TWI686194B

TWI686194B - 廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物及其用途

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Publication number: TWI686194B
Application number: TW107106605A
Authority: TW
Inventors: 林蕭水銀
Original assignee: 林蕭水銀; 中山醫學大學
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2020-03-01
Also published as: TW201936183A

Abstract

本發明提供一種廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物，其主要成份係植物多酚、及殺菌劑。本發明亦提供廣效用於口腔保健、抗癌及抗人類常見之感染細菌之用途。

Description

廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物及其用途

本發明提供一種廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物，及其廣效用於口腔保健、抗癌及抗菌等之用途。

氟化物(Fluoride)用於固齒之用途已行之有年，過去也有許多證實氟化物用於固齒之研究(ten Cate JM,Featherstone JD 1991.Mechanistic aspects of the interactions between fluoride and dental enamel.CRC Crit Rev Oral Biol Med 2：283-296；Tatevossian A.1990.Fluoride in dental plaque and its effects.J Dent Res 69：645-52)，而氟化物亦具有抗菌之功能(Hamilton,I.R.1990.Biochemical effects of fluoride on oral bacteria.J.Dent.Res.,69：660-667.)，使得目前全世界廣泛使用氟化鈉(Sodium Fluoride；NaF)及其衍生物來防治蛀牙，例如添加於牙膏或直接於牙齒表面進行氟化處理，過去更有將氟化物加入飲水中以達預防齲齒之功效(McDonagh,M.S.,P.F.Whiting,P.M.Wilson,A.J.Sutton,I.Chestnutt,J.Cooper,K.Misso,M.Bradley,E.Treasure,and J.Kleijnen.2000.Systematic review of water fluoridation.BMJ 321：855-859)。

兒茶素(Catechin)已被研究出具有許多功效，如抗氧化、殺菌、抗癌等(Morre,D.J.,Morre,D.M.,Sun,H.,Cooper,R.,Chang,J.and Janle,E.M.2003 Tea catechin synergies in inhibition of cancer cell proliferation and of a cancer specific cell surface oxidase(ECTO-NOX).Pharmacol.Toxicol.,92,234-241.；Taylor,P.W.,J.M.Hamilton-Miller,and P.D.Stapleton.2005.Antimicrobial properties of green tea catechins.Food Sci.Technol.Bull.2：71-81.)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)便係兒茶素族群內的一種，且其亦被證實具有抗菌及抗癌之功效。

美國專利US8399220B2便揭露了一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯與氟化鈉之組合用於口腔殺菌用途之發明，然而氟(F^-)係為一種具強毒性之物質，且氟亦會污染環境，對生態之衝擊甚巨，基於環境保護，開發比氟化鈉更有效且安全的藥方，乃係目前急需研究的領域之一。

又，現今全世界由於濫用抗生素結果，引發了產生抗藥性病菌的產生，造成感染具有抗藥性病菌的患者無藥可治，開發有效且安全之抗菌新藥乃當務之急。

本發明之藥物組合物各成份之濃度單位係為莫耳濃度，再計算各成份於組合物藥方之百分比。

除非另外特別加以定義，於此敘述中所用的名詞將具有熟知此技藝者可瞭解之普通且常見之含意。

本發明旨在尋找一種可以替代氟化鈉之組合物藥方，達到更優於氟化物之口腔保健的效果，並免除氟化物對環境生態污染之衝擊。

本發明另一旨係在於尋找替代抗生素之有效殺菌藥方，其係利用天然的綠茶萃取物為主，輔以具有抗菌抗癌功能之標靶藥物及金屬鹽離子化合物，藉此達到有效殺菌又不造成人體負擔之新組合物藥方。

本發明為一種廣效抗菌及抗癌之醫藥組合物，包含一黃酮類化合物(Flavonoid)或植物多酚(Phyto Polyphenols)，如兒茶素；一殺菌劑，如地喹氯銨(Dequalinium)或4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)或其他標靶作用藥物；及一金屬離子鹽類，如銅離子、錳離子、鋅離子、鈉離子、釩離子或鍶離子等金屬離子及其任一化合物。

本發明具有口腔保健之效果。

在一具體實施方式中，本發明可用於齲齒之防治，其對常見齲齒菌(如：UA159型轉糖鏈球菌；Streptococcus mutans UA159)之生長達50%抑制濃度時，其包含78.97%~87.98%的兒茶素、0.23%~10.17%的殺菌劑及10.46%~13.01%的金屬離子鹽類。

於一較佳實施方式中，該兒茶素係指表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，該金屬離子鹽類係選自銅離子、錳離子、鋅離子、鈉離子、釩離子或鍶離子等金屬離子或其任一化合物。

又於一具體實施方式中，本發明可用於牙周病之防治，其對牙周病菌(如：牙齦卟啉單胞菌；Porphyromonas gingivalis)之生長達50%抑制濃度時，其包含78.97%~87.98%的兒茶素、0.23%~10.17%的殺菌劑及10.46%~13.01%的金屬離子鹽類。

本發明進一步可用於抑制癌症。

在一具體實施方式中，本發明對人類口腔鱗狀上皮癌細胞之生長達50%抑制濃度時，其包含21.31%~95.54%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、0.21%~69.64%的殺菌劑及4.25%~9.23%的金屬離子鹽類。

本發明進一步可有廣效殺菌之用途。

在一具體實施方式中，本發明對人類常見之感染細菌(如：大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草桿菌及金黃色葡萄球菌等)之生長達50%抑制濃度時其包含77.48%~95.88%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、0.23%~10.64%的殺菌劑及3.84%~12.1%的金屬離子鹽類。

於一較佳實施方式中，該金屬離子鹽類係進一步選自氯化銅、氯化錳、硫酸鋅、亞硒酸鈉、硫酸氧釩、正釩酸鈉或氯化鍶。

本發明之組合物於口腔保健之用途，其可與石炭酸、百里酚、桉樹腦、苯扎氯銨、西吡氯銨、尼泊金甲酯、過氧化氫、度美芬、氟化物、生物酶、鈣、水，甜味劑(如山梨醇、蔗糖、三氯蔗糖、糖精鈉與木糖醇)等混合以製成液狀或膏狀之製劑，例如漱口水、牙膏或口腔局部塗抹製劑。

本發明之組合物可以混合保溼劑(如：丙二醇、丙烯乙二醇)、乳化劑(如：聚山梨醇酯、羊毛脂)等以噴劑形式使用，病可進一步在醫療器具上形成一層抗菌薄膜。

本發明的組合物可以以固體，溶液，乳劑，分散體，微膠粒，脂質體，以及其他如含有本發明中的一種或多種成分作為活性成分的組合物產物，或與有機或無機載體或賦形劑混合以適用於腸內或腸胃外的施用。活性成分可以被混合，例如，藥學上可接受的通常無毒性的載具如片劑，丸劑，膠囊，栓劑，溶液，乳液，懸浮液以及其他任何合適的形式以供使用。可使用的載體包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯樹膠，明膠，甘露醇，澱粉糊，三矽酸鎂，滑石，玉米澱粉，角蛋白，膠體二氧化矽，馬鈴薯澱粉，尿素，中等鏈長的甘油三酯，葡聚醣，以及合適用於製備製劑，固體，半固體或液體形式的其他載體。另外，亦可以使用穩定劑，增稠劑和著色劑和香料作為輔助。

本發明之組合物可以口服的形式，例如作為片劑，錠劑，錠劑，水性或油性懸浮液，可分散粉末或顆粒，乳劑，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。口服使用的組合物可根據各種已知的醫藥組合物製備方法加以製備，而此組合物可含有一種或多種如蔗糖，乳糖或糖精等甜味劑，如薄荷，冬青油或櫻桃等調味劑，著色劑和防腐劑以提供製藥上的美觀和口感。混合有活性成分與藥學上可接受無毒賦形劑的片劑也可藉由已知方法加以製造。可使用的賦形劑如：(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑和崩解劑，如玉米澱粉，馬鈴薯澱粉或海藻酸；(3)粘合劑，如黃蓍膠，玉米澱粉，明膠或阿拉伯膠，和(4)潤滑劑，如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。片劑可為未包衣，或可以藉由已知技術進行包衣以延遲胃腸道中的崩解與吸收，從而提供較長時間的持續作用。例如延時材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯均可採用，亦可藉由如美國專利案號4256108；4160452；及4,265,874所描述的技術包衣，以生成控制藥效釋放的滲透性治療片劑。

在某些情況下，口服使用的組合物可為硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。它們也可為軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質混合，例如花生油，液體石蠟或橄欖油。

本發明之組合物實施例亦可為無菌注射用懸浮液的形式。此懸浮液可根據已知的方法使用適合的分散或濕潤劑和懸浮劑來配製。無菌注射用製劑亦可為無菌可注射溶液或懸浮液溶於無毒的腸道外可接受稀釋劑或溶劑中，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液。無菌的不揮發油通常用作溶劑或懸浮介質。為了這個目的，任何溫和的固定油都可以使用，包括合成的單或二甘油酯，脂肪酸(包括油酸)，天然存在的植物油如芝麻油，椰子油，花生油，棉籽油等，或合成的脂肪酸載體如油酸乙酯或類似物。緩衝劑，防腐劑，抗氧化劑等可以根據需要進行結合。

本發明之組合物實施方式亦可混合保溼劑(如：urea；PCA-Na)及基劑，以軟膏的形式塗抹於皮膚上。

由於個體受試者可能在症狀的嚴重程度呈現廣泛變化，而每種藥物都有其獨特的治療特徵，本發明之組合物實施應由醫師確定受試者對治療的反應，並相應地改變劑量。

圖1係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對UA159型轉糖鏈球菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖2係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對牙齦卟啉單胞菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖3係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對人類口腔鱗狀上皮癌細胞之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖4係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對大腸桿菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)及鋅離子(Zn))。

圖5係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對綠膿桿菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖6係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對枯草桿菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖7係為E+Q+M及E+F+M之醫藥組合物對金黃色葡萄球菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；Q：地喹氯銨(Dequalinium)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn))。

圖8係為E+R+M及E+F+M之醫藥組合物對牙齦卟啉單胞菌之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；R：4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)及鋅離子(Zn))。

圖9係為E+R+M及E+F+M之醫藥組合物對人類口腔鱗狀上皮癌細胞之生長達50%抑制濃度的配比比例(E：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；R：4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)；F：氟化鈉(NaF)；M：金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)及鋅離子(Zn))。

圖10係本發明表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、地喹氯銨(Dequalinium)及4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)之化學結構式。

以下實施方式僅代表本發明的各個不同方面和特徵，並非用於限制本發明。

病菌之培養

UA159型轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans UA159)以BHI 培養基(Brian heart infusion broth；Beckton Dickinson,Spanks,MD)，培養於37℃厭氧箱內(anaerobic chamber，10%的氫氣、5%的二氧化碳及85%的氮氣；Forma Scientific Inc.Masietta OH,USA)；牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)以厭氧菌培養基(Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth)，培養於37℃厭氧箱內(anaerobic chamber，10%的氫氣、5%的二氧化碳及85%的氮氣；Forma Scientific Inc.Masietta OH,USA)；而其他病菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Streptococcus aureus)及益生菌(Lactobacillus rules)皆以BHI培養基(Brian heart infusion broth；Beckton Dickinson,Spanks,MD)有氧培養於37℃培養箱內。

細胞之培養

人類口腔鱗狀上皮癌細胞株(OECM-1；oral squamous cell carcinoma cell line)及人類牙齦上皮細胞株(SG；Smulow-Glickman gingival cells,SG cells)係以RPMI-1640細胞培養液(包含10%體積百分濃度的胎牛血清(FBS)及濃度為10毫升/每公升的抗生素)培養於37℃、5%二氧化碳的濕式培養箱內。

各種藥物的製備

本實施方式所使用之藥物有表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E：EGCG)、地喹氯銨(Q：Dequalinium)、4-己基間苯二酚(R：4-hexylresorcinol)、氟化鈉(NaF)、氯化銅(CuCl₂)、氯化錳(MnCl₂)、硫酸鋅(ZnSO₄)、亞硒酸鈉(NaSeO₃)、硫酸氧釩(VOSO₄)、正釩酸鈉(Na₃VO₄)及氯化鍶(SrCl₂)，所有的藥物皆依照說明書之建議，以水或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)進行製備。

各種藥物再進一步以水或PBS進行連續稀釋，以供後續實驗所用。

各種藥物抑制病菌生長

先將各種病菌約培養16小時後，測得OD600值約為0.55，相當於菌液濃度為每毫升1.7×10⁹個菌落形成單位(1.7×10⁹CFU/ml)。

以BHI培養基將各菌液稀釋一百萬倍(每毫升1.7×10³個菌落形成單位；1.7×10³CFU/ml)，得到測試用的菌液。

於96孔盤中加入100微升的稀釋菌液及10微升之各種藥物，分成對照組與加藥組，皆做三重複，經混和均勻後，於0小時測定OD600值，接著於37℃隔夜無氧培養，約隔21小時後測定OD600值。

加藥後所測得的OD600值，與對照組比較，即可計算抑制生長50%之濃度(IC50)。

各種藥物抑制細胞生長

於96孔細胞培養盤(96-well culture plate)中，每個well種1*10⁴個OECM-1細胞，並分成對照組及加藥組，於37℃、5%二氧化碳的濕式培養箱內培養16~18小時，確認細胞經換盤後都穩定貼覆在盤底後，於每個well中依照分組加入10微升之其所對應的各種藥物，皆做三重複。

加藥後，細胞經培養培養24~48小時後，計算各個組別的細胞濃度，將加藥組的細胞濃度與對照組的細胞濃度比較，即可計算抑制生長50%之濃度(IC50)。

藥物組合抑制細菌或細胞生長的濃度計算

藥物組合的抑制濃度部分，首先找出各種藥物單用的IC50，再以各種藥物之IC50進行混和，便可求得藥物組合的各種藥物之IC50，並由下列公式求得三者併用之組合指數(Combination index)。

CI值：小於1表示藥物組合彼此之間有協同作用(synergism)；等於1表示藥物組合彼此之間有加成作用；大於1則表示藥物組合彼此之間有對抗作用。

試驗結果

如圖1所示，本發明對齲齒菌(如：UA159型轉糖鏈球菌)之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為87.49%~87.98%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.23%~0.29%的地喹氯銨(Q)及11.73%~12.25%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖2及圖8所示，本發明對牙周病菌(如：牙齦卟啉單胞菌)之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為87.28%~87.98%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.25%~0.29%的地喹氯銨(Q)及11.73%~12.47%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合；或有效成份濃度為79.44%~79.66%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、9.09%~9.30%的4-己基間苯二酚(R)及11.34%~11.47%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖3及圖9所示，本發明對人類鱗狀上皮癌細胞之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為94.60%~95.54%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.21%~0.28%的地喹氯銨(Q)及4.25%~5.11%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合；或有效成份濃度為22.27%~25.48%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、65.61%~68.82%的4-己基間苯二酚(R)及8.91%~8.92%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖4所示，本發明對大腸桿菌之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為95.28%~95.41%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.25%~0.27%的地喹氯銨(Q)及4.34%~4.45%的氯化錳或硫酸鋅等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖5所示，本發明對綠膿桿菌之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為92.81%~95.69%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.32%~2.94%的地喹氯銨(Q)及3.99%~4.25%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖6所示，本發明對枯草桿菌之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為95.18%~95.40%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.26%~0.34%的地喹氯銨(Q)及4.34%~4.51%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

如圖7所示，本發明對金黃色葡萄球菌之生長達50%抑制濃度時，其有效成份濃度係為95.18%~95.42%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)、0.28%~0.34%的地喹氯銨(Q)及4.29%~4.48%的氯化錳、硫酸鋅或硫酸氧釩等金屬離子鹽類(M)的組合。

由圖1至圖9可發現，本發明確實成功取代了氟化物的應用，且由於表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E)係天然的綠茶萃取物，不僅大大降低對環境的影響，更免去對人體造成負擔的疑慮。

另外，本發明對乳酸菌之生長並無顯著抑制效果，但卻有抑制上述各種病菌之功效，顯示本發明進一步有益於調整體內菌相，有益身體健康(未示於圖中)。

E‧‧‧表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)

Q‧‧‧地喹氯銨(Dequalinium)

F‧‧‧氟化鈉(NaF)

M‧‧‧金屬離子鹽類，包含錳離子(Mn)、釩離子(VO₄)及鋅離子(Zn)

Claims

一種醫藥組合物，包含：87.28%~87.98%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)；0.25%~0.29%的地喹氯銨(Dequalinium)；及11.73%~12.47%的錳離子、釩酸根離子或鋅離子。
一種如請求項第1項所述之醫藥組合物用於製備抑制牙齦卟啉單胞菌生長的藥物之用途。
一種醫藥組合物，包含：94.60%~95.54%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)；0.21%~0.28%的地喹氯銨(Dequalinium)；及4.25%~5.11%的錳離子、釩酸根離子或鋅離子。
一種如請求項第3項所述之醫藥組合物用於製備抑制人類鱗狀上皮癌細胞生長的藥物之用途。
一種醫藥組合物，包含：79.44%~79.66%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)；9.09%~9.30%的4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)；及 11.34%~11.47%的錳離子或鋅離子。
一種如請求項第5項所述之醫藥組合物用於製備抑制牙齦卟啉單胞菌生長的藥物之用途。
一種醫藥組合物，包含：22.27%~25.48%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)；65.61%~68.82%的4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)；及8.91%~8.92%的錳離子或鋅離子。
一種如請求項第7項所述之醫藥組合物用於製備抑制人類鱗狀上皮癌細胞生長的藥物之用途。
一種醫藥組合物，包含：95.18%~95.42%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate；EGCG)；0.26%~0.34%的地喹氯銨(Dequalinium)；及4.29%~4.48%的錳離子或鋅離子。
一種如請求項第9項所述之醫藥組合物用於製備抑制枯草桿菌或金黃色葡萄球菌生長的藥物之用途。