G-3' SEQ ID NO：24
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasasgs T s G s m C-3' SEQ ID NO：25
5’-GN2-C6ocoao A s G sgstsgsasasgs mcsgsas A s G s T s G-3' SEQ ID NO：26
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasas G s T s G-3' SEQ ID NO：26及
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsas A s G s T-3' SEQ ID NO：27
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在一個實施例中，其中與經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G stsasasasgsasgs A s G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G s T-3' SEQ ID NO：16及
5'-GN2-C6ocoao m C s G s m C s gstsasasasgsasgsas G s G s T-3' SEQ ID NO：17
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在一個實施例中，其中經GalNAc結合之反義寡核苷酸是
5'-GN2-C6ocoao A s G s A s asgsgscsascsasgsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：18或
5'-GN2-C6ocoao G s A s G s asasgsgscsascsasgsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：19
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在一個實施例中，其中與經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：20
5'-GN2-C6ocoao G s A s A s gstsgscsascsas mcs G s G-3' SEQ ID NO：21
5’-GN2-C6ocoao G s A s A sgstsgscsascsas m C s G s G-3’ SEQ ID NO：21
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s asasgstsgscsascsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：22
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascs A s m C s G-3' SEQ ID NO：23
5'-GN2-C6ocoao m C s G s A s asgstsgscsascsas m C s G-3' SEQ ID NO：24
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasasgs T s G s m C-3' SEQ ID NO：25
5’-GN2-C6ocoao A s G sgstsgsasasgs mcsgsas A s G s T s G-3' SEQ ID NO：26
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasas G s T s G-3' SEQ ID NO：26及
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsas A s G s T-3' SEQ ID NO：27
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在一個實施例中，其中與經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasasgs T s G s m C-3' SEQ ID NO：25
5’-GN2-C6ocoao A s G sgstsgsasasgs mcsgsas A s G s T s G-3' SEQ ID NO：26
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsasas G s T s G-3' SEQ ID NO：26及
5'-GN2-C6ocoao A s G s G s tsgsasasgs mcsgsas A s G s T-3' SEQ ID NO：27
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在一個實施例中，其中與經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G stsasasasgsasgs A s G s G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G s m C s G s tsasasasgsasgsas G s G s T-3' SEQ ID NO：16
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascsas m C s G s G-3' SEQ ID NO：20
5'-GN2-C6ocoao A s G s m C s gsasasgstsgscsascs A s m C s G-3' SEQ ID NO：23及
5’-GN2-C6ocoao A s G sgstsgsasasgs mcsgsas A s G s T s G-3' SEQ ID NO：26
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物。
在下表2中，顯示在5’端具有生物可切斷型CA連接子(如果存在)的反義寡核苷酸序列，以及顯示靶向SEQ ID NO：1之位置1530至1602的經GalNAc結合之反義寡核苷酸。
Figure 109145408-A0305-12-0094-22
Figure 109145408-A0305-12-0095-23
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧基-LNA單元；劃有底線的大寫字母表示MOE；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物(圖1D)。化合物15_至27_1全部描述在WO2015/173208中，化合物29_1描述在WO2014/179627中，一些化合物也列於表2所示的圖中。
8.TLR7促效劑
本發明之TLR7促效劑是具有類鐸受體促效活性的3-取代的5-胺基-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮化合物及其前藥。WO 2006/066080、WO 2016/055553和WO 2016/091698描述了此類TLR7促效劑及其前藥和它們的製造(藉由引用併入本文)。
在本發明的一個方面，本發明之醫藥組合中的TLR7促效劑由式(I)表示：
Figure 109145408-A0305-12-0096-24
其中，X為CH2或S；R1為-OH或-H及R2為1-羥丙基或羥甲基；或式(II)：
Figure 109145408-A0305-12-0096-25
其中，X為CH2或S；R1為-OH或-H或乙醯氧基，及R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
式(I)化合物是活性TLR7促效劑。
在本發明的一個實施例中，式(I)的活性TLR7促效劑的子集合由式(V)表示：
Figure 109145408-A0305-12-0097-26
其中，R1為-OH且R2為1-羥丙基或羥甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在本發明的一個實施例中，式(I)或式(V)中R2上的取代基選 自：
Figure 109145408-A0305-12-0097-27
、
Figure 109145408-A0305-12-0097-28
、
Figure 109145408-A0305-12-0097-29
及
Figure 109145408-A0305-12-0097-30
式(II)化合物是TLR7促效劑前藥。在一個實施例中，該前藥是在R2上具有取代基的單一前藥(single prodrug)，其選自：
Figure 109145408-A0305-12-0097-31
在另一個實施例中，前藥是在R2上具有取代基的雙重前藥(double prodrug)，其選自：
Figure 109145408-A0305-12-0097-32
式(II)之TLR7促效劑前藥的子集合由式(III)表示：
Figure 109145408-A0305-12-0097-33
其中，R1為-OH或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1- 羥甲基或
Figure 109145408-A0305-12-0098-34
或
Figure 109145408-A0305-12-0098-35
或
Figure 109145408-A0305-12-0098-36
。
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物；或式(IV)：
Figure 109145408-A0305-12-0098-37
其中，R1為乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基或
Figure 109145408-A0305-12-0098-38
 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
如同式(III)之化合物，式(IV)之化合物是雙重前藥，其中R1為OH且R2為1-乙醯氧基丙基。式(III)之化合物，其中R1是乙醯氧基且R2是三重前藥(triple prodrug)。
在投予後，式(II)、式(III)或式(IV)之化合物被代謝為其活性形式，其為有用的TLR7效劑。
在一個實施例中，在本發明之醫藥組合中使用的TLR7促效劑選自以下相所組成之群組：[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基]乙酸酯(CMP ID NO：VI)； 5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：VII)；5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：VIII)；5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：IX)；5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：X)；5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：XI)；[(S)-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基]乙酸酯(CMP ID NO：XII)及(1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯(CMP ID NO：XIII)及其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
表3列出了本發明中的TLR7促效劑，包括描述其製備的參考文獻。
Figure 109145408-A0305-12-0099-39
Figure 109145408-A0305-12-0100-40
在特別優選的實施例中，TLR7促效劑是CMP ID NO：VI。
9.醫藥組成物
在另一方面，本發明提供之醫藥組成物包含任一上述治療性寡核苷酸或TLR7促效劑或其鹽以及一種藥學上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。在一個實施例中，本發明之醫藥組合中的治療性寡核苷酸和TLR7促效劑是以單獨的組成物投予。在一個實施例中，將治療性寡核苷酸調製在磷酸鹽緩衝液中，用於皮下投予，並將TLR7促效劑調製為錠劑，用於口服投予。
本發明之醫藥組合中的治療性寡核苷酸可與藥學上可接受之有效或惰性物質混合，用以製備醫藥組成物或製劑。組成物及用以形成醫藥組成物製劑的方法取決於若干標準，包括但不限於，投予途徑、疾病程度或要施予的劑量。治療性寡核苷酸之藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)，而醫藥上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在某些實施例中，治療性寡核苷酸之藥學上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，寡核苷酸用於藥學上可接受之稀釋劑的濃度為50至150mg/ml溶液。治療性寡核苷酸或醫藥組成物包含藉由腸胃外途徑投予的治療性寡核苷酸，該腸胃外途徑包括靜脈、動脈、皮下或肌內注射或輸注。在一個實施例中，寡核苷酸結合物為靜脈投予。對於治療性寡核苷酸，如果將其皮下投予是有利的。在一些實施例中，本發明的寡核苷酸結合物或醫藥組成物以0.5~6.0mg/kg，例如0.75~5.0mg/kg，例如1.0~4mg/kg的劑量投予。可以每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或間隔更長的時間投予。
對於本發明之醫藥組合中的TLR7促效劑，醫藥有效量之本發明之化合物是經腸道(例如口服或透過胃腸道)投予。本發明的TLR7促效劑化合物可以以任何方便之投予形式的單位劑量進行投予，例如以錠劑、粉劑、膠囊，溶液、分散劑，懸浮液、糖漿劑、噴霧、栓劑、凝膠、乳化劑。特別是，可以使用口服單位劑型，例如錠劑和膠囊。在一實施例中，醫藥有效量之本發 明之TLR7促效劑化合物將在每劑量約75~250mg，例如100~200mg，例如每劑150~170mg的範圍內。可以每天、每隔一天(QOD)或每週(QW)投予。
合適的載體和賦形劑是本領域技術人員眾所周知的，並且詳細描述在例如，Ansel，Howard C.等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems。Philadelphia：Lippincott，Williams & Wilkins，2004；Gennaro，Alfonso R.等人，Remington：The Science and Practice of Pharmacy。Philadelphia：Lippincott，Williams & Wilkins，2000；和Rowe，Raymond C.Handbook of Pharmaceutical Excipients.Chicago,Pharmaceutical Press,2005。
這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行投予。製劑的pH通常為介於3和11之間，更佳的是介於5和9之間或是介於6和8之間，最佳的是介於7和8之間，例如7至7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。
10.治療性寡核苷酸的配方
各種促進治療性寡核苷酸使用的配方已被開發出來，其可以適用於本發明之醫藥組合中使用的治療性寡核苷酸。例如，可使用使降解最小化、促進遞輸及/或攝入、或者為配方中的寡核苷酸提供另一種有益特性的配方，將寡核苷酸遞輸至個體或細胞環境。在一些實施例中，本文提供了包含第一藥物的醫藥組合，該第一藥物是包含減少HBV抗原(例如，HBsAg)表現之寡核苷酸(例如，單股或雙股寡核苷酸)的組成物。可以適當地調製這樣的組成物使得投予於個體時，在目標細胞的直接環境中或全身性地，能有足夠部分的寡核苷酸進入細胞以減少HBV抗原表現。如本文所揭露的，多種合適的寡核苷酸配方中的任一種皆可用於遞輸寡核苷酸以降低HBV抗原。在一些實 施例中，將本發明之醫藥組合的寡核苷酸調製在緩衝溶液中，例如磷酸鹽緩衝食鹽水溶液、脂質體、微胞結構和殼體。
具有陽離子脂質的寡核苷酸配方可用於促進寡核苷酸轉染到細胞中。例如，可以使用陽離子脂質(例如lipofectin)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子(例如，聚離胺酸)。合適的脂質包括Oligofectamine，Lipofectamine(美國生命技術公司)，NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(羅氏公司)，所有脂質均可根據製造商的說明使用。
因此，在一些實施例中，寡核苷酸配方包含脂質奈米顆粒。在一些實施例中，賦形劑包含脂質體、脂質、脂質複合體、微球、微粒、奈米球或奈米顆粒、或者其他可以調製用於向有需要之個體的細胞、組織、器官或身體投予(例如，參見，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press，2013)。
在一些實施例中，本文所揭露的配方包含賦形劑。在一些實施例中，賦形劑給予組成物之活性成分改善的穩定性、改善的吸收、改善的溶解性和/或治療性增強。在一些實施例中，賦形劑是緩沖試劑(例如，檸檬酸鈉、磷酸鈉、tris鹼或氫氧化鈉)或媒液(例如，緩衝溶液、凡士林、二甲基亞碸或礦物油)。在一些實施例中，將寡核苷酸凍乾以延長其保存期限，然後在使用前(例如，投予個體)製成溶液。因此，包含在本文所述的任何一種寡核苷酸之組成物中的賦形劑可以是凍乾保護劑(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或崩解溫度調節劑(例如，葡聚醣、聚蔗糖或明膠)。
在本發明之醫藥組合的一些實施例中，將包含寡核苷酸的組成物調製成與其意圖投予之途徑相容。投予途徑的實例包括腸胃外(例如，靜脈、皮內、皮下)、口服(例如，吸入)、經皮(局部)、經粘膜和直腸投 予。當本發明之醫藥組合中的寡核苷酸是RNAi寡核苷酸時，皮下配方是特別有利的。
適用於注射使用的醫藥組成物包括無菌水溶液(當藥物是水溶性時)或分散液，以及用於即時調配無菌注射溶液或分散液的無菌粉劑。合適的載體包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝液(PBS)。載體可以是水或溶劑或分散介質。溶劑或分散介質可包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物。在許多情況下，優選地在組成物中包括等張試劑(例如，糖)、多元醇(例如，甘露醇、山梨糖醇)和氯化鈉。可以藉由將所需量的寡核苷酸與所需的一種或上述列舉之成分的組合，摻入到選定的溶劑中來製備無菌注射溶液，然後過濾滅菌。
在本發明之醫藥組合的一些實施例中，儘管活性成分的百分比可以為總組成物之重量或體積的約1%至約80%或更多，組合物中的組成物可包含至少約0.1%或更多的治療劑(例如，用於減少HBV抗原表現的寡核苷酸)。製備此類醫藥配方領域的技術人員將考慮諸如溶解度、生體可用率、生物學半衰期、投予途徑、產品保存期限以及其他藥理學條件等因素，因此可能需要各種劑量及治療方案。
即使許多實施例係關於本文所揭露之任何寡核苷酸的肝臟靶向遞輸，但也可以考慮靶向其他組織。
11.醫藥組合和部分之套組
本發明的一個方面涉及一種醫藥組合，其將本文所述之靶向HBV的治療性寡核苷酸和TLR7促效劑分別調製於藥學上可接受之載體。
與單獨包含治療性寡核苷酸或TLR7促效劑相比，本發明的醫藥組合可以更有效地用於治療HBV感染。在一個實施例中，與單獨包含治療性 寡核苷酸或TLR7促效劑相比，本發明之醫藥組合可以用於更迅速地抑制HBV、延長抑制HBV的延續時間及/或在抑制HBV方面有更好的效果。可藉由HBsAg力價的降低來測量這些效果。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或TLR7促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更快的HBsAg力價降低。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或TLR7促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更持久的HBsAg力價降低。在一個實施例中，與單獨包含治療性寡核苷酸或TLR7促效劑相比，本發明之醫藥組合引起更多的HBsAg力價降低。
在本發明一個優選的實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：本文所述的RNAi寡核苷酸和TLR7促效劑。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：RNAi寡核苷酸和式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
Figure 109145408-A0305-12-0105-41
其中，X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
上文已經分別描述了本發明之RNAi寡核苷酸和TLR7促效劑，例如。在上述之部分1至3和8中。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合可以選自表4垂直列中之化合物以及水平列中之化合物。每個可能的組合都用「x」表示。
Figure 109145408-A0305-12-0106-42
以下表5和表6顯示RNAi寡核苷酸(垂直)和TLR7促效劑(水平)的選定組合。
Figure 109145408-A0305-12-0106-43
Figure 109145408-A0305-12-0107-44
在本發明的一個實施例中，醫藥組合選自以下各項所組成之群組：RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VII； RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：1及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：XIII；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在一個實施例中，本發明之醫藥組合的治療性寡核苷酸由RNAi寡核苷酸所組成，其為RNAi ID NO：7：一種用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現的寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之各者經結合至單價GalNac部分，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0109-46
；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0109-47
 且該TLR7促效劑為CMP ID NO：VI：
Figure 109145408-A0305-12-0110-48
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在特別優選的實施例中，醫藥組合包含RNAi寡核苷酸和TLR7促效劑，該TLR7促效劑為CMP ID NO：VI。
在一個實施例中，醫藥組合包含本發明之RNAi寡核苷酸和TLR7促效劑，進一步還包含CpAM(核心蛋白別構調節劑)。
在一個優選的實施例中，CpAM為根據化合物(CpAM1)。化合物(CpAM1)是CpAM，其藉由靶向HBV殼體用於在人類中治療及/或預防HBV，此揭露於WO2015132276中。化合物(CpAM1)的結構如下所示：
Figure 109145408-A0305-12-0110-49
其中R1為氫、鹵素或C1-6烷基； R2為氫或鹵素；R3為氫或鹵素；R4為C1-6烷基；R5為氫、羥C1-6烷基、胺基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；R6為氫、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-，X為羰基或磺醯基；Y為-CH2-、-O-或-N(R7)-，其中，R7為氫、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、C3-7環烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-鹵C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7環烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7環烷基-COOH、羥-CtH2t-、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；W為-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；n為0或1；m為0至7；t為1至7；或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物。
在另一個優選的實施例中，CpAM為根據化合物(CpAM2)或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。化合物(CpAM2)是CpAM，其藉由靶向HBV殼體用於在人類中治療和/或預防HBV，此揭露於WO2015132276的實例76中，並且可以依照其製備。化合物(CpAM2)的結構如下所示：
Figure 109145408-A0305-12-0112-50
在另一個優選的實施例中，CpAM是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-yl-1,4-二氫嘧啶-6-基]甲基]-3-側氧基-5,6,8,8a-四氫-1H-咪唑並[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸，此揭露於WO2015132276的實例76中，並且可以依照其製備。
在本發明的另一個實施例中，醫藥組合包含或由以下各項組成：長度為13至22個核苷酸的經GalNAc結合之反義寡核苷酸，其具有至少12個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與來自SEQ ID NO：1的位置1530至1602之連續序列100%互補，以及式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
Figure 109145408-A0305-12-0112-51
其中，X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基， 針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
上文已經分別描述了本發明之靶向HBV的經GalNAc結合之反義寡核苷酸和TLR7促效劑，例如，在上述之部分4至6和8中。
在本發明的一個實施例中，醫藥組合可以選自表7中垂直列中的化合物和水平列中的化合物。每個可能的組合都用「x」表示。
Figure 109145408-A0305-12-0113-52
以下表8和表9顯示經GalNAc結合之反義寡核苷酸(垂直)和TLR7促效劑(水平)的選定組合。
Figure 109145408-A0305-12-0114-53
Figure 109145408-A0305-12-0114-54
在本發明的一個實施例中，醫藥組合選自以下各項所組成之群組： CMP ID NO：15_1及VI、CMP ID NO：15_2及VI；CMP ID NO：16_1及VI；CMP ID NO：20_1及VI；CMP ID NO：23_1及VI；CMP ID NO：26_1及VI；CMP ID NO：29_1及VI；CMP ID NO：15_1及VII、CMP ID NO：15_2及VII；CMP ID NO：16_1及VII；CMP ID NO：20_1及VII；CMP ID NO：23_1、VII；CMP ID NO：26_1及VII；CMP ID NO：29_1及VII；CMP ID NO：15_1及VIII、CMP ID NO：15_2及VIII；CMP ID NO：16_1及VIII；CMP ID NO：20_1及VIII；CMP ID NO：23_1及VII；CMP ID NO：26_1及VIII；CMP ID NO：29_1及VIII；及CMP ID NO：15_1及XIII、CMP ID NO：15_2及XIII；CMP ID NO：16_1及XIII；CMP ID NO：20_1及XIII；CMP ID NO：23_1及XIII；CMP ID NO：26_1及XIII；CMP ID NO：29_1及XIII；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在一個實施例中，醫藥組合由圖5所示的CMP ID NO：15_1的經GalNAc結合之反義寡核苷酸組成，且TLR7促效劑是CMP ID NO：VI：
Figure 109145408-A0305-12-0115-55
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
在特別優選的實施例中，醫藥組合包含反義寡核苷酸，TLR7促效劑為CMP ID NO：VI。
術語「套組」或「部件套組」是指用於執行HBV感染受試者之治療的材料組裝，包含有關如何進行治療的說明。
本發明的一個方面是包含一種、兩種或多種治療性有效成分(例如藥物成分或藥物)的部件套組，其中兩種選自本文所述之治療性寡核苷酸和本文所述的TLR7促效劑。
本發明的一個實施例是部件套組，其包含如本文所述的治療性寡核苷酸和如本文所述的TLR7促效劑作為藥物成分。
在一個實施例中，本發明的套組包含第一藥物及第二藥物，該第一藥物是調製為用於皮下注射之本文所述的治療性寡核苷酸，該第二藥物是調製為用於口服投予之本文所述的TLR7促效劑。可以將治療性寡核苷酸調製成小瓶中的液體，劑量為一劑或多劑，或在載藥注射器中配成一種藥學上有效之劑量。或者，治療性寡核苷酸可以是凍乾粉末的形式，且套組包含用於製備注射用治療性寡核苷酸的溶劑。可以理解的是，所有用於注射的藥物都是無菌的。套組中的TLR7促效劑可以是錠劑形式(或口服投予的替代單位劑量形式，例如膠囊和凝膠)，每錠劑具有藥學上有效之單一劑量，該套組可包含多個錠劑。
在另一個實施例中，本發明的部件套組進一步包括包裝插頁，其說明將治療性寡核苷酸併以TLR7促效劑投予以治療B型肝炎病毒感染。特別是，包裝插頁說明慢性B型肝炎病毒感染之治療。
套組可僅包含一種藥物成分以及包裝插頁，說明其併以其他藥物成分來投予。在一個實施例中，本發明的部件套組包含或包括如本文所述之治療性寡核苷酸的第一藥物以及包裝插頁，該包裝插頁說明該第一藥物併以本文所述之TLR7促效劑作為的第二種藥物來使用，但該第二藥物需單獨購買。在另一個實施例中，本發明的部件套組包含或包括如本文所述之TLR7促效劑 的第一藥物以及包裝插頁，該包裝插頁說明該第一藥物併以本文所述之治療性寡核苷酸作為的第二種藥物來使用，但該第二藥物需單獨購買。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合可以併以第三或其他治療劑來使用，所述第三或其他治療劑可以包括在部件套組中或單獨提供。該其他治療劑可以是例如治療HBV感染的護理標準，特別是慢性HBV感染。
12.應用
本發明之醫藥組合是用於治療B型肝炎病毒感染，特別是治療慢性HBV患者。
本發明之醫藥組合可以用作治療劑和預防治療。
本發明之醫藥組合可以用作組合的B型肝炎病毒靶向療法和免疫療法。特別是，當用於在感染細胞中的HBV治療時，本發明之醫藥組合能夠影響以下一個或多個HBV感染參數：i)減少細胞的HBV mRNA，ii)減少血清中的HBV DNA及/或iii)減少HBV病毒抗原，例如HBsAg和HBeAg。在本發明的一個實施例中，與使用醫藥組合中之單個藥物成分進行治療時所能達到的效果相比，該一個或多個參數具有改善效果。
可以使用HBV感染的初代人類肝細胞或HBV感染的HepaRG細胞或ASGPR-HepaRG細胞，在體外測量對HBV感染的效果(參見例如PCT/EP2018078136)。還可以使用AAV/HBV小鼠模型在體內測量HBV感染的效果，該模型的小鼠感染了攜帶HBV基因組(AAV/HBV)的重組腺相關病毒(AAV)(Dan Yang等人2014 Cellular&Molecular Immunology 11,71-78)或HBV微型圓形小鼠(可在Covance Snangnai獲得，另見Guo等人2016 Sci Rep 6：2552和Yan等人2017 J Hepatology 66(6)：1149-1157)或人源化肝細胞PXB小鼠模型(可在PhoenixBio獲得，另請參見Kakuni等人2014 Int.J.Mol.Sci.15：58-74)。HBsAg及/或HBeAg之分泌的抑制可以藉由ELISA測定，例 如根據製造商的說明使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic)。HBV mRNA和pgRNA的減少可藉由qPCR測定，例如如「材料和方法」部分所述。評估測試化合物是否抑制HBV感染的其他方法，是藉由qPCR(例如WO 2015/173208中所述)或使用北方墨點法、原位雜交技術或免疫發光法來測定HBV DNA的分泌。
在本發明的一個實施例中，如本文所述之靶向HBV mRNA的治療性寡核苷酸和如本文所述之TLR7促效劑的醫藥組合，提供了優於單一化合物治療(單獨治療性寡核苷酸或單獨TLR7促效劑)的優勢。例如，優點可以是：i)與單一療法相比，血清HBV-DNA降低的時間延長；ii)與單一療法相比，HBsAg的反彈延遲及/或iii)治療範圍的延長。關於藥物的術語「治療範圍(therapeutic window)」或「藥物範圍(pharmaceutical window)」是可以有效治療疾病而沒有毒性作用的藥物劑量範圍。在本發明的一個實施例中，與單一療法相比，可以藉由組合治療達成治療範圍的增加。
在本申請的研究中，與使用單一療法時所需的劑量相比，已經觀察到使用組合治療時可以以低3至5倍的劑量獲得顯著改善的效果，且與較高劑量下的相同組合相比，組合治療以低3至5倍的劑量可以達到基本相同的效果。例如，已顯示對於單一療法而言，需要高劑量(7.5mg/kg抗HBV反義寡核苷酸或100mg每2天(QOD)的TLR7促效劑)才能有效減少HBsAg，當以較低劑量(1.5mg/kg和每週100mg(QW))組合使用時，HBsAg減少至檢測極限以下，且與較高劑量的單一療法相比，其反彈時間顯著延長。此外，當使用抗HBV治療性寡核苷酸以低5倍之劑量(1.5mg/kg vs 7.5mg/kg)併以TLR7促效劑以每週一次取代每隔一天(相當於劑量減少4倍)投予的醫藥組合時，病毒參數HBsAg的反彈可延遲至相同程度。對於HBV-DNA的減少，觀察到相似的結果。
本發明提供用以治療或預防HBV感染的方法，該方法包含對罹有或易於罹患HBV感染的個體，投予治療或預防有效量之本發明之醫藥組合。
本發明的另一方面涉及本發明之醫藥組合在抑制慢性HBV感染發展或治療的用途。
本發明的一個方面是一種治療感染HBV受試者的方法，例如受試者具有慢性HBV感染，該方法包括投予醫藥有效量之本文所定義的治療性寡核苷酸和醫藥有效量的式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
Figure 109145408-A0305-12-0119-56
其中，X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，對於式(II)而言，對於感染了HBV的受試者，R1是-OH或-H或乙醯氧基，R2是1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基。
本發明還涉及如本申請中所述的治療性寡核苷酸，其用作組合治療中的藥物。本發明還涉及如本申請中所述的TLR7促效劑，其用作組合治療中的藥物。
特別是，本文所定義的治療性寡核苷酸和式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
Figure 109145408-A0305-12-0120-57
其中，X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基；它們是用於治療B型肝炎病毒感染。
本發明的一個實施例是治療性寡核苷酸在製備用於治療B型肝炎病毒感染(例如慢性HBV病毒感染)之第一藥物中的用途，其中該第一藥物是如本申請中所述的治療性寡核苷酸，並且其中該第一藥物併以第二藥物投予，其中該第二藥物是如本申請中所述的TLR7促效劑。
在本發明的一個實施例中，含有治療性寡核苷酸的藥物組成物將以皮下劑量投予。在本發明的另一個實施例中，TLR7促效劑以口服劑量投予。由於藥物組成物將透過兩種不同的投予途徑進行投予，因此它們可以遵循不同的投予方案。
如本發明之醫藥組合通常是以有效量投予。
在一個實施例中，以1mg/kg至4mg/kg的劑量範圍皮下投予如本申請中所述的治療性寡核苷酸，每週一次或每月一次給藥，持續24至72週之間，例如36至60週之間，例如48週，並且每隔一天(QOD)以150至170mg的口服單位劑量投予本申請中所述的TLR7促效劑，持續8至26週，例如 10至24週，例如12或13週，隨後每週一次(QW)投予，持續24至48週，例如30至40週，例如35週。每隔一天投予之期間中，可能需要10到14週，例如12週的治療期間。在整個治療期間，TLR7促效劑的投予劑量數在60至100劑之間，例如在75至90劑之間，例如81、82、83或84劑。治療性寡核苷酸的投予劑量數在6至72之間，例如在9至15之間，例如12或48劑。
為了獲得最佳的組合效果，將治療性寡核苷酸和TLR7促效劑的投予間隔少於一個月，例如間隔少於一周，例如間隔兩天，例如在同一天。
13.使用方法
I.減少HBsAg表現
在一些實施例中，提供了用於將有效量之本發明的任何一種醫藥組合遞輸至細胞的方法，其包含本文所揭露之寡核苷酸，特別是本文所揭露之RNAi寡核苷酸，用以減少HBsAg的表現。本文所提供的方法可用於任何合適的細胞類型。在一些實施例中，細胞是表現HBV抗原的任何細胞(例如，肝細胞、巨噬細胞、單核細胞衍生的細胞、前列腺癌細胞、腦細胞、內分泌組織、骨髓、淋巴結、肺、膽囊、肝臟、十二指腸、小腸、胰腺、腎臟、胃腸道、膀胱、脂、軟組織和皮膚)。在一些實施例中，細胞是已經從個體獲得的初代細胞，且可以經歷有限次數的傳代，使得該細胞基本上保持其天然表型特性。在一些實施例中，寡核苷酸被遞輸至的細胞是離體的或體外的(即，可以被遞輸至培養中的細胞或該細胞所駐留的生物體)。在特定的實施例中，提供了用於向細胞遞輸醫藥組合的方法，該醫藥組合包含有效量之本文所揭露之任何一種寡核苷酸，特別是本文所揭露之一種RNAi寡核苷酸，用以僅在肝細胞中減少HBsAg的表現。
在一些實施例中，本文所揭露之醫藥組合中的寡核苷酸可以使用適當的核酸遞輸方法引入，該方法包括注射包含寡核苷酸的溶液、由被寡核 苷酸覆蓋的顆粒轟擊、將細胞或生物體暴露於包含寡核苷酸的溶液中或在存在寡核苷酸中將細胞膜的電穿孔。可以使用其他合適的方法將寡核苷酸遞輸至細胞，例如脂質媒介的載體轉運、化學媒介的轉運和陽離子脂質體轉染，例如磷酸鈣等。
抑制的結果可以藉由評估細胞或個體一種或多種特性的適當測定法，或者解由評估指示HBV抗原表現的分子(例如，RNA、蛋白質)的生化技術來證實。在一些實施例中，通過將HBV抗原的表現水準(例如，mRNA或蛋白質水準)與適當的對照(例如，未遞輸藥物組合或遞輸負調控的細胞或細胞群中之HBV抗原表現水準)進行比較，來評估本文提供之醫藥組合的寡核苷酸降低HBV抗原的表現水準的程度。在一些實施例中，HBV抗原表現的適當調控水準，可以是預定的水準或數值，如此便不需要每次都測量調控水準。預定的水準或數值可以採取多種形式。在一些實施例中，預定的水準或數值可以是單個截止值，例如中位數或平均值。
在一些實施例中，投予包含如本文所述之寡核苷酸的醫藥組合，特別是本文所述之RNAi寡核苷酸，可引起細胞中HBV抗原(例如，HBsAg)表現水準降低。在一些實施例中，與HBV抗原的適當控制水平相比，HBV抗原表現水準的降低可以是降低至1%或更低，5%或更低，10%或更低，15%或更低，20%或更低，25%或更低，30%或更低，35%或更低，40%或更低，45%或更低，50%或更低，55%或更低，60%或更低，70%或更低，80%或更低，或者90%或更低。合適的對照水準可以是未與包含本文所述之寡核苷酸(特別是RNAi寡核苷酸)之醫藥組合接觸的細胞或細胞群中HBV抗原表現的水準。在一些實施例中，在有限的期間後評估根據本文所揭露之方法，將本發明之醫藥組合的寡核苷酸遞輸至細胞的效果。例如，在將寡核苷酸引入細胞後至少8小時、12小時、18小時、24小時；或至少一、二、三、 四、五、六、七、十四、二十一、二十八、三十五、四十二、四十九、五十六、六十三、七十、七十七、八十四、九十一、九十八、105、112、119、126、133、140或147天後，可以在細胞中分析HBV抗原的水準。
在一些實施例中，HBV抗原(例如，HBsAg)表現水準的下降在投予後持續一段時間。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，HBsAg的可檢測之表現減少持續在7至70天的期間內。例如，在一些實施例中，在投予寡核苷酸後，可檢測的減少持續在10至70、10至60、10至50、10至40、10至30或10至20天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在20至70、20至60、20至50、20至40或20至30天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在30至70、30至60、30至50或30至40天的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在40至70、40至60、40至50、50至70、50至60或60至70天的期間內。
在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測之HBsAg表現的減少持續在2至21週的期間內。例如，在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在2至20、4至20、6至20、8至20、10至20、12至20、14至20、16至20或18至20週的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在2至16、4至16、6至16、8至16、10至16、12至16或14至16週的期間內。在一些 實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在2至12、4至12、6至12、8至12或10至12週的期間內。在一些實施例中，在投予本發明之醫藥組合的寡核苷酸後，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，可檢測的減少持續在2至10、4至10、6至10或8至10週的期間內。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合的寡核苷酸，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，其是以轉殖基因的形式被遞輸，該轉殖基因經工程改造以在細胞中表現寡核苷酸(例如，其正義和反義股)。在一些實施例中，本發明之醫藥組合的寡核苷酸，特別是當該寡核苷酸是反義寡核苷酸時，其是使用轉殖基因被遞輸，該轉殖基因經工程改造以表現本文所揭露之任何寡核苷酸可以使用病毒載體(例如，腺病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相關病毒或單純皰疹病毒)或非病毒載體(例如質體或合成的mRNA)遞輸轉殖基因。在一些實施例中，本發明之醫藥組合的轉殖基因可以直接注射至個體。
II.治療方法
本揭露之方面涉及用於減少HBsAg表現(例如，減少HBsAg表現)以治療個體HBV感染的方法。在一些實施例中，該方法可以包括向所需個體投予醫藥組合，該醫藥組合包含有效量之本文所揭露之任何一種寡核苷酸。本揭露提供了預防和治療方法，治療處於HBV感染風險(易於感染)及/或與HBV感染相關的疾病或病症之個體。
在某些方面，本揭露提供了藉由向個體投予治療劑(例如，治療組合、寡核苷酸或載體或編碼相同的轉殖基因)來在個體中預防如本文所述的疾病或病症的方法。在一些實施例中，特別是在治療組合之寡核苷酸是RNAi寡核苷酸的情況下，待治療的個體是將從HBsAg蛋白量減少(例如肝臟 中)中受有治療上之利益的個體。例如，可以藉由本領域已知的診斷或預後測定中的一種或組合(例如，鑑定肝硬化及/或肝臟發炎)來鑑定具有疾病或病症風險的個體。預防試劑的投予可以在疾病或病症的特徵性症狀的檢測或表現之前進行，使得疾病或病症可被預防或替代地延緩其發展。
本文所述之方法通常涉及向個體投予有效量的治療組合，即能夠產生期望之治療結果的量。治療上可接受的量可以是能夠治療疾病或病症的量。任何一位個體的合適劑量取決於某些因素，包括個體的身材、體表面積、年齡、要投予的特定組合物、組合物中的活性成分、投予時間和途徑、總體健康狀況和其他同時投予的藥物。例如，劑量可以在0.1mg/kg至12mg/kg的範圍內。劑量也可以在0.5至10mg/kg的範圍內。或者，劑量可以在1.0至6.0mg/kg的範圍內。劑量也可以在3.0至5.0mg/kg的範圍內。
在一些實施例中，藉由腸胃內(例如，口服，藉由胃飼管、藉由十二指腸飼管、藉由胃造口術或直腸)、腸胃外(例如，皮下注射、靜脈注射或輸注，動脈內注射或輸注、骨內輸注、肌內注射、腦內注射、腦室內注射、鞘內)、局部(例如，表皮、吸入、經由滴眼液或透過粘膜)或通過直接注射入目標器官(例如，個體的肝臟)向個體投予本文所揭露之治療組合的任何一種組成物。通常，本文所揭露之治療組合的寡核苷酸試通過靜脈或皮下投予。
如一組非限制性實例，本即時揭露之治療組合的寡核苷酸通常是每季(每三個月一次)、每兩個月(每兩個月一次)、每月或每週一次投予。例如，寡核苷酸可以每一、二或三週投予一次。寡核苷酸可以每天投予。
在一個優選的實施例中，本發明之RNAi化合物是靶向HBV的siRNA，其以0.1mg/kg至7mg/kg之間的劑量皮下投予，優選地在0.5mg/kg至6.5mg/kg之間，最優選地在1mg/kg至6mg/kg之間。在一個實施例中，該 劑量每兩週一次、每四周一次或每六週一次投予。在一個優選的實施例中，該劑量每月一次投予。在一個特別優選的實施例中，每月一次投予1mg/kg至6mg/kg之間的劑量。每月一次被理解為是指以大約一個日曆月的長度間隔投予連續劑量。
在一些實施例中，待治療的個體是人類或非人類的靈長類動物或其他哺乳動物個體。其他示例性的個體包括家養動物，例如狗和貓；家畜，例如馬、牛、豬、綿羊、山羊和雞等；以及例如小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠等動物。
實施例
本發明之以下實施例可與本文所述之任何其他實施例結合運用：
1.一種醫藥組合，其包含以下項或由以下項組成：治療性寡核苷酸、及式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
Figure 109145408-A0305-12-0126-58
其中，X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
2.如實施例1之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為RNAi寡核苷酸。
3.如實施例2之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為靶向HBV之寡核苷酸(RNAi ID NO：1)。
4.如實施例2或3之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為靶向HBsAg mRNA之寡核苷酸(RNAi ID NO：2)。
5.如實施例2至4中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為減少HBsAg mRNA表現之寡核苷酸(RNAi ID NO：3)。
6.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為包含長度為19至30個核苷酸的反義股之寡核苷酸，其中，該反義股包含與如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)中所示之HBsAg mRNA序列互補之區域(RNAi ID NO：4)。
7.實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含長度為19至30個核苷酸的反義股，其中，該反義股包含與如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO：33)中所示之HBsAg mRNA序列互補之區域(RNAi ID NO：5)。
8.實施例6或7之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸進一步包含長度為19至50個核苷酸的有義股，其中，該有義股與該反義股形成雙股螺旋區域。
9.如實施例8之醫藥組合，其中，該有義股包含與如UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ ID NO：34)中所示之序列互補之區域。
10.如實施例8或9之醫藥組合，其中，該有義股包含與如5'-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO：35)中所示之序列互補之區域。
11.如實施例9之醫藥組合，其中，該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO：36)中所示之序列。
12.如實施例9之醫藥組合，其中，該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO：37)中所示之序列組成。
13.如實施例9之醫藥組合，其中，該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列組成。
14.如實施例8至12中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股包含如ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO：39)中所示之序列。
15.如實施例8至14中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股包含如GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：40)中所示之序列。
16.如實施例8至14中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列組成。
17.如實施例8至14中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股由如GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：42)中所示之序列組成。
18.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中，該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，其中，該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，其中，該反義股及該有義股之各者包含一個或多個經2'-氟及2'-O-甲基修飾之核苷酸及至少一個硫代磷酸酯鍵聯，其中，反義股的5'-核苷酸的糖 的4'-碳包含磷酸酯類似物，並且其中，有義股經結合至一個或多個N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分。
19.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股經結合至一個或多個N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及至少三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯類似物。
20.如實施例19所示之醫藥組合，其中，該有義股包含介於在位置1與2的核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵聯。
21.如實施例19或20之醫藥組合，其中，該反義股包含介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21、及21與22之間的五個硫代磷酸酯鍵聯。
22.如實施例19至21中任一實施例之醫藥組合，其中，該反義股的5’-核苷酸具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0130-59
23.如實施例19至22中任一實施例之醫藥組合，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之一個或多個經結合至單價GalNAc部分。
24.如實施例23之醫藥組合，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之各者經結合至單價GalNAc部分。
25.如實施例24之醫藥組合，其中，該-GAAA-模體包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0130-60
 其中：L代表鍵結、點擊化學控點或長度為1至20個含連續共價鍵結原子的連接子，其選自由以下各項所組成之群組：取代和未取代之伸烷基(alkylene)、取代和未取代之伸烯基(alkenylene)、取代和未取代之伸炔基(alkynylene)、取代和未取代之伸雜烷基(heteroalkylene)、取代和未取代之伸雜烯基(heteroalkenylene)、取代和未取代之伸雜炔基(heteroalkynylene)、及其組合；並且X為O、S或N。
26.如實施例25之醫藥組合，其中，L為縮醛連接子。
27.如實施例25或26之醫藥組合，其中，X為O。
28.如實施例20之醫藥組合，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0131-61
29.如實施例8之醫藥組合，其中，該有義股在其3'端包含如下所示之主幹-環圈：S1-L-S2，其中，S1與S2互補，並且其中，L形成長度達至6個核苷酸的介於S1與S2之間之環圈。
30.如實施例29之醫藥組合，其中，L為四鹼基環圈。
31.如實施例29或30之醫藥組合，其中，L形成長度為4個核苷酸的介於S1與S2之間之環圈。
32.如實施例29至31中任一實施例之醫藥組合，其中，L包含GAAA所示之序列。
33.如實施例29至32中任一實施例之醫藥組合，其中，該主幹-環圈的L之達至4個核苷酸各自結合至單獨的GalNAc。
34.如實施例6至16中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸。
35.如實施例34之醫藥組合，其中，該經修飾之核苷酸包含2'-修飾。
36.如實施例35之醫藥組合，其中，該2'-修飾為選自以下各項之修飾：2'-胺基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基及2'-去氧-2'-氟-β-d-阿糖核酸。
37.如實施例6至16中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
38.如實施例6至16中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。
39.如實施例38之醫藥組合，其中，該至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
40.如實施例6至16中任一實施例之醫藥組合，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯類似物。
41.如實施例6至16中任一實施例之醫藥組合，其中，該寡核苷酸的至少一個核苷酸經結合至靶向配體。
42.如實施例41之醫藥組合，其中，該靶向配體為N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)部分。
43.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中：該有義股由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列組成，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸之各者經結合至單價GalNAc部分；並且該反義股由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列組成，且在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19包含經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22包含經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及包含介於在位置1與2的核苷酸之間、介於在位置2與3的核苷酸之間、介於在位置3與4的核苷酸之間、介於在位置20與21的核苷酸之間及介於在位置21與22的核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含甲氧基膦酸酯(MOP)(RNAi ID NO：6)。
44.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之寡核苷酸，該寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸；在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸之各者經結合至單價GalNAc部分，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0134-62
 ；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19包含經 2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22包含經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及包含介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0135-63
 (RNAi ID NO：7)。
45.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸具有如圖29A中所繪示之結構(RNAi ID NO：8)。
46.如實施例2至5中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為寡核苷酸HBV(s)-219(RNAi ID NO：9)。
47.如實施例1之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為長度為13至22個核苷酸的經GalNAc結合之反義寡核苷酸，其具有至少12個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與來自SEQ ID NO：1的位置1530至1602之連續序列為100%互補。
48.如實施例47之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列與選自由以下各項所組成之群組之標靶序列為100%互補：SEQ ID NO：1的位置1530至1598；1530至1543；1530至1544；1531至1543；1551至1565；1551至1566；1577至1589；1577至1591；1577至1592；1578至1590；1578至1592；1583至1598；1584至1598；1585至1598及1583至1602。
49.如實施例47或48之醫藥組合，其中，該連續核苷酸序列的長度為介於12至16個核苷酸之間。
50.實施例47至49中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組：gcgtaaagagagg(SEQ ID NO：2)；gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO：3)；cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)；agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)；agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO：10)；cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：12)aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO：13)；aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)及gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO：29)，或其醫藥上可接受之鹽。
51.如實施例47至50中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列為式5’-F-G-F’-3’之缺口體，其中，區域F及F’獨立地由2至5個經2’糖修飾之核苷酸組成，且界定該區域F及F’的5’及3’端，且G為介於6與10個DNA核苷之間的能夠招募核糖核酸酶H之區域。
52.如實施例51之醫藥組合，其中，該2’糖修飾核苷獨立地選自由以下各項所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA及LNA核苷。
53.如實施例51或52中任一實施例之醫藥組合，其中，該一個或多個2’糖修飾核苷為MOE核苷。
54.如實施例51或52中任一實施例之醫藥組合，其中，該一個或多個2’糖修飾核苷為LNA核苷。
55.如實施例54之醫藥組合，其中，該經修飾之LNA核苷選自氧-LNA、胺基-LNA、硫代-LNA、cET及ENA。
56.如實施例54或55之醫藥組合，其中，該經修飾之LNA核苷為氧-LNA，其具有下列2’-4’橋-O-CH2-。
57.如實施例56之醫藥組合，其中，該氧-LNA為β-D-氧-LNA。
58.如實施例54或55之醫藥組合，其中，該經修飾之LNA核苷為cET，其具有下列2’-4’橋-O-CH(CH3)-。
59.如實施例58之醫藥組合，其中，該cET為(S)cET，即6’(S)甲基-β-D-氧-LNA。
60.如實施例54或55之醫藥組合，其中，該LNA為ENA，其具有下列2’-4’橋-O-CH2-CH2-。
61.如實施例47至60中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸之連續核苷酸序列選自由以下各項所組成之群組：GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO：2)；GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO：3)；CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO：4)； AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO：5)；GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO：6)；AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：7)；GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO：8)；GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO：8)；GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO：9)；AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO：10)；CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO：11)；AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO：12)；AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO：13)AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO：13)；AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO：14)及GCAGAGgtgaagcgaAGTGC(SEQ ID NO：29)
其中，大寫字母表示LNA或MOE核苷且小寫字母表示DNA核苷。
62.如實施例47至61中任一實施例之醫藥組合，其中，連續核苷酸序列內的至少50%之該核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
63.如實施例47至62中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列內的所有核苷間鍵聯均為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
64.如實施例47至63中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸之GalNAc結合物為二價、三價或四價GalNAc簇。
65.如實施例64之醫藥組合，其中，該GalNAc結合物選自圖1B、1D或1J。
66.如實施例47至65中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸之GalNAc結合物及連續核苷酸序列是藉由包含兩、三、四或五個經磷酸二酯連接的DNA核苷之PO連接子共價連接的。
67.如實施例66的實施例之醫藥組合，其中，該PO連接子為反義寡核苷酸一部分且由胞嘧啶及腺嘌呤(CA)之二核苷酸序列加上至少兩個磷酸二酯鍵聯組成，該磷酸二酯鍵聯一個介於C與A之間且一個接至GalNAc簇。
68.如實施例47至67中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸長度為12至18個核苷酸。
69.如實施例47至68中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸選自由以下各項所組成之群組：
5'-GN2-C6ocoao G S m C S G S tSaSaSaSgSaSgSaS G S G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G S m C S G S tSaSaSaSgSaSgS A S G S G-3' SEQ ID NO：15
5'-GN2-C6ocoao G S m C S G S tSaSaSaSgSaSgSaS G S G S T-3' SEQ ID NO：16
5'-GN2-C6ocoao m C S G S m C S gStSaSaSaSgSaSgSaS G S G S T-3' SEQ ID NO：17
5'-GN2-C6ocoao A S G S A S aSgSgScSaScSaSgSaS m C S G S G-3' SEQ ID NO：18
5'-GN2-C6ocoao G S A S G S aSaSgSgScSaScSaSgSaS m C S G S G-3' SEQ ID NO：19
5'-GN2-C6ocoao A S G S m C S gSaSaSgStSgScSaScSaS m C S G S G-3' SEQ ID NO：20
5'-GN2-C6ocoao G S A S A S gStSgScSaScSaS mcS G S G-3' SEQ ID NO：21
5'-GN2-C6ocoao G S A S A SgStSgScSaScSaS m C S G S G-3’ SEQ ID NO：21
5'-GN2-C6ocoao G S m C S G S aSaSgStSgScSaScSaS m C S G S G-3' SEQ ID NO：22
5'-GN2-C6ocoao A S G S m C S gSaSaSgStSgScSaScS A S m C S G-3' SEQ ID NO：23
5'-GN2-C6ocoao m C S G S A S aSgStSgScSaScSaS m C S G-3' SEQ ID NO：24
5'-GN2-C6ocoao A S G S G S tSgSaSaSgS mcSgSaSaSgS T S G S m C-3'SEQ ID NO：25
5’-GN2-C6ocoao A S G SgStSgSaSaSgS mcSgSaS A S G S T S G-3' SEQ ID NO：26
5'-GN2-C6ocoao A S G S G S tSgSaSaSgS mcSgSaSaS G S T S G-3' SEQ ID NO：26及
5'-GN2-C6ocoao A S G S G S tSgSaSaSgS mcSgSaS A S G S T-3' SEQ ID NO：27
其中，大寫粗體字母表示β-D-氧-LNA單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯；上標m表示含有5-甲基胞嘧啶鹼基的DNA或β-D-氧-LNA單元；GN2-C6表示帶有C6連接子的GalNAc2結合物，或其醫藥上可接受之鹽。
70.如實施例47至69中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸為5’-Fig1J-o G S C S A S G S A SgSgStSgSaSaSgScSgSaS A S G S T S G S G-3’(圖2)，其中，劃有底線的大寫字母表示MOE單元；小寫字母表示DNA單元；下標「o」表示磷酸二酯鍵聯；下標「s」表示硫代磷酸酯鍵聯。
71.如實施例1至70中任一實施例之醫藥組合，其中，該TLR7促效劑為式(III)所示者：
Figure 109145408-A0305-12-0140-65
其中，R1為-OH或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
72.如實施例1至70中任一實施例之醫藥組合，其中，該TLR7促效劑為式(IV)所示者：
Figure 109145408-A0305-12-0140-66
其中，R1為乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基。
73.如實施例1至70中任一實施例之醫藥組合，其中，該TLR7促效劑為式(V)所示者：
Figure 109145408-A0305-12-0141-67
其中，R1為-OH且R2為1-羥丙基或羥甲基或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
74.如實施例1至73中任一實施例之醫藥組合，其中，該TLR7促效劑選自由以下各項所組成之群組：[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基]乙酸酯(CMP ID NO：VI)；5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(IS)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：VII)；5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：VIII)；5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMPID NO：IX)；5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：X)； 5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：XI)；[(S)-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]-環丙基-甲基]乙酸酯(CMP ID NO：XII)及(1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯(CMP ID NO：XIII)；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
75.如實施例2至46及71至74中任一實施例之醫藥組合，其中，包含RNAi寡核苷酸及TLR7促效劑之組合選自由以下組合所組成之群組：RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：1及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：9及CMP ID NO：VIII； RNAi ID NO：1及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：2及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：3及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：4及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：5及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：6及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：XIII，或RNAi ID NO：9及CMP ID NO：XIII；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
76.如實施例2至46及71至74中任一實施例之醫藥組合，其中，該RNAi寡核苷酸為RNAi ID NO：7：包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之各者經結合至單價GalNac部分，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0144-68
；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0144-69
 且該TLR7促效劑為CMP ID NO：VI：
Figure 109145408-A0305-12-0145-70
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
77.如實施例47至74中任一實施例之醫藥組合，其中，包含經GalNAc結合之反義寡核苷酸及TLR7促效劑之組合選自由以下組合所組成之群組：CMP ID NO：15_1及VI；CMP ID NO：15_2及VI；CMP ID NO：16_1及VI；CMP ID NO：20_1及VI；CMP ID NO：23_1及VI；CMP ID NO：26_1及VI；CMP ID NO：29_1及VI；CMP ID NO：15_1及VII；CMP ID NO：15_2及VII；CMP ID NO：16_1及VII；CMP ID NO：20_1及VII；CMP ID NO：23_1及VII；CMP ID NO：26_1及VII；CMP ID NO：29_1及VII；CMP ID NO：15_1及VIII；CMP ID NO：15_2及VIII；CMP ID NO：16_1及VIII；CMP ID NO：20_1及VIII；CMP ID NO：23_1及VII；CMP ID NO：26_1及VIII；CMP ID NO：29_1及VIII；CMP ID NO：15_1及XIII；CMP ID NO：15_2及XIII；CMP ID NO：16_1及XIII；CMP ID NO：20_1及XIII；CMP ID NO：23_1及XIII；CMP ID NO：26_1及XIII；及CMP ID NO：29_1及XIII，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
78.如實施例47至74中任一實施例之醫藥組合，其中，該經GalNAc結合之反義寡核苷酸為如圖5中所示之CMP ID NO：15_1且該TLR7促效劑為CMP ID NO：VI：
Figure 109145408-A0305-12-0146-71
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
79.如實施例1至78中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的。
80.如實施例79之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之鹽為金屬陽離子，其中較佳的是，該醫藥上可接受之鹽為Na+或K+。
81.如實施例1至80中任一實施例之醫藥組合，其中，如實施例1至79中任一實施例所述之治療性寡核苷酸及TLR7促效劑是以醫藥上可接受之載體來調製的。
82.如實施例81之醫藥組合，其中，該醫藥上可接受之載體為水。
83.如實施例1至82中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製於磷酸鹽緩衝液中的。
84.如實施例1至83中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該TLR7促效劑是調製用於口服投予的。
85.如實施例1至83中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於靜脈內注射的，且該TLR7促效劑是調製用於口服投予的。
86.如實施例2至46、75、76和79至83中任一實施例之醫藥組合，其中，該治療性寡核苷酸為調製用於皮下注射之siRNA且該TLR7促效劑是調製用於口服投予的。
87.如實施例1至86中任一實施例之醫藥組合，其中，該醫藥組合包含RNAi寡核苷酸及TLR7促效劑，其中，該醫藥組合進一步包含CpAM(核心蛋白別構調節劑)。
88.如實施例87之醫藥組合，其中，該CpAM具有根據下面所示的化合物(CpAM1)之式：
Figure 109145408-A0305-12-0147-72
其中R1為氫、鹵素或C1-6烷基；R2為氫或鹵素；R3為氫或鹵素；R4為C1-6烷基；R5為氫、羥C1-6烷基、胺基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；R6為氫、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-，X為羰基或磺醯基；Y為-CH2-、-O-或-N(R7)-， 其中，R7為氫、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、C3-7環烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-鹵C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7環烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7環烷基-COOH、羥-CtH2t-、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；W為-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；n為0或1；m為0至7；t為1至7；或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物。
89.如實施例87或88之醫藥組合，其中，該CpAM為化合物(CpAM2)
Figure 109145408-A0305-12-0148-73
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
90.一種醫藥組合，其包含RNAi寡核苷酸、TLR7促效劑及CpAM，其中，該RNAi寡核苷酸為RNAi ID NO：7：包含與反義股形成雙股螺旋區域的有義股之寡核苷酸，其中： 該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2，-氟修飾之核苷酸，在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸，及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該有義股上-GAAA-序列的核苷酸中之各者經結合至單價GalNAc部分，其中，該-GAAA-序列包含下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0149-74
；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸，在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸，及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20 與21及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中，該反義股的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有下列結構：
Figure 109145408-A0305-12-0150-75
 其中，該TLR7促效劑為CMP ID NO：VI：
Figure 109145408-A0305-12-0150-76
或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物；並且其中，該CpAM為化合物(CpAM2)：
Figure 109145408-A0305-12-0150-77
 或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
91.一種醫藥組成物，其包含如實施例1至90中任一實施例之醫藥組合。
92.一種部件套組，其包含如實施例1至90中任一實施例之治療性寡核苷酸和具有有關投予TLR7促效劑以治療B型肝炎病毒感染之說明的包裝插頁。
93.如實施例92之部件套組，其中，於該包裝插頁中所述之TLR7促效劑為如實施例1至90中任一項之TLR7促效劑。
94.如實施例92或93之部件套組，其中，該套組包含如實施例1至90中任一實施例之治療性寡核苷酸及如實施例1至90中任一實施例之TLR7促效劑。
95.如實施例92至94中任一實施例之部件套組，其中，該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該TLR7促效劑是調製用於口服投予的。
96.如實施例92至95中任一實施例之部件套組，其中，該包裝插頁說明慢性B型肝炎病毒感染之治療。
97.如實施例1至96中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式。
98.一種如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組用於治療B型肝炎病毒感染之用途。
99.如實施例98之用途，其中，待治療的B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染。
100.如實施例98或99中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的。
101.如實施例98至100中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的。
102.如實施例98至101中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的。
103.如實施例98至102中任一實施例之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑。
104.如實施例98至103中任一實施例之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及TLR7促效劑之投予。
105.如實施例98至104中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型。
106.如實施例98至105中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg。
107.如實施例98至106中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的。
108.如實施例98至107中任一實施例之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸。
109.如實施例98至108中任一實施例之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
110.如實施例98至109中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
111.如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其用於醫藥中。
112.如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組，其用於治療B型肝炎病毒感染。
113.如實施例111或112所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，待治療的B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染。
114.如實施例111至113中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的。
115.如實施例111至114中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的。
116.如實施例111至115中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的。
117.如實施例111至116中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑。
118.如實施例111至117中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予。
119.如實施例111至118中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型。
120.如實施例111至119中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且TLR7促效劑之劑量為150至170mg。
121.如實施例111至120中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的。
122.如實施例111至121中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸。
123.如實施例111至122中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
124.如實施例111至123中任一實施例所使用之醫藥組合、組成物或套組，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
125.一種治療性寡核苷酸在製造用於治療B型肝炎病毒感染的第一藥物中之用途，其中，該第一藥物為如實施例1至97中任一實施例之治療性寡核苷酸，並且其中，該第一藥物是併以第二藥物來投予的，其中，該第二藥物為如實施例1至97中任一實施例之TLR7促效劑。
126.一種如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組在製造藥物中之用途。
127.一種如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組在製造用於治療B型肝炎病毒感染之藥物中之用途。
128.如實施例125至127中任一實施例之用途，其中，待治療的B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染。
129.如實施例125至128中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的。
130.如實施例125至129中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的。
131.如實施例125至130中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的。
132.如實施例125至131中任一實施例之用途，其中，投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑。
133.如實施例125至132中任一實施例之用途，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予。
134.如實施例125至133中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型。
135.如實施例125至134中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg。
136.如實施例125至135中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的。
137.如實施例125至136中任一實施例之用途，其中，該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸。
138.如實施例125至137中任一實施例之用途，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
139.如實施例125至138中任一實施例之用途，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
140.一種用於治療B型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如實施例1至97中任一實施例之治療性寡核苷酸併以治療有效量之如實施例1至91或94至97中任一實施例之TLR7促效劑投予受B型肝炎病毒感染之個體。
141.一種用於治療B型肝炎病毒感染之方法，該方法包含將治療有效量之如實施例1至97中任一實施例之醫藥組合、組成物或套組投予受B型肝炎病毒感染之個體。
142.如實施例140或141之方法，其中，待治療的B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染。
143.如實施例140至142中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的。
144.如實施例140至143中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的。
145.如實施例140至144中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的。
146.如實施例140至145中任一實施例之方法，其中，投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑。
147.如實施例140至146中任一實施例之方法，其中，在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予。
148.如實施例140至147中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型。
149.如實施例140至148中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg。
150.如實施例140至149中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的。
151.如實施例140至150中任一實施例之方法，其中，該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸。
152.如實施例140至151中任一實施例之方法，其進一步包含將有效量之恩替卡韋投予該個體。
153.如實施例140至152中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
154.一種減少B型肝炎病毒表面抗原在細胞中的表現之方法，該方法包含將如實施例1至91中任一實施例之醫藥組合或組成物遞輸至該細胞。
155.如實施例154之方法，其中，該細胞為肝細胞。
156.如實施例154或155之方法，其中，該細胞是在體內。
157.如實施例154或155之方法，其中，該細胞是在體外。
158.如實施例154至157中任一實施例之方法，其中，該治療性寡核苷酸是以經工程改造以在該細胞中表現該寡核苷酸的轉殖基因形式遞輸的。
159.一種實質上如本文中所述並參照附圖之醫藥組合、組成物、套組、用途或方法。
實例
A部分：RNAi寡核苷酸的效果
實例A1有效之HBsAg表現的寡核苷酸抑製劑的開發
HBV表面抗原被識別作為RNAi為基礎療法的目標，以治療HBV感染。如圖20顯示的HBV基因組結構所示，HBsAg由從單一ORF轉錄的三個RNA分子所編碼。設計寡核苷酸是為了使一個或多個有助於HBsAg組裝(示例RNAi目標位在圖20中用「X」表示)的RNA轉錄本緘默化。在體外和體內設計並評估靶向HBsAg之寡核苷酸HBV-254。選擇HBV-254，且HBV-254是根據直接靶向四種HBV RNA種類之mRNA轉錄本的能力而設計 的。實驗中使用的HBV-254雙股螺旋寡核苷酸包含以下所示之序列(顯示5’至3’)的有義股：GUGGUGGACUUCUCUCAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：55)；以及以下所示之序列(顯示5’至3’)的反義股：UAUUGAGAGAAGUCCACCACGG(SEQ ID NO：56)。
對HDI小鼠進行單一劑量寡核苷酸HBV-254的評估，以證明皮下靶向HBsAg病毒轉錄本的能力(圖20)。如圖所示，HBV-254隨著劑量的增加而系統性地減少小鼠中HBsAg水準。在小鼠中進一步評估臨床前效力，採用QW×3給藥方案，以3mg/kg皮下投予HBV-254(圖23)。投予點在圖中用箭頭表示。在經過寡核苷酸治療和未經治療的對照小鼠中監測HBsAg水準，持續147天。在整個研究中，經治療之小鼠的HBsAg水準持續降低，在首次投予後約兩個月，其表現水準(相對於對照)顯示穩定在降低的基線水平。
藉由使用未經修飾之四鹼基環圈形式的寡核苷酸進行psiCHECK報告測定法，通過體外篩選鑒定出其他有效的靶向HBsAg之寡核苷酸。來自三個不同孔盤的結果如圖14所示。使用發光為基礎的報告測定法，在HeLa細胞中以三種濃度(1、10和100pM)評估包含HBV-254在內的每種寡核苷酸。與正調控(8、40和200pM)、負調控(1nM)和模擬轉染相比，每個孔盤的報告結果進一步顯示。以方框強調顯示的寡核苷酸按比例增加以用於體內測試，其中發現HBV-219和HBV-258是在HBV-254和從篩選所鑑定出的那些寡核苷酸中最有效的寡核苷酸。與HBV-254相比，HBV-219在效力上表現出多對數的改善，因此被選定進行進一步的評估。
實例A2序列保守性分析和經工程改造之錯配以增加整體治療效用
將實例A1中評估的幾種最有效的寡核苷酸與HBV基因型A-I的基因組序列進行比較。初步保守性分析的結果列於表10。如表所示，HBV-219在這些基因組中的保守性相對較低。然而，如果在引導股的位置15引入錯配(MM)，則保守性百分率將顯著提高(從66%增至96%)。生物信息學的策展和比對是使用來自GenBank公共數據庫的基因型B型肝炎病毒(HBV)序列數據(藉由引用併入本文)。
Figure 109145408-A0305-12-0159-78
隨後進行保守性分析，其聚焦於表10中的幾種寡核苷酸，並涉及更廣泛的檢索參數。例如，鑒於初步分析僅包括全長基因組序列，聚焦分析包括全長和部分(與目標位>80%相同度)的序列。此外，檢測的基因組數量從初步分析中的5628個增加到聚焦分析中的17000個以上。聚焦分析的結果與初步分析中觀察到的趨勢基本上一致(表11)。如圖15所示，並在圖中進一步說明，除非引導股在位置15的錯配被耐受，否則預期HBV-219對HBV基因型B、E、F、H和I無活性。
Figure 109145408-A0305-12-0159-79
Figure 109145408-A0305-12-0160-80
使用psiCHECK-2雙發光素酶報告系統評估HBV-217、HBV-219、HBV-254、HBV-255和HBV-258中各自在選定位置上錯配的影響。psiCHECK載體能夠監測與報告基因融合之目標基因表現的變化，其中活性RNAi降解融合構建體，從而產生相應的報告信號降低。圖16中的圖式概括地描述了這些測定法中使用的載體。親代部分報告序列包含120個鹼基對片段，該鹼基對片段來自基因型A(GenBank：AM282986.1)在S ORF中感興趣的目標位周圍。親代寡核苷酸雙股螺旋序列與報告質體在圖16所示的相應位，具有100%的同源性，其中錯配寡核苷酸雙股螺旋序列對報告質體具有單個錯配。圖17中顯示了所測試之寡核苷酸的親代和錯配序列，其與相應的親代部分報告序列對齊。
對於錯配測定的實例，所測試的寡核苷酸包含相同的修飾模式。根據圖17中各寡核苷酸顯示的編號方案，修飾係如下：在位置1之5'-甲氧基、膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷；在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置1與2、2與3、3與4、20與21以及21與22的核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。對每個親代和錯配子集的錯配位置都不同，如圖17中的方框所示。
每種寡核苷酸的psiCHECK2報告測定法歷時三天，其使用從1nM開始的6點、5倍系列稀釋轉染至HeLa細胞中。在第1天，以10,000個HeLa細胞/孔(96-孔)種入黑壁透明底的孔盤中(80%至90%融合)。在第2天，將載體DNA和RNAi分子在適量之無血清的Opti-MEM® I培養基中稀釋，並輕輕混合。將Lipofectamine® 2000輕輕混合後，取0.2μL稀釋到25μL之無血清的Opti-MEM® I培養基中，用於每個反應。將稀釋液輕輕混合並在室溫下孵育5分鐘。孵育5分鐘後，將等體積之稀釋的DNA和RNAi分子與稀釋的Lipofectamine® 2000合併。將合併的混合物輕輕混合，並在室溫下孵育20分鐘，以使複合體生成。隨後，將DNA-RNAi分子-Lipofectamine® 2000複合體添加到每個包含細胞和培養基的孔中，並藉由前後搖動孔盤來輕輕混合。然後將細胞在CO2培養箱中於37℃下進行孵育，直至準備好收穫細胞並測定目標基因。在第3天，將100μL的Dual-Glo試劑添加到每個孔中，混合並孵育10分鐘，然後讀取發光值。向每個孔中再添加100μL的Dual-Glo Stop&Glo，混合並孵育10分鐘，然後讀取發光值。為每個親代和錯配寡核苷酸生成劑量-反應曲線，以評估錯配對活性的影響。在表12中顯示每種寡核苷酸確定的EC50值以及其他規格。
表12.靶向HBsAg之寡核苷酸的錯配評估
Figure 109145408-A0305-12-0162-81
如相對EC50值所示，HBV-219雙股螺旋的體外劑量-反應曲線顯示，在引導股的位置15存在單個錯配的情況下，沒有活性損失。隨後的體內分析比較了HBV-219親代(此處稱為HBV(s)-219P1)和錯配寡核苷酸(此處稱為HBV(s)-219P2)，其證實引入錯配沒有產生活性損失(圖18)。如圖19顯示的單一劑量滴定圖所示，HBV-219錯配寡核苷酸雙股螺旋(HBV(s)-219P2)在投予體內後70天的期間被耐受。
圖20顯示具有併入錯配的HBV-219(在此稱為HBV(s)-219)，其經修飾之雙股螺旋結構的實例。根據圖17中各寡核苷酸顯示的編號方案，有義股橫跨有核苷酸1到36，且反義股橫跨有寡核苷酸1到22，後者之股從右到左的方向顯示編號。所示的雙股螺旋形式在有義股之位置36和反義股之位置1的核苷酸之間具有切口。有義股中的修飾如下：在位置3、8至10、12、13及17的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯；在位置27至30的2'-OH核苷酸； 在位置27的2'-胺基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc；及分別在位置28、29和30的2'-胺基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc。反義股中的修飾如下：在位置1的5'-甲氧基、膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯；在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置1與2、2與3、3與4、20與21以及21與22的核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。反義股在位置15包含併入的錯配。同樣如圖所示，雙股螺旋的反義股包含橫跨位置21至22的「GG」突出。
表13顯示有關HBV(s)-219和上述兩種前驅物(HBV(s)-219P1和HBV(s)-219P2)的詳細資訊。
Figure 109145408-A0305-12-0163-82
實例A3：HBV(s)-219前驅物的抗病毒活性
評估HBV(s)-219前驅物對HBV核心抗原(HBcAg)次細胞定位的治療效果。對NODscid小鼠進行HBV基因組的頭尾二聚體之流體動力學注射 (HDI)。HDI後2週開始用寡核苷酸治療。治療後從小鼠中分離出肝細胞進行免疫組織化學染色，其顯示HBV核心抗原(HBcAg)的表現急劇減少。
進行RNA定序以檢測HBsAg減弱(knockdown)對HBV病毒轉錄本整體表現的影響。在三輪每週一次、每次3mg/kg的劑量給藥後四天，從HDI小鼠中分離出肝細胞。從肝細胞中提取總RNA，並使用HiSeq平台進行Illumina定序。圖21B描述RNA定序結果，其中將檢測到的RNA轉錄序列與HBV RNA進行作圖(map)。其還描述HBV(s)-219及其前驅物的目標位，顯示寡核苷酸靶向pgRNA(3.5kb)、S1(2.4kb)及S2(2.1kb)轉錄本。結果顯示，與媒劑調控相比，用HBV(s)-219P1治療的結果是使所有HBV病毒轉錄本緘默化超過90%。
HBV(s)-219P1寡核苷酸之持續時間的效果在兩種不同的HBV小鼠模型中進行了檢測，一種是cccDNA依賴性的HDI模型，另一種是cccDNA依賴性的AAV模型。與用媒劑調控及靶向HBxAg mRNA之RNAi寡核苷酸相比，在HBV之HDI模型中進行三輪每週一次3mg/kg之劑量的靶向HBsAg mRNA之HBV(s)-219P1寡核苷酸給藥的治療情況下，對HBsAg mRNA表現的時間進程(12週)進行分析(圖22A)。HBV(s)-219P1寡核苷酸產生了
Figure 109145408-A0305-12-0164-104
3.9 log的減少，並具有超過7週之相對較長的活性持續期間；相比之下，HBV(x)靶向之寡核苷酸產生了約3.0 log的減少，且持續期間較短。
與用媒劑調控及靶向HBxAg mRNA之RNAi寡核苷酸相比，在AAV-HBV模型中進行三輪每週一次3mg/kg之劑量的靶向HBsAg mRNA之HBV(s)-219P2寡核苷酸給藥的治療情況下，對HBsAg mRNA表現的時間進程(12週)進行分析(圖22B)。在該模型中，HBV(s)-219P2寡核苷酸產生之對數的減少及持續時間與HBV(x)靶向之寡核苷酸相當。圖22A和22B中使用之靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸，具有 UGCACUUCGCGUCACCUCUAGCAGCCGAAAGGCUGC的有義股序列及UAGAGGUGACGCGAAGUGCAGG的反義股序列。該靶向HBxAg的RNAi寡核苷酸在本文中稱為GalXC-HBVX。
如上所述，與使用媒劑調控與靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸相比，使用如上述靶向HBsAg mRNA之HBV(s)-219前驅物寡核苷酸治療後，進行免疫組織化學染色以檢測從HBV的AAV-HBV模型和HDI模型中所取得之肝細胞中HBcAg的次細胞分佈。(圖23)在HDI模型中，治療後殘留的核心蛋白(HBcAg)在兩種RNAi寡核苷酸之間的次細胞定位上表現出顯著差異，但在AAV模型中無差異。
實例A4：在PXB-HBV嵌合人類肝臟模型基因型C中HBV(s)-219P1的評估
在PXB-HBV模型中評估HBV(s)-219P1的抗病毒活性，在HBV文獻中也稱為嵌合人類肝臟模型。該技術基於將人類肝細胞移植到嚴重免疫受損的小鼠中，然後使用遺傳機制使宿主鼠肝細胞中毒(Tateno等人，2015)。該過程導致小鼠含有>70%之源自人體組織的肝臟，與野生型小鼠不同，其可以感染HBV(Li等人，2014)。PXB-HBV模型在HBV(s)-219藥理學中可用於多種目的：(1)確認寡核苷酸可在體內與人類RNAi機制(RISC)接合，(2)確認靶向GalNAc配體構型可在體內經由人類ASGR內化進入肝細胞，以及(3)確認在真正HBV感染之模型的功效(與HBV表現的工程模型相反)。儘管移植人類肝細胞導致不規則的嵌合肝生理功能存在局限性(Tateno等人，2015)，但在該模型中可以觀察到顯著的抗病毒功效。
在小鼠初次感染HBV基因型C後約8週，收集每隻小鼠的血漿以作為基線HBsAg測定。然後，9隻小鼠的分群(n=3用於PK，n=6用於PD)每隻接受3輪每週一次之0(PBS)或3mg/kg HBV-219P1的SC注射。給 藥的第一天視為是第0天。每週進行非末端採血以確定每隻小鼠的血清HBsAg和循環HBV DNA的水準(圖24A至24D)。在第28天對小鼠實施安樂死用於期終的組織終點。分析第28天之肝臟樣本的肝內HBV DNA和cccDNA水準。在用HBV-219P1治療的小鼠中，分析的所有終點均觀察到顯著的抗病毒活性，包括HBsAg減少>80%，以及循環HBV DNA、肝內HBV DNA和cccDNA顯著的降低(圖24A至24D)。這些數據表明，在全身性地投予後，HBV(s)-219治療可在感染的人類肝細胞中引起抗病毒活性。
實例A5：HBV(s)-219P2增強恩替卡韋的抗病毒活性
在現行的護理標準中，核苷酸類似物(例如恩替卡韋)可有效減少循環HBV基因體DNA，但不能減少循環HBsAg。然而這種治療會導致可控制的病毒血症，需要終生治療且很少能實現功能性的治愈。靶向S抗原的RNAi寡核苷酸會影響病毒聚合酶和HBsAg蛋白。在這項研究中，在表現HBV之小鼠(HDI模型)中探討HBV(s)-219P2作為單一療法和與恩替卡韋的組合治療，針對抗病毒活性的組合效果。
每天投予小鼠口服劑量500ng/kg恩替卡韋(ETV)，持續14天。皮下投予單一HBV(s)-219P2。藉由qPCR測量循環病毒量(HBV DNA)(圖25A)，藉由ELISA測量血漿HBsAg水準(圖25B)，並且藉由qPCR測量肝臟HBV mRNA和pgRNA水準。可觀察到HBV-219P2和ETV組合療法有明顯的累加效果。結果顯示單獨的ETV療法對循環HBsAg或肝病毒RNA無效。此外，由HBsAg或HBV RNA測量到的HBV(s)-219P2抗病毒活性不受與ETV共給藥的影響(圖25B至25C)。
如圖25A至25C所示，相對於PBS治療的小鼠(n=6)，每天以500ng/kg的劑量口服給藥恩替卡韋14天的單一療法引起血漿中檢測到的HBV DNA平均降低~1.6 log。而循環HBsAg或肝病毒RNA均未見顯著的降 低。相對於PBS(n=7)，在第0天以單一劑量1mg/kg或3mg/kg皮下給藥HBV-219P2的單一療法，引起血漿中檢測到的HBV DNA分別平均降低~0.8 log或~1.8 log。在第0天以單一劑量6mg/kg皮下給藥HBV-219P2的單一療法，引起血漿中的HBV DNA平均降低~2.5 log，且兩隻小鼠中的水準降至檢測極限以下(n=7)。在第0天以單一劑量皮下給藥HBV-219P2的單一療法，引起循環HBsAg和肝病毒RNA兩者之劑量依賴性的降低。每天以500ng/kg的劑量口服恩替卡韋14天且在第0天以單一劑量1mg/kg皮下給藥HBV-219P2的組合療法，引起在血漿中檢測到的HBV DNA加成的平均減少~2.3 log。與單一劑量1mg/kg皮下給藥HBV-219P2的單一療法所觀察到的血漿HBsAg和肝病毒轉錄本水準的降低相似，其顯示血漿HBV DNA減少的加成性，但在循環HBsAg或肝病毒轉錄本則未顯示。
實例A6 HBV(s)-219P2和GalXC-HBVX的抗病毒活性比較
在這項研究中，對表現HBV之小鼠(HDI模型)投予HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX(與圖22A和22B中使用的GalXC-HBVX序列相同)或兩種RNAi寡核苷酸的組合，並在給藥後兩週或九週監測血漿HBsAg水準。如圖26B所示，在用單一飽和的9mg/kg劑量皮下給藥HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或兩者的組合治療後2週，觀察到相似的HBsAg抑制水準。在以靶向S之HBV(s)-219P2治療的小鼠中觀察到HBsAg的抑制時間延長，而用GalXC-HBVX或二者之組合治療的小鼠在治療後9週具有明顯的HBsAg恢復(n=3)。
也對接受HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或兩種RNAi寡核苷酸之組合的小鼠，評估表現HBV之小鼠中的HBV核心抗原(HBcAg)的次細胞定位。對表現HBV之小鼠(HDI模型)，用單一飽和劑量(9mg/kg，皮下)之HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1：1組合進行治療。在圖27A所示的時間 點，對肝臟切片進行HBcAg染色；顯示代表性的肝細胞。用HBV(s)-219P2治療的分群，無論是作為單一療法或組合GalXC-HBVX，在核HBcAg起作用。僅用GalXC-HBVS治療的分群，僅顯示HBcAg的胞質定位，據報告是治療反應的有利預後指標(Huang等人，J.Cell.Mol.Med.2018)。每隻動物中具有核染色之HBcAg陽性細胞的百分比顯示在圖27B中(n=3/組，每隻動物在給藥後2週計數50個細胞)。為了確認對HBcAg次細胞定位的影響是由於HBV轉錄組的區域，而不是由於RNAi序列的未知特性，設計並測試具有靶向X和S開讀框內的替代序列。(參見圖27C)。圖27C中使用HBV-254。HBV-254的序列描述於實例A1中。圖27C中使用之靶向HBxAg的替代寡核苷酸，具有GCACCUCUCUUUACGCGGAAGCAGCCGAAAGGCUGC之有義股序列以及UUCCGCGUAAAGAGAGGUGCGG之反義股序列。與圖26B中使用的RNAi寡核苷酸相比，這兩個替代RNAi寡核苷酸在S或X抗原中具有不同的RNAi標靶序列。然而，它們對血漿水準HBcAg表現出相同的差別效果，表明該效果對靶向S抗原本身俱有特異性，但對所使用的寡核苷酸則無特異性。
實例A7：在健康的人類個體中評估安全性、耐受性以及在HBV患者中評估HBV(s)-219的功效
本研究旨在在健康個體(A組)中評估安全性和耐受性以及在HBV患者中評估HBV(s)-219的功效(B組)。分群的劑量資訊顯示在圖28中。HBV(s)-219的分子結構如圖20、圖29A所示，並在下方顯示：
Figure 109145408-A0305-12-0169-83
患者選擇標準如下所示。
A組-健康個體
入選標準
1.簽署知情同意書時，年齡為18歲(或法律准許的年齡，以較大者為準)至65歲(含65歲)。
2.篩選時根據醫學評估(包括病史、體格檢查和實驗室檢查)確定明顯健康
a.沒有正在患病的症狀
b.體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓無臨床上顯著的異常
c.沒有臨床上顯著的心血管或肺部疾病，也沒有需要藥物治療的心血管或肺部疾病。
3.在篩選和第1天時，研究者認為12導聯心電圖(ECG)在正常範圍內或無床顯上顯著的異常
4.在篩選隨訪1和住院時(第1天)負向篩選濫用酒精或藥物者
5.在篩選隨訪1之前至少5年的非吸煙者，在篩選隨訪1時尿液尼古丁濃度為陰性
6.身體質量指數(BMI)在18.0至32.0kg/m2(含)的範圍內。
7.男性或女性：
a.男性參與者：
男性參與者必須同意在治療期間以及研究性介入的給藥後至少兩週內使用避孕藥，並且在此期間不能捐贈精子。
b.女性參與者：
如果女性參與者未懷孕、未哺乳且至少符合以下條件之一，則符合參加條件：不具有有生育能力的女性(WOCBP)，或者，取決於地區；從篩選後的研究招募開始持續整個治療期間，並在研究性介入的給藥後至少12週，同意遵循避孕指南的WOCBP。
8.能夠提供簽署的知情同意書1，其中包括遵守要求和限制。
排除標準，A組
1.任何可能干擾本研究藥物吸收、分佈或消除，或干擾本研究中臨床和實驗室評估的醫學病史，包括(但不限於)；慢性或複發性腎臟疾病、功能性腸病(例如頻繁的腹瀉或便秘)、胃腸道疾病、胰腺炎、癲癇、皮膚粘膜或肌肉骨骼疾病、自殺企圖或自殺觀念歷史記錄、或臨床上顯著的抑鬱症或其他神經精神病學需要藥物介入的疾病
2.高血壓控制不佳或不穩定；或篩選時持續收縮壓>150mmHg或舒張壓>95mmHg
3.胰島素或降血糖劑治療的糖尿病病史
4.過去12個月內需要住院的哮喘病史
5.根據中央研究實驗室的篩選結果確定的G-6-PD缺乏症的證據
6.目前內分泌疾病控制不佳，但甲狀腺疾病(甲狀腺機能亢進/甲狀腺功能低下等)除外，任何經過藥理治療的甲狀腺疾病均被排除。
7.如果參與者的惡性腫瘤在過去三年中通過化療完全緩解，並且沒有其他醫學或外科手術介入，則可以接受惡性腫瘤病史
8.多種藥物過敏史或對寡核苷酸或GalNAc的過敏反應史
9.對皮下注射不耐受的歷史或明顯的腹部疤痕，其可能會阻礙研究性介入的投予或局部耐受性的評估者
10.臨床上相關的手術史
11.過去3年內持續濫用乙醇(每天>40gm乙醇)或使用非法藥物的歷史。
12.研究性介入投予前7天內有臨床上顯著的疾病
13.在投予研究性介入之前的2個月內捐贈500mL以上的血液，或在篩選之前的7天內捐贈血漿
14.篩選時正處於重大感染或已知的發炎過程(研究者認為)
15.有慢性或複發性尿路感染(UTI)，或篩選前一個月內有UTI
16.計劃在研究進行期間進行選擇性外科手術
17.在進行研究性介入之前的4週內投予處方藥
18.在首次給藥後的7天內使用非處方(OTC)藥物或草藥補給品(常規維生素除外)，除非研究者和試驗委託者同意不具有臨床意義。
19.在給藥前3個月內已接受研究藥物，或在研究招募前正在進行另一項臨床研究追蹤。
20.篩選時對HBV、HIV、HCV或HDV抗體呈血清反應陽性(如果在篩選前3個月內進行，則可使用歷史檢測)
21.篩選隨訪或住院時(第1天)的丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)、總膽紅素、鹼性磷酸酶(ALP)或白蛋白超出參考範圍
22.研究者認為臨床上相關且無法接受的全血細胞計數測試異常；血紅蛋白<12.0g/dL(相當於120g/L)；血小板超出正常範圍。
23.血紅蛋白A1C(HbA1C)>7%
24.研究者認為其臨床上顯著且無法接受的任何其他安全實驗室測試結果
25.從進入臨床研究中心前的48小時到研究結束為止，已經進行或計劃進行運動水準的重大改變。
26.研究者認為之任何條件都可能使參與者不適合招募，或者可能干擾參與或完成研究。
具有B型肝炎的B組成人
B組入選標準
1.簽署知情同意書時，年齡為18歲(或法律准許的年齡，以較大者為準)至65歲(含65歲)。
2.慢性B型肝炎感染，記錄於：
a.與CHB兼容的臨床病史，根據兼容的臨床資訊，以及先前對HBsAg和可能的其他HBV血清學標誌物(HBeAg,HBV DNA)的血清陽性
b.對HBeAg陽性患者進行篩選時血清HBsAg>1000IU/mL，或對HBeAg陰性患者>500IU/mL
c.篩選時對未接受過治療的患者在中心研究實驗室藉由TaqManTM HBV DNA v2.0測定法，測定血清HBV DNA>20,000IU/mL
d.血清IgM抗HBc陰性
3.臨床病史與代償性肝病兼容，無肝硬化跡象：
a.無食道或胃腸道靜脈曲張出血史
b.無腹水史
c.無因慢性肝病引起的黃疸病史
d.無肝性腦病病史
e.無門脈高壓的生理特徵-蜘蛛狀血管瘤等
f.沒有先前的肝臟活檢、肝臟成像研究或彈性成像結果表明肝硬化
4.未接受過B型肝炎治療：先前沒有針對B型肝炎的抗病毒治療(先前沒有HBV核苷酸或含干擾素的治療)或在篩選隨訪前連續至少12週使用核苷酸療法(恩替卡韋或替諾福韋)，具有令人滿意的耐受性和順服性
5.血清ALT>60U/L(男性)或>38U/L(女性)(美國肝病研究協會(AASLD)HBV指導標準的2倍ULN，Terrault等人，2016)
6.在篩選和第1天時，12導聯心電圖無臨床上顯著的異常(研究者認為)
7.沒有其他已知的肝病病因
8.除了良好控制的高血壓和他汀類藥物對高膽固醇血症的控制外，沒有其他需要持續醫療管理或長期或反復藥物介入的醫療狀況
9.BMI在18.0至32.0kg/m2(含)的範圍內
10.男女不限
a.男性參與者：
男性參與者必須同意在治療期間以及研究性介入之最後給藥的12週內使用避孕藥並且在此期間不能捐贈精子。
b.女性參與者：
如果女性參與者未懷孕、未哺乳且至少符合以下條件之一，則符合參加條件：非WOCBP，或者，取決於地區；在治療期間並在研究性介入給藥後至少12週，同意遵循避孕指南的WOCBP。
11.能夠提供簽署的知情同意書，包括遵守要求和限制。
排除標準，B組
1.任何可能干擾本研究藥物吸收、分佈或消除，或干擾本研究中臨床和實驗室評估的醫學病史，包括(但不限於)；慢性或複發性腎臟疾病、功能性腸病(例如頻繁的腹瀉或便秘)、胃腸道疾病、胰腺炎、癲癇、皮膚粘膜或肌肉骨骼疾病、自殺企圖或自殺觀念歷史記錄、或臨床上顯著的抑鬱症或其他神經精神病學需要藥物介入的疾病
2.高血壓控制不良或不穩定
3.胰島素或降血糖劑治療的糖尿病病史
4.過去12個月內需要住院的哮喘病史
5.根據中央研究實驗室的篩選結果確定的G-6-PD缺乏症的證據
6.目前內分泌疾病控制不佳，但甲狀腺疾病(例如甲狀腺機能亢進/甲狀腺功能低下等)除外，任何經過藥理治療的甲狀腺疾病均被排除。
7.慢性或複發性UTI病史，或篩選前一個月內有UTI
8.肝癌病史
9.如果患者的惡性腫瘤在過去三年中通過化療完全緩解，並且沒有其他醫學或外科手術介入，則可以接受HCC以外的惡性腫瘤病史
10.過去3年內持續濫用乙醇(每天>40gm乙醇)或使用非法藥物的歷史。
11.對皮下注射不耐受的歷史或明顯的腹部疤痕，其可能會阻礙研究性介入的投予或局部耐受性的評估者。
12.在治療前的最近6週接受輸血，或預期在透過試驗後追蹤期間進行輸血。
13.篩選前2個月內捐獻或失去血液>500mL，或篩選前7天內捐獻血漿
14.篩選的3個月內進行抗病毒治療(恩替卡韋或替諾福韋除外)或過去3年使用干擾素治療
15.在過去6個月內(或預期需要)使用抗凝血劑、全身性地投予皮質類固醇、全身性地投予免疫調節劑或全身性地投予免疫抑製劑
16.在進行研究性介入的投予之前的14天內使用處方藥，試驗主持人或試驗委託者認為會干擾研究執行者。沒有全身吸收的局部用藥、他汀類藥物(瑞舒伐他汀除外)、高血壓藥物、OTC和處方止痛藥或激素避孕藥(女性)是可以接受的。
17.在研究性介入的投予之前3個月內長效注射或植入任何藥物，可注射/可植入的避孕措施除外。
18.持續使用草藥補給品或全身性非處方藥；參與者必須願意在研究期間停止該用藥
19.在給藥前3個月內已接受研究藥物，或在研究招募前正在進行另一項臨床研究追蹤。
20.篩選時肝臟彈性成像(即FibroScan®)kPa>10.5
21.篩選時仰臥休息10分鐘後收縮壓>150mmHg，舒張壓>95mmHg。
22.肝轉胺酶(ALT或AST)在篩選時確認>7 x ULN
23.持續性或複發性高膽紅素血症的病史，除非已知吉爾伯特病或杜賓-約翰遜綜合症
24.對人類免疫缺陷病毒(HIV)或C型肝炎病毒(HCV)或D型肝炎病毒(HDV)的抗體呈血清反應陽性
25.Hgb<12g/dL(男性)或<11g/dL(女性)
26.篩選時血清白蛋白<3.5g/dL。
27.篩選時白血球總計數<4,000細胞/μL或嗜中性細胞絕對計數(ANC)<1800細胞/μL。
28.篩選時血小板計數每μL
Figure 109145408-A0305-12-0176-105
100,000。
29.篩選時國際標準化比率(INR)或凝血酶原時間(PT)高於正常參考範圍(根據當地實驗室參考範圍)的上限。
30.血清BUN或肌酐>ULN
31.血清澱粉酶或脂肪酶>1.25 x ULN
32.血清HbA1c>7.0%
33.血清甲型胎兒蛋白(AFP)值>100ng/mL。如果篩選時的AFP>ULN但<100ng/mL，若肝臟成像研究顯示無可疑之可能的HCC病灶，則患者符合條件
34.研究者認為其臨床上顯著且無法接受的任何其他安全實驗室測試結果
35.從進入臨床研究中心前的48小時到研究結束為止，已經進行或計劃進行運動水準的重大改變。
36.研究者認為之任何條件都可能使參與者不適合招募，或者可能干擾參與或完成研究。
B部分：經GalNAc結合之反義寡核苷酸的效果
材料與方法
AAV/HBV小鼠模型
AAV-HBV小鼠模型是藉由向C57BL/6小鼠注射帶有可複制HBV基因組(AAV-HBV)的重組腺相關病毒而生成的。rAAV8-1.3 HBV ayw病毒懸液購自北京五加和分子醫學研究有限公司(中國北京)。從SLAC實驗室動物有限公司(中國上海)購買動物(雄性，到達時年齡4-5週)，使其在動物設施中適應5-7天，然後透過尾靜脈注射1×1011 AAV-HBV的載體基因組 (稀釋於200μL PBS)。可以在三週後建立HBV基因組的持續表現，並在小鼠血清中檢測到高水準的HBV病毒標誌物，包括HBV DNA、HBsAg和HBeAg。具有穩定的HBV病毒血症和C57BL/6小鼠之合格的免疫系統，AAV-HBV小鼠模型是用於評估化合物在體內的抗HBV功效。AAV-HBV研究的生命中部分是透過科文斯藥物研發(上海)有限公司(Covance Shanghai)的契約服務進行的，使用血清進行的生命後分析是在上海羅氏創新中心內部進行的(RICS)。
化合物治療前7天，採集血液樣本進行血清製備(~15μL)，並根據HBV DNA、血清中HBsAg水準和體重，將感染AAV-HBV的動物分為不同的治療組。
以1.5或7.5mg/kg的劑量，在第0至49天期間的第0、7、14、21、28、35、42和49天每週一次皮下給藥食鹽水(01組)以及CMP ID NO：15_1的抗HBV ASO。以100mg/kg的劑量，在第0至55天期間每隔一天(QOD)，或在0至49天期间的第0、7、14、21、28、35、42和49天每週一次(QW)，藉由餵食管餵食投予CMP ID NO：VI的TLR7促效劑。在整個研究期間，每週經由眼窩靜脈竇給動物放血以收集樣本。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在Oligomaker 48上，以1微莫耳刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於60℃處理5至16小時，將所述寡核苷酸自固相支持物上裂解。使用逆相HPLC(RP-HPLC)或固相 萃取來進行所述寡核苷酸的純化，之後以UPLC進行特性分析，再用ESI-MS進一步確定分子質量。
寡核苷酸的延長：
利用5’-O-DMT-保護醯胺在乙腈中的0.1莫耳溶液以及DCI(4,5-二氰基咪唑)的乙腈(0.25莫耳)溶液做為激活物，進行β-氰乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)的耦合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附結合基團的C6連接子，或結合基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵聯，使用氫化黃原素(0.01莫耳於乙腈/吡啶9：1)執行硫醇化處理。可利用0.02莫耳的碘於THF/吡啶/水7：2：1導入磷酸二酯鍵聯。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。
可於固相合成的最後循環使用經商購取得的C6胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自固相支持物切割後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入結合物。
以RP-HPLC純化：
使用製備性RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10毫米管柱上對粗產化合物進行純化。使用0.1莫耳pH為8的乙酸銨及乙腈為緩衝液，流速為每分鐘5毫升。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲醯胺
DMT：4,4’-二甲氧三苯甲基
THF：四氫呋喃
Bz：苯甲醯基
Ibu：異丁醯基
RP-HPLC：逆相高效液相層析
T m 測定：
將寡核苷酸及RNA目標(磷酸鹽連結，PO)雙股螺旋在500ml無核糖核酸酶水中稀釋至3mM，而後與500ml 2x Tm緩衝液(200mM氯化鈉、0.2mM EDTA、20mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。將所述溶液加熱至95℃並維持3分鐘，而後放置在室溫中退火30分鐘。在配備有Peltier溫度編程器PTP6的Lambda 40 UV/VIS分光光度計上利用PE Templab軟體(Perkin Elmer)測量雙股螺旋熔解溫度(Tm)。溫度自20℃漸升至95℃，然後降至25℃，於260奈米處記錄吸收度。利用第一衍生物及融化和退火的局部最大值來評估雙股螺旋Tm。
組織特異性體外連接子切割試驗
使用相關組織(例如肝臟或腎臟)的均質物及血清，對具有待測生物可切割型連接子(例如DNA磷酸二酯連接子(PO連接子))的FAM標記之寡核苷酸進行體外切割。
從合適的動物(例如小鼠、猴子、豬或大鼠)收集組織和血清樣本，並在均質化緩衝液(0.5% Igepal CA-630、25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl，pH 8.0(用1N NaOH調整))中均質化。將組織均質物和血清摻入寡核苷酸至200μg/g組織的濃度。將樣本在37℃下孵育24小時，然後用苯酚-氯仿萃取樣本。使用Dionex DNApac p-100管柱在Dionex Ultimate 3000上對溶液進行AIE HPLC分析，梯度範圍為10mM至1M過氯酸鈉，pH 7.5。使用615 nm的發光檢測器和260nm的UV檢測器，針對標準測定切割的和未切割的寡核苷酸含量。
S1核酸酶切割試驗
將具有S1核酸酶易感性連接子(例如DNA磷酸二酯連接子(PO連接子))的FAM標記之寡核苷酸，在S1核酸酶提取物或血清中進行體外切割。
藉由核酸酶緩衝液(每100μL 60U)中的S1核酸酶對100μM寡核苷酸進行體外切割，持續20和120分鐘。藉由向緩衝溶液中添加EDTA來停止酶活性。使用Dionex DNApac p-100管柱在Dionex Ultimate 3000上對溶液進行AIE HPLC分析，梯度範圍為10mM至1M過氯酸鈉，pH 7.5。使用615nm的發光檢測器和260nm的UV檢測器，針對標準測定切割的和未切割的寡核苷酸含量。
HBsAg抗原測量
根據製造商的實驗方案，使用HBsAg化學發光免疫測定法(CLIA)(中國鄭州安圖生物診斷有限公司，目錄號CL0310-2)測定感染AAV-HBV小鼠血清中的HBsAg水準。簡要地說明，將50μl的血清轉移至抗體塗佈的微孔盤，並加入50μl的酶結合物試劑。將該孔盤於室溫下在振盪器上孵育60分鐘，然後使用自動清洗機以清洗緩衝液洗滌所有孔洞六次。加入25μl的基質A，然後加入25μl的基質B到每個孔洞中。將孔盤在室溫下孵育10分鐘，然後使用Envision發光讀數器(Perkin Elmer)測量發光值。HBsAg的單位為IU/ml；其中1ng HBsAg=1.14IU。
同樣，也可以根據製造商的實驗方案和上述HBsAg的簡要說明，使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic#CL0310-2)測量HBeAg的水準。
即時聚合酶連鎖反應檢測HBV感染細胞的細胞內HBV
mRNA
可以使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)、TaqMan RNA-to-CT 1-Step套組(Applied Biosystems,#4392938)、人類ACTB內源性對照(Applied Biosystems,#4310881E)，藉由qPCR在技術的複製物中定量HBV mRNA。Taqman試劑與以下市售的ThermoFisher Scientific引子(HBV Pa03453406_s1,ACTB 4310881E)一起使用。使用比較週期閾值2-△△Ct方法分析mRNA表現，該方法針對參考基因ACTB和PBS治療的細胞進行了標準化。
HBV DNA提取和qPCR
最初，用磷酸鹽緩衝液(PBS)將小鼠血清稀釋10倍(1：10)。使用MagNA Pure 96(Roche)機器人提取DNA。將50μl之稀釋的血清在處理匣中與200μl的MagNA Pure 96外部裂解緩衝液(Roche，目錄號06374913001)混合，並孵育10分鐘。然後使用「MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」(Roche，目錄號06543588001)和「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」的實驗方案提取DNA。DNA洗脫體積為50μl。
使用Taqman qPCR機(ViiA7,life technologies)對提取的HBV DNA進行定量。在PCR中以複製品測試每個DNA樣本。在384孔盤中，將5μl的DNA樣本添加到15μl的PCR mastermix中，其包含10μl的TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems，目錄號4369016)、0.5μl的PrimeTime XL qPCR Primer/Probe(IDT)以及4.5μl的蒸餾水，並使用以下設置進行PCR：UDG孵育(2分鐘，50℃)、酶活化(10分鐘，95℃)和PCR(15秒之40個循環，95°用於變性且1分鐘，60℃退火和延長)。藉由ViiA7軟體基於HBV質體DNA標準曲線由Ct值計算DNA拷貝數。
TaqMan引子的序列顯示在表14中。
Figure 109145408-A0305-12-0182-84
ZEN是內部淬滅體
實例B1
這項研究旨在提供證據證明，使用HBV體內功效小鼠模型，靶向HBV的經GalNAc結合之反義寡核苷酸(抗HBV ASO)和TLR7促效劑的組合，會具有有益的抗病毒效果。
在慢性HBV治療中，直接作用的抗病毒藥物(例如靶向HBV的經GalNAc結合之反義寡核苷酸)(抗HBV ASO)和免疫調節劑(例如類鐸受體7的促效劑(TLR7促效劑))組合，可能以每種單獨化合物之單一療法的活性中無法預知的方式，影響組合的效果。
為了評估體內系統中抗HBV ASO和TLR7促效劑的組合，使用慢性HBV感染的小鼠模型。在「材料和方法」中描述的AAV/HBV小鼠模型中，建立了持續HBV感染，其引起病毒標誌物(HBsAg,HBeAg,HBV DNA)表現在血漿中可檢測。在單一療法或組合中已評估治療後對這些病毒標誌物的效果，該治療是CMP ID NO：15_1(表2和圖4)之抗HBV ASO以1.5mg/kg或7.5mg/kg劑量給藥，以及CMP ID NO：VI(表3)之TLR7促效劑以100mg劑量每隔一天(QOD)或每週一次(QW)給藥。
表15至18顯示用不同劑量治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBV-DNA水準。該數據還表示在圖9A至9D中。
Figure 109145408-A0305-12-0183-85
表16：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBV-DNA水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以1.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每週(QW)投予100mg/kg；或兩者的組 合。與抗HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7 QW相比，計算出該組合的p值。*p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-106
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-107
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-108
0.001；ns不顯著；†定量下限。
Figure 109145408-A0305-12-0184-86
表17：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBV-DNA水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以7.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每隔一天(QOD)投予100mg/kg；或兩者的組合。與抗HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7 QOD相比，計算出該組合的p值；*p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-109
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-110
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0184-111
0.001；ns不顯著；†定量下限。
Figure 109145408-A0305-12-0185-87
表18：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBV-DNA水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以7.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每週(QW)投予100mg/kg；或兩者的組合。與抗HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7 QW相比，計算出該組合的p值；*p值
Figure 109145408-A0305-12-0185-112
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0185-113
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0185-114
0.001；ns不顯著；†定量下限。
Figure 109145408-A0305-12-0186-88
表15至18和圖9A至D顯示對於CMP ID NO：15_1和CMP ID NO：VI的所示投予之組合，在研究期間病毒標誌物HBV-DNA的變化。對於CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)單一療法，在1.5mg/kg和7.5mg/kg兩者均觀察到HBV-DNA迅速減少至測定之較低的量化水準(LLOQ)以下(圖9A和C)，以及含有任何濃度之抗HBV ASO的任何組合(圖9A至D，實線)。相反，當僅用TLR7促效劑(CM ID NO：VI)治療時，每隔一天(QOD)給藥一次，HBV-DNA的減少僅達到LLOQ(圖9A和C)。在QW給藥時(圖9B和D)，TLR7促效劑單一療法最多減少約1.5-log。
給藥結束後，所有治療組的HBV-DNA水準部分反彈，在1.5mg/kg劑量的單一療法中，抗HBV ASO的絕對反彈最大(圖9A和B)。該組中的HBV DNA血漿水準恢復到對照組的½log以內。同樣地，在追蹤期間，無論是QOD還是QW給藥的單一療法，經TLR7促效劑治療之動物的反彈均恢復至對照組的1 log以內。這種反彈雖然與抗HBV ASO的幅度不同，但在治療結束後比抗HBV ASO治療組的反彈更快。
與每種單一化合物的治療相比，用抗HBV ASO和TLR7促效劑組合治療之組的反彈(通過HBV DNA測量)始終被延遲。值得注意的是，高劑量抗HBV-ASO之反彈的延遲發生和動力學在與頻繁和不頻繁之TLR7促效劑給藥的組合之間相似，反彈分別在第91和84天開始。有趣的是，在最低的組合劑量下(圖8B)，反彈似乎始於第84天，這比具有高TLR7促效劑劑量的低抗HBV ASO的反彈(圖8A)晚，其在第77天觀察到反彈。因為，與用TLR7促效劑單一治療觀察到的相比，降低3倍劑量不會對觀察到反彈的時間產生負面影響，所以當將抗HBV ASO和TLR7促效劑組合使用時，其增加TLR7的治療範圍。
表19至22顯示用不同劑量治療後AAV/HBV小鼠血清中的HBsAg水準。該數據也表示在圖10A至10D中。
表19：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBsAg水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以1.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每隔一天(QOD)投予100mg/kg；或兩者的組合。與a)抗HBV ASO 1.5mg/kg和b)TLR7 QOD相比，計算出該組合的p值。*p值
Figure 109145408-A0305-12-0187-115
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0187-116
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0187-117
0.001；ns不顯著。
Figure 109145408-A0305-12-0188-89
表20：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBsAg水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以1.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每週(QW)投予100mg/kg；或兩者的組合。與a)抗HBV ASO 1.5mg/kg和b)TLR7 QW相比，計算出該組合的p值。*p值
Figure 109145408-A0305-12-0188-118
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0188-120
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0188-121
0.001；ns不顯著。
Figure 109145408-A0305-12-0189-90
表21：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBsAg水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以7.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每隔一天(QOD)投予100mg/kg；或兩者的組合。與a)抗HBV ASO 7.5mg/kg和b)TLR7 QOD相比，計算出該組合的p值。*p值
Figure 109145408-A0305-12-0189-122
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0189-123
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0189-124
0.001；ns不顯著。
Figure 109145408-A0305-12-0190-92
表22：在以下治療後，AAV/HBV小鼠血清中的HBsAg水準：食鹽水(媒液)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)每週以7.5mg/kg的劑量給藥；CMP ID NO：VI(TLR7)每週(QW)投予100mg/kg；或兩者的組合。與a)抗HBV ASO 7.5mg/kg和b)TLR7促效劑QW相比，計算出該組合的p值。*p值
Figure 109145408-A0305-12-0190-125
0.05；**p值
Figure 109145408-A0305-12-0190-126
0.01；***p值
Figure 109145408-A0305-12-0190-127
0.001；ns不顯著。
Figure 109145408-A0305-12-0191-93
還測量了HBeAg水準，但是在單一治療和組合治療之間未觀察到市場差異。
表19至22和圖10A至10D顯示對HBsAg的效果通常與對HBV-DNA的效果相似。與HBV DNA不同，用1.5mg/kg抗HBV ASO(CMP ID NO：15)治療無法將HBsAg抑制到檢測極限以下水準(圖10A和10B)，TLR7促效劑(CMP ID NO：VI)以任何劑量給藥也無法做到(圖10A至10D)。另一方面，與單一治療相比，抗HBV ASO和TLR7促效劑的組合能夠在所有劑量下將HBsAg減少至檢測極限以下，並延遲反彈。如同HBV DNA，觀察到最低限度的TLR7促效劑治療範圍增加也與HBsAg減少有關， 而對於HBsAg來說這一點更為顯著，因為最低劑量的組合(圖10B)，無論是減少HBsAg還是延遲反彈，都與最高劑量的組合(圖10C)基本上一樣有效，這表明抗HBV ASO的治療範圍也可能有所增加。
研究結論
研究中的數據顯示，在慢性HBV感染的體內模型中，抗HBV ASO和TLR7促效劑的組合具有益處。從HBV DNA和HBsAg的角度測量，這些好處最明顯地可以看作是治療結束後反彈的延遲。沒有跡象表明該組合改變了這些化合物的風險狀況，並且在臨床環境中每種活性成分的較低劑量可以達到與較高劑量組合相同的抗病毒效果。對於組合的治療範圍中，這種正向增加對患者來說是有明顯的好處。
C部分：比較RNAi和反義寡核苷酸的效果
實例C1
這項研究的目的是評估AAV-HBV小鼠模型中某些化合物的體內藥理作用和功效。
測試的化合物：負調控siRNA(DCR-AUD1，不靶向HBV基因組的siRNA)；HBV(s)-219(抗HBV siRNA)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)。
攜帶B型肝炎病毒(HBV)基因組的重組腺相關病毒(AAV)rAAV8-1.3HBV ayw(批號：2019032703)購自北京五加和分子醫學研究所有限公司，並在使用前儲存於-70℃。
取得了一百一十五(115)隻雄性C57BL/6小鼠。在給藥前第0天，將所有動物透過尾靜脈注射1×1011之AAV-HBV的載體基因組以進行模型誘導。在給藥前第24天，根據基線血清病毒標誌物和體重，選擇80隻合格的HBV感染小鼠。
將80隻選擇的小鼠隨機分為4組進行化合物治療。在第0天以5mL/kg的劑量皮下注射無菌水、DCR-AUD1、DCR-S219(9mg/kg)和CMP ID NO：15_1(6.6mg/kg)。劑量體積為2mL。
在第0至21天期間每週測量一次體重。在研究期間，研究組之間未觀察到體重增長的顯著差異。
在第0至21天期間每週兩次收集全血以製備血清(每隻小鼠15μL)。在第21天，對小鼠實施安樂死。除了用於病毒標記測定的血清樣本外，還製備了額外的血清樣本(每隻小鼠120μL)並儲存在-70℃下。收集整個肝臟，切成兩半，速凍並保存在-70℃。其餘的劑量配方以及期終血清和組織樣本分別於2019年11月16日和20日處置。
HBsAg的基線血清水準由ARCHITECT i2000(美國伊利諾伊州萊克布拉夫湖的雅培實驗室)和輔助試劑測定。基線血清HBV DNA水準藉由使用ABI7500(美國加利福尼亞州福斯特城的Applied Biosystems公司美國加利福尼亞州福斯特城的Applied Biosystems公司)和檢測套組(中國湖南長沙的聖湘生物科技股份有限公司)進行測量。
結果顯示於圖30。抗HBV ASO(HBV-LNA)使HBsAg水準迅速下降，並一直維持到大約10天，此後HBsAg水準反彈。靶向HBV的siRNA化合物(DCR-S219)最初減少HBsAg水準的速度稍慢，但減少速率仍然非常快。此外，在實驗的21天中，使用siRNA化合物可保持令人印象深刻的減少水準，沒有反彈的跡象。對於siRNA化合物，甚至可以從圖30中看到更多好處，因為莫耳劑量比LNA化合物低得多，從而獲得了優異的結果。圖30顯示了用9mg/kg siRNA和6.6mg/kg LNA給藥的小鼠的結果，然而，由於這些化合物之間的分子量差異，siRNA的莫耳劑量僅為LNA的0.3倍左右(DCR-S219的Mw為22262Da，而CMP ID NO：15_1的Mw為6638Da)。因 此，本發明之siRNA的莫耳劑量遠低於反義寡核苷酸的莫耳劑量，其可以獲得優異的結果。
例如，如實例B和圖9所示，將數據與抗HBV ASO和TLR7促效劑的數據結合時，其顯示出TLR7促效劑與RNAi寡核苷酸(例如靶向HBV的siRNA)結合的益處。
如圖10A所示，單獨的TLR7促效劑可減少HBsAg，但最初的HBsAg減少速度較慢(第42天觀察到的最低HBsAg)。因此，使用RNAi寡核苷酸(例如靶向HBV的siRNA)與TLR7促效劑存在協同作用，因為實例C/圖30中靶向HBV的siRNA實現了快速有效的HBsAg減弱，即在10天內。此外，如圖30所示，靶向HBV的siRNA提供了非常有效的長期減弱作用，優於抗HBV ASO。
根據本文所揭露之數據，可以確定包含1)RNAi寡核苷酸(例如靶向HBV的siRNA)和2)TLR7促效劑之組合的效果將是快速誘導的、長時間有效的HBsAg減弱、在很長一段時間顯示出出有效的抗病毒控制。因此，包含RNAi寡核苷酸和TLR7促效劑的組合是本發明最優選的組合。
在本文揭露實例的A、B和C部分的試驗結果之前，無法預期到這樣有益的效果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
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Figure 12_A0101_SEQ_0017
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Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
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Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029

Claims (15)

  1. 一種醫藥組合，其包含以下或由以下組成：用於減少B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表現之治療性寡核苷酸、及式(I)或式(II)之TLR7促效劑：
    Figure 109145408-A0305-13-0001-94
     其中X為CH2或S；針對式(I)，R1為-OH或-H且R2為1-羥丙基或羥甲基，針對式(II)，R1為-OH或-H或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基或乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基，或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物；且其中該寡核苷酸為如RNAi ID NO：7所示，且包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸；在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中該有義股上-GAAA-序列的核苷酸之各 者經結合至單價GalNAc部分，其中該-GAAA-序列包含下列結構：
    Figure 109145408-A0305-13-0002-95
    ；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21、及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中該反義股的5'-核苷酸具有下列結構：
    Figure 109145408-A0305-13-0002-96
  2. 如請求項1之醫藥組合，其中該RNAi寡核苷酸具有如圖29A中所繪示之結構(RNAi ID NO：8)。
  3. 如請求項1之醫藥組合，其中該TLR7促效劑具有式(III)、式(IV)或式(V)之任一者：
    Figure 109145408-A0305-13-0003-97
     其中R1為-OH或乙醯氧基且R2為1-乙醯氧基丙基或1-羥丙基或1-羥甲基；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物；
    Figure 109145408-A0305-13-0003-98
     其中R1為乙醯氧基(環丙基)甲基或乙醯氧基(丙炔-1-基)甲基；
    Figure 109145408-A0305-13-0004-99
     其中R1為-OH且R2為1-羥丙基或羥甲基；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  4. 如請求項1之醫藥組合，其中該TLR7促效劑選自由以下各項所組成之群組：[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基]乙酸酯(CMP ID NO：VI)；5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：VII)；5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：VIII)；5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：IX)；5-胺基-3-(2'-O-乙醯基-3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO：X)；5-胺基-3-(3'-去氧-β-D-核呋喃糖苷基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO：XI)；[(S)-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫 口柬(oxathiolan)-2-基]-環丙基-甲基]乙酸酯(CMP ID NO：XII)及(1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬(oxathiolan)-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯(CMP ID NO：XIII)；或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  5. 如請求項1之醫藥組合，其中包含RNAi寡核苷酸及TLR7促效劑或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物之該組合選自由以下組合所組成之群組：RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VI；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：VIII；RNAi ID NO：7及CMP ID NO：XIII；RNAi ID NO：8及CMP ID NO：XIII；其中該RNAi ID NO：7寡核苷酸包含與反義股形成雙股螺旋區域之有義股，其中：該有義股包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO：41)中所示之序列，且其包含在位置3、8至10、12、13及17的經2’-氟修飾之核苷酸；在位置1、2、4至7、11、14至16、18至26及31至36的經2’-O-甲基修飾之核苷酸；及介於在位置1與2的核苷酸之間之一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中該有義股上-GAAA-序列的核苷酸之各 者經結合至單價GalNAc部分，其中該-GAAA-序列包含下列結構：
    Figure 109145408-A0305-13-0006-100
    ；並且該反義股包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO：38)中所示之序列，且其包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16及19的經2'-氟修飾之核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18及20至22的經2'-O-甲基修飾之核苷酸；及介於核苷酸1與2、2與3、3與4、20與21、及21與22之間的五個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中該反義股的5'-核苷酸具有下列結構：
    Figure 109145408-A0305-13-0007-101
     其中該RNAi ID NO：8寡核苷酸具有如圖29A中所繪示之結構；其中CMP ID NO：VI為[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羥基-四氫呋喃-2-基]丙基]乙酸酯；其中CMP ID NO：VII為5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮；其中CMP ID NO：VIII為5-胺基-3-[(2R,3R,5S)-3-羥基-5-[(1S)-1-羥丙基]四氫呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮；其中CMP ID NO：XIII為(IS)-1-[(2S,5R)-5-(5-胺基-2-側氧基-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫口柬(oxathiolan)-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯。
  6. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合，其中：a)該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的；或b)該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的，其中該醫藥上可接受之鹽為金屬陽離子；或c)該治療性寡核苷酸是以醫藥上可接受之鹽來調製的，其中該醫藥上可接受之鹽為Na+或K+。
  7. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合，其中：a)如請求項1至5中任一項之治療性寡核苷酸及TLR7促效劑是 以醫藥上可接受之載體來調製的；或b)如請求項1至5中任一項之治療性寡核苷酸及TLR7促效劑是以醫藥上可接受之載體來調製的，其中該醫藥上可接受之載體為水。
  8. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合，其中該治療性寡核苷酸是調製於磷酸鹽緩衝液中的。
  9. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合，其中該治療性寡核苷酸是調製用於皮下注射的，且該TLR7促效劑是調製用於口服投予的。
  10. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合，其中：a)該醫藥組合進一步包含CpAM(核心蛋白別構調節劑)；或b)該醫藥組合進一步包含CpAM(核心蛋白別構調節劑)，其中該CpAM具有根據下面所示的化合物(CpAM1)之式：
    Figure 109145408-A0305-13-0008-102
     其中 R1為氫、鹵素或C1-6烷基；R2為氫或鹵素；R3為氫或鹵素；R4為C1-6烷基；R5為氫、羥C1-6烷基、胺基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；R6為氫、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-，X為羰基或磺醯基；Y為-CH2-、-O-或-N(R7)-，其中R7為氫、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、C3-7環烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-鹵C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7環烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7環烷基-COOH、羥-CtH2t-、羧基螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；W為-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；n為0或1；m為0至7；t為1至7；或其醫藥上可接受之鹽、或鏡像異構物或非鏡像異構物；或c)該醫藥組合進一步包含CpAM(核心蛋白別構調節劑)，其中該CpAM為化合物(CpAM2)
    Figure 109145408-A0305-13-0010-103
     或其醫藥上可接受之鹽、鏡像異構物或非鏡像異構物。
  11. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任一項之醫藥組合。
  12. 一種部件套組，其包含如請求項1至10中任一項之醫藥組合或如請求項11之醫藥組成物，和具有有關投予TLR7促效劑以治療B型肝炎病毒感染之說明的包裝插頁。
  13. 一種如請求項1至10中任一項之醫藥組合、如請求項11之醫藥組成物或如請求項12之套組的用途，其係用於製備治療B型肝炎病毒感染之醫藥。
  14. 一種如請求項1至10中任一項之醫藥組合、如請求項11之醫藥組成物或如請求項12之套組的用途，其係用於製備治療B型肝炎病毒感染之醫藥，其中： a)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染；或b)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的；或c)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的；或d)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的；或e)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑；或f)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予；或 g)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予，其中該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型；或h)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予，其中該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型，其中該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg；或i)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性 寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予，其中該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型，其中該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg，其中該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的；或j)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予，其中該治療性寡核苷酸為用於皮下投予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型，其中該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg，其中該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的，其中該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸；或k)待治療的該B型肝炎病毒感染為慢性B型肝炎病毒感染，其中該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑是以醫藥有效量投予的，其中該治療性寡核苷酸是每週投予的，且該TLR7促效劑是每隔一天投予的，其中該治療性寡核苷酸是以每次投予1至4mg/kg的劑量給藥的，且該TLR7促效劑是以每次投予150至170mg的劑量給藥的，其中投予該治療性寡核苷酸達48週，且投予84劑的TLR7促效劑，其中在同一週開始該治療性寡核苷酸及該TLR7促效劑之投予，其中該治療性寡核苷酸為用於皮下投 予之劑型，且該TLR7促效劑為用於口服投予之劑型，其中該治療性寡核苷酸之劑量為100至150mg/ml，且該TLR7促效劑之劑量為150至170mg，其中該治療性寡核苷酸是在沒有以靶定編碼HBV mRNA轉錄本的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治療的情況下投予的，其中該個體未被投予選擇性靶向HBxAg mRNA轉錄本的RNAi寡核苷酸，其進一步包含將有效量之恩替卡韋(Entecavir)投予該個體。
  15. 一種減少B型肝炎病毒表面抗原在細胞中的表現之活體外方法，該方法包含：a)將如請求項1至10中任一項之醫藥組合或如請求項11之醫藥組成物遞輸至該細胞；或b)將如請求項1至10中任一項之醫藥組合或如請求項11之醫藥組成物遞輸至該細胞，其中該細胞為肝細胞。
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