TWI606835B - 基於靈芝多醣之組合物及治療癌症之方法 - Google Patents

Description

基於靈芝多醣之組合物及治療癌症之方法

本發明係有關於用於治療癌症之方法及組成物。具體而言，本發明係有關於藉由調節EMT來治療腫瘤病程及移轉之方法。更具體而言，本發明係有關於用於調節EMT及抑制癌症病程，包括肺癌及乳癌，之靈芝(Ganoderma lucidum,Reishi或Ling-Zhi)萃取物。

上皮細胞癌，舉例而言，攝護腺癌、乳癌、大腸癌、肺癌、胰臟癌、卵巢癌、脾臟癌、睪丸癌、胸腺癌等等，係特徵為上皮細胞異常、加速生長之疾病。起初此加速生長造成腫瘤形成。最後，亦會發生移轉至不同器官位置。雖然已進行各種癌症的診斷和治療，這些疾病仍然造成顯著的死亡率。

肺癌是癌症死亡率的首要原因。在美國，2006年106,374男性及90,080女性被診斷出肺癌，且89,243男性及69,356女性死於肺癌。(U.S.癌症統計工作組。美國癌症統計：1999至2006年發病率和死亡率基於網路的報告。亞特蘭大(GA)：衛生署和人類服務部，疾病控制和預防中心，以及國家癌症研究所2010年。)

肺癌被粗分為小細胞肺癌(SCLC，包含20%之肺癌)，及非小細胞肺癌(NSCLC，包含80%之肺癌)。非小細胞肺癌的腺癌亞型代表最常見的肺癌病理類型。中晚期NSCLC患者具轉移性疾病且診斷後平均存活4-5個月，存活1年者不到10%。(Sharma SV，Bell DW，Settleman J，& Haber DA(2007)肺癌之表皮生長因子受體突變。Nat Rev Cancer 7(3)：169-181。)

在全世界，乳癌佔女性癌症發病之10.4%，為第二最常見之非皮膚癌症之類型(第一為肺癌)及第五大癌症死亡的常見原因。有許多不同類型的乳癌，不同階段(擴散)、侵略性、和遺傳結構；生存率與這些因素有很大關係。2009年，在美國有192,370(女性)和1,910(男性)新發病例，和40,170(女性)和440(男性)人死於乳癌。其中一個潛在的治療癌症治療策略，是抑制移轉。

靈芝(Ganoderma lucidum,Reishi或Ling-Zhi)，一種腐生真菌，早已被傳統中醫建議用做膳食補充劑(Wang Y-Y，et al.(2002)靈芝多醣之免疫調節和抗腫瘤活性之研究：含海藻醣之醣蛋白部分之活性的功能與蛋白質分析。Bioorganic & Medicinal Chemistry 10(4)：1057-1062)。靈芝LZ-8之蛋白質靈芝-8對全身過敏性反應有正面效果，且已被用做治療肝癌及預防糖尿病。(Kino K. et al.，J. Biol. Chem. 1989；264(1)：472-8)。

先前研究已證實，靈芝之葡聚醣萃取物衍生之多醣(EORP)，因為醣蛋白部分含有具β-1,3-聯結之多醣骨架主鏈或具α-1,4-聯結之聚甘露醣主鏈，發揮了多種免疫功能和抗腫瘤活性(Chen H-S，et al.(2004)靈芝多醣之免疫調節和抗腫瘤活性之研究。Bioorganic & Medicinal Chemistry 12(21)：5595-5601；Hsu H-Y，et al. 2004)靈芝多醣萃取物誘發細胞激素表現，經由TLR4-調節之蛋白質激酶訊息傳遞途徑。J Immunol 173(10)：5989-5999)。舉例而言，來自靈芝之多醣抑制腫瘤生長和誘導各種炎性細胞激素之表現。因此，多醣化合物可能是一種抗腫瘤劑的基礎上，能夠增強宿主的防禦系統(Cao Q-Z & Lin Z-B(2006)靈芝多醣肽能抑制人類肺癌細胞內血管內皮細胞之生長和VEGF之誘發。Life Sciences 78(13)：1457-1463)。雖然已發現靈芝可抑制轉錄因子NF-κB及AP-1，並減少VEGF及TGF-β1之分泌(Stanley G，Harvey K，Slivova V，Jiang J，& Sliva D(2005)靈芝透過抑制VEGF及TGF-β1從前列腺癌細胞分泌來抑制血管生成。Biochemical and Biophysical Research Communications 330(1)：46-52)。然而，EORP之抗轉移功能的分子機制很不明朗。

TGF-β在癌症生物學扮演雙重角色，亦即，腫瘤抑制及促癌作用。TGF-β抑制上皮、內皮細胞和造血細胞譜系增生，作為腫瘤抑制因子。在腫瘤發展過程中，腫瘤可抵抗TGF-β中介的生長抑制並過度表達TGF-β。在這個階段，TGF-β促進腫瘤生長及移轉(Dumont N & Arteaga CL(2003)瞄準TGF-β在人類腫瘤形成之信息傳導網路。Cancer Cell 3(6)：531-536；Siegel PM & Massague J(2003)TGF-β在體內平衡和癌症之抑制細胞生長和凋亡的行為。Nat Rev Cancer 3(11)：807-820；Wakefield LM & Roberts AB(2002)TGF-β信息傳遞：對腫瘤形成積極和消極影響。Current Opinion in Genetics & Development 12(1)：22-29)。當癌前病變進展，TGF-β之角色從腫瘤抑制因子變成腫瘤促進因子。由TGF-β誘導的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，早期上皮腫瘤轉化為侵入性、轉移性腫瘤(Thiery JP(2002)腫瘤進程之上皮-間質轉化。Nat Rev Cancer 2(6)：442-454)。細胞可進血管內入淋巴或血管，允許其被動傳輸至遠處器官(Id.)。

上皮-間質轉化(EMT)是一個重要的癌細胞表型改變，其觸發入侵和移轉。Snail，一個鋅指結構轉錄因子，被認為有參與上皮-間質轉化。它已被證明可減弱細胞週期，並在外滲、傳播和血管內週期(extravasation，dissemination and intravasation cycle)期間提供腫瘤細胞生存優勢(Vega S，et al.(2004)Snail阻斷細胞週期並抗細胞死亡。Genes & Development 18(10)：1131-1143)。

上皮-間質轉化的相關細胞轉化及細胞交互作用發生於非小細胞肺癌(NSCLC)、大腸癌(CRC)，及胰臟癌。在上皮-間質轉化期間，上皮細胞下調其細胞間附著，喪失頂端-基底極性，並進行細胞形態的變化，從立方型單層至分散、梭形纖維母細胞樣細胞。分化標記之表現轉換了如E-鈣黏素之細胞-細胞接合蛋白成包括N-鈣黏素及纖維連接蛋白之間質標記。再者，靜止細胞轉換為能夠通過細胞外基質入侵之遷徙細胞的。上皮-間質轉化在致癌和移轉方面很重要(Janda E，et al.(2002)Ras和TGF-β協同調節上皮細胞可塑性及移轉：Ras訊息傳遞途徑之剖析。J Cell Biol 156(2)：299-313)。

需要以能調節上皮-間質轉化(EMT)之藥劑來增進治療如肺癌之固態腫瘤之方法。

本揭露內容係有關於靈芝F3部分對肺腺癌病程及移轉之效果。靈芝F3部分逆轉了活體外A549人類NSCLC細胞系由TGF-β1誘發之EMT。此外，該靈芝F3部分抑制活體內帶有LLC之小鼠模型肺臟與肝臟之實驗性移轉之表現。本揭露內容揭露了，靈芝F3部分可抑制如NSCLC之固態腫瘤有關之EMT及移轉。

本發明係有關於一種醫藥組成物，其包含：靈芝萃取物之一或多個子部分，其中該一或多個子部分之量(靈芝F3部分)係足以(a)調節上皮-間質轉化(EMT)，或(b)降低非小細胞肺癌(NSCLC)細胞之移轉及入侵，或兩者皆是；及可選的，一醫藥上可接受之賦形劑。

在某些方面，該一或多個子部分可由以下獲得：均質化靈芝組織；以鹹性水溶液萃取均質植物化組織以形成粗萃取物；中和該鹼萃取物至約pH 7.2±0.2並過濾以獲得透明靈芝粗萃取物；以及將該透明靈芝粗萃取物經切向流過濾法，以移除低分子量成分並獲得純化的靈芝F3部分。

某些具體實施例中，該靈芝F3部分顯示如圖6之HPLC輪廓。某些具體實施例中，靈芝F3部分包含多醣或醣肽，其包含終端海藻醣殘基。

本發明亦揭露用於預防、治療或降低細胞中與癌症有關事項之方法，其包含：將一包含靈芝F3部分之組成物與該細胞接觸，其中該靈芝F3部分具有如圖6之HPLC輪廓，又其中該組成物包含足量靈芝F3部分以能(a)調節上皮-間質轉化(EMT)，或(b)降低肺癌細胞之移轉及入侵，或兩者皆是。某些具體實施例中，該細胞係哺乳動物細胞。某些具體實施例中，該哺乳動物細胞係在人體中。

在某些方面，該癌細胞包含神經母細胞瘤、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、Epstein-Barr相關淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、視網膜胚細胞瘤、小細胞肺癌、腦瘤、血癌、表皮樣癌、攝護腺癌、腎細胞癌、移形細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胃癌，及其他腸胃道癌症。

在某些方面，該癌細胞包含一固態腫瘤，其選自非小細胞肺癌(NSCLC)、胰臟癌、大腸癌、乳癌及肝癌。

在某些方面，上皮-間質轉化(EMT)之調節包含降低一或多個選自下列之症狀：喪失上皮-細胞標記；由上皮腫瘤細胞造成之喪失細胞極性及細胞-接合蛋白；獲得蛋白質間質-細胞標記。

在某些方面，上皮-間質轉化(EMT)之調節包含消耗EMT，其具一或多個選自下列之效果：轉化纖維母細胞至上皮形態；上調主要上皮細胞標記表現；及下調間質細胞標記表現。

在某些方面，該EMT係由EMT-相關訊息傳遞途徑所誘發，該訊息傳遞途徑係經由受體所驅動，如血小板衍生生長因子受體(PDGFR)；纖維母細胞生長因子受體(FGFR)；cMET；TGFβR；IGF-1R；及選自PI3K、AKT及mTOR之激酶。

某些具體實施例中，該EMT係由TGF-β1所誘發。某些具體實施例中，EMT降低包含TGF-β1-中介之訊息傳遞之抑制，其包含一或多個選自下列之效果：(i)降低TGF-β1產生，(ii)下調TGF-β受體II表現，(iii)減少Smad2/3磷酸化，及(iv)減少Snail蛋白質表現。

某些具體實施例中，該上皮-細胞標記係選自E-鈣黏素及γ-連環蛋白。某些具體實施例中，該蛋白質間質-細胞標記係選自中間絲蛋白、纖維連接蛋白、及N-鈣黏素。

在某些方面，肺癌細胞之移轉及入侵之降低包含抗轉移性效果。某些具體實施例中，該肺癌細胞係非小細胞肺癌(NSCLC)細胞。某些具體實施例中，該抗轉移性效果包含降低間質上皮轉化(MET)並藉此降低上皮腫瘤細胞在離原發腫瘤遙遠處之增生及生長。

某些具體實施例中，該靈芝F3部分係與治療上有效量之化學治療劑合併施用，該劑選自順鉑、阿黴素、紫杉醇、道諾黴素、絲裂黴素、放線菌素D、博來黴素、VP16、腫瘤壞死因子、長春新鹼、長春鹼、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、氮芥苯丙胺酸、環磷醯胺、氮芥苯丁酸、馬利蘭、環己亞硝、盤尼西林、紅黴素、安莫西林、頭孢坐林、亞胺培南、氮烯內醯胺、舒巴坦、利奈唑胺、慶大黴素、磺胺甲異噁唑、萬古黴素、塞普沙辛、梭鏈孢酸、曲美普林、硝基甲嘧唑乙醇、氯林絲菌素、莫螢菌素、兩性黴素B、立汎黴素、氟康唑，或其等之組合物。

某些具體實施例中，該靈芝F3部分係與治療上有效量之順-雙氨雙氯鉑(II)(CDDP或順鉑)合併施用。某些具體實施例中，該順鉑係以腹腔內施用。某些具體實施例中，施用靈芝F3部分及順鉑藉由一或多個(a)降低肺腫瘤多發性，及(b)降低腫瘤尺寸，來降低遠處轉移，其中該腫瘤多發性或尺寸被降低了較單獨施用順鉑達成更多的量。

在某些方面，該靈芝F3部分係與抗癌療法合併施用，該抗癌療法係選自於藥物、荷爾蒙、基因治療組成物、放射性核種、營養品、外科程序、輻射程序或其等之組合。某些具體實施例中，該靈芝F3部分之施用係在抗癌療法之前或之後。

某些具體實施例中，該靈芝F3部分係同時或依序以口服、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔內、滴鼻或經皮方法施用。

由較佳具體實施例之說明及以下的圖式，將清楚呈現本發明之上述及其他態樣，雖然在不脫離本揭露內容新穎概念之精神與範圍下仍可做成變化例及修飾例。

本發明說明中之用詞通常具有在本技術領域中、在本發明內容中、及各用語所在之特定內容中的原始意義。某些用來描述本發明之詞彙將在以下或在發明說明書中討論，以對專門人員提供有關於本發明之描述的附加指南。為了方便，某些詞彙可能會以醒目標示，例如使用斜體及/或引號。醒目標示之使用並不影響一詞彙之範圍及意義；一詞彙之範圍及意義在同內容中係相同的，無論是否以醒目標示。可被理解的是，同樣的事情可用一種以上的方式說明。因此，可使用其他語言及同義字用於任何一或多個此處討論的詞彙，且一詞彙是否在此處被詳盡闡述或討論並不賦予任何特殊的意義。提供某些詞彙的同義字。一或多個同義字之敘述並不排除其他同義字之使用。在本發明說明書任一處，實例的使用包括此處所討論的任何詞彙的例子，係僅用於解說，並不限制本發明或舉例用辭彙之範圍及意義。同樣地，本發明並不受本發明說明書中所給的各種具體實施例。

除非另有定義，此處所有使用之技術及科學名詞具有與本發明所屬技術領域中熟習此藝者所一般性了解者相同的含意。如有矛盾的情形，以本文件(包括定義)為準。

此處所使用的「腫瘤」乙詞，以本說明書及申請範圍目的而言，是指源於導管上皮細胞之固態非淋巴原發腫瘤，包括但不限於，源自胸、前列腺、結腸、肺、胰腺、肝、胃、膀胱、或生殖道(子宮頸、卵巢、子宮內膜等等)、大腦和骨髓之腫瘤；黑色素瘤；或淋巴瘤。

此處所使用的「抑制腫瘤生長」乙詞，以本說明書及申請範圍目的而言，是指一或多個：減慢腫瘤生長，阻止腫瘤生長，導致腫瘤減少或消退，抑制腫瘤入侵，造成腫瘤細胞死亡，或造成轉移的降低或回歸。

此處所使用的「防止腫瘤發展」乙詞，以本說明書及申請範圍目的而言，是指抑制腫瘤生長；更特定而言，造成腫瘤細胞死亡，防止腫瘤形成腫塊。

「抗癌藥劑」可對個體內癌症做負面影響，舉例而言，殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、減少癌細胞生長速度、降低移轉的發病率或數量、減少腫瘤的大小、抑制腫瘤生長，減少血液供應到腫瘤或癌細胞、促進對癌細胞或腫瘤之免疫反應、防止或抑制癌症病程，或增加癌症個體壽命。更一般地說，這些組成物和方法將提供一個有效的結合量殺死或抑制細胞增生。這個過程可能涉及同時將細胞與抗癌藥劑及多因子接觸。這可藉由將細胞與單一組成物或含兩種藥劑之藥物製劑接觸，或藉由將細胞與兩個不同的組成物或製劑同時接觸而實現，其中一組成物包括，例如，一個表現構築，而另一組成物包括第二劑，如放射性核種或抗癌藥。

F3靈芝多醣萃取物展現抗腫瘤活性。本揭露內容揭露了靈芝F3組成物在非小細胞肺癌(NSCLC)中調節上皮-間質轉化(EMT)並減少移轉及入侵之功能。

本揭露內容之靈芝F3部分組成物逆轉了人類NSCLC細胞系A549之EMT。以TGF-β1預培養A549細胞，接著以靈芝F3組成物處理，造成TGF-β1誘發之EMT之消耗，包括(i)轉化纖維母細胞至上皮形態，(ii)上調主要上皮細胞標記表現：E-鈣黏素及γ-連環蛋白，(iii)下調間質細胞標記表現：中間絲蛋白及N-鈣黏素。

不受理論的約束，所建議可改變EMT之機制可基於靈芝F3部分抑制了TGF-β1中介之訊息傳遞之觀察，其經由(i)降低TGF-β1產生，(ii)下調TGF-β受體II表現，(iii)減少Smad2/3磷酸化，或(iv)減少Snail蛋白質表現。

又，鼠類Lewis肺癌(LLC)活體外模型，靈芝F3部分降低細胞移轉、細胞入侵及菌落形成。靈芝F3部分在NSCLC方面的進一步治療用途，係基於口服及注射靈芝F3部分對LLC-異種移植小鼠中移轉之效果。特定而言，LLC-1細胞經由尾靜脈注射被植入小鼠。七天後，以腹腔注射CDDP(0.5mg/g)同時每兩天以腹腔注射EORP(0.075mg/g)或每天以口服EORP(0.075mg/g)處理小鼠4週。以靈芝F3部分對LLC-異種移植小鼠尾靜脈腹腔注射已在統計上及明顯地降地了肺癌移轉，相較於控制組小鼠。又，靈芝F3部分及順鉑之結合處理顯著地降低了在肺部的轉移性小結之標記及尺寸。在順鉑外添加靈芝F3部分增強了移轉至肺及肝之抑制。我們目前的結果證實，在動物模型中，靈芝F3部分在定義與EMT相關表型及其逆轉過程以及肺癌移轉活性之抑制扮演關鍵角色。

●　上皮間質轉化(EMT)及癌症

已觀察到患者腫瘤樣本中，上皮-細胞標記之喪失及間質-細胞標記之獲得，特別是在固態腫瘤之前緣或入侵前端，如非小細胞肺癌(NSCLC)、胰臟癌、直腸癌，及肝癌。此等上皮樣及間質樣細胞標記表型之改變與腫瘤病程之程度有關。上皮-細胞標記(例如E-鈣黏素、γ-連環蛋白，及其他)之喪失與腫瘤之疾病病程轉移潛力有關。顯然癌細胞可透過與EMT有關之特定生物路徑之活化而去分化，藉此獲得移轉及入侵之能力。因此，已在實驗上觀察到有關EMT及正常器官發展者，亦被認為可應用在固態腫瘤之病程─轉錄重編程過程，藉此上皮腫瘤細胞喪失細胞極性及細胞接合蛋白，且同時獲得蛋白質間質-細胞標記(例如中間絲蛋白、纖維連接蛋白，及其他)及與間質細胞有關之訊息傳遞活性，在細胞不著地(anchorage-independent)環境促進移轉及存活，並最終移轉至遠處。

間質樣腫瘤細胞以增生潛力為代價獲得移轉能力。如同在正常EMT中，腫瘤細胞中病理EMT起因於細胞轉錄重編程導致其轉化成間質樣細胞表現型，由EMT有關訊息傳遞途徑促進，其部分透過異常存活信號經經由受體及調節激酶所驅動，受體如血小板衍生生長因子受體(PDGFR)；纖維母細胞生長因子受體(FGFR)；cMET；TGFβR；IGF-1R；調節激酶如PI3K，AKT及mTOR。細胞改變，其造成由癌症病理EMT驅動之更間質樣狀態，被認為在與不良預後有關之疾病病程扮演重要角色。

相反的，間質上皮轉化(MET)，藉此間質腫瘤細胞改變成更上皮樣表現型，被認為是被需要來再生一增生狀態並形成類似原發腫瘤之巨轉移至遠處。據推測，MET幫助遠離原發腫瘤處之上皮腫瘤細胞之增生及生長。

●　靈芝F3部分逆轉人類A549 NSCLC中由TGF-β1誘發之EMT

據報導，A549細胞發生了因應TGF-β1從立方形變化到呈長梭形，並顯示減少上皮標記表現及增強間質標記表現(Kasai H，Allen J，Mason R，Kamimura T，& Zhang Z(2005)TGF-beta1誘發人類肺泡上皮成間質細胞轉化(EMT)。Respiratory Research 6(1)：56)。細胞經TGF-β1處理72小時顯示細胞間接觸減少且由圓形變成梭樣間質表現型(圖1A，比較圖a及圖b-d)。生長於正常培養基之平坦、上皮狀A549細胞並無因靈芝F3部分處理而改變(圖1A，圖a，及e)。因此，我們估計，TGF-β1所需要來起始A549中之EMT的最佳濃度與時間為以高達5ng/ml之TGF-β1培養24小時。間質標記，包括中間絲蛋白及N-鈣黏素，被TGF-β1處理上調，而上皮標記，包括E-鈣黏素及γ-連環蛋白，則被下調(圖1B，比較欄3及欄1)。研究經TGF-β1及靈芝F3部分共處理細胞72小時之表現型。以靈芝F3部分處理A549廢止了由TGF-β1誘發之EMT，如細胞形態改變所示(圖1A，比較圖b-d及圖f-h)，及EMT標記，包括E-鈣黏素、γ-連環蛋白、N-鈣黏素及中間絲蛋白(圖1B，比較欄3與欄4)。生長於正常培養基之A549細胞之EMT標記並無因靈芝F3部分處理而改變(圖1B，比較欄1與欄2)。由於細胞運動增強是一個眾所周知的與EMT相關表型變化，以移轉分析法分析細胞運動的變化。測試靈芝F3部分對TGF-β1誘發之A549細胞移轉之效果。結果顯示，靈芝F3部分抑制了TGF-β1誘發之A549細胞移轉至聚碳酸酯多孔膜下方(圖1C)。靈芝F3部分逆轉了A549細胞中TGF-β1誘發之EMT特性。

●　靈芝F3部分抑制A549中TGF-β1誘發有關EMT之訊息傳遞

由於癌細胞往往會增加其活性TGF-β1之產生，其不僅觸發EMT並允許細胞變成具侵入性(Derynck R，Akhurst RJ，& Balmain A(2001)腫瘤中TGF-β訊息傳遞之抑制及癌症病程。Nat Genet 29(2)：117-129)，我們研究了在A549細胞做靈芝F3部分處理後TGF-β1之產生及其與EMT之關聯。結果表明，靈芝F3部分可在6小時或24小時抑制A549細胞中TGF-β1產生(圖2A)。為了探索其中靈芝F3部分抑制TGF-β1誘導的EMT，我們測得的效果靈芝F3部分早期TGF-β1誘導的信號事件在A549細胞的機制。主要的TGF-β1誘發之訊息傳遞途徑為Smad訊息傳遞。因為Smad2/3磷酸化是TGF-β1誘發之上皮-間質轉化所需。因此，我們研究了靈芝F3部分對TGF-β1誘發之Smad2/3磷酸化之效果。我們發現靈芝F3部分之處理於3小時降低了TGF-β1誘發之Smad2/3磷酸化(圖2B，比較欄3與欄4)。已知Snail及Slug可調節E-鈣黏素轉錄作用。兩個轉錄因子皆因應進行TGF-β1誘發之EMT之細胞中之TGF-β1而被誘發(Cano A，et al.(2000)。轉錄因子Snail藉由抑制E-鈣黏素表現來控制上皮-間質轉化(EMTs)。Nat Cell Biol 2(2)：76-83)。為定義靈芝F3部分逆轉TGF-β1誘發之EMT之機制，以西方墨點法研究Snail及Slug之蛋白質濃度。當以靈芝F3部分處理，其阻斷了TGF-β1路徑下游受體，A549細胞中Snail被減少了。然而，Slug並不隨靈芝F3部分變化(圖2C，比較欄3與欄4)。

●　靈芝F3部分抑制LLC之入侵及菌落形成

因為已發現活體外靈芝F3部分可逆轉TGF-β1誘發之EMT，接著在帶有LLC之小鼠模型研究活體內靈芝F3部分之抗移轉效果。首先，我們測試靈芝F3部分對LLC細胞之細胞移轉、入侵，及菌落形成之抗移轉效果。在靈芝F3部分濃度為120μg/ml時，LLC細胞之入侵被顯著地減少至33.8%，相較於未經處理之控制組(**，p<0.01)(圖3A)。此外，靈芝F3部分(120μg/ml)之效果顯著減少40%菌落形成，相較於控制組孔(*，p<0.05)(圖3B)。因此，靈芝F3部分可減少LLC細胞入侵及菌落形成。

●　靈芝F3部分結合順鉑對帶有LLC之小鼠之抑制效果

為研究靈芝F3部分在小鼠模型活體內之抗轉移性能力，經由尾靜脈注射LLC將LLC細胞導入C57BL/6小鼠。注射7天後，隨機選擇小鼠以2日之間隔腹腔注射PBS或靈芝F3部分，或口服靈芝F3部分。我們發現，靈芝F3部分(腹腔注射)顯著地抑制肺腫瘤多發性(26.8±4.9 v.s. 7.0±1.4，p<0.001)及肺病變之腫瘤體積(146.5±65.9 v.s. 78.2±8.0，p<0.05)，相較於僅處理PBS(圖4A)。在靈芝F3部分口服組觀察到相似的變化，且此組顯著的抑制肺腫瘤多發性(9.7±4.0 v.s. 26.8±4.9，p<0.05)及肺病變之腫瘤體積(15.9±11.2 v.s. 146.5±65.9，p<0.05)，相較於僅處理PBS(圖4A)。再者，此模型提供了靈芝F3部分結合標準化學治療劑之基礎。在本研究中，我們選擇了順-雙氨雙氯鉑(II)(CDDP；順鉑)結合靈芝F3部分施用之最佳時間表，第7天。而CDDP及靈芝F3部分之結合(腹腔注射)進一步降低了肺腫瘤多發性(5±2.8對照12.8±6.3，p<0.05)及肺病變之腫瘤體積(7.0±1.8對照141.9±65.2，p<0.05)，相較於僅處理CDDP(圖4A)。

為了進一步分析測試小鼠中之LLC移轉，進行組織染色實驗。以H&E染色之肺切片顯示了腫瘤在第28天移轉至肺泡肺組織之形態，其在以靈芝F3部分處理後消失(圖4B)。我們發現，靈芝F3部分(腹腔注射)或靈芝F3部分(口服)與CDDP結合抑制了腫瘤移轉至肺泡肺組織，相較於僅以CDDP處理(圖4B)。接著，我們亦發現靈芝F3部分(腹腔注射)或靈芝F3部分(口服)與CDDP結合抑制了腫瘤移轉至肝組織，相較於僅以CDDP處理(圖4C)。綜言之，這些數據表明，F3部分的靈芝及有效CDDP之組合也可能降低遠處轉移。

為了增加本發明方法之有效性，可能需要結合抗癌組成物及其他亦能有效治療超增生疾病之藥劑。此等組合治療可發生於本發明治療方法之施用範疇，例如在相同的原位注射方案內結合基因治療及一抗癌藥。另擇的，可在本發明範圍內使用組合治療，舉例而言，在有系統施用治療藥劑以外，藉由以本發明方法原位施用一或多個治療藥劑。

抗化學治療及放射線治療藥劑之腫瘤細胞代表了臨床腫瘤學重大問題。目前癌症研究的一個目標是要設法藉由結合基因治療來改善化療及放射線治療的療效。舉例而言，當以反轉錄病毒載體系統將單純泡疹-胸腺激酶(HS-tK)基因傳送至腦瘤，可成功的誘發對抗病毒藥更昔洛韋(ganciclovir)之易感性(Culver，et al.，1992)。本發明設想，除了其他促細胞凋亡或細胞週期調節劑外，靈芝F3治療可相似地合併用於化學治療、放射線治療、或免疫治療干預。

另擇的，靈芝F3組成物治療可以數分鐘至數週之間隔在其他藥劑處理之前或之後進行。在具體實施例中，其中其他藥劑及表現構築被分別送入細胞，一般會確保一段顯著時間不超出每次輸送的間隔，因此該藥劑及表現構築將仍然可對細胞展現好的結合效果。在此情形，設想可在約12-24小時內將細胞與兩種模式皆互相接觸，更佳地，在6-12小時內。然而在某些情況，可能需要延長時間來顯著治療，數天(2、3、4、5、6或7)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8)等各施用間之時效。

可將靈芝F3組成物與其他形式之癌症治療如手術合併施用。大約60%之癌症患者在某些情型會進行手術，包括預防性手術，診斷手術或分期手術，根治性手術和姑息性手術。根治性手術是可以合併其他療法的癌症治療，例如本發明之治療、化學治療、放射線治療、荷爾蒙治療、基因治療、免疫治療和/或替代療法。

根治性手術包括將全部或部分癌變組織被物理性移除、切除及/或銷毀的手術切除。腫瘤切除是指物理移除至少部分之腫瘤。除腫瘤切除外，手術處理包括雷射手術、冷凍手術、電外科和微觀控制的手術(莫氏手術)。進一步設想本發明可合併表面皮癌、初癌，或偶然量之正常組織之切除來使用。

在癌變細胞、組織、或腫瘤之全部或部分切除下，體內將形成一腔。可藉由以附加的抗癌療法灌注、直接注射或區域施用來完成此治療。此治療可重複，舉例而言，每1、2、3、4、5、6、或7天，或每1、2、3、4、及5週或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12月。這些治療亦可為不同劑量。

本發明設想，其他藥劑可與本發明之靈芝F3部分組成物合併使用以改善治療的治療效果。這些附加藥劑包括免疫調節劑、影響細胞表面受體及GAP連結上調之藥劑、細胞生長抑制劑及分化劑，細胞吸附抑制劑，或可增加超增生細胞對細胞凋亡誘導因子之易感性之藥劑。免疫調節劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β、及γ；IL-2及其他細胞激素；F42K及其他細胞激素類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES，及其他趨化激素。本發明進一步設想細胞表面受體或其配體如Fas/Fas配體、DR4或DR5/TRAIL之上調將增強本發明之誘發細胞凋亡能力，其透過通過對超增生細胞建立自分泌或旁分泌作用。藉由提升GAP連結數來增加細胞間訊息傳遞將增加對鄰近超增生細胞族群之抗超增生效果。其他具體實施例中，細胞生長抑制劑或分化劑可用於與本發明合併使用以改善治療的抗超增生效果。細胞吸附抑制劑被認為可改善本發明之效用。細胞吸附抑制劑之實例為局部黏合激酶(FAKs)抑制劑及洛維汀(Lovastatin)。本發明亦設想其他可增加超增生細胞對細胞凋亡之易感性之藥劑，如抗體c225，可用來與本發明合併使用以改善治療效果。

靈芝F3部分可與其他用於治療癌症之化學治療劑合併製劑或合併施用，包括烷化劑、抗代謝物抗拮劑、抗癌抗生素、及植物衍生之抗癌藥劑。"烷化劑"之實例包括含氮芥子油、含氮芥子油-N-氧化物鹽酸鹽、苯丁酸氮芥(chlorambutyl)、環磷醯胺、依弗醯胺、沙奧特帕、卡波醌(carboquone)、甲苯磺酸胺丙磺酯(improsulfan tosylate)、二甲磺酸丁酯、鹽酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、二溴甘露醇(mitobronitol)、氮芥苯丙胺酸、氮烯唑胺(dacarbazine)、雷諾氮芥(ranimustine)、雌二醇氮芥磷酸鈉、三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、環己亞硝、鏈尿佐菌素、哌血生(pipobroman)、乙環氧啶(etoglucid)、卡鉑定、順鉑、米鉑(miboplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、六甲基蜜胺(altretamine)、氨莫司汀(ambamustine)、二溴螺銨鹽酸鹽(dibrospidium hydrochloride)、佛替姆丁(fotemustine)、潑尼氮芥(prednimustine)、嘌嘧替派(pumitepa)、ribomustin、替莫唑胺(temozolomide)、treosulphan、氯乙環磷酰胺(trophosphamide)、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、卡波醌(carboquone)、阿多來新(adozelesin)、半胱胺亞硝脲(cystemustine)、及比折來新(bizelesin)。"抗代謝物"之實例包括硫醇嘌呤、6-硫醇嘌呤核糖苷、硫肌苷(thioinosine)、胺甲葉酸、依諾他賓(enocitabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶、阿拉伯糖基胞嘧啶十八烷基磷酸钠、環胞苷鹽酸鹽(ancitabine hydrochloride)、5-FU藥物(例如，氟尿嘧啶、喃氟啶(tegafur)、UFT、5'-去氧-5-氟尿苷、卡莫氟(carmofur)、加洛他濱(gallocitabine)、乙嘧替氟(emmitefur))、氨基蝶呤(aminopterine)、留可佛林鈣、片錠、甘氨硫嘌呤(butocine)、亞葉酸鈣(folinate calcium)、左亞葉酸鈣(levofolinate calcium)、克拉屈濱(cladribine)、乙嘧替氟(emitefur)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基尿素(hydroxycarbamide)、噴司他丁(pentostatin)、吡曲克辛(piritrexim)、碘去氧尿甘、丙脒腙(mitoguazone)、噻唑呋林(thiazophrine)，及氨莫司汀(ambamustine)等等。"抗癌抗生素"之實例包括放線菌素-D、放線菌素-C、絲裂黴素-C、色黴素-A3、鹽酸博來黴素、硫酸博來黴素、硫酸培來黴素(peplomycin sulfate)、鹽酸道諾黴素、鹽酸阿黴素、鹽酸阿柔比星(aclarubicin hydrochloride)、鹽酸畢拉魯比辛、鹽酸依畢魯比辛、新抑癌素、光神黴素(mithramycin)、肉瘤黴素(sarcomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、米托坦(mitotane)、鹽酸佐柔比星(zorubicin hydrochloride)、鹽酸邁杜蔥酮、及鹽酸艾達魯比辛等等。"植物衍生之抗癌藥劑"包括磷酸依托泊甙(etoposide phosphate)、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼、硫酸長春地辛(vindesine sulfate)、坦尼坡賽、紫杉醇、多西泰索(docetaxel)、及長春瑞濱(vinorelbine)等等。

可與靈芝F3組成物合併施用之例示藥物為順鉑。順鉑已被廣泛用來治療癌症如轉移性睾丸癌或卵巢癌，晚期膀胱癌，頭部或頸部癌，子宮頸癌，肺癌或其他腫瘤。順鉑(CDDP)可被單獨施用或與靈芝F3藥劑合併，以臨床應用之有效劑量5-20mg/m²，在全部三個病程中每三週五天。例示劑量可為0.50mg/m²、1.0mg/m²、1.50mg/m²、1.75mg/m²、2.0mg/m²、3.0mg/m²、4.0mg/m²、5.0mg/m²、10mg/m²、20mg/m²、50mg/m²。當然，所有這些劑量皆為例示用，任何在這些點之間的劑量亦可用於本發明。順鉑不可為口服吸收，因此必須經靜脈注射、皮下注射、腫瘤內或腹腔內輸送。

荷爾蒙治療亦可與本發明合併使用或與任何前述之其他癌症治療合併。荷爾蒙之使用可在治療某些癌症時應用，如乳癌、前列腺癌、卵巢癌，或子宮頸癌，以降低或阻斷某些荷爾蒙如睾丸激素或雌激素之效果。此治療通常與至少一個其他癌症治療結合使用，作為一種治療選項或降低轉移的風險。

「施用」乙詞是指靈芝F3組成物以能達到所欲目的之方式被輸送至宿主。如前所述，該組成物可以一有效路徑施用，如口服、外用、直腸給藥等等。組成物可被施予任何需藥治療之宿主，例如，脊椎動物，如哺乳類動物，包括人類、男性人類、女性人類、靈長類動物、寵物，如貓、狗、家畜，如牛、馬、鳥、雞等等。

有效量之靈芝F3組成物被施用至此等宿主。有效量是指能達到所欲結果之量，較佳為如上所述之有益或治療效果。此量可常規地決定，例如，進行劑量反應實驗，其中各種劑量被施用至細胞、組織、動物模型，以決定達到一效果之有效量。基於各種因素來選擇量，包括靈芝萃取物施用的環境(例如，癌症病人，動物模型，組織培養細胞等等)，待處理細胞之處，待處理之病人或動物之年齡、健康、性別，和重量等等。有用的量包括，10毫克-100克，較佳地，例如，每劑100毫克-10克，250毫克-2.5克，1克，2克，3克，500毫克-1.25克等等之不同形式之組成物如靈芝F3粉末，靈芝F3糊，或靈芝F3輸液及製被為含靈芝F3有效成份之飲料，及注射劑，取決於受者的需要及製備方法。

本發明可與多樣賦形劑一起使用。本發明之靈芝F3組成物可以各種有效形式，包括但不限於乾燥粉末、磨碎、乳液、萃取物，和其他傳統的組成物。

本發明之靈芝F3組成物可經由任何有效路徑以任何形式被施用，包括，例如，經口腔，經非腸道，經腸道，經腹腔，局部，經透皮(例如，使用任何標準的貼劑)，經眼，經鼻腔，局部的，非口服，如氣霧劑、吸入劑、皮下、肌肉、頰、舌下、直腸、陰道、內動脈、及腦脊髓膜內等等。可單獨施用或合併使用任何成成分，活性或非活性，包括藥用形式，或作為食物或飲料添加劑。

本發明之較佳具體實施例中，組成物以任何合適的形式被經口施用，包括，例如，丸劑，膠囊劑，顆粒劑，片劑或懸浮劑。

組成物亦可結合任何醫藥上可接受載劑。「醫藥上可接受之載劑」乙詞是指任何醫藥載劑，如標準載劑，如，Remington：藥劑業的科學與實踐. Lippincott Williams & Wilkins；Twenty first Edition(2005)所述者。合適的載劑實例在本領域為習知，可包括但不限於，任何標準醫藥載劑如磷酸鹽緩衝鹽溶液、含Polysorb80之磷酸鹽緩衝液、水、乳化液如油/水乳化和各類潤濕劑。其他載劑可能還包括無菌溶液、片劑，醫藥包衣片和膠囊。此等載劑典型地含有賦形劑如澱粉、牛奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽類、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉、植物脂肪或油、樹膠、乙二醇。此等載劑亦可包括香味及顏色添加劑或其他成份。組成物包含此等載劑被以廣為人知的傳統方法製劑。一般而言與組成物一起被製劑的賦形劑係適用於口服且不與該組成物或其他活性成分起有害反應。

合適的醫藥上可接受載劑包括但不限於水、鹽溶液、醇、阿拉伯樹膠、植物油、芐醇、明膠、碳水化合物如乳糖、直鏈澱粉或澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、香料油、脂肪酸單甘酯和甘油、季戊四醇脂肪酸酯、羥基甲基纖維素及其類似物。其他添加劑包括，例如，抗氧化劑和防腐劑、色素、調味劑和稀釋劑、乳化和助懸劑，如洋槐、瓊脂、海藻酸、海藻酸鈉、膨潤土、卡波姆、卡拉膠、羧甲基纖維素、纖維素、膽固醇、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、辛苯昔醇(octoxynol)9、油醇、聚維酮、丙二醇單硬脂酸酯、十二烷基硫酸鈉、山梨醇酯、硬脂醇、黃蓍膠、黃原膠及其衍生物、溶劑，和雜項成分如微晶纖維素、檸檬酸、糊精、葡萄糖、液體葡萄糖、乳酸、乳糖、氯化鎂、偏磷酸鉀、澱粉及其類似物。

本組成物亦可與其他活性成份一起製劑，如抗氧化劑、維生素(A、C、抗壞血酸、B's，如B1、硫胺素、B6，維生素B6、B群、生物素、膽鹼、菸鹼酸、泛酸、B12、氰鈷胺和/或B2、D、D2、D3、骨化醇、E，如生育酚、核黃素、K、K1、K2)。

實例

無意限制本發明之範圍，有關於本發明之具體實施例之例示的器具，設備，方法及其等之相關結果提供如下。值得注意的是，標題或子標題可為便於閱讀方便而用於實例中，但不應限制本發明之範圍。再者，此處提出及揭露某些理論；然而，只要本發明是在根據本發明下實施而無考慮到特定理論或行為流程圖，不論這些理論正確與否，都不應限制本發明之範圍。

實例1：細胞系

A549，一種人類肺腺癌細胞系，得自於生物資源保存及研究中心(BCRC，新竹，台灣)。將細胞培養在RPMI 1640培養液中，其補充有10%胎牛血清及2mM L-麩胺酸(Life Technologies，Inc.，MD)。以胰蛋白酶-EDTA將吸附的細胞剝離。鼠類Lewis肺癌(LLC，H-2b，ATCC：CRL-1642)得自於BCRC並培養在RPMI 1640及Dulbecco改進之Eagle培養基(GIBCO-Life Technologies)，其補充有1.5 g/L之NaHCO3及10%胎牛血清(FBS)。所有細胞被維持在37℃在一5% CO2-95%空氣之潮濕環境。

實例2：試劑和抗體

重組人類TGF-β1(R&D)，抗-E-鈣黏素(BD bioscience)，抗-N-鈣黏素(BD bioscience)，抗-中間絲蛋白(Sigma)，抗-γ-連環蛋白(Santa Cruz)，抗-磷酸-smad2/3(Santa Cruz)，抗-snail(Abcam)，抗-slug(Cell Signaling)，抗-TGF-βRII(Santa Cruz)，抗-β-肌動蛋白(Santa Cruz)。

實例3：小鼠

雄性C57BL/6(H-2b；6-8週大)小鼠購自於國家實驗動物中心(台北)。小鼠在陽明大學實驗動物照護及使用委員會核准下養育。

實例4：靈芝F3部分　粉末之製備

靈芝粗萃取物之製備：將靈芝子實體研磨成約5mm之顆粒，將這些子實體顆粒加入0.04N預熱至80℃之NaOH溶液(1 kg顆粒/12公升溶液)，於80℃將該混合物溫和攪拌3小時。冷卻該溶液至室溫並以32% HCl調整pH至7.2±0.2。將矽鈣石(1 kg/100公升溶液)添加至該溶液，攪拌，接著過濾過濾壓系統以獲得透明靈芝粗萃取物。此靈芝粗萃取物之顯示許多不同分子量大小峰之HPLC(高壓液相層析)圖形如圖5所示。

靈芝F3部分之製備：使用100KD切向流過濾法系統(Millipore Corporation，USA)進一步純化該靈芝粗萃取物，以移除小分子量部分、成分及NaCl。純化之靈芝F3部分之HPLC圖形如圖6所示。

乾燥靈芝F3部分粉末：以標準凍乾程序從靈芝F3部分純化溶液移除水。

此處所揭露之靈芝F3部分相同於美國專利No. 7,135,183圖1中之部分-3，155至205 mL，該案之全文以引用的方式併入本文中。用來比較這些部分之方法為HPLC指紋圖形及細胞激素表現圖形。

靈芝F3部分組成物：將靈芝F3部分粉末溶解於二次蒸餾H2O或PBS中。於25℃攪拌溶液30分鐘，並於4℃離心(1800 x g)10分鐘。將上清液(溶解率為50%)使用0.22μm無菌過濾器(Millipore，Inc.，Temecula，CA)過濾，如文獻所述(Hsu H-Y，et al.(2004)靈芝多醣萃取物透過TLR4-調節蛋白質激酶訊息傳遞途徑誘發細胞激素表現。J Immunol 173(10)：5989-5999)。

實例5：全細胞萃取物之製備

為了分析蛋白質表現，培養細胞(4×105於6 cm組織培養盤)並以靈芝F3部分(60，120及180 μg/ml)或空載體處理。以含1% Na3VO4之冷PBS潤洗細胞一次，以40 μl裂解緩衝液將細胞原位裂解，裂解之細胞被置於冰上10分鐘，接著於4℃ 12000×rpm離心10分鐘。使用Bradford蛋白質分析法(Bio-Rad，Hercules，CA)以牛血清白蛋白做為基準來決定上清溶液之蛋白質濃度。

實例6：西方墨點法分析

在培養期後收集細胞並添加裂解緩衝液。等量之蛋白質被裝入10% SDS-PAGE並透過濕轉印墨點系統移轉至Immobilon PVDF膜上(Blot Electrophoretic Transfer Cell，Bio-Red；移轉緩衝液：25 mM Tris-base，192 mM甘胺酸，0.1% SDS及20%甲醇，250 mA，100分鐘)，用於西方墨點分析。

實例7：活體外細胞移轉、入侵及軟瓊脂菌落形成分析

使用6.5-mm Costar Transwell chambers(8 μm孔徑；Corning，NY)進行細胞移轉分析。在LLC細胞以靈芝F3部分(120μg/ml)處理後，4 x 104細胞/200μl被種在Transwell室中。使用Transwell過濾器之細胞入侵分析被覆以適當的Matrigel(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。在24小時培養後，將該過濾器溫和地從室中移除並以棉籤掃除上表面之無侵入性細胞。將細胞以甲醇固定10分鐘。將移轉至膜下側之細胞以劉氏染色法染色(Handsel Technologies，Inc.，台北，台灣)。於100X放大倍率顯微鏡下檢測細胞。為做軟瓊脂菌落形成分析研究，LLC細胞被置入具上層為0.33%瓊脂、底層為0.5%瓊脂(Noble agar，Becton Dickinson)、含10% FBS之DMEM6孔盤中(每孔1500細胞)。培養細胞16天並計算菌落數。

實例8：活體內移轉分析

LLC細胞(2 x 105細胞)經由側尾靜脈注射植入C57BL/6小鼠。隨機將小鼠分為六個處理組：PBS、靈芝F3部分(腹腔注射)、靈芝F3部分(口服)、順-雙氨雙氯鉑(II)(CDDP or順鉑)/靈芝F3部分(腹腔注射)，或CDDP/靈芝F3部分(腹腔注射)。第7天對小鼠腹腔注射CDDP(0.5 mg/g)。同時，對小鼠每兩天腹腔注射靈芝F3部分(0.075 mg/g)，或每天口服靈芝F3部分(0.15 mg/g)。4週後犧牲小鼠，檢驗所有器官移轉形成的情形。將肺移除並固定在10%三聚甲醛中。計算肺腫瘤菌落之數量及腫瘤體積。腫瘤體積以長x寬x高x0.5236(mm3)計算，參照文獻(Santini D，Vincenzi B，Tonini G，Scarpa S，& Baldi A(2003)Correspondence Re：E。Corey et al.，唑來膦酸展現對攝護腺癌轉移成骨和溶骨之抑制效果。Clin. Cancer Res。，9：295-306，2003。Clinical Cancer Research 9(8)：3215-3215)。代表性之肺腫瘤被移除、固定並包埋在石蠟中。將包埋之組織以H&E染色用來組織分析。

實例9：統計分析

數據以平均數±標準差表示，且統計上顯著由學生t-測試來檢驗。

本說明書中所有引用之文獻及專利申請案以引用的方式併入本文中，猶如每獨立文獻或專利申請案被特定且獨立地指出以引用的方式併入。

雖然前述發明已以明確理解之目的藉由圖說及實例詳盡地敘述，熟悉此一行業技藝人士依本發明之教示，可明顯知道某種變形與修飾是可在不離所附之申請專利範圍之精神或範疇下被做成的。

以下圖式形成本說明書之部分並被包括以進一步證明本揭露內容之某些態樣，藉由參照此處呈現之一或多個圖式合併特定具體實施例之詳細說明，將更易於理解本發明。本專利或申請檔案包括至少一彩色圖式。本發明或發明申請公開文件之彩色圖式影本可在支付必要費用後向本公司索取。

圖1顯示，A549細胞回應靈芝F3部分(顯示為"EORP")配方進行EMT。(1A)未經處理之A549細胞(1×105細胞/ml)顯示上皮形態。B-D，A549細胞與TGF-β1(1，2及5 ng/ml)一起培養72小時。E-H，以含各種濃度TGF-β1(0，1，2及5 ng/ml)之120 μg/ml靈芝F3部分處理細胞72小時(放大倍率×200)。(1B)A549細胞(1×105細胞/ml)與5 ng/ml之TGF-β1一起培養24小時。24小時後，以靈芝F3部分(120 μg/ml)刺激24小時。蒐集總細胞裂解液，以西方墨點法偵測EMT標記。(1C)在與或不與TGF-β1(5 ng/ml)一起培養24小時後，以靈芝F3部分(120 μg/ml)處理A549細胞(2×105細胞/總)24小時。在處理後，細胞被殖於Transwell系統。由Transwell系統以以聚碳酸酯過濾器(孔徑，8 μm)測量細胞移轉。藉由在顯微鏡下計量移動至聚碳酸酯多孔膜下方之細胞數來量化A549細胞之移轉能力。

圖2顯示，靈芝F3部分(顯示為EORP)配方降低了A549細胞中TGFβ1訊息傳遞途徑。(2A)將A549細胞與或不與靈芝F3部分一起培養在培養基中6及24小時。蒐集培養液以測量TGF-β1，其由ELISA測定。數據以平均數±標準差表示。＊：控制組及經靈芝F3部分處理之A549細胞之間的顯著不同，p＜0.05。將A549細胞與或不與TGF-β1一起培養24小時後，以或不以靈芝F3部分處理3小時。以或不以TGF-β1(5 ng/ml)處理A549細胞24小時，接著置換新鮮培養液。接著，以靈芝F3部分(120 μg/ml)處理A549細胞3小時。(2B)磷酸化Smad2/3之表現、(2C)Snail及Slug之表現以西方墨點法偵測之。

圖3顯示靈芝F3部分(顯示為EORP)配方抑制了A549及LLC-1細胞之移轉、入侵及菌落形成。(3A)以靈芝F3部分(120 μg/ml)處理LLC-1細胞(4×104細胞/200μl)18小時。由Transwell系統以以聚碳酸酯過濾器(孔徑，8μm)測量細胞移轉及細胞入侵。藉由在顯微鏡下計量入侵至聚碳酸酯多孔膜下方之細胞數來量化A549細胞之移轉及入侵能力。(3B)將LLC-1細胞鋪在具上層為0.33%瓊脂、底層為0.5%瓊脂、含10% FBS之DMEM 6孔盤中。培養細胞16天並計量菌落數。顯示之數據為重複實驗的三重樣本之平均數+標準差，在三個獨立實驗中獲得相似結果。*p<0.05及**P<0.01對照控制組。

圖4顯示，結合CDDP之靈芝F3部分(顯示為EORP)配方抑制了腫瘤移轉。將LLC-1細胞經由尾靜脈注射植入小鼠(每組n=8)。7天後，以CDDP(0.5 mg/g)腹腔注射處理小鼠，同時以靈芝F3部分(0.075 mg/g)每2天腹腔注射處理，或以靈芝F3部分(0.075 mg/g)每日口服投藥進行4週。(4A)左圖為肺腫瘤多重性；右圖為肺病變之腫瘤體積(mm3)。*p<0.05，**p<0.01及***P<0.001對照控制組或CDDP組。(4B)上圖為肺；中圖為以HE染色之肺切片：x 20放大倍率；下圖為以HE染色之肺切片：x 400放大倍率。(4C)上圖為HE染色之肝切片：x 100放大倍率；下圖為HE染色之肝切片：x 400放大倍率。

圖5顯示靈芝粗萃取物之HPLC圖樣，使用尺寸篩除管(Tosoh TSK-GEL G5000PW)。

圖6顯示經純化之靈芝F3部分之HPLC圖樣，使用尺寸篩除管(Tosoh TSK-GEL G5000PW)。

Claims (14)

1. 一種靈芝萃取物之一子部分之組成物用於製備降低肺癌細胞移轉之醫藥組合物之用途，其中該靈芝萃取物之部分係由一包含下列步驟之方法獲得，該方法包含以鹼性水溶液萃取靈芝(Ganoderma lucidum)之均質化組織，該鹼萃取物被中和並過濾而獲得透明的靈芝萃取物，移除低分子量成分進一步純化獲得之子部分，且該靈芝萃取物之子部分之活性成分為以高分子量之靈芝多醣為主。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該細胞係哺乳動物細胞。
3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該哺乳動物細胞係人類細胞。
4. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該哺乳動物細胞係非人類動物。
5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌細胞是非小細胞肺癌(NSCLC)。
6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該抑制肺癌細胞移轉為肺癌細胞之移轉及入侵之降低，其包含抗轉移性效果。
7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該肺癌細胞係非小細胞肺癌(NSCLC)細胞。
8. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物係與治療上有效量之化學治療劑合併施用，該化學治療劑選自順鉑、阿黴素、紫杉醇、道諾黴素、絲裂黴素、放線菌素D、博來黴素、VP16、腫瘤壞死因子、長春新鹼、長春鹼、雙氯乙基亞硝脲(carmustine)、氮芥苯丙胺酸、環磷醯胺、氮芥苯丁酸、馬利蘭、環己亞硝、盤尼西林、紅黴素、安莫西林、頭孢坐林、亞胺培 南、氮烯內醯胺、舒巴坦、利奈唑胺、慶大黴素、磺胺甲異噁唑、萬古黴素、塞普沙辛、梭鏈孢酸、曲美普林、硝基甲嘧唑乙醇、氯林絲菌素、莫螢菌素、兩性黴素B、立汎黴素、氟康唑，或其等之組合物。
9. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物係與治療上有效量之順-雙氨雙氯鉑(II)(CDDP或順鉑)合併施用。
10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該順鉑係以腹腔內施用。
11. 如申請專利範圍第9項之用途，其中施用該組成物及順鉑藉由一或多個(a)降低肺腫瘤多發性，及(b)控制腫瘤大小作用來降低遠處轉移，其較單獨施用順鉑大幅降低該腫瘤多發性或大小。
12. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組成物係與抗癌療法合併施用，該抗癌療法係選自於藥物、荷爾蒙、基因治療組成物、放射性核種、營養品、外科程序、輻射程序或其等之組合。
13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該組成物之施用係在抗癌療法之前或之後。
14. 如申請專利範圍第8至12項中任一項之用途，其中該組成物係同時或依序以口服、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔內、滴鼻或經皮方法施用。