TWI599370B

TWI599370B - 靈芝多醣誘發之抗體介導抗腫瘤活性

Info

Publication number: TWI599370B
Application number: TW103125579A
Authority: TW
Inventors: 翁啟惠; 吳宗益; 許先業; 廖詩芬; 梁其輝
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2017-09-21
Also published as: TW201542224A; US20160166661A1; CN105473149A; WO2015026484A9; JP2016525552A; US10307470B2; WO2015026484A1

Description

靈芝多醣誘發之抗體介導抗腫瘤活性

【參考相關申請案】

本申請案主張2013年7月26日申請之美國臨時專利申請案第61/859,162號之優先權，標題為「靈芝多醣誘發之抗體介導抗腫瘤活性」，其在此併入本案以作為參考資料。

本發明係有關癌症疫苗之領域。具體而言，本發明係有關以醣類為主的免疫原性組合物，其包含分離自靈芝類(Ganoderma lucidum)之含岩藻糖萃取物之富含岩藻糖的多醣。更具體而言，本發明係有關癌症疫苗，其係針對含有Globo H及相關抗原的細胞。

各種形式的中草藥多醣已成為世界各地的有價值健康補給品(1,2)，顯示投予此類多醣可改善體內先天免疫。然而，其潛在分子機制仍不清楚。

欲設計抗癌療法，必須尋找不存在於正常細胞的癌症或癌症幹細胞分子標靶。醣化異常通常與腫瘤進展相關，此為Meezan等人於1969年首次提出，其證實癌症聚醣與健康細胞有所不同(Meezan E,et al.(1969)Biochemistry 8：2518-2524.)。腫瘤相關聚醣的末端岩藻醣化(fucosylation) 及唾液酸醣化(sialylation)異常為癌症進展的數個重要醣化事件之一(3,4)，且近來此類不尋常的聚醣係用於開發抗癌症疫苗(5-7)。醣化異常包括喪失或過度表現特定結構、持續的斷裂結構、及出現新結構。後來的許多組織學證據支持了結構差異的說法，其係使用凝集素染色法並進行健康與惡性組織的比較(Turner G A(1992)Clin Chim Acta 208：149-171；Gabius H J(2000)Naturwissenschaften 87：108-121.)。

近來，藉由單株抗體及質譜鑑定，找到腫瘤相關醣抗原(Shriver Z,et al.(2004)Nat Rev Drug Disc 3：863-873；Pacino G,et al.(1991)Br J Cancer 63：390-398.)。至今，已確認出許多腫瘤相關抗原以醣脂質或醣蛋白形式表現於癌症細胞並與特定類型的癌症相關(Bertozzi C R,Dube D H(2005)Nat Rev Drug Discovery 4：477-488.)。雖然對於表面醣類於惡性細胞中扮演的角色所知相對甚少，不過以被動投予或疫苗誘發抗體對抗這些抗原已知與改善的預後有關。

在這些報告的腫瘤相關聚醣中，醣脂質抗原Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)係首先由Hakomori等人於1984年自乳癌MCF-7細胞分離及鑑定(Bremer E G,et al.(1984)J Biol Chem 259：14773-14777.)。抗Globo H單株抗體的進一步研究顯示，Globo H存在於許多其他癌症，包括前列腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、及結腸癌，且僅有極少表現於正常分泌組織的內腔表面，其不易與免疫系統接觸(Ragupathi G,et al.(1997)Angew Chem Int Ed 36：125-128.)。此外，已經證實，乳癌病患血清中含有高濃度抗Globo H抗體(Gilewski T et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：3270-3275；Huang C-Y, et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：15-20；Wang C-C,et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33)：11661-11666)，且相較於Globo H呈陰性的腫瘤病患，Globo H呈陽性的腫瘤病患存活期較短(Chang,Y-J,et al.(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104(25)：10299-10304.)。這些發現使得Globo H這種六醣表位成為引人注目的腫瘤標記及發展癌症疫苗的可行標靶。

舉例而言，以Globo H為主的醣共軛物(glycoconjugate)疫苗近來正進行大規模的臨床試驗，並顯示藥劑治療效果(8,9)。在針對病原微生物(如B型嗜血桿菌(Haemophilus influenza type B)及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia))的免疫反應研究中，證實含重複抗原單元的多醣一般而言為T細胞非依賴型(T cell-independent；TI)(10,11)。

Globo H為過度表現於各種上皮癌的癌症抗原。目前認為，此類抗原可作為癌症免疫治療標靶。雖然疫苗已開發成誘發抗體反應以對抗Globo H，其抗癌功效不理想，係因Globo H的抗原性低。

在乳癌中，60%以上的乳管癌、乳腺小葉癌、及管狀癌可觀察到Globo H表現，但未出現於非上皮乳腺腫瘤(Mariani-Constantini R et al.,(1984)Am.J.Pathol.115：47-56)。Globo H未於正常組織表現，除了管腔邊界頂部上皮細胞的微弱表現以外，該處似乎無法與免疫系統接觸(Id.；Zhang S.et al.,(1997)Int.J.Cancer 73：42-49)。

Globo H亦於乳癌幹細胞(breast cancer stem cells；BCSCs)中表現。流式細胞分析顯示，41個乳癌標本中有25個表現Globo H(61.0%)。25個非乳癌幹細胞(Non-BCSCs)標本中有25個且40個乳癌幹細胞標本中有8個(20%)表現Globo H。40個腫瘤標本中有31個(77.5%)表現Globo H 五醣前驅物階段專一性胚胎抗原-3(stage-specific embryonic antigen-3；SSEA-3)。31個非乳癌幹細胞標本中有29個且40個乳癌幹細胞標本中有25個(62.5%)表現SSEA-3(Chang W-W.et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(33)：11667-11672.)。

仍有需要發展新的能誘發高程度免疫反應以靶向Globo H及相關抗原的疫苗。

本發明係有關一種醣系免疫原性組合物，其包含富含岩藻糖之靈芝多醣區分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS係以粒徑排阻層析法分離自靈芝F3，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自於1,4-甘露聚糖及1,6-α-半乳聚糖的主鏈，其中主鏈連接至末端含岩藻糖的側鏈；以及可視需要的佐劑。

在一些具體實施例中，佐劑為醣脂質。在特定具體實施例中，佐劑為α-GalCer的合成類似物，其係選自於：

在一態樣，FMS包含主鏈，其經由一或多個選自於Fucα1-2Gal、Fucα1-3/4Man、Fucα1-4Xyl及Fucα1-2Fuc的鍵聯而連接至末端含岩藻糖的側鏈。FMS主要包含岩藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖，其比例為2：1.5：2.5：3.5。在一些具體實施例中，FMS包含小量的葡萄糖、葡萄糖胺及半乳糖胺。

在一態樣，以免疫原性組合物結合醣脂質佐劑以誘發IgG、IgG1及IgM抗體並提供特殊免疫原性(exceptional immunogenicity)。

在一態樣，免疫反應產生的抗體專一性地結合至腫瘤相關抗原之至少一者，該抗原係選自於由Globo H、Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3；Gb-5；Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)、及SSEA-4(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)組成之群組，其皆具有癌症細胞專一性。

在一些具體實施例中，免疫反應產生的抗體專一性地結合至聚醣抗原，該抗原包含常見結構：Fucα1-2Galβ1-3GalNAc-R位於非還原末端。

在一態樣，免疫反應產生的抗體專一性地結合至抗原，該抗原進一步包含額外的雙醣延伸，其位於Fucα1-2Galβ1-3GalNAc-R的還原端，其中雙醣部分係選自於：Fucα1-2Gal-R、Fucα1-3/4Man-R、Fucα1-4Xyl-R及Fucα1-2Fuc-R。

在一態樣，免疫反應產生的抗體專一性地結合至α-L-岩藻糖專一性凝集素、刺金雀花凝集素-I(Ulex europaeus agglutinin-I；UEA-I)。

在一態樣，免疫反應產生的抗體專一性地結合至聚醣抗原，該抗原包含s血型ABH決定位。

在一態樣，免疫反應產生的抗體可於癌症細胞觸發補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)。在一些具體實施例中，CDC活性足以於肺癌細胞減少腫瘤大小。

在一態樣，投予免疫原性組合物造成單核球趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1；MCP-1)的血清濃度下降。

在本方法的一些具體實施例中，免疫原性組合物進一步包含癌症疫苗，且進一步其中一或多個以一有效量之癌症疫苗的治療可抑制腫瘤生長。在一些具體實施例中，投予癌症疫苗減少腫瘤大小。

本發明係有關一種包含免疫原性組合物的癌症疫苗，其能於個體誘發抗癌免疫反應。在一些態樣，癌症疫苗適於治療選自於由乳癌、肺癌、肝癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦腫瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、及膀胱癌所組成群組之癌症。

本發明進一步提供一種使用前述免疫原性組合物的方法。本發明係有關包含抑制腫瘤生長的治療方法，該方法包含：(a)投予免疫原性組合物至有需求的個體，該組合物包含富含岩藻糖之靈芝多醣區分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS係以粒徑排阻層析法自靈芝F3分離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自於1,4-甘露聚糖及1,6-α-半乳聚糖的主鏈，其中主鏈連接至末端含岩藻糖的側鏈；以及可視需要的佐劑；以及(b)誘發致使抑制腫瘤生長的免疫反應。

這些及其他態樣將因下列較佳具體實施例之說明並結合下列圖式而顯見，儘管可能會進行變更及修改，但未背離本發明新穎概念之精神及範疇。

下列圖式構成本說明書之一部份並涵蓋進一步闡釋本發明之特定態樣，可藉由參照一或多個這些圖式並結合本文所呈特定具體實施例之詳述以更好地理解。

本專利圖式如下。

圖1為由CFG聚醣微陣列測定的血清IgM抗體聚醣結合模式。各直方圖代表不同來源的IgM結合至聚醣微陣列，其中x軸為所測定的611個醣類的聚醣編號且y為相對螢光單位(relative fluorescent units；RFU)。在注射四劑之後，於第14天收集經(A)F3、(B)FMS、及(C)PBS處理的小鼠血清樣本(以1：100比例稀釋測試)並以功能性醣質體協會H中心(Consortium for Functional Glycomics(CFG)Core H)的印刷陣列Version 5.0分析。圖中列出9個經鑑定的聚醣結構並標記聚醣編號。虛線圓圈表示一致的聚醣表位(H型3/4結構)。條形顯示平均RFUs。n=4(A,B)；n=2(C)。

圖2為一系列由FMS誘發之抗血清所高度識別的腫瘤相關聚醣。各個具有化學連接子的聚醣結構皆印刷於CFG 5.0版，其分成二組。連接子結構如所示：sp0=CH₂CH₂NH₂；sp9=CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂；sp21=N(CH₃)OCH₂CH₂NH₂。血型決定位(H、A、或B)的定義如本文之註解。

圖3為富含岩藻糖之F3多醣FMS的抗腫瘤活性。(A)以LDH套組測定經FMS處理的小鼠的抗血清對於LLC1與TC-1腫瘤細胞的抗體介導細胞毒性(antibody-mediated cytotoxicity；CDC)。抗血清於56℃加熱30min(HI抗血清)的數值表示補體缺乏效應。(B)預防性(Exp-1)及治療性(Exp-2)FMS體內治療間之抗腫瘤效果比較。對照組為以腫瘤接種經PBS處理的小鼠。(C)FMS處理抑制體內腫瘤相關細胞介素及趨化介素的產生。在腫瘤接種之後，於指定時間收集血清樣本並以Beadlyte mouse 21-pex套組測定。(D及E)以組裝式聚醣微陣列測定植物凝集素(AAL，2μg/ml及UEA-I，10μg/ml)及抗Globo H mAb(MBr1，0.5mg/ml)對於Globo H(GH)、FMS、及F3的不同結合強度。(F、G及H)DFMS(低岩藻糖含量的FMS)處理減少體內CDC(F)及抗腫瘤活性，如腫瘤生長曲線(G)及MCP-1產生量(H)之評估。數值顯示平均值±標準差(各實驗n=3~5)。n.d.=未檢出。NS=無統計顯著性。

圖4為免疫接種靈芝多醣小鼠的抗聚醣IgM產生與B1 B細胞增殖間之相關性。(A及B)以Globo H相關之印刷聚醣微陣列(A)及FMS塗佈之ELISA培養盤(B)評估經FMS及DFMS處理的小鼠的抗血清。(A)將IgM抗Gb5設定為1，以進行IgM結合至Globo H(GH)及其截斷形式的標準化(以1：100比例稀釋測試)。(B)藉由檢測450nm下的吸光值以測定IgM與FMS的結合(以1：20至1：320比例稀釋測試)。(C、D及E)免疫接種FMS時腹腔B1 B細胞之增殖。B1 B細胞的FACS輪廓代表經FMS處理小鼠及對照組。額外的B2 B細胞及巨噬細胞的量顯示於圖S4。數字(%)代表各圈選的陽性細胞(C)。於自經FMS處理小鼠純化的體外B1 B細胞培養中，FMS誘發向上調節血漿細胞表面標記物(CD138)(D)及IgM產生(E)。平均值±標準差(各實驗n=3~5)。n.d.=未檢出。

圖5為F3的抗腫瘤效果。(A)以LLC1細胞(2 x 10⁵)皮下注射C57BL/6小鼠，接著每隔2天以F3(每隻小鼠24、52、120、及240mg/kg體重)腹腔注射處理21天。以平均值±標準誤差表示腫瘤體積曲線(各組 n=4~6)。圖中顯示相較於對照組(經PBS處理的小鼠)的腫瘤生長統計分析。***p<0.001。(B)以F3(0、60、90、120、及180μg/ml)於體外處理LLC1細胞(1×10³)24h，並以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)試驗測定細胞存活率。將未處理細胞之存活率標準化為100%。數據以±標準誤差表示(n=4)。(C)以mAb MBr1檢測及流式細胞儀分析鑑定表現於LLC1細胞的Globo H。在此直方圖中，y軸表示細胞數目且x軸表示螢光強度(對數尺度)。以DyLight-649共軛連接的MBr1進行陽性細胞染色。非專一性結合對照組的染色僅以二級mAb進行。細胞含於PBS(含有5% BSA)代表空白組。(D)F3誘發之抗血清於體外觸發補體介導LLC1細胞溶解。將細胞培養於10%抗血清，並分成下列四組：(1)經PBS處理小鼠；(2)經F3處理小鼠；(3)經受LLC1小鼠；以及(4)經F3處理/經受LLC1小鼠。在37℃下培養1h之後，細胞以FITC共軛連接的膜聯蛋白(annexin V)染色並以碘化丙啶(propidium iodide；PI)複染，以藉流式細胞儀檢測早期凋亡及晚期凋亡細胞。早期凋亡細胞(%)呈現膜聯蛋白V-FITC⁺及PI^-，且晚期凋亡細胞(%)呈現膜聯蛋白V-FITC及PI雙重陽性。

圖6為經F3處理的小鼠血清(腹腔注射120mg/kg體重)的聚醣微陣列分析。由四個實驗條件取得測試抗血清(於第一次注射後第14天)：經PBS處理的小鼠、經F3處理的小鼠、經受LLC1小鼠、及經F3處理/經受LLC1小鼠。測定血清IgM抗體對於60個合成寡醣陣列的聚醣結合輪廓。數據以平均值±標準差表示(各組n=4~6)。圖中指出具顯著差異的IgM結合之Globo H系列聚醣及其聚醣數目。

圖7列出連接於組裝式聚醣晶片之NHS功能化玻璃面的60個聚醣結構及其聚醣數目。

圖8為經FMS處理組及對照組小鼠腹腔細胞族群的FACS輪廓。數字(%)代表各圈選的陽性細胞。經PBS處理組(對照組)與經FMS處理組小鼠間之B2 B細胞(A)及巨噬細胞(B)子族群無顯著差異。各組n=3~5。

圖9(9A)設計二個免疫接種方案以評估預防性及治療性處理。(9B)進行競爭試驗以評估FMS誘發之血清IgM的聚醣專一性。將競爭劑醣類及抗血清(以1：100比例稀釋測試)同時加入Globo H印刷晶片上的子孔。以無競爭劑的抗血清進行標準化以取得結合百分比。圖中顯示二獨立實驗之一代表數據。n=3重複。

圖10(10A)全甲基化FMS水解物醛醣醇類之單電荷加鈉分子離子的MALDI-MS製圖及組成指派。(10B)FMS水解物之全甲基化醛醣醇類的目標性nanoLC-MS/MS聚醣定序及岩藻糖化表位鍵聯鑑定。圖中顯示FMS-H聚醣的基峰層析圖及聚醣組合物1Fuc-2Hex-itol、1Fuc-1Xy-1Hex-itol、及3Fuc-itol的個別萃取離子層析圖。NL(標準化水平)代表層析圖的軸強度。表1顯示觀察到的m/z及聚醣組合物分析。

表1. 全甲基化FMS水解物醛醣醇類之nanoLC-MS光譜觀察到的多電荷加鈉分子離子的組成指派

圖11為FMS水解物之全甲基化醛醣醇類的目標區域奈米LC-MS/MS聚醣定序及岩藻糖化表位鍵聯鑑定。藉由(11A)1Fuc-2Hex-itol、(11B及11C)1Fuc-1Xyl-1Hex-itol、及(11D)3Fuc-itol的數據依賴性MS² 及隨後的MS³光譜，以鑑定全甲基化FMS水解物醛醣醇類的岩藻糖化醣表位(glycotope)鍵聯。三角形代表岩藻糖殘基。圓形代表六碳糖殘基。星號代表木糖殘基。

「Reishi(靈芝)」是指蕈類靈芝(Ganoderma lucidum)之一形式的名稱，及其近親松杉靈芝(Ganoderma tsugae)。「純化的靈芝」是指靈芝萃取物，其製備如美國正式申請案第11/553,402號及/或第10/213,257號(現為美國專利第7,135,183號)所揭示，在此併入本案以作為參考資料，其中純化的靈芝包含多醣或含有末端岩藻糖殘基的醣胜肽。

以靈芝的鹼萃取物進行粒徑排阻層析法。將具有O.D.625光吸收值約1.8的主要區分命名為區分3。區分3包括含岩藻糖的醣蛋白部分，其包含末端岩藻糖殘基。「末端岩藻糖殘基」乙詞是指位於接近醣鏈游離端之區域的醣鏈之岩藻糖殘基。區分3的含岩藻糖醣蛋白部分亦包括以α1,2-岩藻糖苷鍵聯及α3,4-岩藻糖苷鍵聯結合的岩藻糖殘基。

FMS為源自F3的富含岩藻糖之多醣區分，其具有獨特免疫原性，且以F3或FMS免疫接種的小鼠可發揮有效的抗體介導反應以對抗表現Globo H的鼠科LLC1細胞。這些發現與先前的主張一致，即由靈芝多醣強化的宿主免疫功能提供Globo H陽性肺癌病患免疫治療上極大的功效(48)。依據聚醣結構分析，最可能的岩藻基聚醣部分為Fucα1-2Gal-R、Fucα1-3/4Man-R、Fucα1-4Xyl-R及Fucα1-2Fuc-R。

其中一些可活化抗體反應以對抗腫瘤專一性聚醣表位，這為開發複合醣類發展出一方向，作為以免疫調節為主的治療。雖然本研究侷限在靈芝多醣，且大部分針對肺癌，不過高通量聚醣微陣列分析及醣類抗原詳細結構分析應可應用於其他藥用多醣，其誘發不同的抗體介導生物功能。

在下列說明中，參考同為本發明之一部份的圖式，其通過圖解可實施之特定具體實施例的方式呈現。這些具體實施例係經詳述以使熟習本領域者能實施本發明，並應理解到，可採用其他具體實施例，且可進行結構、邏輯、及電學上的改變而不背離本發明之範疇。因此，下列示例性具體實施例之說明不可視為具有侷限性，且本發明之範疇係如所附申請專利範圍之定義。

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的意義。儘管類似或等同於本文所述之任何方法及材料可用於本發明之實施或測試，現將說明較佳之方法及材料。本文所特別提及的所有公開文獻及專利皆併入本案以作為參考資料，其目的在於包括說明及揭示公開文獻所報告的化學品、細胞株、載體、動物、儀器、統計分析、及方法學，其用途可能與本發明相關。本說明書引用的所有參考文獻皆視為代表本領域之技術水準。本文不可解釋為同意本發明無權先於先前發明揭露。

在說明本發明之材料及方法前，應理解到，本發明未侷限於所述的特定方法學、步驟、材料、及試劑，因其可能改變。亦應理解到，本文使用之術語，目的僅在於說明特定具體實施例，而非旨在侷限本發明之範疇，並將僅侷限於所附之申請專利範圍。

當提供一範圍之數值時，應理解到，除非本文另有明確說明，各中間值至下限單位的十分之一、該範圍之上限與下限之間、及該設定範圍的任何其他設定值或中間值皆涵蓋於本發明之內。這些較小範圍的上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，亦可涵蓋於本發明之內，其皆受設定範圍的任何特定排除限制。當設定範圍包括限制值之一或兩者時，排除於這些涵蓋的限制值的任一或兩者之外的範圍亦包括於本發明之中。

除非另有指明，本發明之實施將採用常規分子生物學、微生物學、重組型DNA、及免疫學技術，其皆為本領域之技術範圍。此類技術皆於文獻中完整解釋。參見如Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；DNA Cloning, Volumes I and II(D. N. Glover ed., 1985)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；專書類，Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)；以及Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)。

除非另有明確指明，本文及後附申請專利範圍中使用的單數形式「一」、「一者」、及「該」皆包括複數參考體。因此，舉例而言，「運輸增強劑」包括複數個運輸增強劑及單一運輸增強劑。參照「螫合劑」，其包括二或多個螫合劑及單一螫合劑等。在本說明書及隨附的申請專利範圍中，將會參考一些術語，其應定義為具有下列涵意：本文使用的「治療性」及「治療」等詞是指投予藥劑或配方至患有不良病況、疾病、或病症之臨床症狀的個體，以進行降低症狀嚴重度及/或頻率、消除症狀及/或其潛在病因、及/或促進損傷的改善或補救。「預防性」及「預防」等詞是指投予藥劑或組合物至臨床上無症狀的個體，其易患有特定不良病況、疾病、或病症，因此其係有關預防症狀及/或其潛在病因的發生。除非另有指明，不論明示或暗示，若使用本文中「治療」(或「治療性」)乙詞而未提及可能的預防，其旨在亦涵蓋預防。

「可視需要的」或「可視需要存在」，如用於「可視需要的取代物」或「可視需要存在的添加劑」是指後續描述的成分(如取代物或添加劑)可存在或可不存在，因此該描述包括成分存在的實例及成分不存在的實例。

「醫藥上可接受」乙詞是指非生物學上或其他方面非所要之材料，例如，該材料可併入本發明之配方而不造成任何非所要的生物效應或以有害方式與劑型配方之其他組分之任一者交互作用。然而，當「醫藥上可接受」乙詞用於涉及醫藥上賦形劑時，意指賦形劑已符合毒理學及製造測試所需的標準及/或其包括於美國食品藥物管理局提出的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。如以下之進一步詳述，「藥理學上活性」(或簡單而言「活性」)，如用於「藥理學上活性」衍生物或類似物，意指衍生物或類似物具有如同母藥的相同類型藥理學活性。

本文使用的「抗原」乙詞係定義為任何能誘發免疫反應的物質。

本文使用的「免疫原」乙詞是指抗原或物質能誘發產生抗原，如DNA疫苗。

本文使用的「免疫原性」乙詞是指免疫原、抗原、或疫苗刺激免疫反應的能力。

本文使用的「免疫療法」乙詞是指基於調控免疫系統之概念的治療方案模式，以達到預防及/或治療目的。

本文使用的「細胞介素」乙詞是指多種小型、分泌性蛋白質之任一者，其藉由影響免疫細胞分化過程以調節免疫反應的強度及時間，該過程通常涉及基因表現改變，使得前驅細胞變成不同的特化細胞類型。細胞介素基於其推測之功能、分泌之細胞及作用標的已廣泛命名為淋巴激素(lymphokines)、介白素及趨化介素。舉例而言，一些常見的介白素包括但不侷限於，IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21及TGF-β。

本文使用的「趨化介素」乙詞是指於感染位置釋放的各種小型趨化性細胞介素之任一者，為提供動員及活化淋巴細胞的工具。趨化介素吸引白血球至感染位置。趨化介素具有保留的半胱胺酸殘基，使其能分成四個族群。這些族群的代表性趨化介素為C-C趨化介素(RANTES、MCP-1、MIP-1α、及MIP-1β)、C-X-C趨化介素(IL-8)、C趨化介素(淋巴趨化因子(Lymphotactin))及CXXXC趨化介素(分形素(Fractalkine))。

本文使用的「表位」乙詞係定義為抗原分子的一部分，其接觸抗體之抗原結合位置或T細胞受體。

本文使用的「疫苗」乙詞是指含有抗原的製劑，其係由完整致病生物體(死亡或減毒)或此類生物體之成分如蛋白質、胜肽、或多醣組成，其用於產生免疫力以對抗生物體造成的疾病。疫苗製劑可為天然的、合成的或衍生自重組型DNA技術。

本文使用的「免疫佐劑」乙詞是指用於與免疫原結合的物質，其強化或改良免疫原的免疫反應。以α-GalCer類似物作為免疫佐劑以改良或增加疫苗效果，其係刺激病患的免疫系統，使投予該疫苗的病患對於疫苗的反應更激烈。在一示例性實施中，以類似物C34作為佐劑。本文使用的「鋁佐劑」乙詞是指具有免疫佐劑活性的鋁鹽。此試劑可於溶液中吸附及沈澱抗原蛋白；所得的沈澱物可改進疫苗免疫原性，其係藉由促進抗原自接種位置形成的疫苗積存處緩慢釋放。

本文使用的「抗腫瘤免疫療法活性劑」乙詞是指本發明之疫苗產生的抗體可抑制、減少及/或消除腫瘤。

本文使用的「抗原專一性」乙詞是指細胞族群的特性，因此供應特定抗原或抗原片段區分可造成專一性細胞增生。

本文使用的「流式細胞分析」或「FACS」等詞是指檢查懸浮於流體流之顆粒或細胞之物理及化學性質的技術，其可經由光學及電子學檢測裝置進行。

胜肽的胺基酸殘基縮寫如下：苯丙胺酸為Phe或F；白胺酸為Leu或L；異白胺酸為Ile或I；甲硫胺酸為Met或M；纈胺酸為Val或V；絲胺酸為Ser或S；脯胺酸為Pro或P；蘇胺酸為Thr或T；丙胺酸為Ala或A；酪胺酸為Tyr或Y；組胺酸為His或H；麩醯胺酸為Gln或Q；天冬醯胺酸為Asn或N；離胺酸為Lys或K；天門冬胺酸為Asp或D；麩胺酸為Glu或E；半胱胺酸為Cys或C；色胺酸為Trp或W；精胺酸為Arg或R；以及甘胺酸為Gly或G。胺基酸之進一步描述請參見Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W.H. Freeman & Co., New York 1983。

本發明之組合物可包括於醫藥或營養組合物，並伴隨額外的活性試劑、載體、載具、賦形劑、或助劑，其可由熟習本領域之技術人員閱讀本發明而理解。

本發明之組合物可包括於醫藥或免疫原性組合物，並伴隨額外的活性試劑、載體、載具、賦形劑或助劑，其可由熟習本領域之技術人員閱讀本發明而理解。

醫藥或免疫原性組合物較佳為包含至少一醫藥上可接受載體。在此醫藥組合物中，本發明之組合物形成「活性化合物」，亦可稱作「活性試劑」。本文使用的「醫藥上可接受載體」乙詞包括兼容於醫藥投予的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑與抗真菌劑、等張劑與吸收延遲劑、及其類似物。補充型活性化合物亦可併入本組合物。醫藥組合物係配製成兼容於其預期之投予途徑。投予途徑之實例包括非口服，如靜脈、皮內、皮下、口服(如吸入)、經皮(局部)、經黏膜、及直腸投予。用於非口服、皮內、或靜脈施加的溶液或懸浮液可包括下列成分：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶液；抗菌劑如苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螫合劑如乙二胺四醋酸；緩衝液如乙酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽；以及張力調節劑如氯化鈉或葡萄糖。可以酸或鹼調整pH，如鹽酸或氫氧化鈉。可將非口服製劑封裝於玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶。

本文提及的個體是指人類或非人類靈長類(如大猩猩、彌猴、狨猿)、家畜動物(如羊、牛、馬、驢、及豬)、伴侶動物(如狗、貓)、實驗室測試動物(如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)、圈養野生動物(如狐、鹿)、及可由本發明試劑獲益的任何其他生物體。可由本發明所述之試劑獲益的動物類型無侷限。個體不論是人類或非人類，皆可稱作病患、個人、動物、宿主或接受者。

適合注射用途的醫藥組合物包括無菌水溶液(其為水溶性)或分散液及用於臨時製備成無菌注射液或分散液的無菌粉末。在靜脈投予方面，適用載體包括生理鹽液、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽液(phosphate buffered saline；PBS)。在所有情況中，組合物應除菌且應維持流動至易於注射的程度。其應於製造及保存條件下維持穩定，並可防止微生物如細菌及真菌的滋生。載體可為含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及其類似物)、及其適當混合物的溶劑或分散劑介質。可藉由使用包衣如卵磷脂、於分散時維持所需顆粒大小及使用界面活性劑維持適當的流動性。可藉由各種抗菌劑及抗真菌劑如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物達到預防微生物作用的效果。在許多情況中，組合物較佳為包括等張劑，如糖類、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可藉由將延長吸收試劑(如單硬脂酸鋁及明膠)包括於組合物以延長注射組合物的吸收。

「有效」量或「治療上有效」量的活性試劑是指提供有利功效的無毒且足量試劑。活性試劑的「有效」量將依個體而變，其取決於個體的年齡及一般條件、特定活性劑或試劑及其類似物。除非另有指明，本文使用的「治療上有效」量乙詞旨在包括除了治療不良病況的有效量以外，尚包括預防不良病況及/或改善不良病況的有效量。

如本文所定義，活性化合物的治療上有效量(即有效劑量)範圍為約0.001至100g/kg體重，或其他本領域技術人員無需實驗即可顯見及理解的範圍。本領域之技術人員應理解到，特定因素可影響有效治療個體所需的劑量及時間，這些因素包括但不侷限於，病症或疾病嚴重程度、先前的治療、個體身體健康或年齡、及患有其他病症。

本文使用的不良狀況可能是常見於個體的「正常」狀況或可能與一確定病症相關或可能無關的病理狀況。

本文使用的「脂質」乙詞是指參與細胞傳訊途徑的任何脂溶性(親脂性)分子。

本文使用的「醣脂質」乙詞是指連接醣類的脂質，其可作為細胞識別的標記物。

依據另一態樣，熟習本領域之技術人員可設想到一或多個部件套組，該部件套組可進行本發明方法之至少一者，該部件套組包含二或多個組合物，該組合物係單獨使用或結合前述方法之至少一者之一有效量本發明組合物。

套組亦可包括組合物，其包含活性試劑、生物事件標識物、或其他由熟習本領域之技術人員閱讀本發明而理解的化合物。套組亦可包含至少一組合物，其包含一有效量之本發明組合物或細胞株。依據熟習本領域之技術人員理解之流程，以部件套組之組合物及細胞株進行本發明之至少一方法。

本文使用的「多胜肽」乙詞是指胺基酸殘基的任何集合體或聚合體。多胜肽可由二或多個多胜肽鏈組成。多胜肽包括蛋白質、胜肽、及寡胜肽。多胜肽可為直鏈型或分枝型。多胜肽可包含修飾的胺基酸殘基、胺基酸類似物、或非天然存在的胺基酸殘基，並可以非胺基酸殘基將其中斷。定義中涵蓋經修飾的胺基酸聚合體，不論是以天然或干預方式產生，如形成雙硫鍵、醣化、脂質化、甲基化、乙醯化、磷酸化、或藉由操縱方式，如以標定成分連接。

本文使用的「專一性結合」乙詞是指結合配對體(如抗體與抗原)間之交互作用。在各情況中，專一性結合可藉由親和力常數約10^-6莫耳/公升、約10^-7莫耳/公升、或約10^-8莫耳/公升、或以下而實施。

如熟習本領域之技術人員因閱讀本發明而顯見，本文所述及圖式的個別具體實施例之每一者具有分立的元件及特徵，其可易於與其他數個具體實施例之任一者之特徵分開或結合而不背離本發明之範疇或精神。可由列舉事件之順序或邏輯上可能的任何其他順序的方式執行任何列舉之方法。

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的相同意義。若有衝突，將以本文件(包括定義)為準。

自靈芝分離富含岩藻糖之多醣區分(FMS)

最近的研究結果顯示，專一性B細胞亞群能建立記憶以提供專一性免疫球蛋白(immunoglobulin；Ig)合成，以針對TI相關聯的多醣反應(12-14)。欲瞭解由天然來源衍生之多醣的生物學意義，先前已分離及確認取自靈芝(一種長期作為中草藥的蕈類)的水溶性及含岩藻糖多醣(F3)粗萃取物區分(15)。已證實，F3為調節細胞介素網絡、IgM產生、及造血細胞增生所必需(16-19)。

已發現多個可與F3交互作用的樣式辨識受體(pattern recognition receptor)，包括Dectin-1、DC-SIGN、蘭格素(Langerin)、庫弗氏細胞受體、巨噬細胞甘露糖受體、及類鐸受體(20)。值得注意的是，這些結果證實，F3的活化免疫反應可能是藉由與醣類辨識受體的交互作用。在動物實驗中，據報告F3可作為疫苗佐劑，並經由增強宿主介導免疫而發揮抗腫瘤活性(21)，這引發一個問題，即抗體介導免疫是否且如何於小鼠的F3抗腫瘤活性上扮演一角色。

在目前的研究中，以富含岩藻糖的F3多醣(FMS)作為免疫原，結果顯示，誘發的抗血清能生物識別相關的聚醣，具體而言是腫瘤相關的聚醣表位，這支持一假設，即靈芝多醣末端岩藻醣化於抗腫瘤反應上扮演關鍵角色。

靈芝F3的抗腫瘤活性

我們首先以動物腫瘤模式進行研究，係使用C57BL/6J小鼠並移植鼠科路易氏肺癌(Lewis lung carcinoma；LLC1)細胞，以研究F3抗腫瘤活性。簡言之，以皮下注射(s.c.)方式將LLC1細胞植入小鼠，接著每隔一天腹腔注射(i.p.)投予一次F3(每隻小鼠24、52、120、及240mg/kg體重，係溶於PBS)；並重複此流程28天。

如腫瘤生長曲線(圖5A)所示，F3以劑量依賴性方式明顯抑制LLC1細胞生長，且最有效的抑制反應出現於120與240mg/kg間之劑量，其為人類每日可行的劑量。然而，MTT試驗結果顯示，相較於未處理細胞，F3(<200μg/ml)對於LLC1細胞的存活率不具明顯功效(圖5B)。這些結果顯示，F3可抑制LLC1細胞生長並經由間接抗腫瘤機制延長經受腫瘤小鼠的存活率。在動物研究中，先前已報告萃取自靈芝之多醣的抗腫瘤效果(22,23)。

更有趣的是，證據顯示，經靈芝多醣處理之小鼠的血清明顯抑制體外鼠科肉瘤-180(murine sarcoma-180)及人類肺癌(PG)生長，但是單獨經純的靈芝萃取物處理無法誘發類似功效(24,25)。因此，發明人進行合成聚醣微陣列分析，以調查是否F3誘發之抗血清能生物識別重要聚醣表位。每隔一週以60個結構不同的合成寡醣篩選血清樣本，這些寡醣包括數種腫瘤相關的聚醣。鑑於F3誘發之抗血清的聚醣結合樣式，顯示一明顯趨勢，即於二週的F3處理之後，相較於對照組(未經F3處理)，IgM抗體結合至Globo H及Globo H系列聚醣的親和力增加，這些聚醣包括末端四醣(Bb4)及三醣(Bb3)(圖6，且醣類結構顯示於圖7)。

與IgM反應相反的是，血清IgG不具明顯聚醣結合功效。截至目前，IgM抗Globo H單株抗體(mAb)MBr1為含有Globo H醣之共軛物檢測的有價值探針之一(26,27)，並亦認為，其發揮補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)以對抗Globo H陽性腫瘤(8,28)。因此，我們以mAb MBr1免疫染色法檢查LLC1細胞表面上Globo H抗原表現量(圖5C)。將F3誘發之抗血清加入LLC1細胞，發現可於體外觸發細胞死亡(圖5D)，從而推測F3具有誘發抗體介導抗腫瘤活性的潛力。

自靈芝分離之富含岩藻糖之多醣區分(FMS)誘發抗體辨識Globo H系列結構

本發明之一具體實施例為癌症的治療方法，其係藉由投予一有效量之含有FMS及佐劑的免疫組合物至有需求之個體。目標癌症類型包括但不侷限於，乳癌(包括第1至4期)、肺癌(如小細胞肺癌)、肝癌(如肝細胞癌)、口腔癌、胃癌(包括T1-T4)、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦腫瘤(如星狀細胞瘤、多形性神經膠質母細胞瘤及腦脊髓膜瘤)、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、及子宮內膜癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、及胃腸道間質瘤。

可視需要地，佐劑與FMS包括於免疫原性組合物。在一些具體實施例中，佐劑為醣脂質。較佳之佐劑包括但不侷限於，α-GalCer之合成類似物，如7DW8-5及C34。

先前的報告指出，多醣的岩藻醣化負責F3的免疫調節活性(15)。由於F3習知為異質性及高分子量多醣(>100kDa)，因此發明人以一系列層析步驟自F3純化富含岩藻糖之多醣區分，並稱作FMS。

利用SEC/MALLS(粒徑排阻層析結合多角度雷射光散射，size-exclusion chromatography combined with multi-angle laser light scattering)系統，評估FMS的平均分子量為35kDa。

組合物分析顯示，FMS主要由岩藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖組成，其比例為2：1.5：2.5：3.5，並伴隨少量的葡萄糖及胺基糖類(如葡萄糖胺及半乳糖胺)。甲基化分析顯示，FMS以1,4-甘露聚糖主鏈為主體，並於C3位置具有側鏈，且C2位置具有1,6-α-半乳聚糖支鏈，並以末端岩藻糖高度修飾(表3)(29-31)。

欲檢查FMS誘發之抗血清的聚醣結合性質，使用取自功能性醣質體協會H中心(Consortium for Functional Glycomics(CFG)Core H)的611個聚醣組成的更全面聚醣微陣列，以評估血清IgM抗體的作用。發明人分別檢查取自經FMS及F3處理之小鼠的第二週血清樣本。同時亦分析對照組小鼠(經PBS處理)的血清，以測定非專一性結合的背景值。圖1顯示以相對螢光單位(relative fluorescence units；RFUs)表示611個聚醣的結合輪廓。可以顯見，FMS組的抗聚醣IgM抗體專一性及選擇性比F3組的更高，這幾個聚醣包括聚醣編號(#)60、62、390、391、394、468、469、537、及538。表2列出由F3組結合的前30個聚醣的詳細列表。

雖然影響抗體結合力的確切抗原尚不清楚，但是變得更清楚的是，這些排名前面的由FMS誘發之抗血清結合的聚醣，其非還原端皆具有共同結構，即Fucα1-2Galß1-3GalNAc-R。更有趣的是，發現有一群聚醣(## 390、391、及394)具有最高的抗體結合強度，顯示Fucα1-2Galß1-3GalNAc-R還原端的額外雙醣(Fucα1-2Gal)延伸可改進抗血清結合親和力。

接著，我們探討是否任何高度識別性聚醣與內源性人類腫瘤相關抗原有關。當進一步分類這些聚醣結構的特性及其生物來源時，顯示大部分代表僅能於人類醣鞘酯(glycosphingolipids；GSLs)發現的血型ABH決定位(圖2)(32-34)。該三個聚醣# 390、391、及394具有特徵決定位，其屬於GSL新乳糖系列(neolacto-series)(第3型鏈)的末端聚醣結構。已有報告指出，此類GSL聚醣於正常與癌症組織間之分佈差異可用於診斷人類子宮頸癌及膀胱腫瘤(35,36)。

此外，其他三個聚醣經鑑定為屬於GSL globo系列結構(第4型鏈)的腫瘤相關抗原，包括Globo H(# 60)、Globo A(# 537)及Globo B(# 538)。這可能是習知醣類專一性抗體交叉反應性的表現，可以推測，於所觀察到的FMS誘發之IgM抗體(即可識別Globo H及相關腫瘤結合聚醣(延長的Globo H系列)的抗體)的專一性之下，聚醣部分Fucα1-2Galß1-3GalNAcα/ß(稱作H型3/4)可能是抗原決定位。

FMS末端岩藻糖於抗體介導抗腫瘤功效上具有重要性

我們進一步研究是否FMS介導的LLC1細胞抗體反應能觸發體外細胞毒性，以及是否此CDC活性對於Globo H陽性腫瘤具有效用。亦選擇Globo H陰性小鼠腫瘤細胞株TC-1進行比較。如圖3A所示，CDC試驗結果顯示，LLC1細胞對於FMS誘發之抗血清的敏感性比TC-1細胞的高，且呈現濃度依賴效應。我們進一步探討是否FMS能抑制LLC1細胞的體內生長。設計二種免疫方案，與經PBS處理之接受LLC1小鼠(對照組)相比較，評估預防性(Exp-1)及治療性(Exp-2)兩者的潛力(圖9A)。所得的腫瘤生長曲線顯示，FMS預處理(Exp-1)能更大地減少腫瘤體積(p<0.05，相較於對照組)(圖3B)。由於慢性發炎與腫瘤發展之間常被認為緊密相關，發明人檢查是否FMS劑量可調節體內LLC1相關聯發炎介質的產生。經FMS預處理(Exp-1)小鼠於接種腫瘤後第28天的多重細胞介素剖析顯示，二種趨化介素及一種細胞介素明顯減少，分別為單細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、CXCL1(KC)及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)(p<0.05，相較於第28天的對照組)(圖3C)。更有趣的是，投予FMS可有效降低經受LLC1小鼠的血清MCP-1濃度。已知MCP-1分泌自腫瘤細胞，其為人類肺癌發病機制的重要決定因子。先前的研究亦證實，於數個非小細胞肺癌(NSCLC)動物模式中，阻斷MCP-1，如以中和抗體介導，明顯減緩原發腫瘤生長(37,38)。因此，這些結果支持一觀點，即FMS不僅能抑制LLC1細胞生長，還能減輕體內相對發炎程度。

以F3及FMS作為免疫原誘發抗體及抑制Globo H陽性腫瘤生長的令人意想不到能力，再加上聚醣微陣列分析，顯示存在於F3及FMS的抗原單位結構可為岩藻糖化聚醣。先前的研究證實，mAb MBr1的最小表位為H型3/4，如Globo H的末端三醣(Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ，亦稱作Bb3)，且末端岩藻糖為抗體辨識所必需(27,34,39)。欲檢查是否Globo H系列分子存在於靈芝多醣，我們製作醣印刷玻片(saccharide-printed slides)，其係藉由將Globo H(100μM)、F3(1mg)、及FMS(1mg)連接於NHS活化玻片，接著以MBr1作用於玻片。如預期，抗體與Globo H的結合曲線呈現劑量依賴效應。儘管如此，FMS及F3顯示既非明顯結合交互作用，亦非劑量依賴行為(圖3D)。關於抗體專一性，發明人先前報告，以Globo H為主的醣共軛物疫苗所誘發的抗體對於Globo H、SSEA3(亦稱作Gb5、Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)、及SSEA4(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)的敏感性更高(9)。然而，此種交叉反應性並未出現於F3或FMS誘發之IgM抗體。這使得發明人認為，靈芝多醣可能未含有Globo H系列抗原。這以二個α-L-岩藻糖專一性凝集素UEA-I(刺金雀花凝集素-I)及AAL(橙黃網孢盤菌凝集素；Aleuria aurantia lectin)作用於醣印刷玻片的方式進行探討。AAL結合至所有樣本，其證實α-岩藻基鍵聯的存在。FMS及F3兩者顯示與凝集素UEA-I有明顯結合強度(圖3E)，顯示存在Fucα1-2Gal雙醣單元。所觀察到的低Globo H結合力係與先前的研究一致，顯示凝集素UEA-1不與H型3/4結構反應(40,41)。總之，結果提出證據，即靈芝多醣含有α-L-岩藻糖化聚醣，但可能不同於Globo H系列結構。

欲探討是否FMS之α-岩藻基殘基與抗腫瘤活性相關，我們以重組型脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)α-L-岩藻糖苷酶選擇性移除FMS之末端岩藻糖。在酵素水解及後續純化之後，取得FMS修飾型，稱作DFMS。DFMS中的岩藻糖含量為FMS中的50%，其係藉由HPAEC/PAD方法測定。接著，發明人以前述預防性免疫方案比較DFMS與FMS的抗腫瘤功效。CDC 活性及腫瘤生長分析兩者顯示，與FMS相反的是，DFMS對於LLC1細胞的體外及體內存活率不具有明顯抑制作用(圖3F及G)。此外，經DFMS處理的小鼠與對照組小鼠間之MCP-1濃度無明顯統計上差異，其相反於FMS組觀察到的血清MCP-1濃度降低(圖3H)。這些結果強烈支持，FMS末端岩藻醣化濃度與抗腫瘤功效之間具有直接關聯。欲驗證是否血清抗體直接涉及抗腫瘤活性，且欲研究不同處理之抗血清的聚醣結合專一性是否具有任何改變，接著使用Globo H相關之印刷聚醣微陣列。如預期，DFMS組的血清IgM抗Globo H能力明顯下降(p<0.01，相較於FMS組)，這與其獨特的抗腫瘤效果結果一致(圖4A，且醣類結構顯示於圖7)。此外，以FMS塗佈的96孔盤進行測定，我們亦證實，FMS誘發之FMS抗血清的可檢測稀釋範圍為介於1：20與1：320比例之間，而在DFMS組中FMS結合之IgM抗體的量實質上減少(p<0.05)(圖4B)。然而，利用相同的稀釋因數，各實驗組皆無檢測到對於血清學試驗產生反應的IgG同型。由於各組(以FMS與DFMS相比較)的總IgM產量類似，這些測試的結果顯示，FMS末端岩藻基殘基對於其免疫原性至關重要。儘管已有推測指出含β-葡萄糖及α-甘露糖的蕈類多醣經由先天的醣類辨識受體交互作用產生抗腫瘤作用(42,43)，我們的結果凸顯靈芝多醣末端岩藻糖於抗腫瘤活性的重要性。

免疫注射FMS刺激B1 B細胞活化

大多數抗聚醣/多醣抗體屬於IgM同型，其可能是由稱作B1 B細胞的B細胞亞群產生(12,13)。由於多數的小鼠B1 B細胞主要位於腹腔及胸膜腔，因此我們探討以FMS處理一個月後小鼠腹腔是否有任何細胞變化。圖4C說明其結果(亦參見圖8)。我們發現，流式細胞儀顯示，相較於對照組(僅16%)，經FMS處理之小鼠的B1 B細胞(IgM^hiIgD^loCD11b^lo)百分比明顯增加(高達46%)，而B2 B細胞(IgD^hi)與單核球巨噬細胞(MΦ)(CD11b^hi)兩族群仍類似於對照組。欲進一步確認是否腹腔B1 B細胞的增加量與FMS專一性抗體反應有直接關聯，我們自經FMS處理之小鼠的腹腔純化B1 B與B2 B細胞，並於FMS或DFMS存在下體外培養3天。如預期，以FMS加入培養基造成B1 B細胞明顯增加，其對於CD138(血漿細胞表面標記物)表現呈陽性，而DFMS處理僅檢測到不明顯量的CD138⁺ B1 B細胞(圖4D)。此外，我們觀察到，以FMS體外培養B1 B細胞後IgM產量大幅增加，但未出現於DFMS處理組(圖4E)。然而，FMS或DFMS對於B2 B細胞活化皆未造成任何明顯影響。雖然涉及活化B1 B細胞的體內整合性免疫反應尚不清楚，我們的數據證實，腹腔B1 B細胞於反應FMS及TI抗原上扮演直接角色，造成FMS專一性抗體分泌細胞(漿母細胞)的量增高，並伴隨IgM抗體增加。

以質譜為主之方法鑑定FMS的岩藻基聚醣部分

基於前述之醣類組合物及鍵聯分析，我們證實，不同於一些常見的聚醣，FMS含有Fuc、Gal、Man及Xyl(表3)。

具體而言，醣類分析證實，存在顯著量的末端岩藻糖殘基，其具有免疫生物學相關性。利用競爭試驗，我們發現，完整FMS(MW約35kDa)及衍生自FMS或藻類藻褐素的小型聚醣片段(MW<3kDa)(分別為FMS-H或藻褐素-H，係以部分酸水解法製備)皆可作為競爭性抑制劑以減少FMS誘發之抗血清與Globo H印刷聚醣微陣列的作用，而自墨角藻(Fucus vesiculosus)純化的完整藻類藻褐素(Sigma F-5631)則否(圖9B)(44)。結果證實，由FMS酸水解釋出的岩藻糖化及/或寡岩藻糖化聚醣，為經鑑定可作為生物藥劑的最具前景小型免疫活性分子。令人費解的是，部分水解物的MALDI-MS製圖無法從主要寡己醣中檢測到此種令人信服的岩藻糖化片段，儘管Fuc於FMS中含量明顯豐富(圖10A)。因此，我們認為，全甲基化寡醣苷基醛醣醇類的nanoLC-MS/MS分析具有Fuc依賴性MSⁿ數據擷取所提供的高靈敏度及選擇性等優勢。在此模式下，最初以盡可能多的可檢測尖峰進行盡可能多的MS²分析，但僅有少數針對性產物離子會進行進一步分析。本質上，MS/MS功能會從數百個尖峰中自動地篩選並僅針對感興趣者，其於本情況中為攜帶末端Fuc的次要成分。由LC-MS剖析發現，這些岩藻糖化寡醣的量為僅有Hex寡醣的100倍以下，其可構成FMS的結構主鏈(圖10B)。在由岩藻糖化前驅物提供的MS²產物離子中，將三個不同末端岩藻糖化雙醣表位(即分別位於m/z 415、371、及385的Fuc-Hex、Fuc-Xyl、及Fuc-Fuc)的B離子進一步分離並進行MS³分析，以確認其特性及定義其鍵聯。圖11說明四個選定的MS²/MS³圖譜配對，其代表FMS攜帶的岩藻糖化表位範圍。藉由人工判讀碎體離子，清楚發現，末端Fuc殘基確實可直接連接至Hex(Man或Gal)、Xyl、或另一Fuc，各情況中最常見者為C4及C2位置，不過不能因此排除其他共同存在的鍵聯。Fuc-Hex部分的還原端可進一步以另一Hex或Xyl伸長，而Fuc-Xyl單元可以另一Hex伸長。有趣的是，亦可發現三-Fuc(tri-Fuc)延伸，並伴隨另外的異構物，其中Fuc殘基位於內部或位於還原端。這些結果可解釋發明人的發現，即FMS誘發之IgM抗體的可能分子基礎為交叉反應於H型3/4聚醣(30,45-47)。

本文所述之免疫原性組合物可包含佐劑。佐劑為修飾組合物聚醣共軛物免疫原性的試劑。佐劑通常不會誘發針對其之專一性免疫反應，但可增強指定免疫原劑(抗原)的專一性免疫反應。佐劑可為特定殺菌性之無機或有機化學物質、巨分子、或全細胞，其增強指定抗原的免疫反應。在特定具體實施例中，佐劑為礦物鹽類/凝膠，如氫氧化鋁及磷酸鋁或磷酸鈣凝膠。在特定具體實施例中，佐劑為水包油與油包水乳劑、兩親分子與界面活性劑為主之配方，如MF59(微流化清潔劑穩定性水包油乳劑)、QS-21(純化皂素，其衍生自植物)、AS03(由水包油乳劑及α-生育酚組成)、Montanide ISA-51及Montanide ISA-720。在特定具體實施例中，佐劑為微脂體、仿病毒顆粒(virosome)(單層微脂體載劑併入流感血球凝集素)、ISCOMS(皂素與脂質的結構複合體)、及聚乳酸共乙交酯(polylactide co-glycolide；PLG)、PLG-二甲基胺基乙烷-胺甲醯基-膽固醇(PLGA/DC-膽固醇)顆粒及Iscomatrix。在特定具體實施例中，佐劑為微生物衍生物(天然及合成)，如磷醯脂A(monophosphoryl lipid A；MPL)、Detox(MPL+牛草分枝桿菌(M.Phlei)細胞壁骨架)、AGP[RC-529](合成的醯化單醣)、DC_Chol(能自組成微脂體的類脂質免疫刺激劑)、OM-174(脂質A衍生物)、CpG模體(合成的寡去氧核苷酸，其含有免疫刺激性CpG模體)、改良的熱不穩定內毒素(enterotoxin；LT)、及霍亂毒素(CT)(基因改良的細菌毒素，其經基因改良以提供無毒佐劑作用)；合成的dsRNA、Poly IC：LC(Hiltonol)及Poly I：Poly C12U(Ampligen®)。在特定具體實施例中，佐劑為內源性人類免疫刺激劑，如hGM-CSF或hIL-12(細胞介素，其可以蛋白質或質體編碼方式投予)、Immudaptin(C3d串聯陣列)。在特定具體實施例中，佐劑為惰性載劑，如金顆粒。在特定具體實施例中，佐劑為惰性多醣，如Advax(δ-菊糖)，其衍生自植物(大理菊)。在特定具體實施例中，本文所述之免疫原性組合物可使用組合式佐劑或佐劑系統，如疫苗輸送系統與免疫刺激劑的組合。組合式佐劑或佐劑系統可造成更有效輸送免疫刺激劑及抗原，如AS01，其由微脂體、MPL及QS-21組成；AS02，其由水包油乳劑、MPL及QS-21組成；AS03，其由水包油乳劑及α-生育酚組成；AS04，其由MPL及氫氧化鋁組成；AS15，其由微脂體、MPL、QS-21及CpG寡去氧核苷酸組成；以及GLA-SE，其由含有合成的醯化單醣的穩定水包油乳劑組成。

在一些具體實施例中，用於本文所述免疫原性組合物之佐劑係選自於C34、7DW8-5、C17、C23、C30、α-半乳糖神經醯胺、鋁鹽、鯊烯、MF59或QS-21(參見美國專利號8,268,969及美國公開號2008-0260774，兩者在此併入本案以作為參考資料)。

有多種方法可用於配製本發明之組合物。配製及投予技術可參見「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」，Twentieth Edition, Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(1995)。在人類或動物投予方面，製劑應符合FDA規範的無菌、發熱性、及一般安全性與純度標準。可以多種方式投予醫藥製劑，係如本文所述。

本文所述之免疫組合物可以非口服投予(如靜脈注射、皮下注射或肌肉注射)。或者，可使用其他投予模式，包括栓劑及口服製劑。在栓劑方面，黏和劑及載體可包括，如聚烷撐乙二醇或三酸甘油酯。口服製劑可包括平常使用的初始劑(incipients)，如醫藥級糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。這些組合物製成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放製劑或粉末等形式，並含有10-95%本文所述之免疫組合物。

以兼容於劑型的方式投予免疫組合物，且其量係治療上有效、保護性、及免疫原性。欲投予量取決於欲治療的個體，包括如合成抗體時個體的免疫系統能力，以及視需求，產生細胞介導免疫反應的能力。投予時，所需之活性成分的精確量取決於臨床醫師的判斷。然而，熟習本領域之技術人員可易於判斷適用劑量範圍。初步投予與追加劑量的適用治療方案亦可變，不過可包括初步投予及後續投予。疫苗劑量亦取決於投予途徑，並依據宿主體型大小而變。

本發明之免疫組合物亦可於動物身上產生抗體，以製造抗體，其可用於癌症治療及診斷。於動物身上(如小鼠、兔、山羊、綿羊或馬)製造單株與多株抗體及其區分的方法為本領域習知。參見如Harlow and Lane,(1988)Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。「抗體」乙詞包括完整的免疫球蛋白分子及其區分，如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv(單鏈抗體)及dAb(結構域抗體；Ward,et.al.(1989)Nature,341,544)。

實施例

下列實施例之說明係旨在提供熟習本領域之技術人員如何製造及使用本發明具體實施例的完整發明及描述，且未旨在侷限於發明人視為其發現的範疇內。已致力於確保所使用數字(如數量、溫度等)的準確性，不過仍應考慮到一些實驗誤差及偏差。除非另有指明，份為份重、分子量為重均分子量、溫度為攝氏溫度、及壓力為位於或接近大氣壓力。

小鼠IgM抗Globo H mAb MBr1係購自Alexis Biochemicals。抗IgD(11-26c.2a)、IgM(R6-60.2)、CD11b(M1/70)及CD138(281-2)的螢光染料共軛結合mAbs係購自BD Biosciences。DyLight 649標定的山羊抗小鼠IgG及IgM係購自Jackson ImmunoResearch Labs。DEAE Sephadex A-50及Sephadex G-50凝膠係購自GE healthcare。生物素化凝集素、橙黃網孢盤菌凝集素(AAL)及刺金雀花凝集素-I(UEA-I)係購自Vector Laboratories。PE標定的抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)係購自Invitrogen。4-硝苯基α-L-岩藻糖苷、藻褐素(墨角藻)、商用溶劑及分析試劑係購自Sigma-Aldrich。

靈芝粗萃取物

靈芝粗萃取物(經由鹼萃取(0.1N NaOH)、中和、及酒精沈澱製備)係購自Pharmanex Co.(CA，USA)。Immobiline DryStrip(pH 3-10 NL(非線型)，18cm)及IPG緩衝液(pH 3-10 NL)係購自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)。CHAPS、Tris緩衝液、瓊脂糖、碘乙醯胺及α-氰基-4-羥桂皮酸係購自Sigma Co.(St.Louis,Mo.，USA)；二硫赤蘚醇(dithioerythritol；DTE)係購自Merck Co.(Darmstast,Germany)；丙烯醯胺、過硫酸銨(ammonium persulfate；APS)及TEMED係購自Bio-Rad(Hercules，Calif.，USA)；十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate；SDS)及甘胺酸係購自Fluka(Buchs，Switzerland)；定序級胰蛋白酶係購自Promega(Madison，Wis.，USA)。

純化靈芝萃取物區分3(F3)

靈芝粗萃取物(經由鹼萃取(0.1N NaOH)、中和、及酒精沈澱製備)係購自Pharmanex Co.(CA，USA)。將28mg的粗萃取物溶於2mL的Tris緩衝液(pH 7.0，0.1N)並離心，以移除不溶性材料(7mg)。以凝膠過濾層析法純化上清液，其係使用Sephacryl S-500管柱(100x1.6cm)並以0.1N Tris緩衝液(pH 7.0)作為溶析液。流速設定為0.5mL/min，並收集溶析物(每管7.5mL)。收集5個區分(區分1-5)，且各自進行透析以移除過多的鹽類，並凍乾以分別取得1.0mg、6.2mg、5.3mg、2.1mg、及1mg以下。區分1至區分5的識別方式如下：區分1：100-130mL；區分2：130-155mL；區分3：155-205mL；區分4：205-220mL；區分5：220-255mL。主要區分於O.D.625的吸光值為約1.8，並命名為區分3。

區分3(F3或靈芝F3)習知為異質性及高分子量多醣(>100kDa)，亦包括含岩藻糖醣蛋白部分，其包含末端岩藻糖殘基。「末端岩藻糖殘基」乙詞是指接近醣鏈游離端區域的醣鏈岩藻糖殘基。區分3的含岩藻糖醣蛋白部分，亦包括與α1,2-岩藻糖苷鍵聯與α3,4-岩藻糖苷鍵聯結合的岩藻糖殘基，其可位於末端接近醣鏈游離端之區域。在進一步示例性實施中，含岩藻糖醣蛋白亦可包含葡萄糖、甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺、木糖及半乳糖。亦可包括胺基酸成分，且可包含不會不良地改變含岩藻糖醣蛋白特徵的修飾物。靈芝區分3(F3)的製備及一些用途係揭示於美國專利號7,560,114、7,323,176、7,135,183、7,947,283及7,785,600，其在此併入本案以作為參考資料。

製備富含岩藻糖之F3多醣區分FMS

起始材料為製自Wyntek Corp.(Taiwan)的商用產品(稱作F3，為源自靈芝之水溶性及含岩藻糖多醣的粗萃取物)。將F3溶於50mM醋酸銨，並以離心方式移除不溶性殘基。以DEAE-Sephadex^TM A-50層析法將上清液分段，以取得一區分，其係以50mM醋酸銨作為溶析液。在脫鹽之後，以逆相高效能液態層析法(reversed phase high performance liquid chromatography；RP-HPLC)進一步純化該區分，其係使用半定量型C8管柱偶接Agilent 1100系列系統。所有的運作皆需以0.05%三氟醋酸(trifluoroacetic acid；TFA)作為溶析液，並收集流過液(flow-through)。以選定的區分進行Sephadex^TM G-50層析(1.5×100cm)，其係以去離子水作為溶析液。將含醣區分(其以酚-硫酸法檢測)凍乾，以取得多醣產物並命名為FMS(總產率<0.1%)。以鱉變形細胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate；LAL)測試法(Associates of Cape Cod Inc.)常規監測多醣製備物，以確保不存在內毒素污染。

血清IgM抗體的聚醣結合分析

在全方位聚醣微陣列分析方面，小鼠以每週二次腹腔注射投予測試樣本(每隻小鼠150mg/kg體重)，並於第一次免疫注射後第14天收取血清樣本。以PBS處理的小鼠血清作為對照組。以功能性醣質體協會H中心(Consortium for Functional Glycomics(CFG)Core H)聚醣微陣列(Emory University School of Medicine,Atlanta，USA)進行IgM抗體的聚醣結合剖析。以1：100的比例稀釋血清樣本，並以六重複之含611種聚醣的5.0版印刷陣列進行篩選。可自CFG網站(www.functionalglycomics.org)取得流程步驟及所有引用的CFG編號的聚醣結構。

確認FMS

在分子量測定方面，將FMS(2mg/ml)加入粒徑排阻層析管柱(Shodex SB-806M HQ)，分析設備為Agilent 1260 Infinity LC系統偶接DAWN Heleos多角度光散射(multi-angle light scattering；MALLS)檢測器(Wyatt Technology Corp.)及Optilab®T-rEX^TM折射率(refractive index；RI) 檢測器(Wyatt Technology Corp.)。以Astra Software(Wyatt Technology Corp.)分析分子量。在121℃下以4M TFA水解1h之後，以高效能陰離子交換層析法結合脈衝安培檢測法(High-Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD)測定FMS的主成分單醣。將CarboPac^TM PA-10分析級管柱偶接至Dionex ICS-3000 HPAEC-PAD系統(Dionex corp.)。於10mM NaOH(0.25ml/min)的等度濃度下進行分離，且管柱溫度為環境溫度。單醣標準品包括L-岩藻糖(Fuc)、D-阿拉伯糖(Ara)、D-木糖(Xyl)、D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、D-甘露糖(Man)、D-半乳糖胺(GalNH₂)及D-葡萄糖胺(GlcNH₂)。或者，亦可將酸水解釋出的單醣殘基轉換成其醛醣醇乙酸酯，並以組合式氣相層析/質譜分析法(gas chromatography/mass spectrometry；GC/MS)分析。欲進一步測定醣苷鍵聯位置，進行甲基化分析，其中以建立的方法經由GC/MS分析FMS的部分甲基化醛醣醇乙酸酯(partially methylated alditol acetates；PMAAs)(49)。

水解反應

在FMS α-鍵聯岩藻糖殘基的酵素水解方面，係於大腸桿菌表現His標記的重組型α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51，源自脆弱類桿菌)。以4-硝苯基α-L-岩藻糖苷作為發色受質，以評估酵素活性。以HPAEC-PAD監測FMS之酵素反應所釋出的岩藻糖。所使用的酵素受質比為1：25(wt/wt)並溶於磷酸緩衝液(pH 7)，且反應混合物於37℃下培養數天。重複數次岩藻糖苷酶消化反應，以確保完全切割岩藻糖。最後，藉由Ni-NTA®珠粒(Qiagene)移除酵素以終止反應，接著於100℃下煮沸10min。以Sephadex^TM G-50層析法進一步於蒸餾水中純化消化產物以取得高分子量區分並命名為 DFMS。欲移除內毒素污染，依據製造商指示，將DFMS通過Cellufine® ET淨化珠粒(Chisso，Corp.)，接著以凍乾方式回收。在寡醣製備方面，將多醣樣本溶於0.1M TFA並於100℃下加熱60min。在冷卻之後，混合物經由Centricon離心式過濾裝置(Millipore)過濾。最後，收集過濾物(MW<3KDa)、凍乾，並於試驗前重組。

以岩藻糖為主的nano-LC串聯MS分析

於自製的nanoLC系統進行全甲基化寡醣苷基醛醣醇類的NanoLC-MS/MS分析，該系統包含50μm x 4cm的自製聚苯乙烯-二乙烯基苯(homemade polystyrene-divinylbenzene；PS-DVB)單體捕捉管柱及20μm x 4m的自製PS-DVB接枝型開管分析管柱，其偶接至Orbitrap Elite(Thermo scientific)MS系統。針對此nanoLC系統，將樣本溶於2μL的25%(v/v)乙腈、注入捕捉管柱，且隨後以依序相連的分析管柱分離，其恆定流速為150nl/min，伴隨25min的線性梯度5-40%(v/v)乙腈(並添加0.5mM醋酸鈉)，接著於5min內增至80%乙腈並另外等度維持10min。將溶析物接口至奈噴灑源，其係基於液界組態，由未塗佈射極及高壓(約1.7kV)鉑電極組成。針對數據依賴性擷取週期，於Orbitrap以120,000解析度(於m/z 400)擷取全掃描質譜(m/z 350-2000)，其中自動增益控制(automatic gain control；AGC)目標值為1 x 10⁶。針對10個最強離子，進行數據依賴性CID-MS²實驗，其中強度閾值為3000計數。在MS²質譜的25個最強離子之中，以位於m/z 415.19、371.16、及385.18且強度閾值為100計數的3個不同的B碎體離子候選物進行後續產物離子依賴性CID-MS³實驗。將CID實驗使用的AGC目標值及標準化碰撞能量分別設定為30,000、38%。

小鼠免疫注射時程及肺腫瘤模式

雄性C57BL/6小鼠(5~6週大)係取自國家實驗動物中心(台灣)。所有的動物實驗皆依據實驗動物管理及使用指南的概述程序及中央研究院實驗動物照護及使用委員會的動物研究提案許可之下進行。在探究F3抗腫瘤活性方面，將懸浮於0.1ml PBS的1~2 x10⁵個同源LLC1細胞皮下注射(s.c.)於小鼠右側腹部。接著，每隔2天以指定劑量的F3腹腔注射(i.p.)(每隻小鼠24、52、120、及240mg/kg體重，係溶於PBS)至各組小鼠。以電子式測徑器沿著長軸(a)、短軸(b)、及高(c)測量腫瘤體積。以a x b x c的方式計算腫瘤體積(mm³)。當對照組小鼠的腫瘤達到平均尺寸200mm³時，每隔2~3天記錄腫瘤體積，並於接種腫瘤後約21~28天將小鼠犧牲。欲研究FMS(每隻小鼠150mg/kg體重，係溶於PBS)的抗腫瘤效果，設計二種免疫注射方案以評估其預防性及治療性潛力，如圖9A所示。所有實驗每組含有至少4~5隻小鼠，且實驗至少重複一次。以年齡相符的小鼠接受相同注射量的PBS以作為對照組。以二因子變異數分析配合PRISM軟體評估腫瘤體積差異的統計顯著性。p值0.05或以下視為具有顯著性。

血清抗體的血清學分析

發明人亦以自製的聚醣微陣列測定抗合成聚醣的血清IgM，係依據其公開之方法(50)。在以酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)測定血清IgM總量方面，收取測試樣本、依序稀釋於含1% BSA的PBS、並置於塗佈抗小鼠IgM的96孔培養盤(Bethyl Laboratories,Inc.)。下列用於檢測捕捉到的小鼠IgM之程序及方法係基本上依據製造商之指示進行(Bethyl Laboratories)。欲測試血清抗體對於FMS的反應性，依據前述流程，製備以FMS為主的ELISA試驗，其使用96孔MaxiSorp^TM培養盤(Nunc)(51)，並以TMB作為受質，接著以盤讀儀(Molecular Devices)於450nm下讀取培養盤。所有數據皆以平均值±標準差(SD)表示。以未配對單尾Student`s t檢定評估平均值之間任何差異的顯著性。p值<0.05視為具有統計顯著性。

分析岩藻糖專一性凝集素

使用胺基反應性玻片容許藉由形成醯胺鍵而共價結合含有末端胺的聚醣，並容許能依據微陣列製造機制推測FMS(1mg)及F3(1mg)印刷於N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide；NHS)活化玻片上。在凝集素反應性聚醣檢測方面，各生物素化凝集素以含1%BSA的TBS緩衝液稀釋(1~10μg/ml)並加至玻片上各子陣列。在以TBS緩衝液清洗後，玻片以PE共軛連接的抗生物素蛋白鏈菌素(1：500)探測，並以Genepix 4000B微陣列掃描器(Molecular Devices)掃描。以Genepix軟體(Molecular Devices)抽取影像並分析。各測試樣本的凝集素結合強度以五重複的平均相對螢光強度(RFUs)表示。

細胞培養及FACS分析

在檢測細胞表面Globo H抗原表現方面，小鼠路易氏肺癌(LLC1)細胞及組織培養物1(Tissue culture 1；TC-1)細胞係購自BCRC(生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)，台灣)。以一級mAb MBr1進行約2 x 10⁵個細胞的染色、再以PBS清洗、且隨後以DyLight 649共軛之山羊抗小鼠IgM二級抗體培養。在鑑定小鼠腹腔細胞變化方面，以冰冷PBS灌洗法收取腹腔滲出液細胞，接著細胞同時以FITC共軛連接之抗IgD、PerCP共軛連接之抗IgM、及APC共軛連接之抗CD11b mAbs進行染色。利用FACSAria Cell Sorter(BD Biosciences)，藉由閘控IgM^hiIgD^intCD11b^hi細胞以取得B-1 B細胞，且藉由閘控IgD^hiIgM^intCD11b^lo以分類B-2 B細胞。將新鮮分離的B細胞(2 x 10⁶個細胞/ml)培養於含有10%熱失活性FBS(Hyclone)、青黴素/鏈黴素(100units/ml)及2-巰乙醇(50μM)的RPMI 1640培養基(Invitrogen)，並於指定時間分別處理FMS或DFMS(100μg/ml)。所有的流式細胞分析皆以FACSCanto(BD Biosciences)進行，並以Flow Jo軟體進行結果分析。

小鼠細胞介素/趨化介素檢測

在最後一次FMS免疫注射後第7天，自腫瘤經受小鼠採血，並依據製造商提供的方法，以Beadlyte mouse 21-plex細胞介素/趨化介素檢測套組(Upstate/Millipore)測定經稀釋的小鼠血清樣本，再以Luminex 100系統(Luminex)判讀。

CDC試驗

選取Globo H陽性與陰性腫瘤細胞株、LLC1及TC-1進行補體依賴性細胞毒性(CDC)試驗。在定量CDC活性方面，發明人使用CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit(Promega)，依據製造商之指示，其為一種測定培養基中LDH釋放的非放射性方法。直接以血清樣本作為多株抗體及補體來源。藉由將血清培養於56℃中30min，製備經FMS處理小鼠的熱失活血清(HI抗血清)，以測定補體缺乏效應。簡單而言，將細胞(5x10⁴)懸浮於無血清培養基，並以稀釋的測試血清處理，使得最終小鼠血清濃度達到1、5、10、及20%。在37℃下培養90min之後，以乳糖脫氫酶(LDH) 受質混合上清液(1：1，vol/vol)，接著收集吸光值數據。依據LDH之釋放量，計算細胞溶解百分比(細胞毒性百分比)，其係使用下列公式：100×[(A-C)/(B-C)]，其中A代表稀釋測試血清的吸光值(實驗中LDH釋放量)、B代表以溶解液溶解所有標的細胞的吸光值(最大LDH釋放量)、及C代表培養於無血清培養基之標的細胞的吸光值並作為基線值(自發性LDH釋放量)。

結合競爭試驗

欲測定醣類競爭劑對於抗血清與Globo H間之交互作用的影響，測定血清學反應(以1：100稀釋比例進行血清測試)，其係於醣類競爭劑(0.05mg/ml)存在下使用Globo H印刷玻片。除了完整多醣(FMS-I及藻褐素-I)以外，以前述酸水解法製備其分解的寡醣混合物(FMS-H及藻褐素-H)，並重複測定各組的相對結合親和力且將各組標準化為結合百分比。

本說明書引用的所有公開文獻、專利、及專利申請案在此併入本案以作為參考資料，如同個別的公開文獻或專利申請案，其係特定地且單獨地經指定以併入本案作為參考資料。本文之公開文獻、專利、或公開專利申請案之引用並非承認該公開文獻、專利、或公開專利申請案為先前技藝。

雖然前述之發明內容已由圖式及實例方式詳盡說明，其係旨在提供清楚之理解，熟習本領域之技術人員應能顯見的是，鑑於本發明之內容，可進行其之特定變化及改良而不背離後附本發明申請專利範圍之精神或範疇。

Claims

一種免疫原性組合物，其包含：富含岩藻糖之靈芝區分多醣區分(fucose-enriched Reishi polysaccharide fraction；FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS係自靈芝F3分離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自於1,4-甘露聚糖及1,6-α-半乳聚糖的主鏈，其中該主鏈連接至末端含岩藻糖的側鏈；以及可視需要的佐劑。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該主鏈係經由一或多個選自於Fucα1-2Gal、Fucα1-3/4Man、Fucα1-4Xyl及Fucα1-2Fuc的鍵聯而連接至末端含岩藻糖的側鏈。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中FMS主要包含岩藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖，其比例為2：1.5：2.5：3.5。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中FMS包含小量的葡萄糖、葡萄糖胺及半乳糖胺。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該佐劑為醣脂質。
如申請專利範圍第5項之免疫原性組合物，其中該佐劑為α-GalCer的合成類似物，其係選自於：7DW8-5及C34：
如申請專利範圍第5項之免疫原性組合物，其中投予該組合物至哺乳類動物可誘發IgG抗體。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中投予該組合物至哺乳類動物可誘發IgM抗體。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體專一性地結合至腫瘤相關抗原之至少一者，該抗原係選自於由Globo H、Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3：Gb-5：Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)及SSEA-4(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)組成之群組。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體專一性地結合至聚醣抗原，該抗原包含常見結構：Fucα1-2Galβ1-3GalNAc-R位於非還原末端。
如申請專利範圍第10項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體專一性地結合至抗原，該抗原更包含額外的雙醣延伸，其位於Fucα1-2Galβ1-3GalNAc-R的還原端，其中該雙醣部分係選自於：Fucα1-2Gal-R、Fucα1-3/4Man-R、Fucα1-4Xyl-R及Fucα1-2Fuc-R。
如申請專利範圍第11項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體專一性地結合至α-L-岩藻糖專一性凝集素、刺金雀花凝集素-I(Ulex europaeus agglutinin-I；UEA-I)。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體專一性地結合至聚醣抗原，該抗原包含s血型ABH決定位。
如申請專利範圍第1項之免疫原性組合物，其中該免疫反應產生的抗體可於癌症細胞觸發補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity；CDC)。
如申請專利範圍第14項之免疫原性組合物，其中CDC活性足以減少肺癌細胞的腫瘤大小。
如申請專利範圍第14項之免疫原性組合物，其中投予該組合物造成單核球趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1；MCP-1)的血清濃度下降。
一種癌症疫苗，其包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之免疫原性組合物；以及醫藥上可接受賦形劑，其中相較於誘發癌症後的治療，以該組合物預處理會大幅減少非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer；NSCLC)的腫瘤體積。
如申請專利範圍第17項之癌症疫苗，其中於以該組合物預處理的哺乳類動物中，單核球趨化蛋白-1(MCP-1)、趨化介素(C-X-C模體)配體1(CXCL1/KC)及顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor；G-CSF)的濃度減少。
一種對抗癌細胞的治療藥劑，該治療藥劑包含：富含岩藻糖之靈芝多醣區分(FMS)，其平均分子量為35kDa，其中FMS係自靈芝F3分離，且其中FMS包含多醣，其主要具有選自於1,4-甘露聚糖及1,6-α-半乳聚糖的主鏈，其中該主鏈連接至末端含岩藻糖的側鏈；以及可視需要的佐劑。
如申請專利範圍第19項之治療藥劑，其中投予該治療藥劑至個體誘發抗體產生，該抗體識別表現於癌症細胞的Globo H或Globo H相關的抗原。
如申請專利範圍第20項之治療藥劑，其中Globo H或Globo H相關的抗原係選自於由Globo H、Gb3、Gb4、階段專一性胚胎抗原-3(SSEA-3；Gb-5；Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)及SSEA-4(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ)組成之群組。
如申請專利範圍第19項之治療藥劑，其中該癌症細胞為非小細胞肺癌(NSCLC)細胞。
如申請專利範圍第19項之治療藥劑，其中該主鏈係經由一或多個選自於Fucα1-2Gal、Fucα1-3/4Man、Fucα1-4Xyl及Fucα1-2Fuc的鍵聯而連接至末端含岩藻糖的側鏈。
如申請專利範圍第19項之治療藥劑，其中FMS主要包含岩藻糖、木糖、半乳糖及甘露糖，其比例為2：1.5：2.5：3.5。
如申請專利範圍第19項之治療藥劑，其中FMS包含小量的葡萄糖、葡萄糖胺及半乳糖胺。
一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之免疫原性組合物製造治療腫瘤之藥劑的用途，其中該藥劑包括致使抑制腫瘤生長的免疫反應。